马布特罗受体激动剂

&beta 2-受体激动剂是指含氮激素中的苯乙胺类药物（phenethylamines,PEAs）苯乙胺类药物具有苯乙醇胺结构母核，苯环上连接有碱性的&beta -羟胺侧链。盐酸克伦特罗为国家按兴奋剂管制的&beta 2-受体激动剂，目前，&beta 2-受体激动剂已有20多种，我国禁止所有&beta 2-受体激动剂用于养殖业。近年来，非法使用盐酸克伦特罗（非法用于养殖时俗称&ldquo 瘦肉精&rdquo ）饲养生猪事件屡禁不绝，严重危害食品安全和人民群众身体健康。一些不法养殖户转向购买人用盐酸克伦特罗或其他&beta 2-受体激动剂直接饲喂生猪。本文在已有的方法基础上改进了仪器方法，睿科仪器新推出的全自动固相萃取系统,与串联四极杆液质联用系统可以同时测定九种&beta 2-受体激动剂。实验证明该方法快速、简单，灵敏度高，完全达到了国内，欧盟和日本的要求。 试剂 标准品化合物的结构见图1。乙腈购买于Fisher公司，甲酸购买于Merck公司，甲酸铵购买于Acros Organics公司，水为Milli Q。 图1. 被测&beta 2-受体激动剂的结构 试样制备与保存 牛、猪肌肉组织：若为冷冻样品，将其放置室温下化冻。从原始样品中取出部分有代表性样品约100g，经组织搅拌机将样品均匀搅碎，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入无菌采样袋中，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样（-18℃保存），试样再利用匀质机10000r/min转速下将样品制备均匀。 样品前处理 样品制备 提取 1）称取制备好的样品2.00（± 0.02）g，置于50mL离心管中，加入8mL乙酸钠缓冲液，再加入50&mu L&beta -葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，匀质机匀质30s(10000 r/min)，37℃水浴酶解12h。 2）取出后放置室温，加入100&mu L &beta -激动剂内标工作溶液(8.7)，100&mu L &beta -激动剂加标溶液，加盖后涡旋振荡， 离心10min（5000 r/min），取4mL上清液加入0.1mol/L高氯酸溶液5mL，混合均匀，用高氯酸调节pH值至1± 0.3。离心10min（5000 r/min），将全部上清液转移至另一50mL离心管中，用10mol/L氢氧化钠调节pH值至11。 3）加入10mL氯化钠饱和溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液，加盖至于水平振动器振荡10min。在5000 r/min下离心10min。 转移全部的有机相，在40℃水浴下氮气将其吹干。 4）加入5mL pH=5.2的乙酸钠缓冲溶液，涡旋振荡10s后，进行SPE净化 净化 1）将固相萃取小柱置于固相萃取装置Fotector上，次用5mL 甲醇、3mL水活化小柱； 2）将上述待净化的溶液加入萃取小柱，弃取流出液，然后依次用3mL去离子水，3mL 2%甲酸水溶液(v/v)，3mL甲醇淋洗小柱，弃取流出液，并采用负压抽干小柱； 3）10mL 5%氨水氨化的甲醇溶液洗脱目标物，此时收集洗脱液； 系统自动浓缩定容； 4）往管中加入1mL含0.1%甲酸的5%甲醇溶液复溶样品，涡旋震荡后，滤液待测。 分析条件 样品采用串联四极杆液质联用仪进行分析。 液相条件 采用液相色谱仪，配置有脱气机，二元泵，自动进样器。色谱柱： SB-C18, 2.1× 100, 1.8&mu m。流动相组成：A为10mM Ammonium Formate +0.1% Formic Acid水溶液（用乙酸调节pH值4.5），B为乙腈溶剂。流速0.3mL/min，柱温40℃。梯度洗脱。 质谱条件 串联四极杆质谱仪。在（+）ESI模式下，采集数据，设定质谱参数如下：Capillary 4000V，Drying Gas 11L/min，Neb Press 35 psi，Gas Temp 350℃，碰撞气为高纯氮气，Q1和Q3的分辨率均为单位质量分辨。