片段分析

本应用简报介绍了聚合物型反相色谱柱在单克隆抗体 (mAb) 和抗体药物偶联物 (ADC) 等生物大分子表征中的应用。通过研究完整和片段级 mAb 了解聚合物色谱柱的性能。结果表明该色谱柱具有卓越的分离性能，并适用于 mAb 和 ADC 的常规 LC/MS 分析。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥ 300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µ m的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µ m 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法1。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的， 是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法2。相较于将单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥ 300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主 要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小 (流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 µ m的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6 mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因SEC粒径为3 µ m及以上，可以选择7.8 mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

单克隆抗体聚集可通过产品和环境因素等多种机制产生。体积排阻色谱(SEC) 是单克隆抗体型治疗药物聚集体和片段含量测定和定量分析的标准方法。本应用简报重点展示强制应激研究中获得的利妥昔单抗生物仿制药和创新药物的完整态、聚集体及片段的高分离度分离与定量分析。其中采用Agilent 1260 Infinity 四元生物惰性液相色谱和Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱进行分离与定量分析，并使用分子量标准品校准色谱柱。AdvanceBio SEC 色谱柱的高灵敏度、高分离度分离适用于监测聚集体/降解物，也是亟需高分离度与高灵敏度的应用的理想选择。

由NanoTemper和药明康德子公司Crelux合作完成的STING抑制剂片段筛选案例。包括阳性化合物TSA实验验证STING蛋白结合活性，片段化合物单点筛选及亲和力排序实验。

人凝血酶原片段F1+2(F1+2)检测试剂盒人凝血酶原片段F1+2(F1+2)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人凝血酶原片段F1+2(F1+2)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人凝血酶原片段F1+2(F1+2)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人凝血酶原片段F1+2(F1+2)抗原、生物素化的人凝血酶原片段F1+2(F1+2)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人凝血酶原片段F1+2(F1+2)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)检测试剂盒人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)抗原、生物素化的人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人细胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

PCR扩增线粒体DNA(mtDNA)的序列分析正迅速成为法医测试中公认的手段。法医mtDNA应用关键性的第一步，是确定这些扩增产物片段大小、纯度和浓度是否适合序列分析。Agilent 2100生物分析仪和DNA 500 LabChip能够准确而精密地测定 DNA片段的大小和浓度。在这篇应用报告中，用生物分析仪在序列测定前快速而有效地分析了PCR扩增的DNA片段。

近期，约翰霍普金斯大学医学院的研究人员在Science期刊发表研究成果[1]。他们发现了靶向TP53突变的新抗原，筛选出一种抗体片段（H2-scFv）特异性识别灭活的肿瘤抑制基因的蛋白质产物，通过实时监测T细胞杀伤效应，证实了该抗体片段的有效性，开创了靶向疗法的新领域。此研究中，Incucyte® 被选择并应用于免疫细胞肿瘤杀伤活性的实时动态分析。

针对畜牧养殖行业以及饲料行业，LUMEX为该行业客户打造即用的行业用户方法包。实时荧光定量PCR分析仪AriaDNA结合先进的实时荧光微芯片技术，配合专用方法试剂包，使病原菌及转基因片段分析饲料源性成分，以及动物病害疫情分析检测变得简单快捷。可用于动植物病害测定，饲料原料转基因鉴别，饲料的源性成分分析。满足国标SN/T 4781-2017、SZDBZ268-2017及SNT 3731.4-2013对于动物源及植物园饲料的源性分析要求。

2.7 μ m Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱专为改善多肽分离和肽图分析应用而设计。该色谱柱采用了表面多孔技术，能够实现复杂多肽混合物的快速有效分离。本文以重组人促红细胞生成素(rhEPO) 的胰酶分解物作为糖肽分析的消化物模型，展示了AdvanceBio 肽图分析色谱柱卓越的肽图分析性能。与很多蛋白治疗药物类似，rhEPO 在生产过程中发生了修饰，因此表现出广泛的异质性。AdvanceBio 肽图分析色谱柱采用了优化的 C18 涂层技术，能在一个很宽的洗脱范围内为多肽分析提供卓越的选择性和分离度，以增强糖肽片段的分离，从而实现其快速、有效和灵敏的质谱分析。

