做一个药物的药物动力学,样品是血浆基体,药物极性特强,含氮多碱性,在C18上基本不保留,想用离子色谱做试试,但没有查到离子色谱做血浆样品的文献,样品准备用乙腈沉淀蛋白后离心的上清液直接进样,离子色谱柱可以吗?
10,抽取5个版友);中奖名单:玲儿响叮当(注册ID:jshbhh)捌道巴拉巴巴巴(注册ID:v3082413)大川之子,纵横四海(注册ID:chuangu120)翠湖园(注册ID:hhx050)sixingxing(注册ID:v2889187)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231507_611891_1610895_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609231507_611892_1610895_3.png【注意事项】同样的答案,每人只能发一次PS:该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”,回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容,无法看到其他版友的回复内容。下午3点之后解除,即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。=======================================================================血浆中利多卡因的测定方法:SPE基质:血浆应用编号:101288化合物:利多卡因固定相:ProElut PLS色谱柱/前处理小柱:ProElut PLS 30mg / 1ml 100/pkg样品前处理:1、样品准备 制备2 - 3 mL 血浆,取1 mL 血浆与1 mL 水混匀,待净化。2、净化 a 活化: 依次将1 mL 甲醇、1 mL 水加入ProElut PLS 30 mg/1 mL (Cat.#68002),流出液弃去; b 上样: 将样品加入小柱,流出液弃去; c 淋洗: 1 mL 5% 甲醇水溶液淋洗,淋洗液弃去,将小柱抽干; d 洗脱: 1 mL 甲醇洗脱,收集洗脱液; e 重新溶解:40 oC 下氮气吹干洗脱液,1 mL 流动相定容色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18(2) 200 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99602) HPLC应用101350文章出处:P040关键字:血浆,利多卡因,SPE,ProElut PLS摘要:适用于人与动物血浆中利多卡因的检测。谱图:http://www.dikma.com.cn/Public/Uploads/images/p91%20copy.png图例:1. 立多卡因
血浆样品在做药物代谢时需要前处理吗?
我要用液质联用技术定量检测血浆中的固醇类物质,首先向血浆中加入乙腈,有沉淀产生,需要离心取上清液吗?
请问我想处理含药血浆,也就是想从血浆中提取该药,药为环烯醚帖苷类,我选何种SPE小柱?还有其他处理方法吗?
【作者】 王彦慧; 夏东亚; 郭涛;【机构】 沈阳军区总医院药剂科; 沈阳军区总医院药剂科 辽宁沈阳110016; 沈阳药科大学; 辽宁沈阳110016;【摘要】 目的:建立测定人血浆中盐酸曲马多的高效液相色谱-荧光检测法。方法:血浆样品经液-液萃取,以氟康唑为内标,在Diamonsil C18柱(迪马公司,200mm×4.6mm,5μm),以磷酸二氢纳缓冲液(0.04mol.L-1,pH3.5)-乙腈(77∶23)为流动相,荧光检测,激发波长为275nm,发射波长为302nm。结果:曲马多的线性范围为5~1 000μg.L-1,最低检测限为1μg.L-1。低、中、高3种浓度的日内日间RSD均小于7.7%,提取回收率分别为(85.2±4.3)%,(80.6±3.5)%和(83.6±3.6)%。结论:该法重复性好、准确、简便、快速,适用于人血浆中盐酸曲马多浓度的测定及临床药动学研究。 【谱图】 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/08/201208142231_383915_1609970_3.jpg
想问一下做血浆脂肪酸检测,血浆质控样品要经过怎样的处理才能混匀做成质控呀?先前涡旋三分钟定量分析有些脂肪酸RSD相差比较大?所以想问问大家是怎样做的?