MRM模式下的参数如下： 保留时间 化合物 母离子 子离子 驻留时间 (ms) 碰撞电压 (V) 碰撞能量 Energy (V) 4.95 特布它林 226 15210 100 15 170 10 100 30 4.98 齐帕特罗 262 244 10 100 10 185 10 100 25 4.98 沙丁胺醇 240 222 10 100 5 148 10 100 15 5.04 塞曼特罗 220 202 10 80 5 160 10 80 15 5.80 莱克多巴胺 302 284 10 100 10 164 10 100 15 6.15 妥布特罗 228 119 10 100 30 172 10 10010 6.18 克伦特罗 （瘦肉精） 277 203 10 100 10 259 10 100 5 6.37 溴布特罗 367 349 10 100 10 293 10 100 15 6.49 克仑潘特 291 203 10 100 15 273 10 100 5 6.52 马布特罗 311 237 10 100 15 293 10 100 10 6.83 马喷特罗 325 237 10 100 15217 10 100 25 表2. MRM模式下的质谱参数 结果与讨论 实际样品添加了2ppb的激动剂，经萃取、净化等步骤，其回收率在80-100%之间。其检测灵敏度, 如瘦肉的灵敏度可达10ppt。 图2. 0.5ppb的&beta 2-受体激动剂测得的谱图 更多信息请联系： 厦门总部： 地址：厦门火炬高新区创业园伟业楼北楼N206室 邮编：361004 联系人：游经理 电话：0592-5800190 传真：0592-5800191 服务热线：400-885-1816 E-mail: info@reeko.cc 北京分公司： 地址：北京市朝阳区东三环南路58号富顿中心C座518 邮编：100022 联系人：张经理 电话：010-58674766 传真：010-58674656 E-mail：liangku_zhang@reeko.cc 上海办事处： 地址：上海市长宁区法华镇路751弄34号404 邮编：201103 联系人：陈经理 电话/传真：021-52300176 E-mail：yufei_chen@reeko.cc 关于睿科 睿科仪器（厦门）有限公司是一家专业从事实验室分析仪器研发和生产的高科技企业，是集实验室样品前处理设备研发生产、前处理方法开发、实验室仪器销售为一体的专业厂家。 睿科仪器有限公司拥有专业的销售人员，配备具有研发经验的安装维修工程师和多年应用经验的应用工程师，为实验室分析工作者提供先进、优质的产品和高质量的技术服务。

导 语社会各界对“瘦肉精”食品安全问题的关注，促使了β2-受体激动剂的检测技术得到了飞速发展，从而有效遏止了β2-受体激动剂在动物养殖中的非法使用。而α2-受体激动剂作为一种新型的具有促进生长及提高瘦肉率作用的药物也在逐步引起关注，且在饲料行业中已有非法添加使用的趋势。早在2010年，农业部1519号公告已明确把可乐定、赛庚啶等列入了农业部《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单。 什么是α2-受体激动剂 α2-受体受体激动剂对α2受体具有特异亲和性，主要用于治疗人类的高血压症。有研究表明，在饲料中添加0.5 mg/kg可乐定，能显著提高猪的瘦肉率，改善猪胴体组成，其它α2-受体激动剂也具有类似的作用。《GB 31650-2019 食品中兽药最大残留限量》规定，仅赛拉嗪可用于非产奶期的牛、马等动物，其他α2-受体激动剂均禁止用于畜禽养殖，且不得检出。《GB 31660.6-2019 动物性食品中5种α2-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》食品安全国家标准，提供了替扎尼定、赛拉嗪、溴莫尼定、安普乐定和可乐定在猪、鸡肌肉及内脏中残留检测方法，该标准已于2020年4月1日正式实施。 岛津解决方案 实验部分 检测仪器本实验使用超高效液相色谱仪LC-40与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统。 前处理方法参照《GB 31660.6-2019 动物性食品中5种α2-受体激动剂残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》标准，猪肉样品经用碳酸钠缓冲溶液、乙酸乙酯提取，SHIMSEN Styra MCX (岛津实验器材有限公司，P/N:380-00853-01)固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。 主要方法参数色谱柱：Shim-pack Velox C18（100 mm×2.1 mm I.D.., 1.8 μm, Shimadzu SGLC, P/N: 227-32010-04）流动相：A相-0.2%甲酸水溶液，B相-乙腈洗脱方式：梯度洗脱离子化模式：ESI(+) 分析结果 标准品色谱图5种α2-受体激动剂的标准品色谱图如下图所示。0.5 μg/L 标准样品色谱图（1替扎尼定，2赛拉嗪，3溴莫尼定，4安普乐定，5可乐定） 回收率考察在空白猪肉中添加标准溶液，加标浓度为2 μg/kg，平行测定3次，替扎尼定、赛拉嗪、溴莫尼定、安普乐定和可乐定回收率均在69.6%～91.8%之间，回收率完全满足标准要求。 实际样品分析某市售猪肉样品中分析结果如下图所示，未检出α2-受体激动剂残留。猪肉样品色谱图 小结使用岛津超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统，参考GB 31660.6-2019食品安全国家标准，建立了猪肉中替扎尼定等5种α2-受体激动剂测定方法，该方法灵敏度高，分析时间短，结果准确，可用于猪肉中α2-受体激动剂的快速检测。 岛津超快速三重四极杆液质联用仪