T细胞受体(TCR)和免疫球蛋白一样，是由多个基因片段的基因重组产生的。这种重组产生了大量的T细胞，每一个都针对一种独特的多肽抗原 (peptide antigen)。T细胞对病毒、细菌、肿瘤细胞以及来自正常组织的多肽（在自身免疫性疾病中）有反应。每个多肽的特异性只在循环T细胞的一小部分中被发现，这使得抗原特异性反应的研究变得困难。MACSQuant® 流式细胞分析仪预富集后分析流程将目的稀有细胞以抗体磁珠标记，再对其他分析标记物进行不同多色荧光标记(Sample treatment)，直接上样流式细胞仪(Load sample)。先使用预富集模块功能，在内建的磁力柱上富集目的稀有细胞 (MACS enrichment)，随后进行细胞分析(Flow analysis)，不因过多操作流程而损失细胞，同时获得更多分析数据。

单克隆抗体是目前市场上最大的糖蛋白治疗药物，而且糖基化是引起mAb异质性的主要原因。我们已经知道，mAb的IgG-Fc片段的N-糖基化会影响药物治疗作用机制（MOA），因此监测聚糖的关键质量属性（CQA）是研发生物药物时的重要步骤。同时，糖基化也是影响药物溶解度、动力学、稳定性、功效和免疫原性的关键因素。因此，需使用一系列不同色谱模式的高效液相色谱法来分析完整蛋白和消化后蛋白片段的糖基化情况。TSKgel FcR-IIIA-NPR 色谱柱是一款主要用于分析IgG糖型的亲和色谱柱。将重组FcR-IIIA 蛋白键合到无孔的亲水性聚甲基丙烯酸树脂的填料上作为固定相。这种保留机制是基于FcR 配基与单克隆抗体保守区域内连接在ASN 氨基酸上的糖基间的相互作用。糖蛋白的最终洗脱曲线反映了ADCC的活性，其与N-糖链的构成是相关联的。本资料?中研究的目的是表明，使用质谱法表征TSKgel FcR-IIIANPR色谱柱上分离出来的典型IgG1 洗脱组分，并且验证某些聚糖结构（特别是末端半乳糖的存在）会使单克隆抗体具有更高活性这一观察结果。

抗体是一种结构复杂的糖蛋白。即使是天然抗体，其结构也是各不相同。抗体类药物在其生产工艺（培养、分离纯化）或存储过程中容易导致产品的不均一性，所以在药物研发以及纯化和生产过程中，对抗体药物的定量和定性的分析是非常重要的。 高效液相色谱法（HPLC）可以对抗体药物以及重组蛋白药物中的不均一性进行有效的分析。比如，尺寸排阻色谱法利用分子空间结构的不同，可对多聚体、抗体片段、PEG化蛋白等样品进行有效分离。离子交换、疏水、反相以及正相色谱法可对抗体中的带电异构体、结构异构体，或由于糖基化、托酰胺化和氧化等作用引起的杂质进行高分辨率的分析。 本目录汇总了SEC/IEC/HIC/RPC/HILIC法分析抗体药物的应用实例，同时也涵盖了最新最全的TSK色谱柱产品的选择指南。