10,抽取5个版友);中奖名单:yifan1117(注册ID:yifan1117)玲儿响叮当(注册ID:jshbhh)翠湖园(注册ID:hhx050)吕梁山(注册ID:shih20j07)捌道巴拉巴巴巴(注册ID:v3082413)http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609221516_611598_1610895_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/09/201609221516_611599_1610895_3.jpg【注意事项】同样的答案,每人只能发一次PS:该贴浏览权限为“回贴仅作者和自己可见”,回复的版友仅能看到版主的题目及自己的回答内容,无法看到其他版友的回复内容。下午3点之后解除,即可看到正确答案、获奖情况及所有版友的回复内容。=======================================================================血浆中维生素A 和维生素E 的测定方法:SPE基质:血浆应用编号:101290化合物:维生素A; a- 维生素E固定相:ProElut LLE+色谱柱/前处理小柱:ProElut LLE+ 3ML, max sample volume 100/pk样品前处理:1、血液处理 制备3 - 5 mL 血浆,移取2 mL,加入1 mL 20% 氯化钠水溶液,混匀,待净化。2、硅藻土柱净化a 上样: 将样品加入ProElut LLE+ 3 mL* (Cat.#62503),样品在重力的作用下渗入填料;b 平衡: 静置10 min,使样品在硅藻土表面充分浸润;c 洗脱: 向柱中加入15 mL 乙醚,打开控制阀,调节流速使洗脱液成滴流下,接收洗脱液;d 重新溶解:25 oC 下将洗脱液减压蒸馏至干,用1 mL 甲醇溶解残渣。将溶解液在-18 oC 下放置3 h,用微孔滤膜过滤后,HPLC 分析注: “3 mL” 是指硅藻土柱的最大上样量,如果样品量超过这一数值,样品会流出小柱;添加样品量应尽量接近最大上样量,否则会有部分洗脱液被扣留,影响回收率;样品量一定时,应选择最大上样量稍大于样品量的小柱,差值用20% 氯化钠水溶液补足。色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18(2) 250 x 4.6 mm ID, 5 μm (Cat. #99603) 流动相:甲醇/ 水=98/2 流速:1.0 mL/min 进样量:20 μL 柱温:35oC 检测器:UV 300 nm文章出处:P038关键字:血浆,维生素,SPE,ProElut LLE+摘要:适用于血浆中维生素A 和维生素E 的检测。谱图:http://www.dikma.com.cn/Public/Uploads/images/p94%20copy.png图例:1. 维生素A;2. a- 维生素E
血浆速冻技术的新进展血浆是抗凝全血经物理方法分离制备的一种血液成分,其临床应用是现代成分输血的重要组成部分,尤其是新鲜冰冻血浆(PPT),在临床治疗中更有其重要的作用。血浆是多种血浆蛋白质的混合物,其中包含白蛋白、免疫球蛋白和凝血因子类蛋白。为了有效的保护血浆内的有效成分,特别是凝血因子,并随着我国成分输血技术的发展,新鲜冰冻血浆及冷沉淀的制备技术及应用随之也越来越广泛。目前我国《血站基本标准》实施细则中第92条规定:制备新鲜冰冻血浆时,抗凝剂为CPD、CP2D、CPDA-1的血液应在8小时内分离并速冻;抗凝剂为ACD的血液应在6小时内分离并速冻。其质量要求: 含有全部凝血因子。血浆蛋白为6~8g/%;纤维蛋白原0.2~0.4g%;Ⅷ因子含量:≥0.7 IU/ml 规格。