LC-MS/MS法测定火腿肠中的3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺） 仪器：液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）； 色谱条件： 色谱柱：Agela Venusil MP C18 (2.1mm× 100mm, 5&mu m)； 柱温：35℃；流速：0.3mL；进样量：10&mu L； 流动相：A相：甲醇；B相：0.1%甲酸水溶液； 洗脱程序： 时间（min） A(%) B(%) 0 5 95 5 80 20 5.5 5 95 7 5 95 质谱条件： 离子源：电喷雾离子源 扫描方式：正离子模式 检测方式：多反应监测（MRM） 电离电压：3.0kv 离子源：110° C 雾化温度：350° C 锥孔气流速：50L/h 雾化气流速：650L/h 样品前处理： 按照农业部1025号公告-18-2008方法执行； SPE柱：Agela Cleanert PCX（60mg, 3mL）货号：CX0603 试验结果： 图1 3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺，浓度为10&mu g/L）混合标准溶液特征离子质量色谱图（LC-MS/MS） 注：沙丁胺醇（定量离子对m/z=240.1221.97, 保留时间t=2.08min）、莱克多巴胺（定量离子对m/z=202.2164, 保留时间t=3.14min）、克伦特罗（定量离子对m/z=277.11202.78, 保留时间t=3.21min） 图2-1 空白火腿肠添加3种&beta -受体激动剂（沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺添加浓度为1&mu g/kg）特征离子质量色谱图（LC-MS/MS）[平行样1] 实验数据分析： 准确度和精密度：本方法采用两个添加浓度（1&mu g/kg和10&mu g/kg），用空白添加标准校正，其回收率范围为70%-110%。三个平行样的相对标准偏差小于20%。 总结： Agela Cleanert PCX以及Agela Venusil MP C18 在前处理及液相色谱-串联质谱仪法测定沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺等3种&beta -受体激动剂试验中性能表现优异，可用于问题猪肉及其制品中的瘦肉精的检测。

今年3月，瘦肉精事件引发全国拉网式排查，瘦肉精事件闹得沸沸扬扬，10年间瘦肉精屡禁不绝，添加瘦肉精喂出来的猪不仅颜色光亮，而且可以增加猪的瘦肉率，现在人们都关注身材，不吃肥腻的肉，这也导致饮食习惯吃瘦肉，而添加瘦肉精的猪肉正好符合当今人们的饮食习惯，瘦肉精事件一出大家都在徘徊这肉还吃不吃？ 简介瘦肉精：一类动物用药的统称，任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。 目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β-兴奋剂的药物。与传统瘦肉精盐酸克伦特罗同属“肾上腺受体激动剂”的莱克多巴胺等同类药物同样也能提高猪的瘦肉率。盐酸克伦特罗的检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气质联用法及液质联用法。国家标准GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定中规定方法为气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法、酶联免疫法，其方法检出限均为0.5ug/kg。SN/T 1924—2007 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法采用LC/MS/MS法，该方法具有高灵敏度等优点被普遍使用。本文使用UPLC/XEVO TQ-S对猪尿液中的β-受体激动剂进行分析。