片段分析

实验背景Fragment-based drug discovery(FBDD)，是先导化合物发现的主流方法之一。它利用核磁共振技术（NMR）、X-射线单晶衍射（X-ray）以及热迁移分析（TSA） 等方法筛选出与靶蛋白有弱相互作用的小分子片段，之后基于其结构信息对活性片段进行优化，进而得到更高活性的先导化合物进行新药的研发。在筛选小分子片段时，NMR能在接近生理条件的溶液中获得结合部位信息以及Kd，但其缺点为只能检测比较小的蛋白，且样品消耗量大。X-ray则需要先制备蛋白晶体，并且蛋白晶体和其在溶液中的构象可能会有差异。此外，这两种方法都需要非常昂贵的设备，通常只能在专用的平台由专业操作人员协助开展实验。TSA（Thermal shift assay）通过检测蛋白的熔解温度Tm变化来进行蛋白结合配体的筛选，其检测速度快，实验门槛低。因此我们可以先使用TSA进行初级筛选,之后结合NMR或X-ray进行验证。TSA的主要技术有染料法以及无标记的nanoDSF技术。在之前的文章中我们已经介绍过这两种技术的原理及对,小编今天将和大家分享荷兰癌症研究所（NKI）的研究人员发表在JoVE实验视频期刊基于nanoDSF技术建立的片段化合物库筛选Protocol。doi:10.3791/62469实验演示实验小贴士使用蛋白纯度大于95%的均一蛋白蛋白检测浓度通常为200μg/ml, 本文中筛选768个化合物片段消耗～12ml蛋白，仅2.5mg需要提前评估DMSO对蛋白的影响，本文中DMSO终浓度为0.2%操作演示实验小结基于此Protocol，研究人员对三种蛋白（癌症高表达蛋白 Hec1，单极纺锤体蛋白激酶1 Mps1及新冠非结构蛋白5,nsp5）进行了DSi-Poised library（768个片段）的筛选。研究人员指出使用搭载nanoDSF技术的Prometheus蛋白稳定性分析仪在进行TSA筛选时有以下优势：1样品消耗量低，要比其他方法少几个数量级2除Tm外，还可同时检测样品的聚集情况。3传统DSF方法，染料可能会干扰蛋白与配体间的结合除了无标记nanoDSF检测模块外，Prometheus蛋白稳定性分析仪还可搭载动态光散射（DLS），静态光散射（SLS）和背反射（Backreflection）模块，只需要10μl样品就可以完成均一性，热稳定性，胶体稳定性的检测。同时我们还提供自动化解决方案，便于客户进行无人值守的高通量筛选。机械臂自动上样NanoTemper用户介绍荷兰癌症研究所（NKI）成立于1913年，是荷兰唯一的专业癌症中心，一直以来也肩负着国际化科学与临床专业知识、发展及培训中心的重要角色。该中心位于阿姆斯特丹，提供荷兰国内最佳的癌症治疗，并曾推动了多项科学突破。（图片来源百度）[1] Ahmad M , Fish A , Molenaar J , et al. Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery[J]. Journal of Visualized Experiments, 2021(171).

STING抑制剂片段筛选案例干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes, STING)在天然免疫中发挥重要作用，当细胞被病原体(如病毒)感染时，STING可以诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的产生，是靶向治疗自身免疫疾病和癌症的潜在靶标蛋白。近年STING相关研究火爆，管线数量激增。目前全球范围内在研的STING靶向药物超过50种。今天给大家介绍的STING抑制剂片段筛选案例是由NanoTemper和药明康德旗下的Crelux公司合作完成的。研究人员生产纯化了带有His-tag的STING蛋白，随后使用Prometheus蛋白稳定性分析仪进行缓冲液优化并使用环二核苷酸cGAMP作为阳性对照进行Thermal shift assay，快速验证了蛋白的结合活性。案例回顾：差示扫描荧光法表征蛋白配体互作，不加染料的那种接下来研究人员使用Dianthus完成了片段化合物库单点筛选及亲和力排序。在使用Dianthus进行筛选时，其中一个分子需要带有荧光。本实验中, 研究人员使用His-tag荧光标记试剂盒对STING蛋白进行了特异性标记，片段终浓度为500μM，结合缓冲液为50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, 0.005% TWEEN® 20, 4% DMSO。 STING片段筛选流程下图为单点筛选结果，2213个片段加上阳性及DMSO对照（均重复一次）总共采集了5376个数据点，即14块384孔板。消耗590μg STING蛋白,上机检测时间约8h（Dianthus 33分钟即可完成一块384孔板检测，↓ 文末查看Dianthus上机演示）。紫色线框中的黄色数据点为阳性对照cGAMP，213个阳性化合物响应值CV仅0.25%，检测重复性非常好。最后将单点筛选结果中的162个hits（上图蓝色数据点）进行12个浓度点的梯度稀释检测亲和力。消耗STING蛋白190μg，上机检测时间约3小时。苗头化合物验证基于片段的药物发现 (FBDD) 是药物研发的主流方法之一。但片段分子量低，且与蛋白靶标亲和力低，通常在μM-mM范围，因此对筛选技术的灵敏度有较高的要求。Dianthus基于光谱位移技术（Spectral shift）检测，不依赖于分子量，可检测pM-mM的亲和力。此外，Dianthus检测一个kd仅需1min，单孔上样体积20μl，是您亲和力筛选项目的强大工具！Dianthus产品介绍：全新Dianthus携光谱位移技术横空出世，1分钟击破亲和力筛选难点！wx搜索NanoTemper视频号，查看Dianthus上机操作演示吧！

从人类基因组草图到完全图谱——论基因组重复片段研究作者：李东卫，张玉波（中国农业科学院农业基因组研究所，“岭南现代农业”广东省实验室，深圳 518120）2001年发表的人类基因组草图并没有包含全部的基因组序列，直到二十年后，科学家们才正式宣布完成了人类全序列基因组图谱，这其中主要的技术障碍就是重复片段的测序工作。重复片段（segmental duplications，SDs）是指广泛存在于基因组中的大于1 kb且序列相似性超过90%以上的大片段。它们可以通过基因组重排及拷贝数变异产生新基因和驱动进化，其大量存在于子端粒中，并与哺乳动物细胞复制性衰老以及癌症等重要生物学过程密切相关，一直以来备受科学家关注。但是其序列特点使得常规的测序技术难以完全准确测出全部序列，是基因组组装工作的一个难点。人类基因组全图谱的完成将重复片段在生物体进化、延缓衰老、疾病治疗等方面的研究提供基础。本文将就重复片段的重要性，研究的技术难点，研究现状以及未来展望等方面展开论述。重复片段的重要性重复片段是基因组中序列高度相同的大片段，具有广泛的结构多样性。它们占人类参考基因组（T2T-CHM13）中的7.0%，长度为218 Mbp[2 ]，在中心体及子端粒区域富集高达10倍。中心体所包含的5个典型重复为：α卫星，β卫星，CER卫星，γ卫星，CAGGG重复，以及重复子4。子端粒所包含的典型重复为：端粒相关重复（TAR）以及传统的（TTAGGG）n重复[4 ]。重复片段可以介导染色体重排，使常染色体和异染色体之间通过同源重组产生镶嵌类型的重复的染色质[5 ]。在最近新鉴定的人类重复片段中，Mitchell R等预测了182个新的候选蛋白编码基因，并使用T2T-CHM13基因组重构了重复基因（TBC1D3，SRGAP2C，ARHGAP11B），这些基因在人额皮质增生中具有重要作用，揭示了重复片段结构在人和他们近亲物种之间的巨大进化差异[6 ]。大量的染色体子端粒区含有重复片段[8 ]。复制性衰老被认为是一种抗癌机制，限制细胞增殖。长寿的有机体经历更多的细胞分裂，因此具有更高的产生肿瘤的风险。端粒酶能够增加端粒的长度，促进癌细胞不断增殖，因此长寿动物体细胞倾向于抑制端粒酶的活性，从而抑制肿瘤发生的风险[10 ]研究难点：大片段长度、多拷贝数、序列高度相似 重复片段的大的片段长度，多拷贝数以及序列的高度相似是长期以来其研究的难点。各种测序技术的发展致力于解决这个问题。重复片段长度范围是1到400 kb [12 ]。而且，标准的长读段校正工具，例如MUMmer 或Minimap2不能够有效的捕捉低相似的重复片段，也经常将重复片段与其它调控元件混淆[14 ]，为重复片段的研究带来机遇。尤其是PacBio的HiFi读段，具有长读段的同时还具有较高的准确度。但是，很多重复片段的长度要比HiFi读段的平均长度要长，因此很难完全准确的进行组装[3 ]。染色体重排，尤其是染色质断裂常发生在高GC区域[16 ]。同时，在T2T-CHM13基因组基础上，Mitchell R等首次进行了全基因组重复片段的研究。与当前人类参考基因组（GRCh38）鉴定的167 Mbp复制片段相比，鉴定了更多的（218 Mbp）非冗余重复片段（图2 a, b）。新发现91%的重复片段能更好地代表人的拷贝数，通过与非人灵长类基因组相比，前所未有的揭示了人类和其它近亲在重复片段结构中的杂合性以及广泛的进化差异[17 ]。图2 T2T-CHM13中新鉴定的染色体内（a）与染色间（b）的重复片段[1 ]。利用重复片段解析衰老机制未来可期新组装的T2T-CHM13的拷贝数比GRCh38高9倍，因此它能更好的呈现人类拷贝数变异。通过鉴定新基因的拷贝数变异，可筛选相应的药物治疗靶点。例如，CHM13鉴定到LPA、MUC3A、FCGR2基因的拷贝数变异与疾病相关[1]。此外，对于尚具争议的疾病标志基因，例如乳腺癌中ESR1 基因[18]，可以通过CHM13对其进行分子进化分析，进而鉴定其突变和扩增，确定其在乳腺癌中的作用。尽管端粒作为抗衰老靶标已研究多年，但是端粒长短变化与复制性衰老的关系仍不清楚。细胞减数分裂过程中端粒变短的机制是什么？重复片段拷贝数变异与端粒变短有无相关性？很多研究已证明端粒酶具有延长端粒长度的作用，具体的机制是什么？这些问题因此前端粒不能被准确测序而长期未解决。现在，人类基因组完全图谱已基本实现，相信这些谜团会很快解开。未来可以根据人类年龄增长过程中端粒重复片段的拷贝数变异，解析其抗衰老的机制。通过人为干预其拷贝数，可能用于探索生命的极限。1. Vollger MR, Guitart X, Dishuck PC, Mercuri L, Harvey WT, Gershman A, Diekhans M, Sulovari A, Munson KM, Lewis AM et al.Segmental duplications and their variation in a complete human genome. bioRxiv.2021:2021.2005.2026.445678.2. Prodanov T, Bansal V.Sensitive alignment using paralogous sequence variants improves long-read mapping and variant calling in segmental duplications. Nucleic Acids Research.2020 48(19).3. Bailey JA, Yavor AM, Massa HF, Trask BJ, Eichler EE.Segmental duplications: Organization and impact within the current Human Genome Project assembly. Genome research.2001 11(6):1005-1017.4. Courseaux A, Richard F, Grosgeorge J, Ortola C, Viale A, Turc-Carel C, Dutrillaux B, Gaudray P, Nahon JL.Segmental duplications in euchromatic regions of human chromosome 5: a source of evolutionary instability and transcriptional innovation. Genome research.2003 13(3):369-381.5. Giannuzzi G, Pazienza M, Huddleston J, Antonacci F, Malig M, Vives L, Eichler EE, Ventura M.Hominoid fission of chromosome 14/15 and the role of segmental duplications. Genome research.2013 23(11):1763-1773.6. Young E, Abid HZ, Kwok PY, Riethman H, Xiao M.Comprehensive Analysis of Human Subtelomeres by Whole Genome Mapping. PLoS genetics.2020 16(1):e1008347.7. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W et al.Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature.2001 409(6822):860-921.8. Seluanov A, Chen ZX, Hine C, Sasahara THC, Ribeiro AACM, Catania KC, Presgraves DC, Gorbunova V.Telomerase activity coevolves with body mass not lifespan. Aging Cell.2007 6(1):45-52.9. Bromham L.The genome as a life-history character: why rate of molecular evolution varies between mammal species. Philos T R Soc B.2011 366(1577):2503-2513.10. Shay JW.Role of Telomeres and Telomerase in Aging and Cancer. Cancer discovery.2016 6(6):584-593.11. Sharp AJ, Locke DP, McGrath SD, Cheng Z, Bailey JA, Vallente RU, Pertz LM, Clark RA, Schwartz S, Segraves R et al.Segmental duplications and copy-number variation in the human genome. American journal of human genetics.2005 77(1):78-88.12. Hartasanchez DA, Braso-Vives M, Heredia-Genestar JM, Pybus M, Navarro A.Effect of Collapsed Duplications on Diversity Estimates: What to Expect. Genome Biol Evol.2018 10(11):2899-2905.13. Numanagic I, Gokkaya AS, Zhang L, Berger B, Alkan C, Hach F.Fast characterization of segmental duplications in genome assemblies. Bioinformatics.2018 34(17):i706-i714.14. Vollger MR, Dishuck PC, Sorensen M, Welch AE, Dang V, Dougherty ML, Graves-Lindsay TA, Wilson RK, Chaisson MJP, Eichler EE.Long-read sequence and assembly of segmental duplications. Nature methods.2019 16(1):88-94.15. Rhie A, McCarthy SA, Fedrigo O, Damas J, Formenti G, Koren S, Uliano-Silva M, Chow W, Fungtammasan A, Kim J et al.Towards complete and error-free genome assemblies of all vertebrate species. Nature.2021 592(7856):737-+.16. Nurk S, Koren S, Rhie A, Rautiainen M, Bzikadze AV, Mikheenko A, Vollger MR, AltemoseN, Uralsky L, Gershman A et al.The complete sequence of a human genome. bioRxiv.2021:2021.2005.2026.445798.17. Zhu Y, Liu X, Ding X, Wang F, Geng X.Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology.2019 20(1):1-16.18. Tabarestani S, Motallebi M, Akbari ME.Are Estrogen Receptor Genomic Aberrations Predictive of Hormone Therapy Response in Breast Cancer? Iranian journal of cancer prevention.2016 9(4):e6565.