可以看出,时间和温度是制备出质量合格的新鲜冰冻血浆两个关键点,尤其是对于活性很高的凝血因子VIII和V,时间和温度是影响其活性的重要因素。中国医学检验杂志1995年3月第18卷第2期《血浆凝血因子测定的影响因素探讨》,作者通过对比经过不同温度和时间后FVIII含量发现:32℃条件下6小时活性只有48%,24小时5%4℃条件下6小时活性有95%,24小时剩29%。由于在血浆结冰过程中,凝血因子VIII含量与时间呈指数下降关系,所以速冻时间越短,凝血因子VIII和V的损失也就越小。国际上通用的标准是1个小时内速冻完成,如果能在30分钟内完成速冻,那么效果将会更好。因此要保证新鲜冰冻血浆及冷沉淀等成分的疗效,必需在采供血过程中控制好冷链和时间链,其中血浆速冻技术是其中一个重要环节,速冻的时间和效果将直接关系到血浆及冷沉淀产品的质量和疗效。 随着《中华人民共和国献血法》的实施和无偿献血的深入开展,血站的采血方式已由有偿献血时代的站内采血为主转向站外无偿流动采血。要达到采血后6h(或8 h)内分离血浆并冻结有时存在一定的困难。因此为保证临床使用新鲜冰冻血浆、血浆冷沉淀的质量尽可能的缩短血浆速冻的时间就显的尤为重要了。我国血站采用的血浆速冻技术主要经过了以下几个发展阶段:1、用超低温冰箱来进行血浆速冻。此种方法的主要不足在于:冰箱内空间有限,将血浆叠加在一起,上下接触不均匀。冰箱制冷效率有限,速冻时间较长(通常需要6-8h)。显然是达不到要求的。2、强制对流型速冻机。最初的血浆速冻设备我们称为强制对流型速冻机(blast freezer)。该类设备的设计思路来源于普通冰箱,也是使用空气作为冷媒。通过更强的制冷功率来得到低温空气,并且使冷空气快速的流动,加快冷空气与溶液的热交换来实现快速冻结的目的,因此,也称之为“冷风制冷”。由于这类设备内冷空气流动速度比冰箱内空气流动速度有了很大提高,使得制冷效果得到提高,缩短了血浆冻结的时间。对于超低温冰箱来说,这种方式使得速冻的时间已经得到了大大的缩短,但由于关键技术的不足,其速冻时间通常都需要2h。3、平板接触式速冻机。这类设备是根据最新的平板接触制冷技术制造而成。它通过改变传统的“空气”冷媒,用特制不锈钢作为冷媒,加快血浆热交换实现速冻,从而达到缩短速冻时间的目的。今天,我们来讲讲血浆速冻技术的新进展:平板接触式血浆速冻技术。平板接触式速冻(contact plate freezing)。该技术通过高效压缩机使金属板稳定在-50℃的温度,血浆袋通过与-50℃的低温金属板直接接触进行热传递,由于空气的热传导率仅为0.28 w/m•k,而金属的热传导率为58.02w/m•k是空气的上百倍。因此使得降温效率得到极大的提高,降温过程所需时间更少,因此可以得到更多的凝血因子,得到更好质量的新鲜冰冻血浆。平板接触式速冻技术,虽然出现的时间不长,但是它已经以其强大的技术优势已经在国际上占据了血浆速冻市场40%的份额。
新手,我现在有一份血液,没药物的,做工作曲线。我是直接加甲醇沉淀蛋白后上清就是血浆吗?然后加标曲溶液就是工作曲线了?
大肠埃希菌也产生血浆凝固酶,可是通常做大肠埃希菌鉴定时没有做血浆凝固酶试验。而金黄色葡萄球菌要做。是什么原因?
今天给测试中心的一个老师打电话说了我的样品处理方式。我取血浆100ul,加入200ul的乙酸乙酯涡旋3min,然后高速离心12000r/min 10分钟,取上层清液进气质,测试中心的老师说这样不行,必须的衍生化,因为血浆中还有很多的甘油三酯,会污染气质,我看文献都没有衍生化呢?
各位大侠!我是刚毕业的本科生,我做生物等效性的,在处理空白血浆的时候一直有干扰峰,换流动相没法消除,分不开峰,现急求血浆处理方法,我准备用5%高氯酸沉淀蛋白的方法,但是对于高氯酸沉淀后,取上清液直接进样有点担心,PH值合适吗?能直接进样吗?会不会伤柱子啊?请各位大侠帮帮新人!先谢谢啦!我做了好多次了,空白一直有干扰,是新鲜的空白血,应该不会污染到的.