实验方法UPLC条件LC系统： ACQUITY UPLC® 运行时间： 10min色谱柱： ACQUITY® BEH C18 1.7μm，2.1mm x 100mm流动相A： 0.1%甲酸水流动相B： 乙腈流速： 0.40mL/minMS条件MS系统： Xevo TQ-S离子模式： ESI+毛细管电压： 3.5kv源温度： 150℃雾化气温度： 500℃雾化气流速： 900L/hr锥孔气流速： 20 L/hrMRM条件：Quanpedia数据库Quanpedia是沃特世特有的一种可扩展和可搜索的数据库，为您提供LC/MS/MS定量方法信息，目前数据库已有超过1200种化合物，包括色谱方法、质谱方法、定量方法等，您可自由选择其中的任意化合物或化合物种类自动形成您所需的方法，无需再重新进行方法开发过程。下图为数据库得到的方法信息：自动生成MRM方法： 样品制备样品制备参照GB/T 22286-2008《动源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定》进行。■ 量取2.0mL猪尿液样品，加入8mL 0.2M的PH为5.2的乙酸钠缓冲液，充分混匀■ 加入50μLβ-Glucuronidase/aryl sulfatase混匀，于37℃水浴水解过夜■ 水解液振荡15min，在5000r/min条件下离心分离10min后，取4mL上清液中添加100uL 10ng/mL的内标溶液混匀，加入5mL 0.1M高氯酸混合均匀，并调节溶液PH值到1±0.3。以5000r/mim条件下离心分离10min后，移取上清液并用10M的氢氧化钠溶液调节PH值到11。■ 加入10mL饱和氯化钠溶液和10mL异丙醇-乙酸乙酯（6:4）混合溶液，离心分离后取有机相，在40℃水浴下用氮气将其吹干■ 提取残渣中加入5mL 0.2M乙酸钠缓冲液（PH5.2），超声混匀溶解残渣■ 样品净化（如下图所示），使用Oasis MCX（3cc/60mg）小柱■ 净化后的洗脱液用氮气吹干，用流动相溶解定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待进样分析 下图为数据库得到的方法信息： 固相提取净化过程Oasis MCX（3cc/60mg）：实验结果与讨论本方法才用一次进样同时监测猪尿液样品中的21种β-受体激动剂进行检测，在灵敏度、分离度方面获得满意的结果。与常规的串联四极杆质谱仪不同的是，Xevo TQ-S为您提供最好的定量数据的同时，还为您提供高质量的光MS/MS信息。对猪尿液中含0.5ug/L的受体激动剂样品，启用PICs（子离子确认扫描）功能，可在不影响MRM定量的同时得到各化合物子离子扫描图，与标样子离子图进行匹配，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。 结论本方法采用多离子反应监测（MRM）方式对21种β-受体激动剂进行检测，具有快速、准确、灵敏度高、分析周期短、适用范围广等优点。适用各类动物组织或动源性食品等的测定。IntelliStart技术可以使得开发分析方法过程变成流线型工作流程。这意味着需要更少的时间来开发方法，大大提高工作效率。强大的Quanpedia数据库包含上千种化合物的方法，自动生成方法文件让你轻松简单快速应对各种突发事件。PICs（子离子确认扫描）功能为您提供最好的定量数据的同时，还为您提供高质量的光谱MS/MS信息，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 联系人：张林海沃特世公司市场部86(21) 61562642lin_hai__zhang@waters.com 周瑞琳 （Grace Chow）泰信策略（PMC）020-83569288grace.chow@pmc.com.cn

瘦肉精：一类动物用药的统称，任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。 目前，能够实现这种功能的物质是一类叫做β-受体激动剂的药物，将其混入猪饲料进行饲养，能促进猪的生长速度、提高瘦肉率，同时使肉色鲜红，卖相更好。与传统瘦肉精盐酸克伦特罗同属“肾上腺受体激动剂”的莱克多巴胺等同类药物同样也能提高猪的瘦肉率。 盐酸克伦特罗的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气质联用法及液质联用法。国家标准GB/T5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定中规定方法为气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法、酶联免疫法，其方法检出限均为0.5μg/kg。