环保大比武精彩片段集锦（一）&mdash &mdash 赛前准备篇 公司全动员 各地勤备战 严把质量关 整装齐待发 环保大比武精彩片段集锦（二）&mdash &mdash 领导关注篇 环境监测司魏司长等领导来我公司进行实地调研 魏司长亲自坐镇，指挥大比武现场布置及仪器摆放 万本太总工视察会场 吴晓青部长视察大比武决赛场地及仪器 老领导督查比赛现场 环保大比武精彩片段集锦（三）&mdash &mdash 赛场风采篇 参赛队员入场 部委领导致辞参赛队员代表及裁判员代表宣誓

01研究背景Eurofins Discovery是全球领先的早期药物研发服务平台，拥有超过40年的药物发现研究经验。作为业内领导者，Eurofins Discovery为研究者提供包括但不限于药物化学、合成化学、体外药理学、安全性药理学与功效、ADME-Tox（药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性研究）以及定制蛋白质和检测服务。Eurofins Discovery支持多种药物发现，如GPCRs（G蛋白偶联受体）、激酶、离子通道、核激素受体以及其他蛋白质和酶。在药物研发领域，GPCR家族因其在细胞信号传导中的重要作用而备受关注。近日，Eurofins Discovery团队利用前沿的生物物理技术--光谱位移（Spectral Shift, SpS），在属于GPCR家族的人类腺苷A2A受体（A2AR）上发现了新拮抗剂片段，为GPCR药物设计提供了新视角。与此同时，该研究也利用了来自NanoTemper公司专利的MST（微量热泳动）、TRIC（温度依赖的荧光强度变化）和nanoDSF技术设计GPCR配体。这项研究不仅为GPCR药物开发提供了新策略，也为基于片段药物发现设计（FBDD）带来了新「组合拳」！02技术亮点基于Eurofins Discovery片段文库和Eurofins CALIXAR专利的去垢剂，利用MST-TRIC和超灵敏光谱位移技术，可以在单剂量实验中，从2342个片段库快速筛选出826个片段，作为第一轮初步Hits筛选。之后，利用MST-TRIC和光谱位移技术进行第二轮Hits确认。利用Echo® MS声滴喷射技术，实现了在384孔板中的纳升级精确分配，确保了数据的稳健性。利用nanoDSF技术作为正交检测手段，进一步确认这些片段Hits的稳定性。最后进行A2AR与参考化合物和片段苗头化合物的分子对接研究（Docking Studies）。点击此处，解锁海报全文 Eurofins Discovery | 片段药物发现新「组合拳」 原创_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)03关于NanoTemperNanoTemper的愿景是致力于创造一个任何疾病都可以被治愈的世界！NanoTemper是全球领先的科学仪器制造商，2008年成立于德国慕尼黑，历经十余载发展，在全球13个国家设立分支机构。卓越的产品和优质的服务使NanoTemper成为全球成千上万的制药公司、学术研究机构及科技公司的首选合作伙伴。Dianthus 高通量筛选平台 可直接在溶液中检测亲和力，无需固定 检测一个Kd仅需1min 标准规格384孔板，单次运行可检测32个Kd 无微流控系统，无需清洗维护 专利技术加持：TRIC（温度依赖的荧光强度变化），Spectral Shift（光谱位移）PR Panta 蛋白稳定性分析仪 高数据质量，超高分辨率，多参数精准表征 天然条件下检测，无需染料标记 检测浓度范围广，低样品消耗量 可同时支持四大技术模块：nanoDSF，DLS，SLS，背反射

据物理学家组织网8月29日(北京时间)报道，美国能源部劳伦斯利弗莫尔国家实验室(LLNL)研究人员最近开发出一种核酸(DNA和RNA)快速扩增技术，使聚合酶链式反应(PCR)的速度大大加快，可在3分钟内将基因组片段扩增10亿倍，迅速识别出病原菌。疾病快速诊断有望很快成为现实。相关论文发表在最近出版的《分析师》杂志上。 　　PCR技术能让研究人员把一段DNA或RNA复制上百万副本，然后用于基因组测序、基因分析、遗传病诊断、亲子鉴定、法庭鉴定、确定疾病感染等。该过程一般需要1小时到几天时间。然而，快速诊断、应急反应或传染病监控往往要求PCR技术缩短到几分钟。 　　领导这项研究的工程师雷金纳德比尔和同事克服酶动力学和热动力学方面的限制，用多孔材料和绝热薄膜制造出一种设备，实现了极速热循环，能每秒钟加热或制冷45℃，一次热循环不超过2.5秒。比尔特别指出：“这种设备的独特之处还在于，它制冷的速度和加热一样快。” 　　开发出这种设备后，比尔和同事从10种商用酶中选出了2种，这2种酶的链式反应速度非常快，将一些参数略作调整，就能使反应更快。 　　他们用一种肠杆菌属的细菌测试了新的PCR设备迅速扩增DNA片段的能力，然后用一段严重急性呼吸道综合征(SARS)DNA片段演示了设备处理威胁公共健康病毒方面的效果。该设备完成对目标DNA30个周期(10亿倍)的PCR扩增，用时仅为2分18秒。 　　目前，研究小组正在开发一种实时探测设备。按照他们的设想，将来一台PCR仪器就能完成整个测试，从样本到结果只需10分钟。市场对这种设备的需求将是巨大的，除传统的公共卫生和医疗研究领域，一台简单实用的实时PCR设备在养殖、农业以及食品加工行业都非常有用，可用来保障食品安全。

p style=" text-align: justify " 　　你是否也遇到过类似的问题: /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 今天怎么这么背，每件事情都失算， br/ /p p style=" text-align: justify " 　　只想用机械打断法做个核酸样本片段化， /p p style=" text-align: justify " 　　却在转移时把样本混淆了， /p p style=" text-align: justify " 　　时间有限，样品不少，实验无法按预计完成…… /p p style=" text-align: justify " 　　谁能告诉我该怎么办? /p p style=" text-align: justify " 　　放弃曾经(或目前仍为)最主流的二代测序核酸样本片段化方法机械打断法,尝试更便捷、经济、高效的片段化方法新宠酶切法。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/26c8626e-26dc-4cc5-833a-02773eaef459.jpg" title=" 01.jpg" alt=" 01.jpg" width=" 392" height=" 259" style=" width: 392px height: 259px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 酶切片段化法相较机械打断法有何过人之处? /strong /p p style=" text-align: justify " 　　一步完成，无需样本转移，不会混淆样本 /p p style=" text-align: justify " 　　速度更快，需要手动操作的时间更少 /p p style=" text-align: justify " 　　样品损失少，产率高，文库质量更好、复杂度更高 /p p style=" text-align: justify " 　　硬件投入低甚至无需硬件投入 /p p style=" text-align: justify " 　　而相较于市面上其它品牌的酶切打断试剂盒，安捷伦最新推出的 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒则拥有更多亮点。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 1：在文库质量方面具有更高的覆盖率和复杂性 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒在新鲜冷冻和 FFPE 样品中表现出相同或更高的覆盖率(图 1)及更高的复杂性(图 2)。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/110508c1-d041-46cc-ac50-069662d70890.jpg" title=" 02.jpg" alt=" 02.jpg" width=" 501" height=" 319" style=" width: 501px height: 319px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 1. 与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可提供更好的 100x 碱基覆盖率。利用试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10 ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1(DIN =2.7，ddCq = 1)为子宫样品。FFPE 2 为喉肿瘤样品(DIN = 2.3，ddCq = 2)。 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/7778f9e4-5626-4585-af12-1d3ad8e516c8.jpg" title=" 03.jpg" alt=" 03.jpg" width=" 519" height=" 303" style=" width: 519px height: 303px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 2.与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可得到更高的文库复杂性( HS文库大小)。利用 SureSelect XT HS 和XT 低起始量酶切片段化试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1(DIN= 2.7，ddCq = 1)为子宫样品。FFPE2 为喉肿瘤样品( DIN = 2.3，ddCq = 2 )。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 2 ：简单化一的程序应对广泛样本类型与样本质量 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对各种 CG 含量样本、不同类型样本(血液、新鲜冷冻组织、FFPE样本等)，以及不同质量的样本。无需针对不同样本类型或样本质量修改或重新摸索最优程序。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/1a8fffd2-b9f6-454b-bba8-6fc2f505eac9.jpg" title=" 04.jpg" alt=" 04.jpg" width=" 459" height=" 300" style=" width: 459px height: 300px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 3. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对质量不同的 DNA 样品可产生相似的 DNA片段化模式。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 3：同一程序应对不同起始量样本，无需调校程序 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对从10ng – 200ng大跨度起始量的 DNA 样本。无需根据不同的起始 DNA 量优化和调整实验程序。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/3fb00c0a-8957-445a-933f-a46913a69307.jpg" title=" 05.jpg" alt=" 05.jpg" width=" 462" height=" 273" style=" width: 462px height: 273px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 4. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒针对各种 DNA 起始量，可产生高度一致的 DNA 片段谱。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 4：对 EDTA 的超强容忍度，无需额外纯化步骤 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对不同的 DNA 缓冲液条件不敏感，从而省略了其它酶剪切方法所需的纯化或中和步骤。分别保存在 Tris、0.1× TE(10 mmol/LTris、0.1 mmol/L EDTA，pH 7.5)和 1× TE(10 mmol/LTris、1 mmol/L EDTA，pH 7.5)中的 DNA 可以产生高度相似的 DNA 片段谱(图 5)。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/5ba1fb35-b470-4f7d-83fd-5786367d0796.jpg" title=" 06.jpg" alt=" 06.jpg" width=" 275" height=" 450" style=" width: 275px height: 450px " / /p p style=" text-align: justify " 　 span style=" font-size: 14px " 　图 5. SureSelectXT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可用于不同的 DNA 缓冲液，并显示了高度相似的 DNA 片段谱。将从新鲜冷冻组织中提取的 10ng DNA 作为起始样品，分别保存在 Tris、0.1× TE(和 1× TE中。将 DNA 样品进行剪切并用以下方法进行文库制备：A. SureSelectXT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒和 SureSelect XT HS 试剂盒。B. Kapa HyperPlus 试剂盒。B 图显示，保存在 1× TE 中且在没有活化溶液的情况下酶解的 DNA，观察到片段化受到完全抑制(橙色线)。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒的其它亮点还包括从低质量的 FFPE 样本中获得的假阳性数据的量更少，以及更少的 C 到 T 的突变。该试剂盒支持 SureSelect XT HS 和 SureSelect XT 低起始量建库试剂，实现快速的无需机械打断的文库构建。 /p