[align=center][font='times new roman'][size=16px]血浆外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在肺癌诊断中的应用[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]引言[/size][/font][font='宋体']外泌体作为重要的信息载体,参与肿瘤的发生、进展、转移和化疗耐药等过程,外泌体携带大量的遗传物质,已成为液体活检最理想的分析目标。外泌体也是目前最有前途的非侵入性诊断和预后的生物标志物之一。目前,超速离心法是外泌体分离的金标准。为了实现外泌体的临床价值,本研究以超速离心法富集了人血浆中的外泌体,并对健康人及肺腺癌患者的血浆样品做了区分,用于下游的肺癌诊断[/font][font='宋体']。[/font][align=left][font='times new roman'][size=16px]血浆外泌体用于肺癌诊断的策略[/size][/font][/align]肺癌仍然是世界范围内癌症相关死亡的主要诱因,因为大多数患者被诊断时均为晚期。因此,我们初步评估了超速离心法富集外泌体用于肺癌诊断的潜在适用性。我们收集了6名健康捐赠者和6名肺癌患者的血浆样本。利用超速离心法富集1 mL血浆样本中的外泌体,对比健康捐赠者和肺癌患者的血浆外泌体,结合数据分析,评估血浆外泌体在监测肺癌诊断方面潜在的适用性。[align=left][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]血浆中外泌体表征[/size][/font][/align]测试了超速离心法对复杂血浆样品的适用性。首先,利用纳米颗粒示踪分析对超速离心法得到的血浆外泌体进行了表征。如图(a)所示, 纳米颗粒示踪分析显示分离的外泌体粒径分布同样较窄,平均粒径为128.8 nm。与细胞上清样品类似,Western blot方法验证了分离外泌体的有效性。如图(b)所示,经富集后,典型的低丰度外泌体标记物同样得到了有效检测。以上结果证明,超速离心法能[img]" style="max-width: 100% max-height: 100% [/img]够成功的用于血浆中外泌体的富集。[align=center][font='黑体'][size=14px]图[/size][/font][font='黑体'][size=14px] (a)重悬液中血浆外泌体的[/size][/font][font='黑体'][size=14px]纳米颗粒示踪分析技术[/size][/font][font='黑体'][size=14px]表征,(b)[/size][/font][font='黑体'][size=14px]Western blot方法[/size][/font][font='黑体'][size=14px]表征血浆[/size][/font][font='黑体'][size=14px]外泌体标记物HSC70、TSG101、CD63和CD9[/size][/font][font='黑体'][size=14px]蛋白条带[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]血浆外泌体用于肺癌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]诊断[/size][/font][/align][font='宋体']我[/font]们收集了6名健康捐赠者和6名肺癌患者的血浆样本。利用超速离心法富集血浆样本中的外泌体。采用纳米颗粒示踪分析技术对血浆外泌体标进行表征。如图所示,与健康对照组相比,肺癌患者的血浆外泌体显著上调。对比健康捐赠者和肺癌患者的血浆外泌体,结合数据分析,证明血浆外泌体在监测肺癌诊断方面具有潜在的适用性。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/10/202310171534194891_9083_6197575_3.png[/img][font='黑体'][size=14px]图[/size][/font][font='黑体'][size=14px] [/size][/font][font='黑体'][size=14px]健康人与肺癌患者血浆中外泌体的[/size][/font][font='黑体'][size=14px]纳米颗粒示踪分析[/size][/font][font='黑体'][size=14px]技术[/size][/font][font='黑体'][size=14px]表征[/size][/font][/align][align=left][font='黑体'][size=18px]小结[/size][/font][/align]超速离心法可以高效、特异性地从人血浆中富集、纯化外泌体,在此我们评估了超速离心法在复杂血浆样品中的适用性。肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,因为在原发癌症扩散之前进行早期诊断具有挑战性。以6例肺癌患者(6例健康供者为对照)的人血浆为样本,进一步研究超速离心法富集外泌体在肺癌筛查和诊断中的应用。这些结果证实了血浆外泌体在肺癌筛查和监测中的应用潜力。
五糖分子量在2000一下,想做其在血浆中的定量,已知其完全游离于血浆中不与血浆蛋白结合,用3KDa的超滤离心管离心取滤液进样但未出峰,是孔径太小还是提取方法不合适,求指教
请问:在处理血浆样品的时候,有什么方法可以既沉淀蛋白又去处血浆中的氯离子。谢谢!!