单克隆抗体 (mAb) 等蛋白质的翻译后修饰 (PTM) 是确定药品有效性和安全性的关键质量属性 (CQA)。分析技术的进步加快了 PTM 表征这项艰巨任务的速度。在生物制药行业，肽谱分析是蛋白质鉴定的常用方法。其中包括通过酶解生成肽片段，然后进行液相色谱 (LC) 分离、检测和肽段鉴定。肽谱分析与质谱 (MS) 检测联用，可鉴定单个氨基酸变化和 PTM。LC/MS 是 PTM 分析的首选技术。但由于蛋白质酶解物较为复杂，肽谱分离始终是一项具有挑战性的工作。高分离度和可靠的肽谱分离是可靠鉴定 PTM 的关键。目前的 LC/MS 方法中，采用质谱兼容的甲酸 (FA) 离子对试剂法，信号强度要优于其他改性剂。但 FA 的缺点是，与多种 C18 固定相配合使用时峰形较宽并会出现拖尾峰，从而导致肽对发生共洗脱。表征 PTM 时，需要对复杂的胰蛋白酶酶解物中经过修饰和未经修饰的肽进行高分离度液相色谱分离。肽保留和 MS 信号分别会受到所选反相液相色谱柱和流动相离子对试剂的影响。因此，选择正确的液相色谱柱对于提高含 PTM 肽的分离度至关重要。

以磷酸催化、微波辅助合成半乳聚糖为研究对象，探讨半乳聚糖的化学结构及聚合反应的区域选择性和立体选择性。 综合采用高效凝胶渗透色谱、红外光谱、甲基化分析及一维、二维核磁共振波谱（1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，TOCSY，HSQC，HMBC），对半乳聚糖的相对分子质量、糖苷键的立体构型和连接位点进行表征。 结果表明，反应合成的半乳聚糖为多分支结构，重均相对分子质量为 2 657，重均聚合度为 16，糖残基以 α -型半乳吡喃糖为主，主要为𔾸）-α -D-Galp（1→和𔾶，4）-α -D-Galp（1→片段。 结构分析结果进一步表明，微波辅助、磷酸催化半乳糖缩合过程中，不同位点的羟基具有不同的反应活性，4 位羟基的反应活性最强。

本研究比较了三款色谱柱的性能，包括AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 μ m 色谱柱和其他供应商的 2 μ m 和亚 2 μ m 色谱柱，考察了它们在分析 mAb 和 ADC 时获得的峰形以及对 HMW 和 LMW 体积异构体的分离效果。与其他供应商的色谱柱相比，AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 μ m 色谱柱在分析 mAb 时获得的 HWM 和 LMW 物质的峰形和分离度更出色。对于疏水性更强的样品（如 ADC），AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 μ m 色谱柱具有明显优势：大大减少了不利的次级相互作用，获得的峰更尖锐、对称，并且能很好地分离 LMW 片段峰。相比之下，另外两个供应商的色谱柱表现出明显的非特异性结合，得到分裂峰或峰变宽，无法分离 LMW 峰。

尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

单克隆抗体的表征对于产品的安全性和有效性至关重要。确定纯度和表征二聚体或片段等杂质是两个关键的质量参数。尺寸排阻色谱法与质谱联合使用在测定mAb精确分子量方面的应用也越来越广泛。然而，即使在高分子量m/z范围内执行操作，传统SEC一般都会产生大量的颗粒脱落，导致电离效率随时间推移逐渐降低。为避免MS和多角度光散射检测时产生颗粒脱落，东曹开发了TSKgel? UP-SW3000-LS U/HPLC尺寸排阻色谱柱。本应用中，我们使用了TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱与MS对mAb标准品进行了分析。数据表明，就MS观察到的颗粒脱落而言，TSKgel UP-SW3000-LS色谱柱优于竞品UHPLC色谱柱和蛋白质SEC专用低脱落色谱柱。此外，与50次以上的初始进样相比，该色谱柱有助于将电喷雾电离（ESI）源的电离效率保持在90%以上。?

BioCore SCX色谱柱基于先进色谱柱技术，针对单抗类生物大分子电荷异质体的选择性进行优化：在无孔、单分散、高交联度的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球表面，键合一层中性亲水层，在亲水层上接枝磺酸官能团。创新性微球技术确保色谱柱高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂兼容性；先进键合技术有效地阻绝生物大分子与疏水性微球接触，最大限度地降低生物大分子与固定相间不利的相互作用，确保单抗电荷异质体分离所需的选择性。