感谢大家一直以来对阿美特克关注和支持，翘首以盼，SEMICON CHINA 2021活动的视频终于新鲜出炉啦！让我们一起来回顾一下，从布展开始到活动收官的精彩片段吧~针对不同客户的需求，展会结束之后，3月30日~2月份2日，阿美特克举办了为期四天的网络直播，半导体专家介绍了阿美特克在半导体的行业解决方案，讲解如何破解半导体行业难题，实现加速发展。 以下为直播议题 今天，我们为大家整理了直播的精华部分，如果错过直播了或者想要加深了解，可以通过扫描以下二维码，直接进去直播间观看回访噢~ 温馨提示：阿美特克STC材料测试产品经理姜伟先生分享的“芯片、液晶面板等的力学强度检测”在4月2号主题为“光老化、力学强度、程控电源等测试方案”专场噢~

肝癌的发病率和死亡率在癌症中位居前列，全世界每年新增病例超过90万，死亡病例超80万。在所有肝癌病例中，肝细胞癌 (HCC)占比约90%，对肝细胞癌高危人群进行有效、高灵敏度的筛查显得尤为重要。目前对肝癌高危人群早筛的方法是肝脏超声检查和血清甲胎蛋白（AFP）监测，其筛查灵敏度从47%-84%不等，特异性在67%-90%之间。因此，当前急需开发灵敏、高效的非侵入性肝细胞癌筛查方法。　　近期，来自美国约翰霍普金斯大学的研究团队在《Cancer Discovery》上发表题为“Detecting liver cancer using cell-free DNA fragmentomes”的文章。该研究开发出一种基于血液的全基因组cfDNA片段化检测方法（DELFI），为HCC检测提供了一种高性能、具有成本效益的新选择。　　研究人员检测了501名训练队列个体的血浆样本，对cfDNA片段进行低覆盖率基因组测序，分析HCC患者中cfDNA的分子来源，并确定了与片段化变化相关的基因组和染色质特征。通过机器学习方法构建DELFI模型。结果显示，在平均风险人群中，DELFI模型对HCC检测的敏感性为88%，特异性为98%；在高危人群中，DELFI模型对HCC检测的敏感性为85%，特异性为80%。此外，研究人员将来自223名香港患者的全基因组序列数据作为验证队列进行检测。在验证队列中，DELFI模型可将AUC为0.97的HCC患者与高危个体区分开来，有效证明了模型的可靠性。　　该研究开发的全基因组cfDNA片段化特征检测方法对HCC具有高灵敏度和特异性，弥补了血清甲胎蛋白监测敏感性低、准确率差的不足，有望为肝癌高危人群提供可靠且具有成本效益的筛查方式。　　注：此研究成果摘自《Cancer Discovery》杂志，文章内容并不代表本网站的观点和立场，仅供参考。

p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" line-height: 1.5em " 　　光谱组是分析室的一个题目组，以样品的分析与剖析及相应分析仪器的研制为主体工作。在这些分析任务中，有轰动一时的“745”任务和“927”任务，也有无数鲜为人知，但又实实在在为国家解决问题的“小事情”。 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“745”任务由中国科学院大连化学物理研究所(以下简称大连化物所)数十人参加，夜以继日奋战数月取得了完整和准确的剖析结果，为获国家级特等奖的某项目奠定了基础。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　这是一个有各地区各行业人士参加的规模宏大的合作项目。就分析任务来说，每一项数据都至少有两个不同的实验室来测试。当时大连化物所由朱葆琳负责，组织了包括行政、工厂及各研究室多方人员参加的会战组。仅是负责人的会议，就将科技处大会议室挤得满满的。参与人员虽多，但人人都全力以赴、相互配合。每次去外地取样，保卫科同志都携枪同往。任务进行期间，大家除了睡觉几乎都在实验室工作。双职工无法去接孩子，托儿所的日托便自动成了长托。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　当时大部分分析工作由大连化物所与中科院长春应化所平行完成。但有一个传感器，要分析其中密封的气相与液相内容物。由于数量只有一个，无法分割，只由大连化物所承担，这就要保证万无一失。全所立即投入各方力量，在充分论证后，只用了很短的时间就制备出真空取样装置。由于此项目要求时间紧，又要充分保证数据的完备，有时候我们就得用非常规的办法。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　那是一个固体填充物的分析，其中有一个组分很难分离，这就无法定量。样品数量有限，不能反复试探。不过显微镜观察发现，该组分为球形颗粒。虽然粒度不均匀，但皆为球形。于是，我们用测量显微镜测量了样品若干截面上的圆截面面积，得到了该组分的定量数据。我们刚着手测量时，曾想测量尽可能多的截面，以得到更准确的结果。正在测量时，朱葆琳来了。当他听过我们的想法后，立即指出，从该固体填充物的应用目的看，该填充物中各组分的空间分布应是非常均匀的。从这点考虑，测准一个或少数几个截面就够了。我们测量了几个，之间的差别确实很小。老一代学术带头人坚实的理论与清晰的思维，给我们留下了深刻的印象。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　在我们的日常分析服务中，还有大量的“小事情”：它们有来自工厂和农村的技术关键问题，也有为法院审理民事和刑事案件提供证据，为公安机关侦破案件提供线索的分析工作。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　上世纪80年代初，某工厂欲进口一种只知其商品名的溶剂，外商要价相当于每吨25万元人民币。经我们分析确定，这是一种国内大量生产的廉价溶剂，售价仅为每吨2000元人民币，我们的数据使该厂节省了大笔开支，同时也提高了潜在的国际竞争能力。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　在日常的分析服务工作中，每一个数据似乎都很平常，但它们凝聚着我们的心血与执着。除了大量分析、剖析任务外，新的光谱分析方法的建立和新的专用光谱分析仪器的研制工作给我们留下的印象更加深刻。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　虽然当时大连化物所高浓度重水分离工艺的研究工作进展喜人，但是原来使用的重水浓度测定方法——浮沉子法操作太复杂、速度太慢。我们决定用红外光谱法解决这一问题。经过几个月的努力，我们建立起标准偏差小于0.003%的高浓度重水红外光谱测定法，一个样品的测定时间仅需几分钟，甚至可以连续测定。这为重水研究和生产提供了理想的分析方法。在此基础上，我们继续努力，研制出可在车间使用，可由工人操作的小型仪器。高浓度重水分析方法先后被当时的化工部和核工业部定为标准方法。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　记得1969年，当时液体火箭燃料氧化剂四氧化二氮(N sub 2 /sub O sub 4 /sub )的分析检测只有经典的元素分析法，所用的仪器用一辆大卡车都装不了，还得花费至少一周时间才能得出样品中的含水量(还是从测得的氢元素含量推算的)，因而数据不能很好地反映质量。为此，有关单位向我们提出解决液体N sub 2 /sub O sub 4 /sub 质量分析检测问题的任务。接受这一任务后，我们分三个阶段开展工作：第一阶段，使用各种手段全面分析样品中的杂质，确定其中有H sub 2 /sub O和HNO sub 3 /sub 两种杂质影响质量 第二阶段，用实验室光谱仪器建立液体N sub 2 /sub O sub 4 /sub 中微量HNO sub 3 /sub 和H sub 2 /sub O的近红外光谱测定法，方法快速简便，仅数分钟即能取得准确的结果 第三阶段，研制成功专用红外线分析仪。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　N sub 2 /sub O sub 4 /sub 是一种强氧化剂，又极易吸收水分，其吸收的水分，部分转化成HNO3和HNO2等强腐蚀性物质。它在低温时凝固，室温下蒸发成为毒性很强的NO2气体。因此，对此样品操作条件和操作技术要求很高。我们在完成这一任务的过程中，克服了许多困难，也遭受了许多身体伤害，常常让毒气呛得透不过气来，手指的皮肤总是被烧成黄色，衣服上出现一个个被腐蚀的窟窿，但没有人对此有怨言。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　对于我们研制的手提式专用红外线分析仪，使用单位都十分满意，本应迅速组织鉴定、投入生产、推广使用，但遗憾的是，委托单位坚持认为任务是他们提出的，成果应归属他们，大连化物所只是一个协作单位。由于这个原因，鉴定、投产、使用均被拖延下来。直至有关方面组织对贮运液体N sub 2 /sub O sub 4 /sub 的槽车列车性能进行全面考察、鉴定时，情况才有转机。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　记得那是1971年盛夏，某装备部的一位负责同志和N sub 2 /sub O sub 4 /sub 生产厂的军代表来找我们，告知液体N sub 2 /sub O sub 4 /sub 槽车列车性能考察、鉴定的事项。按鉴定要求，N sub 2 /sub O sub 4 /sub 装注入槽车前和运达后，必须准确测定其中的H sub 2 /sub O含量，有关单位用元素分析法测了一个多星期也没有得到可信的数据。一列专列、数十位鉴定组成员和N sub 2 /sub O sub 4 /sub 生产厂有关人员都在焦急地等待，急切地盼望大连化物所派人携带红外专用分析仪前往救急。受所领导的派遣，光谱组3位同志连夜乘火车赶赴N sub 2 /sub O sub 4 /sub 生产厂。次日到达后，未经休息立即取样分析，为大家提供了满意的测定结果。这促使仪器研制的委托单位不得不对此成果召开鉴定会，通过对此成果的鉴定，承认这是大连化物所的成果。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　对我们来讲，往事已成过去。每当看到尾部冒着棕黄色滚滚浓烟的火箭升天的时候，我们总因这里有我们的贡献而感到欣慰。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　作者简介： /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　车迅，男，1940年4月出生，1962年10月~2000年4月在中科院大连化物所工作，研究员。主要从事分析化学研究工作。现已退休。 /p p br/ /p

大家好，本周为大家分享一篇文章，Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates [1]，文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。　　抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物，它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷，以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上，给ADC带来了额外的异质性，增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用，与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比，TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而，对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质，TD-MS的断裂效率较低，获得的序列和药物偶联位点信息有限。　　为了增加TD-MS的序列信息含量，一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中，这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中，作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上，并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC，几乎60%的假定药物偶联位点被识别。　　内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域，因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法，并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖，例如，轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A)，重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B)，而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%，这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说，轻链的序列覆盖率从54%提高到83%，重链从28%提高到72%，合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著，这表明随着蛋白质分子量增大，分配内部片段变得更有价值。　　图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率，包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)　　图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z和by/cz片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率，序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键，浅灰色表示受二硫键约束的序列区域，橙色表示互补决定区域(cdr)。　　HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干，因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段，以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰，以表明它们的完整性。对于轻链，52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键，清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键，S - S键I和S - S键IV，被89个末端片段和9个内部片段穿过 而中间的两个二硫键，S−S键II和S−S键III，只有24个内部片段穿过，没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性，重要的是，中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外，分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时，额外分配了25个含有G0F的片段，42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段，这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。　　图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链，在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后，通过HCD TD-MS生成片段位置图。　　内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法，将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段，定位了3个偶联位点(K106, K114, K133)，并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述，对于完整的ADC，仅用末端片段确认了16个偶联位点，而在包含内部片段后，这一数字增加到52个，覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。　　图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。　　在这项工作中，作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域，显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息，包括二硫键模式和N糖基化，可以通过包含内部片段获得。最重要的是，内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates

2012年10月16-18日，慕尼黑上海分析生化展(Analytica China 2012)在上海新国际博览中心N1、N2馆顺利召开。东曹（上海）生物科技有限公司顺利参展，并推出若干色谱柱新品，受到新老客户的驻足关注。 此次展会上东曹公司推出了三款新上市的，针对抗体药物的多聚体、蛋白质片段分离分析的SEC色谱柱。新色谱柱将进一步提高对抗体药物前段多聚体、后端片段蛋白的分离效果，以满足生物制药的科研人员对于HPLC色谱柱的分辨率和分离选择性的更高要求。 色谱柱 特点和主要用途 TSKgel SuperSW mAb HR （4&mu m，7.8mmID X 30cm） 抗体二聚体、单体和片段的高分率分离分析 抗体药物的R&D物性评价及最终产品的品质管理 TSKgel SuperSW mAb HTP （4&mu m，4.6mmID X 15cm） 抗体二聚体和单体含量的超高速、短时间分离分析 抗体药物的筛选及最终产品的品质管理 TSKgel UltraSW Aggregate （3&mu m，7.8mmID X 30cm） 抗体多聚体（二聚体以上）的高分辨率分离分析 抗体原料药的R&D物性评价 东曹公司展台掠影