本人用沉淀蛋白方法处理血浆样品,100ul血浆+100ul对照品(10ug/ml)+400ul乙腈沉淀后,离心取上清液吹干,100ul流动相复溶,进样20ul,用液相做的,结果发现峰面积比纯的10ug/ml对照品还要大,回收率大于100%,而空白样品中没有干扰,我就比较困惑了,不知道什么原因,请大家帮帮。多谢!
本人正在使用岛津HPLC做一条肽的药代动力学,用的C18硅胶柱,流动相是水和乙腈梯度洗脱(都含有千分之一三氟乙酸),求做过多肽血浆样品的高手给一些血浆处理方法的建议,目前使用乙腈沉淀法发现峰几乎检测不到,加了点甲酸好一点。参考文献中做万古霉素的方法,血浆样品加入25%三氯乙酸酸与乙腈(2:1),药品的峰还是特别小。使用乙酸乙酯萃取法也做了,提取下层水层,也是没有峰,而且血浆中杂蛋白特别多。多肽药做血浆样品是不是不能用乙腈沉淀法呢?调整乙腈的比例会出现理想的效果吗?最近几天测纯样品(当天解冻的)不加到血浆里发现目标峰面积表小很多,内标就比较正常,不清楚是柱效问题还是紫外检测器问题。以上问题求高手给一些建议,感激涕零!
老师,请教一下,标准品纯溶液的保留时间比加入空白血浆后经处理后进样的保留时间提前05分钟,能确定加入空白血浆后的峰是标准品的峰吗?
各位老师好,我最近在做用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]测定血浆尼古丁含量,人,大鼠,牛空白血浆怎么处理都有峰,定性定量都在同一个位置,而且不稳定,忽高忽低。排除了试剂,质谱污染。等度和梯度洗脱都会出现这个问题。加了内标尼古丁d4空白血浆也还是有。急求各位老师指点,谢谢。用hilic色谱柱,C18色谱柱空白血浆都会出峰。下图是参考文献处理方法。也试过二氯甲烷萃取,也会有同样问题。[img=,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/08/202008051848362442_4888_3557119_3.png[/img][img=,690,920]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/08/202008051850033509_9165_3557119_3.png[/img]
标准品纯溶液的保留时间比加入空白血浆后经处理后进样的保留时间提前05分钟,能确定加入空白血浆后的峰是标准品的峰吗?
近期有媒体报道,在对于新型冠状病毒肺炎疫情的治疗中,在湖北武汉江夏区人民医院采用新冠病人治愈病人特制的含有病毒抗体的血浆对危重病人进行了救治,救治取得了不错的治疗效果,涉及危症病例约10人,经过血浆治疗的重症病患,相关生理指标均有所好转。这是个好消息,但如果因为这样一则消息,就认为可以通过这样使用制作特免血浆治愈新型冠状病毒肺炎,目前还并不那么现实。?先来看下为什么治愈病人的血浆能够对于危重病例起到一定的治疗作用。病毒感染人体以后,人体的免疫系统会产生抗体来对抗病毒感染,这些抗体通常存在于人体的血液中,通过与病毒的某些蛋白质结合,并与身体免疫系统的其他功能相配合,让病毒无法感染人体正常细胞,最终完成病毒的清理杀灭。因此,在新型冠状病毒治愈者的血液中,会存在针对这种新型病毒的抗体,这种抗体能够对病毒起到抵抗作用,这就是用治愈者血浆治疗新型冠状病毒感染患者的基本原理。?这种疗法并不是此次疫情下才发明出来的,实际上科学家早在19世纪初就开始探索这种疗法的可能性了,但后来又有抗生素、抗病毒药物的逐渐涌现,这种研究逐渐被淘汰,而在上世纪70年代,这种疗法重新被提出,并在治疗某些特殊病毒感染问题时,取得了一定的治疗效果,在2003年的SARS疫情下,我国科学家也曾经探索过用治愈者血浆治疗SARS的方式,并取得了一定的成果。