肽谱分析是表征生物治疗性蛋白质的一种常用分析技术。首先用一种或两种蛋白酶将蛋白质酶解成小分子肽。肽混合物通常采用反相色谱法分离，然后通过紫外或质谱检测器进行检测。质谱可以提供肽的质量数据，从而大大扩充肽谱分析的信息含量。由于增加了质量分离模式，可以轻松鉴定出共流出的多肽，同时也可以大幅缩短梯度时长。此外，串联质谱可以将肽碎裂为更小的片段，并为肽的氨基酸序列以及糖基化、磷酸化、氧化和脱酰氨基化等翻译后修饰(PTM) 提供证据。本应用简报介绍了如何使用新型表面多孔肽谱分析色谱柱配合 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS 系统对一种 IgG (1) 治疗性单克隆抗体 (mAb) 进行肽谱分析。结合 MS/MS 分析，肽谱分析色谱柱独特的分离能力可以最大限度提高分离度和效率，可确保实现可靠灵敏的肽鉴定，而且只需 15 分钟的运行即可实现高序列覆盖。6550 iFunnel Q-TOF LC/MS 系统可为肽鉴定提供出色的质量准确度和灵敏度，而 MS/MS 功能则有助于更可靠地确定被修饰肽的鉴定结果。此外，本文还探讨了通过 IgG (1) 肽谱分析梯度和 LC/MS/MS 参数的优化，实现稳定、快速、可靠的 mAb 肽谱分析。

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）可以：（1）研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用；（2）可用于DNA定性和定量分析；（3）用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验方法原理一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

多肽分离是生物药物表征过程中至关重要的一步。肽谱分析在药品开发中作为主要的质量控制 (QC) 步骤，其中包括通过酶解生成多肽片段，然后进行反相分离和质谱鉴定。由于蛋白质混合物的蛋白水解消化物固有的复杂性，高效、高分离度的多肽分离显得尤为重要。保留时间和峰面积/峰 高等肽谱分析的质量属性是获得可靠肽谱分析结果的关键。因此，需要采用稳定可重现的 LC/MS 方法严格表征多肽片段，从而可靠地评估分析结果。本研究证明，使用可兼容质谱的 Agilent AdvanceBio Peptide Plus 色谱柱以及 含甲酸改性剂的流动相可实现高效的多肽分离。本研究筛选了多种类型的样品用于评估多肽分离的色谱柱性能。结果表现出优异的保留时间、峰面积、峰高和半峰宽 (FWHM) 重现性。

饮用水中的微生物污染检测是水质分析的重要环节。水中微生物主要检测：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾地鞭毛虫和隐孢子虫共计六项。实时荧光定量PCR分析仪AriaDNA采用先进的实时荧光微芯片技术，配合专用方法试剂包，使病原菌及转基因片段分析检测简单快捷。

BioCore SCX色谱柱基于先进色谱柱技术，针对单抗类生物大分子电荷异质体的选择性进行优化：在无孔、单分散、高交联度的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球表面，键合一层中性亲水层，在亲水层上接枝磺酸官能团。创新性微球技术确保色谱柱高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂兼容性；先进键合技术有效地阻绝生物大分子与疏水性微球接触，最大限度地降低生物大分子与固定相间不利的相互作用，确保单抗电荷异质体分离所需的选择性。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

Column:BioCore SCX, 10 μ mDimension:4.6× 150 mmMobile Phase:A) 20 mM MES, pH5.5B) 300 mM NaCl in 20 mM MES, pH5.5

BioCore SCX色谱柱基于先进色谱柱技术，针对单抗类生物大分子电荷异质体的选择性进行优化：在无孔、单分散、高交联度的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球表面，键合一层中性亲水层，在亲水层上接枝磺酸官能团。创新性微球技术确保色谱柱高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂兼容性；先进键合技术有效地阻绝生物大分子与疏水性微球接触，最大限度地降低生物大分子与固定相间不利的相互作用，确保单抗电荷异质体分离所需的选择性。

Column:BioCore WCX, 10 μ mDimension:4.6× 150 mmMobile Phase:A) 20 mM MES, pH5.5 B) 300 mM NaCl in 20 mM MES, pH5.5