抗体是免疫系统中一类重要的蛋白质，它们通过特异性方式来结合抗原。这一特性使之在诊断、治疗、基础研究等方面具有巨大的价值。抗体由四条多肽链构成，两条重链和两条轻链，通过二硫键连接而成。它们通常被糖基化，其中羧基端区域高度保守，而氨基端区域在氨基酸序列上可变，从而产生抗体的特异性和多样性。 在一系列的酶切和化学处理下，抗体分子被裂解为各种片段，通过HPLC分离，结合电泳和质谱等手段，抗体的结构可被了解和鉴定。近日，赛分科技的科学家通过体积排阻色谱、离子交换色谱和反相色谱等多种技术实现抗体异构体、各种抗体碎片的高效分离，可对抗体结构进行可靠的鉴定和验证。此外，为抗体药物的质量控制也提供了有效的监控手段。 一、结构研究 体积排阻色谱法（Zenix&trade SEC） 抗体片段重链和轻链的分离 抗体片段Fc和Fab的分离 离子交换色谱法（Antibodix&trade WCX） 抗体片段Fc和Fab的离子交换色谱法分离 反相色谱法（Bio-C8） Column: Bio-C8 4.6 x 100 (3 &mu m, 300 Å , 4.6 x 100 mm) Mobile Phase A: 0.11% TFA in water Mobile Phase B: 0.09% TFA in ACN Flow: 0.5 mL/min Temperature: 75 oC Detection: UV 280 nm 抗体片段重链和轻链的反相色谱法分离 二、抗体异构体分析 Column: Antibodix&trade WCX NP5 4.6 x 250 mm Mobile phases: A: 20 mM sodium acetate, pH 5.15, B: A + 1 M LiCl Flow rate: 0.8 mL/min Detection: UV 280 nm. 单克隆抗体的稳定性分析 更多信息请参考：http://www.sepax-tech.com.cn/training/Antibody Solution Kit.pdf 关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry。本文的通讯作者是罗氏集团的Tilman Schlothauer和Feng Yang。　　治疗性单克隆抗体(mAb)分析中翻译后修饰(PTMs)的表征是一个主要的挑战，单个PTM通常采用bottom-up的方法进行分析，但PTM之间的关联性信息丢失 middle-down方法提供了分辨率、位点特异性和蛋白型异质性的良好平衡，其表征工作流程主要依赖于末端片段离子。内部片段离子的纳入提高了序列覆盖率和PTM分辨率，使其成为一种有前途的方法。先前，糖工程单克隆抗体的研究表明，一组有限的高甘露糖、乙酰氨基葡萄糖和糖基化蛋白型不同程度地影响了PTMs的敏感性质，如脱酰胺和氧化。Asn 325的脱酰胺是一种功能相关PTM，在传统bottom-up方法中由于其较短的肽段和较高的亲水性而经常被忽略，目前没有研究调查Asn 297糖型对Asn 325脱酰胺敏感性的影响。在这篇文章中，作者提出了一种纳入内部片段的middle-down工作流程，在糖型解析层面上评估mAb上Asn 325脱酰胺修饰。　　图1. 糖型解析的Asn 325脱酰胺的middle-down分析流程。(A) IdeS酶切后的Fc/2序列，及相关的糖基化(Asn 297)和脱酰胺(Asn 325)位点。(B)工作流程示意图，包括样品制备、RP-LC亚基分离、MS1电荷态选择、四极杆糖型分离、MS2内部片段搜索，以及基于提取的单同位素质量离子色谱(未修饰与修饰)的定量策略。　　图2. Asn 325脱酰胺鉴定中内部片段SNKAL的定性评价。未修饰(对照)、热应力样品(8w, 40°C)、HC Asn 325 Asp序列突变体的代表性MS2谱图叠加，以及修饰的内部片段离子SDKAL的模拟单同位素质量。*表示未修饰的SNKAL的+1同位素对修饰的SDKAL的单同位素具有足够的分辨率。　　本研究使用标准IgG1单抗(G1m17, Km3)和突变体(HC Asn 325 Asp)。对于热应激，标准单抗在40°C的配方缓冲液中孵育2、4和8周。在IdeS酶切之前，将10%的突变单抗插入标准单抗中，生成加标样品。抗体经IdeS酶切、还原后，用标准RPLC流程分析(图1B) 针对Asn 325脱酰胺位点周围的内部片段离子的覆盖率，作者对HCD碰撞能量和捕获气体参数进行了优化。共分配了覆盖Asn 325的7个内部片段离子，根据片段强度和定量精度，与bottom-up分析确定的目标脱酰胺值相比，选择SNKAL作为Asn 325的代表性特征离子。SNKAL对无应力对照组的特异性通过包含Asp 325的序列突变体(N325D)得到证实，该突变体在未修饰的Asn 325的单同位素质量处没有片段离子(图2)。因此，排除了其他片段离子的中性丢失引起的歧义或重叠。Asn 325对照、Asp 325突变体和分离的糖型(G0F、G1F、G2F)的MS2具有高度可比性。修饰后的单同位素质量和未修饰的Asn 325的第一个同位素之间获得了足够的分辨率(图2)。　　使用middle-down MS对所有糖型的相对脱酰胺评估与bottom-up分析确定的水平一致(图3)。与热应力持续时间无关，单个糖型(G0F、G1F和G2F)的middle-down脱酰胺评估没有显著差异(图4)。Asp 325突变体的插入实验证实了middle-down策略评估单个糖型脱酰胺水平差异的能力。由于未修饰的Asn 325单抗和Asp 325单抗之间的糖型相对丰度的差异，与总加标量(10%)相比，蛋白型(糖型% ×脱酰胺%)混合的比例不同。因此，在加标样品中，G0F的脱酰胺率低于10%，而由G1F和G2F的脱酰胺率高于10%(图4)。Middle-down脱酰胺评估的精度取决于糖型丰度和脱酰胺水平，单个样本的相对标准偏差范围为2.8%至16.4% (n = 9)，样本间中位相对标准偏差为7.4% (n = 16)。总蛋白型丰度和相对标准偏差显示出明显的相关性，并证明了middle-down方法的敏感性，允许在0.2%的相对丰度下评估蛋白型。　　图3. middle-down工作流程对Asn 325脱酰胺定量分析的能力评估。在2w、4w和8w热应力(40°C)下，应力样品bottom-up和middle-down(所有糖型)分析的相关性。数据点表示middle-down分析的技术重复的中位数(n = 9, 3天内重复3次)。误差条显示95%置信区间。CTRL显示n = 3时无应力样品的背景水平。　　图4. Asn 325脱酰胺的糖型解析水平的middle-down分析。从2w, 4w和8w热应力样品和10% Asp 325加标样品中提取所有糖型和分离糖型(G0F, G1F, G2F)的相对脱酰胺结果。技术重复的中位数和95%置信区间为n = 9时[G2F在2w (n = 4)和4w (n = 8)时除外]。ns =不显著。*表示假定值范围(* 0.05, ** 0.01, **** 0.0001)。　　本文引入了一种新的middle-down策略，通过利用HCD碎片的内部碎片离子来分析单克隆抗体Fc中的PTM动力学，将复杂性降低到Fc/2亚基水平，并保留了相关的蛋白质形态完整性，同时获得了bottom-up方法的分辨率和位点特异性，并成功地证明了IgG1抗体的Fc半乳糖基化变体不会影响热应激下Asn 325脱酰胺的程度。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Internal Fragment Ions from Higher Energy Collision Dissociation Enable the Glycoform-Resolved Asn325 Deamidation Assessment of Antibodies by Middle-Down Mass Spectrometry

光阴似箭，日月如梭。眨眼间，时间像一颗划过天际的流星，从我们的身边飞逝而去，“东西分析”（曾用名：东西电子）的三十年的历史就像一颗颗闪耀着光芒的流星一样，在夜空中不断书写着新的华丽的篇章。1988年12月，“东西分析”的前身“北京东西电子技术研究所”宣告诞生，到2002年“北京东西分析仪器有限公司”的又一成立。时至今日，“东西分析”进行了不断开拓创新，树立了国内知名品牌的良好口碑。这个发展的过程，都是由无数的历史片段组成。就让我们跟随几篇旧报纸，来回顾一下“东西分析”在自身的发展史中所做的努力和获得的成绩。图1 中国煤炭报图1是中国煤炭报经济周刊在1996年8月8日刊登的《第一批煤矿安全仪器装备定点生产单位记产品名单》，里面赫然写着北京东西电子技术研究所的三种产品：分别是煤矿专用气相色谱仪GC-4008，气相色谱仪GC-4001，煤自燃性测定仪ZRJ-1。这些产品都是用来监测煤矿，检测瓦斯气体及煤炭中易燃性气体的组份含量，以确保证煤矿安全生产和工人生命安全的质量过硬的产品。还获得过当时的中华人民共和国国煤炭工业部颁发的煤矿安全仪器定点生产企业证书（见图2）。图2 中国煤炭工业部 煤矿安全仪器定点生产企业到后来，“东西分析” 又发展衍生出来的更多先进的型号。值得骄傲的是，目前全国有95％以上的煤矿采用的是“东西分析”不同型号的煤矿专用气色谱仪。这些仪器在恶劣的环境下，依然保持良好的运行，时时监测着煤矿中的安全隐患（时时检测各种易燃易爆气体组分浓度变化），避免事故的发生。煤矿产品至今二十多年，没有由于仪器误报/不报而产生的一例死亡事故，挽救了千万矿工兄弟的生命！这是值得“东西分析”骄傲的一件事，但也是“东西分析”刻苦专研、辛勤付出的必然结果。图3 科学日报刊登采访东西分析文章图3是2001年2月27日 科学日报刊文：《不断创新是企业发展的根本－访北京东西电子技术研究所》的文章。文章中提到的“东西电子”在研发上投入很多资金。在人才选拔上侧重引进踏实肯干，能吃苦，具有有专研精神的技术人才。这是一个高新技术企业所必备的特质，特别是做科学仪器，分析仪器这样专业领域的企业。确实，东西分析在产品研发方面舍得投入，并且是将很大一部分利润投入到新产品研发上面。所以发展至今，我们会看到，在亚洲区域的分析仪器行业中，“东西分析”拥有非常全面的产品系列及众多型号产品，几乎全部都是拥有自主知识产权的产品。这也是公司不断引进和聚集各个领域的人才，才会有如此的成绩。文中还提到，“东西分析”当时制造液相色谱时遇到点问题，需要向上游企业购买品质较好的泵。但是该企业以泵只出口到国外为理由，拒绝提供该泵。这不得不逼着“东西分析”去自己投入大量的精力和资金去研发和生产液相色谱的泵。时至当今，绝大部分液相色谱的市场还是被国外仪器占据。其实国内很多产品并不差，主要是因为企业间缺乏各个专业的联合，所以导致不少产品技术发展较慢，国外产品和国内的产品才出现差距较大的情况。如果相关企业都能在各自强项专业相互合作，取长补短。那么国内分析仪器能加快缩小并追赶上进口高端产品的技术差距。图4 人民日报图4是2003年12月9日 人民日报在头版头条刊文：《广纳人才闯市场－记北京东西电子技术研究所》的文章。内容主要是关于“东西电子”凭借优良产品性能记良好的跟踪服务，赢得业内认识的一致认可，在各地质检、工商、卫生登政府部门采购中相继中标。重要的原因就是公司一直把吸引人才看作是企业发展的第一战略，重视人才、注重创新，使得“东西电子”在市场竞争中站稳脚跟，并且不断发张壮大。里面提到另一个问题，内国企业面临资金不足，又要把大量资金投入到研发中，很多时候都是有心无力，想要和国外产品竞争，并且最终胜出，国家的支持很重要。当今，分析仪器企业在发展过程中，国家和各地政府的支持很重要。相关的产业链上的企业、互联网企业、协会的支持也很重要。 分析仪器行业是一个资金密集型、技术密集型和人才密集型的企业，作为一个科技型企业，不断创新是企业发展的根本，只有不断的完善现有技术和产品，创新和创造新的技术和产品，企业的才能长久的生产并发展。 回顾历史，会让我们砥砺前行。更是为了激励我们，不断突破创新，达到新高度！纵观“东西分析”发展的部分历史片段，它代表了一个在分析仪器行业发展的一个缩影。在新一代人的带领下，“东西分析”已经站在新的起点上，并正在书写新的历史篇章。关于我们北京东西分析仪器有限公司，拥有三十年的分析仪器研发、制造、服务的历史，系北京市高新技术企业，分析仪器制造行业国际化企业。在行业内率先通过ISO9001国际质量体系认证，ISO14001环境管理体系认证，多个产品取得欧盟CE认证，系中华预防医学会卫检专用委员会产品信得过单位。“完美分析，辉映东西”。公司以科研技术实力为后盾，以质量管理为保证，以完善的售后服务为支撑，为用户提供高品质的分析仪器产品。