听起来好像这个方法很靠谱啊,为什么还说这个方法目前还不能作为常规治疗手段来进行新型冠状病毒肺炎感染者呢?这是因为这种疗法虽然有明确的科学原理,但其应用上,却有很多的局限性,简单说来有以下几个方面——?1. 有治疗作用的血浆需要含有一定的抗体浓度,每个治愈者体内的抗体浓度水平不一样,抗体滴度如果达不到一定水平,这个血浆就无法使用。2. 血浆采集后需要进一步制作,同时还要筛选病原体、确认没有其他引起感染的病原体的前提下才能使用。3. 血浆的成分十分复杂,输注入其他人的身体,可能会引起过敏反应、还有窗口期的HIV病毒、疟疾病毒如果检测不到,同样也会对病人造成感染风险。4. 血浆抗病毒治疗,最佳时间是患者起病2周内,如果起病时间超过2周,身体出现了多种严重的其他并发症的情况下,这时候抗病毒治疗已经不是重点了,输注抗病毒血浆也就没有太大治疗效果了。?因此,由于这些方面的局限性,用抗病毒血浆治疗新型冠状病毒肺炎患者的方式,目前还不能
我要用高效液相色谱-质谱联用技术定量检测血浆中的一种三肽,首先向血浆中加入了3倍的乙腈,离心后,取上清,问题是,取得上清应该是澄清的吗?我取得比较深,取得上清是微黄色的,然后用氮吹仪浓缩后,EP管底部有黄橙橙的残渣,在用甲酸溶解后,很浑浊,这能上机检测吗?如果只取澄清透明的上清,我怕检测的时候检测不到,毕竟三肽含量很低!
请高手指点。我前一阵做血浆中的药物检测,用的是AB公司的UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS,血浆前处理采用乙腈:水=1:1沉淀蛋白,结果[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]检测时,柱压飙升,采用的是水-甲醇梯度洗脱,0-5min,0-100%甲醇,请问造成柱压飙升是不是因为蛋白没有除净?怎样才能把血浆处理得更干净呢?谢谢
使用液相色谱检测血浆中样品含量注意事项,已经操作步骤?还有开始能够检测出样品含量一段时间和为什么检测不出呢?很迷惑
小女在做方法学时,用的血浆在-20℃冰箱中放了很久(几个月),实验中也没什么异常,做预试时,用新鲜的空白血浆添加样品和内标,响应比同等条件下的老血浆小了百分之十左右,大家有没有遇到过类似情况呀,急啊,还望各位大侠赐教~~
本人是做药代动力学方面的工作。经常测定药物在体内代谢后的浓度,例如在血浆中,全血中血清中等。但是本人外行,一直不清楚一些道理,例如血浆用水稀释倍数对药物浓度有什么影响,红细胞如何破裂,有的药物容易进入红细胞,而有的药物游离在血浆中。哪位大仙有相关的文献啊!急用,十分感谢!
SPE 规格是 3mL 35mg.250uL 的血浆加2mL 缓冲液混匀之后上样. 结果有的SPE柱堵的非常严重. 血浆样品即使加高负压也不能透过SPE柱.药物含量很低,不能再减少血浆体积了.请问,哪位大侠知道如何解决这个"堵"的问题?
最近看了一篇中文文献,说用气相色谱,只需要0.25毫升血浆就可以检测人体血浆中的二十六烷酸了,但我用气质,用了5毫升也检测不出,但该方法跑标样是没有问题的,用的是甲酯化的方式,因此对该文献产生质疑,请各位做过的发表高论,谢谢!
我们用的是waters的ACQUITY UPLC/XevoR TQD,原来血浆样品处理是血浆100ul+内标液100ul+标品溶液100ul+100ul甲醇涡旋离心沉蛋白,然后直接取上清进样,流动相是甲醇:水,以前血浆样品都很正常,这周做的时候内标峰偏移厉害,如图上面是出问题的内标峰,下面是用水甲醇配的内标标品进样。求指导!http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/12/201412041845_525919_2809725_3.jpg