2011年4月19-21日，由中国药学会药物分析杂志主办，江苏省泰州市中国医药城、国药励展展览有限责任公司承办，江苏省食品药品检验所、泰州市食品药品监督管理局协办的“第二届全国药品质量分析论坛”在江苏省泰州市中国医药城召开，论坛主题为“药物分析与质量提高”，600多位来自全国药检系统、药品生产企业等单位的代表参会。中国食品药品检定研究院、中药民族药首席检定专家林瑞超研究员在大会上作了题为《中药分析与质量提高》的主题报告。本网编辑有幸聆听该报告，收获颇多，在此为网友们呈现相关内容。 林瑞超研究员作题为《中药分析与质量提高》的主题报告 　　就中药分析与质量控制发展简况而言，药分析和质量提高一直处于不断地规范化、标准化进程中，中药质量标准的建立经历了从无到有的发展过程，中药的质量控制不断飞跃，药物色谱分析、药物光谱分析及联用技术成为当前最为主要、最基本的研究方法和手段。 　　现行中药质量控制标准模式基本是沿着天然药物化学的发展，引发分析工作者建立以测定中药某一有效成份为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量控制标准的构想，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制模式，借助于文献报道选定某一中药的“有效成分”、“活性成分”或“指标成分”，建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。 　　目前，作为中药质量控制常规检验的分析方法，占主导地位的任然是TLC、HPLC、GC等，但如超临界流体色谱法、高效毛细管电泳法、分析生物学技术、新兴的光谱技术、联用技术和中药指纹图谱等新技术和新方法也将逐步进入常规中药分析和质量控制中，现将这些技术与方法及其在中药分析和质量控制中的应用简要介绍如下： 　　1、超临界流体萃取-超临界流体色谱(SFE-SFC) 　　超临界流体色谱法(SFC)是以超临界流体作为流动相的一种色谱技术，具有HPLC和GC的优点，能分离分析难挥发、遇热不稳定、HPLC难以检测的物质。SFC法较HPLC法而言，柱效较高且分离时间短 SFC法较GC法的应用更广，更实用。 　　目前SFC法主要在药物小分子手性分离方面的应用比较成熟，有望取代HPLC成为手性分析首选分析手段 在制备色谱方面，由于SFC以CO2为流动相，制备效率提高、成本下降，具有经济、实用、环保等优势。目前，SFC已经发展到联用技术，有SFC-MS联用，SFC-FTIR联用等。SFC不足之处是其分离原理目前尚无理论指导，有待进一步研究。 　　SFC现已用于对沙棘籽、复方酸枣仁汤、香椿子、温郁金等中药的分析。 　　2、高效毛细管电泳法(HPCE) 　　高效毛细管电泳法(HPCE)是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术，具有分离效率高、分析时间短、检测限低、进样量小、自动化程度高等优点，在中药有效成分分析、指纹图谱(特征图谱)的研究方面显示出显著的优势。 　　HPCE法在中药化学成分的分离、含量测定中已经有大量的应用，这些方法在中国、美国及英国药典附录均有收载。 　　HPCE目前在分析和质量控制中，主要用于对生物碱、黄酮类、香豆素、有机酸和各种苷类成份多肽蛋白的分析。采用的是毛细管区带电泳(CZE)和毛细管胶束电动色谱(MECC)模式进行分离分析。 　　3、分子生物技术 　　目前用于中药材鉴定的分子标记技术主要有两类：DNA指纹图谱技术和DNA测序技术。DNA指纹图谱技术主要是利用DNA分子酶切片段长度的多态性或DNA扩增片段长度的多态性来鉴别中药材，如AFLP、AP-PCR、RAPD和SSR等。DNA测序技术则选取特定的基因或DNA片段测序，根据对被测序列DNA分子核苷酸序列多态性的分析在分子系统学的基础上鉴定中药材，目前应用较多的DNA分析鉴定技术是ITS、5S DNA基因。 　　2010版《中国药典》新增采用了DNA分子鉴定技术鉴别蕲蛇、乌梢蛇蛇类药材及炮制品。 　　4、光谱技术 　　紫外光谱、红外光谱、核磁共振氢谱以及X射线衍射技术等鉴别中药材已有大量的研究，已经成为中药鉴定的新方法。 　　如系统鉴别各类植物中药材及复方的紫外光谱谱线组指纹分析系统，该方法简便、可操作性强 傅里叶变换红外光谱、傅里叶变换拉曼光谱技术广泛应用在中药分析和质量控制中，取得了一定进展 采用X射线衍射技术结合材料学中的物相分析，通过对谱峰的归属确定高含量的个别物质。目前利用衍射特征峰敏锐、指纹性强的特点，用X射线衍射技术可有效鉴别矿物类药材的质量。 　　5、色谱与光谱、波谱等联用技术 　　色谱与光谱、波谱等技术联用，取长补短，已成为分析复杂混合物尤其是定性分析中的重要手段，其中GC-MS、GC-FTIR、HPLC-MS、CE-MS、DNA分析鉴定技术、薄层-生物自显影技术等方法已经较多应用于中药制剂分析中。 　　HPLC-MS/MS可对十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱的分离鉴定，再从指纹图谱中选择4-5中指标成分(有效成分或特征成分)进行定量，是研究中药复杂体系尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。 　　LC-ESI(电喷雾)-MS/MS已广泛的应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定、复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等，已在药物分析和质量控制中得到了广泛的应用。 　　6、中药指纹图谱(中药特征图谱) 　　中药指纹图谱是一种创新型中药质量控制核心技术，它能够完整地表征中药复杂体系特征性，按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。 　　中药化学(成分)指纹图谱是指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的，用以表征中药化学成份特征的指纹图谱(特征图谱)。中药生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学指纹图谱、中药蛋白质组学指纹图谱。目前最常用的是中药色谱指纹图谱。 　　林瑞超研究员具体介绍了中药材西青果、中药注射剂肿节风注射液的指纹图谱检测。 　　中药分析与质量控制的新思路 　　随后，林瑞超研究员谈到了中药分析与质量控制的新思路。现代中药分析已不再是单一的检验手段，而是通过新技术、新方法的整合形成一种新的中药分析体系，以系统性、整体性、整合性为方向发展的中药分析方法。运用计算机对中药所含化学成分进行分类描述，目前主要有主成分分析(PCA)、简单分类计算法(SIMCA)、非线性映射(NLM)、人工神经网络(ANN)和模糊模式识别等，主要运用在以下几个方面： 　　1、中药分析对中药信息表达模式的改变 　　中药分析从原来的指标成分分析模式向基因指纹图谱定性和多指标成分定量分析结合模式转变，充分利用中药指纹图谱信息，并融合先进的分析方法，形成独特的中药分析控制新模式。 　　2、中药组分研制策略的改变 　　把中药多方面研制转变为药材配制、组分配制、成分配制三个过程进行研制。 　　3、药物效应风险模式的改变 　　由简单的理化检验转变为系统生物学的药效质量控制(化学-生物学)，把系统生物学、基因组学、蛋白组学等方法系统性研究，以整体表征与局面相结合的模式进行研究。 　　最后，林瑞超研究员对中药分析与质量控制模式的发展趋势进行了展望：一是高灵敏检测技术不断创新 二是高效率联用技术广泛应用 三是中药分析与质量提高指导原则将朝科学、合理、经济、实用、环保方向发展。林瑞超研究员还在报告结束之际发表呼吁，希望业内人士能给予中药分析研究以更多的关注和支持，一起促进我国中药分析研究事业的发展。

2018年10月31日至11月2日，两年一度的2018慕尼黑上海分析生化展（Analytica China）在上海新国际博览中心隆重召开！作为亚洲重要的分析、生化展览，环亚生物带着先进的技术和设备隆重亮相，通过此次展会，为参观者展示了前沿的实验室仪器及应用技术。 展会期间，环亚生物向参会人员展示了我司的通用产品线，包括Aplegen Lum化学发光、荧光成像系统、MaestroNano Pro超微量分光光度计、iTrack微孔板加样记录仪、UltraSlim 蓝光切胶仪，美国Galileo电泳系统，Pippin prep核酸片段回收系统。自动化设备产品线，包括Blue pippin自动化核酸片段回收仪，Prince自动化毛细管电泳分析仪，Blotcycler自动化免疫印迹杂交系统，iTWO微量超微量移液机器人。新引进的新产品iZERO非接触式微量超微量移液机器人，zenCELLowl细胞动态成像及分析系统，PermeaPAD生物仿生屏障系统，吸引了众多参会人员的关注。 开展即迎来了八方宾客，现场火爆，人群络绎不绝Innome厂家助阵 商务洽谈参会人员对zenCELLowl细胞动态成像及分析系统产生浓厚兴趣 为期三天的上海慕尼黑生化展落下帷幕，环亚生物多年来一直在努力，一步一个脚印，稳健发展，致力成为生命科学行业的信息传播者。期待，下一届的慕尼黑，环亚生物会给您带来更多的惊喜！

聚合酶链式反应（PCR）是用于扩增特定DNA片段的分子生物学实验技术。实时荧光定量PCR作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，已经广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等许多研究领域，为了获得最理想的检测结果，实时荧光定量PCR从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测的流程有许多可以优化的参数。直播时间：2022年7月7日下午3点直播亮点：1、荧光定量PCR的基本原理2、荧光定量PCR的体系优化3、荧光定量PCR常见问题分析主讲人：许雪琴，毕业于中国科学院大学，具有多年分子和细胞生物学实验经验。目前负责深蓝云生物科技荧光定量PCR、微滴芯片式数字PCR、Echo正倒置一体显微镜的技术支持工作。 扫描下方海报内二维码报名

仪器信息网讯 由国家自然科学基金委和中国化学会联合主办, 浙江省自然科学基金委、浙江省化学会协办，浙江大学承办的2012年全国微纳尺度生物分离分析学术会议、第七届全国微全分析系统学术会议暨第三届国际微流控分析(西湖)学术论坛(MICRO 2012)于2012年4月23-25日在杭州浙江大学紫金港校区召开。 　　本届会议历时3天，分设色谱分析、毛细管电泳、微纳分析、多相微流控、微纳反应器、微纳生化分析、细胞微流控微纳系统应用及微流控青年论坛共8个分会场，共80多个分会报告。来自全国高等院校、科研院所等单位的多位教授、学者分别就各论坛主题在学术研究及相关仪器研制和应用方面进行了报告，与会人员进行了热烈的交流。仪器信息网编辑从80个精彩报告中选取两个进行了重点关注。 报告人：东南大学 陆祖宏教授 报告题目：一种新的高通量DNA测序芯片的研制及应用研究 　　陆祖宏教授在报告中从五个方面讲解了“高通量DNA测序芯片的研制及应用研究”：新一代的DNA测序技术、AG100型DNA测序技术、高通量DNA测序芯片、AG100的应用实例、三代DNA测序技术展望。 　　陆祖宏教授在报告中说到，新一代DNA测序技术是近五年来发展最快、影响最大、竞争最为激烈的高技术研究领域之一，可同时对大量核酸片段进行并行测序，大幅度降了DNA测序的成本，这将会改变生物医学研究的方式，最终使临床医学产生变革。陆教授同时表示新一代DNA测序技术还不能满足生命科学与临床应用的需求，如成本高、测序速度慢、样品需要量大、测序误差较大、读长短等问题。针对这些问题，陆教授从方法和仪器两个方面进行研究，研制出AG100型DNA测序仪，其具有分辨率(高通量)高、荧光信号拍摄速度快、试剂消耗量小等优点。对DNA测序技术的展望，陆教授表示，探索基于分子器件的第三代单分子DNA测序技术将是未来DNA测序技术的研究方向之一。 报告人：北京大学 黄岩谊教授 报告题目：The application of deformable buttons on-chip 　　黄岩谊教授介绍了如何把一个小尺度的一个动态微阀结构用到芯片中，主要是研究分子与分子之间的相互作用的测量，以及一些不稳定的相互作用，从已经发表的或即将发表的四个方面研究进行了介绍，包括细胞动态迁移的定量研究等。 　　本次会议共有50个学者参加了墙报展览，与会人员参观学习并参与评选“方肇伦优秀青年学者报展奖”和“优秀报展奖”，评选结果将在会议闭幕式上宣布。 与会人员参观墙报展 　　附录：大会会议议程及报展目录.pdf

流动分析技术是20世纪50年代开发的一种湿化学分析技术，该技术自动化程度高，可批量检测样品，解放了劳动力，提高了工作效率，且具有检出限低、重现性好、分析速度快等特点，已广泛应用于环保、水质、烟草、质检及医学检验等行业，测试项目包括总氰化物、氰化物、挥发酚、阴离子表面活性剂、磷酸盐、总磷、总氮、氨氮、硫化物、六价铬、硝酸盐、亚硝酸盐、COD（Mn）、尿素等。目前主流的流动分析技术有两种，即连续流动分析技术(CFA)和流动注射分析技术(FIA)。2023年10月即将实施的生活饮用水标准检验方法GB/T 5750.4-2023中把感官性状和物理指标中的挥发酚类、阴离子合成洗涤剂指标规定了连续流动分析法和流动注射分析法；GB/T 5750.5-2023中无机非金属指标中的氰化物和氨（以N计）规定了连续流动和流动注射分析法。下面小编整理了生活饮用水标准检验方法中涉及到流动分析技术的标准，供大家参考。GB/T 5750.4-2023挥发酚-流动注射法原理：样品通过流动注射分析仪被带入连续流动的载液流中，与磷酸混合后进行在线蒸馏；含有挥发酚类的蒸馏液与连续流动的4-氨基安替比林及铁氰化钾混合，挥发酚类被铁氰化物氧化生成醌物质，在与4-氨基安替比林反应生成红色物质，于波长500nm处进行比色实验。仪器设备：流动注射分析仪：挥发酚反应单元和模块、500nm比色检测器、自动进样器、多通道蠕动泵、数据处理系统。仪器参考条件：自动进样器蠕动泵加热蒸馏装置流路系统数据处理系统初始化正常转速设为35r/min，转动平稳加热温度稳定于150℃±1℃无泄漏、试剂流动平稳基线平直GB/T 5750.4-2023挥发酚-连续流动法原理：连续流动分析仪是利用连续流，通过蠕动泵将样品和试剂泵入分析模块中混合、反应，并泵入气泡将流体分割成片段，使反应达到完全的稳态，然后进入流通检测池进行分析测定。在酸化条件下，样品通过在线蒸馏，释放出酚在有碱性铁氰化钾氧化剂存在的溶液中，与4-氨基安替比林反应，生成红色的络合物，然后进入50mm流通池中在505nm处进行比色实验。 仪器设备：连续流动分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、挥发酚反应单元和蒸馏模块、比色检测器、数据处理系统。仪器参考条件：进样速率进样：清洗比加热蒸馏装置流路系统数据处理系统30个样品/h2：1加热温度稳定于145℃±2℃无泄漏，气泡规则，试剂流动平稳基线平直GB/T 5750.4-2023挥发酚-连续流动法原理：连续流动分析仪是利用连续流，通过蠕动泵将样品和试剂泵入分析模块中混合、反应，并泵入气泡将流体分割成片段，使反应达到完全的稳态，然后进入流通检测池进行分析测定。在酸化条件下，样品通过在线蒸馏，释放出酚在有碱性铁氰化钾氧化剂存在的溶液中，与4-氨基安替比林反应，生成红色的络合物，然后进入50mm流通池中在505nm处进行比色实验。仪器设备：连续流动分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、挥发酚反应单元和蒸馏模块、比色检测器、数据处理系统。仪器参考条件：进样速率进样：清洗比加热蒸馏装置流路系统数据处理系统30个样品/h2：1加热温度稳定于145℃±2℃无泄漏，气泡规则，试剂流动平稳基线平直GB/T 5750.4-2023阴离子洗涤剂-流动注射法原理：通过注人阀将样品注人到一个连续流动载流、无空气间隔的封闭反应模块中,载流携带样品中的阴离子合成洗涤剂与碱性亚甲基蓝溶液混合反应成离子络合物，该离子络合物可被三氯甲烷萃取，通过萃取模块分离有机相和水相。包含离子络合物的三氯甲烷再与酸性亚甲基蓝溶液混合，反萃取洗涤三氯甲烷，再次通过萃取模块分离有机相和水相。于波长 650 m 处对包含离子络合物的三氯甲烷进行比色分析，有机相的蓝色强度与阴离子合成洗涤剂的质量浓度成正比。仪器设备：流动注射分析仪：阴离子合成洗涤剂反应单元和模块、10mm比色池、650nm滤光片、自动进样器、多通道蠕动泵、数据处理系统。仪器参考测试参数：周期时间洗针时间注射时间进样时间出峰时间进载时间到阀时间峰宽200s50s50s80s100s80s80s180s注：不同品牌或型号仪器的测试参数有所不同，可根据实际情况进行调整。GB/T 5750.4-2023阴离子洗涤剂-连续流动法原理：在水溶液中，阴离子合成洗涤剂和亚甲基蓝反应生成蓝色络合物，统称为亚甲基蓝活性物质，该化合物被取到三氯甲烷中并由相分离器分离，三氯甲烷相被酸性亚甲基蓝洗涤以除去干扰物质并在第二个相分离器中被再次分离。其色度与浓度成正比，在650/660 nm处用 10 mm比色池测量其信号值。仪器设备：连续流动分析仪：自动进样器、阴离子合成洗涤剂分析单元(即化学反应模块，由相分离器、多道蠕动泵、歧管、泵管、混合反应圈等组成)、检测单元(检测单元可配备 10 mm 比色池、阴离子合成涤剂检测配备 650/660 nm 滤光片)数据处单元及相应附件。GB/T 5750.5-2023氰化物-流动注射法原理： 在pH为4左右的弱酸条件下，水中氰化物经流动注射分析仪进行在线蒸馏，通过膜分离器分离，然后用连续流动的氢氧化钠溶液吸收；含有乙酸锌的酒石酸作为蒸馏试剂，使氰化铁沉淀，去除铁氰化物或亚铁氰化物的干扰，非化合态的氰在pH数据处理系统初始化正常转速设为35r/min，转动平稳蒸馏部分稳定于120℃±1℃显色部分稳定于60℃±1℃无泄漏、试剂流动平稳基线平直GB/T 5750.5-2023氰化物-连续流动法原理：连续流动分析仪是利用连续流，通过蠕动泵将样品和试剂泵入分析模块中混合、反应，并泵入气泡将流体分割成片段，使反应达到完全的稳态，然后进入流通检测池进行分析测定。在酸性条件下，样品通过在线蒸馏，释放出的氰化氢被碱性缓冲液吸收变成氰离子，然后与氯胺-T反应转化成氯化氰，再与异烟酸-吡唑啉酮反应生成蓝色络合物，最后进入比色池于630 nm波长下比色测定。仪器设备：连续流动分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、氰化物反应单元和蒸馏模块、比色检测器、数据处理系统。仪器参考条件：进样速率进样：清洗比加热蒸馏装置流路系统数据处理系统30个样品/h2：1加热温度稳定于125℃±2℃无泄漏，气泡规则，试剂流动平稳基线平直GB/T 5750.5-2023氨（以N计）-流动注射法原理：在碱性介质中，水样中的氨、铵离子与二氯异氰尿酸钠溶液释放出的次氯酸根反应，生成氯胺。在50℃~60℃的条件下，以亚硝基铁氰化钠作为催化剂，氯胺与水杨酸钠反应形成蓝绿色络合物，在660 nm波长下比色测定。仪器设备：流动注射分析仪：氨反应单元和模块、660nm比色检测器、自动进样器、多通道蠕动泵、数据处理系统、在线蒸馏模块（选配）。仪器参考条件：调整流路系统，载流、缓冲溶液、水杨酸钠溶液、亚硝基铁氰化钠溶液及二氯异氰尿酸钠溶液分别在蠕动泵的推动下进入仪器，流路系统中的试剂流动平稳，无泄漏现象。GB/T 5750.5-2023氨（以N计）-连续流动法原理：在碱性介质中，水样中的氨、铵离子与二氯异氰尿酸钠溶液释放出的次氯酸根反应，生成氯胺。在37℃~40℃的条件下，以亚硝基铁氰化钠作为催化剂，氯胺与水杨酸钠反应形成蓝绿色络合物，在660 nm波长下比色测定。仪器设备：连续流动分析仪：氨反应单元和模块、660nm比色检测器、自动进样器、多通道蠕动泵、数据处理系统、在线蒸馏模块（选配）。仪器参考条件：调整流路系统，载流、缓冲溶液、水杨酸钠溶液、亚硝基铁氰化钠溶液及二氯异氰尿酸钠溶液分别在蠕动泵的推动下进入仪器，流路系统中的试剂流动平稳，无泄漏现象。

上海光谱仪器有限公司采取与科研单位产、学、研结合方式, 积极开展基于本公司新产品为技术平台的新技术的应用研究工作。 由上海市科委资助，华东师范大学承担的《激光诱导荧光微芯片电泳仪的应用方法研究》（项目编号：08142201400）项目是基于上海光谱SP-800MCE微流控生化分析仪，通过研究建立了对&Phi × 174-HaeⅢ digest DNA Marker和p53两种特征基因片段进行电泳快速分离测定的方法，对特征DNA片段的检出限达到1ng/ml，能够满足PCR预处理后特征基因和突变基因分离检测的技术要求。近日，该项目通过了上海市科委组织的验收，研究的的方法以及产品技术平台得到了与会专家的一致好评。 上海光谱SP-800MCE微流控生化分析仪，采用正交光路系统的激光诱导荧光检测技术，与传统共焦光路系统相比具有结构简单、灵敏度高的特点，适合仪器小型化的要求；仪器独特的微米级芯片精确定位技术（发明专利号ZL200610025730.2），保证了测试通道的精确定位，方便仪器使用操作，同时保证仪器的检测灵敏度；上海光谱SP-800MCE微流控生化分析仪可广泛应用于核酸、氨基酸、多肽和蛋白质等不同分析对象的分析，为生命科学科研工作提供了良好的研发平台。 上海光谱仪器有限公司目前还在与复旦大学、同济大学等大专院校、科研院所积极合作，对SP-800MCE微流控生化分析仪做进一步的更广泛的应用开发。为未来推广微流控实用技术作基础准备工作。 本次BCEIA展会，上海光谱也展出了SP-800MCE微流控生化分析仪，欢迎从事这项工作的专家来展台指教和交流。

Creoptix公司，光学生物传感器的领军企业，2022年加入马尔文帕纳科，拥有专利的光栅耦合干涉（GCI）技术，开创新一代动力学，实现了在更广泛的样品范围内提供更高质量的分子结合亲和力数据和动力学数据具备先进的GCI技术的WAVE系列分子互作分析仪，究竟能为生物开发领域带来什么样的支持呢？他和传统的分子互作技术相比又有哪些差异和优势呢？本文将针对以上问题予以解答。1关于光栅耦合干涉技术（GCI）光栅耦合干涉技术（Grating-Coupled Interferometry, GCI）是一种近年发展起来的具有极高灵敏度的基于芯片的非标记生物传感器技术，它区别于依赖荧光和免疫等标记分子的传统分子间相互作用技术。通过一次GCI实验，用户可以快速、准确、可靠的获取一整套描述分子间相互作用的信息，包括并不限于结合有无、结合特异性、描述结合强弱的亲和力KD或键合常数KA、描述结合快慢与稳定性的动力学常数（结合速率常数ka与解离速率常数kd）、样品活性浓度、分子间结合机制以及理论热力学信息（范德霍夫焓变）等。GCI技术的商业化产品是Creoptix WAVE系列（2022年初被马尔文帕纳科收购作为旗下Label-Free分子互作分析平台的一员）。 GCI技术具有高灵敏度、分析物的分子量无下限以及捕获快速解离动力学等优势，改进了基于片段的小分子筛选和动力学分析，与无堵塞的流路集成芯片配合使用，加速了药物开发的过程。图1 光栅耦合干涉技术（GCI）示意图2弱相互作用也能得到很好的数据在基于片段的筛选中发现的弱结合物通常是根据亲和力而不是动力学进行排名的，因为它们的解离速率常数kd非常快，这是传统的SPR仪器无法解决的问题。然而，由于具有超快速的流路切换时间，Creoptix WAVE系统可以提供出色的分辨率，在高达10 s-1的解离速率下仍然能够可靠地确定动力学，提供了一个多功能的片段药物筛选和分析平台。使用4PCZ WAVE芯片固定淀粉样纤维蛋白（Amyloid Fibrils），小分子硫黄素（ThT，319 Da）以4种浓度（50 mM ~ 6.25 mM）注入，拟合后显示出10 s-1左右的解离速率常数。图2 淀粉样纤维蛋白与硫黄素的结合分析下图为在PCP WAVE芯片上捕获的6-mer寡核苷酸（1.7 kDa）与其互补的ssDNA结合的传感图，拟合后显示出10 s-1左右的解离速率常数。图3 寡核苷酸与其互补的ssDNA的结合分析3创新的waveRAPID技术加快药物发现的早期阶段对于更快地将新药送到患者手中至关重要。为了满足用户需求，Creoptix推出了测量动力学的新方法。在传统的动力学实验中，分析物以不断增加的浓度被注入，每次注射的持续时间一样。然而，Creoptix创新的waveRAPID （Repeated Analyte Pulses of Increasing Duration）技术通过以不同时长注入单一浓度的分析物，不断增加在芯片表面的脉冲时间来进行动力学分析，该方法免去了浓度梯度的稀释步骤，大大减少了人为稀释误差和实验前的准备时间。图4 waveRAPID与传统动力学的方法比较用waveRAPID和传统的多循环动力学测量小分子化合物FUR（分析物）与碳酸酐酶CAII（配体）的结合。使用WAVEcontrol软件的“Direct Kinetics”分析，两种方法都能提供高度一致的结果。图5 waveRAPID与传统动力学的数据比较使用waveRAPID技术，在18小时内完成了对90个小分子的动力学分析，图中显示的结果为筛选过的具有低统计学误差的速率常数，突出展示了三种不同结合强度的相互作用的传感图和拟合图。图6 小分子药物苗头化合物的waveRAPID动力学筛选结论Conclusion通过Creoptix WAVE所提供的亲和力和动力学信息能够表征药物结合的详细动力学机制，为开发具有高选择性的药物提供了理论基础，使得未来药物设计中的计算和实验更加合理化。提高通量是药物发现过程中经常提到的需求，使用waveRAPID技术大大缩短了总测量时间，在药物发现领域得到了广泛应用。参考文献[1] Kartal O, Andres F, Lai MP, et al. waveRAPID-A Robust Assay for High-Throughput Kinetic Screens withthe Creoptix WAVEsystem. SLAS Discov. 2021 26(8): 995-1003.[2] FitzGerald EA, Butko MT, Boronat P, et al. Discovery of fragments inducing conformational effects in dynamicproteins using a second-harmonic generation biosensor. RSC Adv. 2021 11(13): 7527-7537.相关产品WAVE 分子相互作用分析仪WAVE分子相互作用分析仪拥有基于光栅耦合干涉技术（GCI）的光学生物传感器，且具有创新性的微流控技术，实现了在更广泛的样品范围内提供更高质量的分子结合亲和力数据和动力学数据，帮助药物和生物科学研究人员加快新药发现和开发的进程。与传统动力学分子互作分析技术相比具有如下优势：无需配置浓度梯度样品10倍于传统分子互作技术分析速度超高灵敏度，捕获快速动力学微流控技术，不堵塞流路点击下载产品手册马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的最近技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如最大程度地提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间。

多重分析，即在单个反应中检测多个靶标，可以帮助用户节省宝贵的样品，并节省时间、试剂和成本。此外，和做多次单重实验相比，由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测，使得样品和试剂的移液操作误差减少，因此多重检测可以提高定量精度。naica® 微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和精准。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测，从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件，可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。评估引物和探针性能的实验指南1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix，该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica® 微滴芯片数字PCR系统的实验数据。2.单重反应测试。在进行多重反应之前，每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如，对于三重分析，在多重反应混合进行之前，首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时，预期结果只出现单一阳性。3.为了优化多重分析性能，样品性质也是十分重要的因素(例如，游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段，分析游离DNA需要设计成短片段DNA，分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的抑制剂。如果样品材料稀少或不容易获得，可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。5. 评估每个单重反应的退火温度范围，在最佳反应温度下，阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准，用于确定所有探针的最佳退火温度。如果单重反应没有被很好地优化，可能会出现明显的非特异性扩增。此外，非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下，可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增，如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。▲图1 ：Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图，在60°C到65°C退火温度内， 蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的最佳退火温度。可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的最佳退火温度。(带*数字为可分性评分)▲图2 ：可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是由Crystal Miner软件自动计算，并可以在高级QC标签栏下找到。6.在选定的退火温度下，使用所有引物和探针进行多重naica® 微滴芯片数字PCR系统，并以区分度为指导，评估反应性能。如果有需要，可从以下几点优化:★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始，并增加循环数，以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。★ 调整引物和探针浓度——naica® 微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)浓度不断增加时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分，及在低引物探针浓度的选择标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)★ 使用修饰的碱基，如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB)，以提高探针的Tm值，同时保持较短的长度(可能20nt)。然而，在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个，以避免扩增减少。7.评价引物和探针的相互作用：在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在最低。二聚体是可以评估的，相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此，多重分析时，建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加浓度至1 uM(例如，提高扩增效率)。▲图4：引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，红框)。当使用反向引物RI target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。当使用正向引物F1 target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，FI target 2应被选择用于多重检测。8.对于多重分析，荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照，Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。有关荧光溢出的更详细描述,请访问https://www.gene-pi.com/item/spill-over-2/。执行荧光溢出补偿的操作说明请参考Crysta Miner软件用户手册。naica® 微滴芯片数字PCR系统naica® 微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行绝对定量。2.5小时内，可快速获得结果。

前言聚合酶链式反应（PCR）是用于扩增特定DNA片段的分子生物学实验技术。实时荧光定量PCR（以下简称qPCR）作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，已经广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等许多研究领域，为了获得最理想的检测结果，qPCR从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测的流程有许多可以优化的参数。qPCR实验的工作流程首先需要确定研究的目的，根据实验设计规划好实验分组、重复次数等细节。接下来分为样本准备和引物探针验证两个重要的步骤。样本准备主要是核酸提取逆转录等步骤，引物探针需要去测试特异性和效率。接下来需要使用qPCR仪来对样品中的目的核酸进行扩增qPCR结束后根据实验目的对目的核酸进行相对或者绝对定量。接下来讲的qPCR体系优化会围绕着这个流程展开。1.样本的采集与处理首先，提前做好功课，了解样本的不同分型，或者了解详细的细胞分群。如果条件允许尽可能覆盖所有的组织类型或者细胞类型。其次，尽可能增加样本数量，也就是生物学重复，从而更客观地反映生物变异程度。另外，qPCR实验也需要有技术重复来降低误差。采样是需要严格规划的过程，比如材料的时效性、珍贵程度等，都要纳入考量范围。样品要尽量新鲜，取样尽可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不马上提取核酸，需要-80°C保存，并尽快处理。2.核酸的提取和检测模板的质量直接影响到检测性能。核酸提取需要有效地将RNA或DNA从其他混合物中分离。RNA样本中的污染物——基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在提取RNA过程中引入的外源杂质(如手套中的粉末)——都已被证明会抑制下游实验，如逆转录和PCR扩增。核酸提取需要使用无菌无酶的试剂耗材，避免RNase或DNase污染，并对内源RNAse或DNAse进行有效抑制；多糖多酚样品要考虑多糖多酚杂质的有效去除。低温保存防止RNA或DNA降解。降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率，降低产量。部分降解的RNA可能不能给出准确的基因表达结果。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。可采用高分辨率琼脂糖凝胶检测核酸质量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）检测核酸纯度和浓度。3.cDNA合成RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要影响。并且RNA 很脆弱，容易降解。为了保证 RNA 的完整性，我们需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入 RNase 抑制剂也能有效防止 RNA 降解。如何评价样品中的杂质对逆转录的影响呢？可以梯度稀释后绘制标准曲线，如果低浓度的样品点数值偏大比较明显，基本可以判定杂质影响显著。不同厂家的反转录试剂会有差异，对RNA中的杂质耐受程度也不同。逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少 RNA 的二级结构，增加逆转录的效率。除了掌握 RNA 的完整性之外，反转录之前还需要对 RNA 浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议 total RNA 上样量小于 5 μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性 (表达丰度高的基因优先被反转录) 而造成定量结果不准确。逆转录出来的cDNA可以直接放在4°C保存，若长期不用，可分装，然后-20°C保存。4.qPCR方法的建立① 定量方法绝对定量：检测起始模板数的精确拷贝数，需要标准品构建标准曲线。标准品可以是纯化的基因组DNA、质粒DNA或者体外转录RNA(cDNA)，其作用是生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系。标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%，与样品的性质尽可能接近，与样品相同的扩增条件（PCR体系、耗材、同一次扩增），大于或等于5个梯度稀释的标准品。相对定量：在一个样本中，目的基因相对于内参基因的量的变化。内参基因选择建议筛选不少于三个内参基因来归一化RT-qPCR数据。目的是消除外部样品偏差，例如总RNA含量，RNA稳定性，酶效率或样品装载量的变化。对候选的内参基因进行qPCR 实验，得出Ct平均值以及 Ct值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。可通过geNorm 、 BestKeeper 、 NormFinder、RefGenes 等工具来评估您的内参基因。② 荧光标记方法染料法：利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量。TaqMan荧光探针：是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5' 末端，而淬灭剂则在3' 末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时, Tag酶的5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。引物探针设计可以参考Gene π网站：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/③ 引物扩增效率验证标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。最常用的是10倍梯度稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。④ 反应体系优化▶ 根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂。▶ 每对引物先进行预实验，确定特异性以及最适浓度。▶ 配置不同的PCR反应体系，选择每个组分合适的浓度。▶ 设置温度梯度测试引物最合适的退火温度。▶ 实验设置NTC、NRT、 NEG和POS等对照组，来监控实验体系或污染。实时荧光定量PCR常见问题分析1.可疑的扩增曲线真正的扩增曲线，有特征的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。如果不是同时具有特征性的三个增长阶段，没有典型的指数增长期，那就不存在扩增。平台期很低也是常见的异常扩增曲线。可能是模板的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系中会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。这种情况可通过调整引物和模板的比例。2.异常的荧光信号NTC出现荧光信号---引物二聚体形成或气溶胶污染，查看熔解曲线是否为单一峰。3.扩增效率过高或过低过低的扩增效率（ 110％）可能存在的原因：▶ 移液器校准不良或移液技术差。▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。▶ 引物二聚体或非特异性扩增。▶ 标准曲线动态范围太小。▶ 基因组DNA污染。4.重复性差为精确定量，对每个样品都要做重复实验，复孔之间的Ct值不应超过0.5，标准偏差不大于0.2，这样，实验结果就有很好的精确度。造成重复性差的原因：▶ 加样误差（操作或者加样器导致）。▶ 没有将试剂和样品充分混匀。▶ 低拷贝的目的片段→泊松分布。▶ 基线阈值设定不合理。Cielo™ 实时荧光定量PCR系统Harness of the power of qPCR☑ 数据可靠性：连续1000次实验后，结果高度一致。☑ 应用灵活性：提供多种qPCR应用分析。☑ 流程智能化：中英文用户界面，触控操作，可多机联用。☑ 在线便捷性：主机可独立运行qPCR程序，数据可USB、Wi-Fi等网络传输。

安捷伦科技公司市场领先的CGH分析方法获得专利授权 高分辨率拷贝数变异分析令临床研究人员如虎添翼 2012 年 8 月 20 日，北京&mdash &mdash 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）日前宣布，其比较基因组杂交(CGH)方法已经获得专利授权。CGH 方法能够帮助基础研究人员和临床研究人员对基因组学和癌症进行深入研究。 美国专利（授权专利号 8,232,055）获得基因组 DNA 拷贝数变化分析方法的专利保护，专利内容包括使用寡核苷酸探针和序列高度复杂的样品（如人基因组 DNA 样品）进行单色和双色分析。 安捷伦的拷贝数分析方法于 2005 年推向市场，其使用长的寡核苷酸探针，因而具有高特异性和灵敏度。例如，使用安捷伦的拷贝数方法能够可靠地分析仅含有 8% 异常细胞的样品中的染色体拷贝数变化。 该分析方法最初开发旨在改善以往老的分析方法的分辨率，例如使用细菌人工染色体(BAC)等较长基因组片段的拷贝数分析方法。（因为序列长度的关系，BAC 探针通常含有高度重复区域。）该分析方法还能改善其他寡核苷酸序列分析结果的完整性，因为其他分析方法所依赖的样品制备方法往往会去除某些基因组 DNA 中重要区段。安捷伦高分辨率平台能够帮助用户全面检测复杂基因组中更小的基因组畸变。 安捷伦副总裁基因组学总经理 Robert Schueren 说：&ldquo 安捷伦市场领先的 CGH 分析方法获得了知识产权保护，我们为此相当兴奋。这一专利授权也再次证明安捷伦对细胞遗传学临床研究领域的持续投入和关注。&rdquo 安捷伦产品在基因组学领域的应用 安捷伦科技公司是下一代测序技术靶向序列捕获和基因组学芯片的全球领导者。安捷伦 SureSelect 和 HaloPlex 靶向序列捕获系统能够帮助研究人员轻松选择测序的目标基因组片段，从而节省了全基因组测序所花费的时间和金钱。HaloPlex 系统具有&ldquo 1天完成从样品制备至测序结果&rdquo 的快速工作流程，非常适合于下一代台式测序仪；而 SureSelect 系统能够在一个反应对中准确捕获全部的外显子和甲基化组，可以和高通量测序系统完美匹配。这两大系统，仅仅是源自安捷伦在合成复杂定制的长寡核苷酸混合物方面的制造专长的两种代表性产品。其他基于此项核心技术的产品线，还包括用于全基因组基因表达谱和比较基因组杂交分析的芯片产品，以及 SureFISH 试剂，它是一种用于寡核苷酸荧光原位杂交(FISH)的的高特异性、高灵敏度产品系列。除了寡核苷酸类产品之外，安捷伦还提供用于样品质量控制的微流体生物分析仪器，以及用于基因组实验的全套试剂、硬件、分析流程和生物信息学软件。 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是化学分析、生命科学、电子和通信领域的技术领导者。公司的 20,000 名员工为 100 多个国家的客户提供服务。在 2011 财政年度，安捷伦的业务净收入为66 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn。

随着以单克隆抗体及ADC药物为主的抗体药物的广泛应用，为保证药品质量并提高稳定性，对各种杂质、结构变体、修饰体的分析表征日益重要。2018年9月27日，为加强生物制药分析表征领域的技术交流，东曹(上海)生物科技有限公司在京举办 “2018东曹色谱分离技术研讨会”。会议邀请津本浩平、山崎洋介、田中亨3位海外专家做学术报告，分享他们在药物研发领域的研究成果。 2018东曹色谱分离技术研讨会现场东京大学教授 津本浩平　　Fc受体(FcR)为特异亲和免疫球蛋白(Ig) Fc片段的细胞表面分子，广泛表达于免疫辅助细胞和效应细胞，在机体免疫调节中起关键作用，为治疗过敏和自身免疫性疾病提供了理想的药物靶标。近日，东曹公司开发了两种基于Fcγ RI(Type-I,CD64)和Fcγ R III(Type- III，CD16)的新型配体，用于抗体的亲和纯化。津本浩平教授在报告中总结了配体与Fcs相互作用的研究进展，并揭示了FcR配体在下一代抗体药物开发中的应用。东曹生命科学研究所主任研究员 田中亨　　TSKgel FcR-IIIA-NPR是东曹最新研发的一款亲和色谱分析柱，采用5μm无孔树脂为基质，搭配修饰重组Fcγ-IIIA配体，结合除IgG2外的含Fc免疫球蛋白，实现糖型和单克隆抗体的快速、高效分析。据田中亨介绍，TSKgel FcR-IIIA-NPR为单克隆抗体的结构及活性分析提供了简便方法，相比传统LC-MS方法更节约成本，可用于生物制药的质量控制、过程分析/优化及相关的细胞系开发。新款色谱柱将于今年11月在中国正式上市。东曹生命科学事业部市场部部长 山崎洋介　　山崎洋介的第一个报告介绍了东曹用于生物分析的新款超高效SEC色谱柱，包含TSKgel UP-SW系列、TSKgel SWXL系列等。其中TSKgel UP-SW3000是一款在UHPLC和HPLC系统上均可实现高分辨率的尺寸排阻色谱柱，采用粒径为2μm、键合了二醇基的硅胶颗粒填充，在抗体药物的研发和质量控制上提供更有力的帮助。相比TSKgel UP-SW3000，TSKgel UP-SW2000更适用于分离低分子量的蛋白质、肽及寡核苷酸。　　山崎洋介的第二个报告介绍了东曹用于单克隆抗体分离纯化的填料。由于在捕获步骤中需要对大量细胞培养液快速纯化，TOYOPEARL Protein A亲和填料被广泛地应用于这一阶段。Protein L填料对单克隆抗体的kappa轻链有亲和作用，对于Fab、scFv这些不含有Fc区域，无法通过Protein A填料进行纯化的抗体片段，则可选择Protein L填料。　　会议设置交流和抽奖环节，由3位报告嘉宾抽取大奖，反馈一直以来给予东曹关注与支持的用户，研讨会在欢快氛围中圆满落下帷幕。

近日发表在《自然方法》杂志上的一篇新论文中，美国加利福尼亚大学圣克鲁斯分校（UCSC）的研究人员介绍了有史以来第一种使用“泛转录组”分析全基因组RNA测序数据的方法。分析一个人的基因表达需要将他的RNA图谱映射到一个标准参照物，以深入了解基因在多大程度上“开启”并在体内发挥功能。但当参照物不能提供足够的信息来进行准确映射时，研究人员可能会遇到问题，这被称为参照偏差。由UCSC生物分子工程副教授本尼迪克特帕特恩领导的一组科学家发布了一个工具包，允许研究人员将个人的RNA数据映射到一个更丰富的参照物上，解决参考信息的偏差，并带来更准确的映射。研究人员表示，泛基因组和转录组的结合在此前从未真正完成过，这是第一次有人尝试将泛基因组作为RNA测序图谱的标准特征。该工具将帮助世界各地致力于通过RNA测序分析了解基因表达的研究人员。“有了这个工具包，我们正在利用从泛基因组获得的更多样化的数据来改进基因表达数据的测量，这一点在个体之间可能会有很大的差异。”帕特恩说，“这样做的目的是让人们在关注基因表达的研究中感受到更多样化的数据的影响，从而更好地分析细胞模型、有机体模型和其他研究应用。”绘制RNA测序数据以了解基因表达可能很困难，因为RNA序列是由细胞机制拼接而成的，这意味着一组RNA数据可能来自基因组的非连接区域，这使得将它们正确地与参照物对齐成为一种挑战。这些剪接点在人类群体中因人而异并不统一，也很难知道RNA来自哪个单倍型。利用新的开源工具，研究人员可获取个体RNA的拼接片段，绘制它们在泛基因组上的排列位置，确定数据属于哪种单倍型，并分析基因表达。

人类的疾病易感性和生理特征等常见性状的差异，往往由DNA序列变化造成，这些DNA片段缺失、增加、异位等变化被统称为遗传变异。全基因组关联研究（Genome-Wide Association Study，GWAS）是通过比对大量人群的遗传信息，利用统计学检测遗传变异和性状之间关联性的方法。西湖大学的研究团队开发了可用于百万级生物样本库的全基因组关联研究的分析工具，相关成果在《Nature Genetics》发表，题为：A generalized linear mixed model association tool for biobank-scale data。　　随着近年来十万级、甚至百万级大型生物样本库的出现，目前的GWAS分析工具已不能满足数据分析的需求。该研究团队开发了一款高效的广义线性混合模型，克服了传统分析工具耗时长等缺点，并且对硬件的要求较低。研究人员通过对包含两百万人的模拟样本进行分析，发现这种工具预算效率最高时可达已有技术的36倍。利用这种工具分析英国生物样本库中的2989个疾病相关性状也验证了其稳健高效的特征，研究人员已将所有的关联分析结果共享到在线数据平台上以供生物医学类研究参考。　　此项成果不仅为超大型生物样本库关联分析研究提供了有力工具，也为揭示人类复杂疾病遗传奥秘带来了新希望。　　注：此研究成果摘自《Nature Genetics》，文章内容不代表本网站观点和立场。 　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41588-021-00954-4

2012年10月16-18日，第六届慕尼黑上海分析生化展（Analytica China 2012）在上海新国际博览中心举行。上海仪真分析仪器有限公司协同欧洲著名的分析仪器生产厂商Spark Holland公司联合参加了展会。我公司在会上展出了Symbiosis Pico全自动在线固相萃-取液相色谱仪、Deena II 全自动石墨消解仪、Merx甲基汞/总汞全自动测汞仪、Fox 4000全自动电子鼻以及Celsis快速微生物检测系统等分析仪器设备，功能应用涉及食品安全、临床诊断、医药研发、毒理法医等众多安全领域。来自荷兰的Spark Holland公司也同期展出了最新研发生产的包括DBS干血点自动进样器、XPrezzo固相萃取仪等在内的样品分析处理设备。仪真公司在此次展会中的部分情况介绍如下： 上海仪真分析仪器有限公司展台全景 我公司部分参展仪器设备展示，从右至左以此为Fragment Analyzer高通量核酸片段分析仪、Fox 4000全自动电子鼻、Symbiosis Pico全自动在线固相萃-取液相色谱仪、Deena II 全自动石墨消解仪。 公司部分参展员工在展台合影

岛津制作所(SSI)近日发布了ATHAP-MALDI基质方法工具包，用于改进对包含跨膜疏水蛋白和多肽的分析能力。传统的LC-MS/MS和MALDI-TOF 很难分析包含疏水基团的膜蛋白。烷基化三羟基苯乙酮(ATHAP)新基质在此方法中发挥了特殊的作用。　　许多疾病的生物标志物是包含疏水基团的膜蛋白。之前用液质和MALDI-TOF的检测效果都不理想，这类蛋白和多肽一般不被目标分析物列表所包含。由于疏水多肽的低溶解性，其难于在液相质谱中得到检测。采用如α -氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA)、芥子酸(SA)、二羟基苯甲酸(DHB)等传统基质的MALDI法离子化效率较低，从而导致用MALDI-TOF检测这些物质灵敏度很差。　　“疏水性是将横跨膜片段整合到脂质双分子层的主要动力。这些新的基质工具包为科学家分析这些重要物质的生物和物理化学性质提供了前所未有的可能性。”岛津公司Scott Kuzdzal博士说。“这些工具包可以提高分析灵敏度，开拓对从抗菌肽到癌症蛋白标志物等关键疏水性分子结构和功能的研究。”　　ATHAP基质由广岛大学和田中耕一尖端科技实验室联合开发，并授权给岛津制作所。本研究得到日本学术振兴会(JSPS) “世界领先创新科技研发资助项目 (FIRST Program) ”的赞助支持。编译：郭浩楠