SN/T 1924—2007 进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法采用LC-MS-MS法，该方法因具有高灵敏度等优点被普遍使用。本文使用UPLC/Xevo TQ-S对猪尿液中的21种β-受体激动剂进行了分析。 QUANPEDIA是沃特世特有的一种可扩展和可搜索的数据库，提供LC-MS-MS定量方法信息，目前数据库已有超过1200种化合物，包括色谱方法、质谱方法、定量方法等，可以自由选择其中的任意化合物或化合物种类自动形成所需的方法，不需要再进行手动方法开发过程。 下图为数据库得到的方法信息： 自动生成MRM方法： 样品制备： 样品制备参照GB/T 22286-2008《动源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定》进行。 1.量取2.0 mL猪尿液样品，加入8 mL 0.2M的pH 5.2的乙酸钠缓冲液，充分混匀。2.加入50 Lβ-Glucuronidase/aryl sulfatase混匀，于37 °C水浴水解过夜。3.水解液振荡15min，在5000r/min条件下离心分离10min后，取4mL上清液中添加100 μL 10 ng/mL的内标溶液混匀, 加入5 mL 0.1M高氯酸混合均匀，并调节溶液pH值到1±0.3。以5000 r/mim条件下离心分离10 min后，移取上清液并用10M的氢氧化钠溶液调节pH值到11。4.加入10 mL饱和氯化钠溶液和10 mL异丙醇-乙酸乙酯(6:4)混合溶液，离心分离后取有机相，在40℃水浴下用氮气将其吹干。5.提取残渣中加入5mL 0.2M乙酸钠缓冲液(pH 5.2)，超声混匀溶解残渣。6.样品净化(如下图所示)，使用Oasis MCX(3cc/60mg)小柱。7.净化后的洗脱液用氮气吹干，用流动相溶解定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，待进样分析。 ?固相提取净化过程Oasis MCX(3 cc/60mg)： 结果与讨论： 本方法采用一次进样同时监测猪尿液样品中的21种β-受体激动剂进行检测，在灵敏度、分离度等方面均获得满意的结果。 图1. 21种β-受体激动剂总离子流图。 图2. 猪尿液基质中0.01ng/mL克伦特罗连续7针进样重复性(峰面积RSD=0.42%)。 与常规串联四极杆质谱仪不同的是，Xevo TQ-S在提供最好的定量数据的同时，还可以提供高质量的光谱MS/MS信息。对猪尿液中含0.5ng/mL的受体激动剂样品，启用PICs(子离子确认扫描)功能，可在不影响MRM定量的同时得到各化合物子离子扫描图，与标样子离子图进行匹配，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。 图3. 猪尿液基质中0.5 ng/mL沙丁胺醇子离子扫描图。 图4. 猪尿液基质中0.5 ng/mL克伦特罗子离子扫描图。 图5. 猪尿液基质中0.5 ng/mL莱克多巴胺子离子扫描图。 结论： 本方法采用多离子反应监测(MRM)方式对21种β-受体激动剂进行检测，具有快速、准确、灵敏度高、分析周期短、适用范围广等优点，适用于各类动物组织或动物源性食品等的测定。 IntelliStart技术可以使得开发分析方法过程变成流线型工作流程。这意味着需要更少的时间来开发方法，大大提高工作效率。强大的QUANPEDIA数据库包含上千种化合物的方法，自动生成方法文件让您轻松简单快速应对各种突发事件。PICs(子离子确认扫描)功能提供最好的定量数据的同时，还可以提供高质量的光谱MS/MS信息，对样品中阳性结果定性起到帮助判断的作用。

// 随着我国经济的飞速发展，使得大众生活水平显著提高的同时，也带来了一些不良的饮食和生活习惯，加上运动的匮乏及遗传和环境因素，肥胖症呈现逐年升高的趋势，预计2025年中国超重及肥胖人数将突破2.65亿。肥胖症作为一种慢性代谢疾病，引起相关并发症的同时还会带来形体焦虑等心理障碍。无论是出于健康管理还是形体控制的考虑，抗肥胖药物都呈现出巨大的市场需求。“管住嘴，迈开腿”，这曾经的减肥金科玉律正越来越受到“魔法”药物的冲击。2021年6月，司美格鲁肽的减肥适应症（商品名：Wegovy）获FDA批准上市，成为首个也是唯一用于体重管理的GLP-1受体激动剂，每周只需注射一次。以司美格鲁肽为代表，凭借其显著的抗肥胖效果成为近期互联网的热门话题，也同时使得GLP-1相关药物正逐渐从糖尿病治疗领域跨界减肥领域。目前全球范围内已经批准上市的GLP-1类药物有8款，每周注射1次的长效制剂有5款。市场上最主流的GLP-1药物是Victoza（利拉鲁肽，每日注射1次）、Trulicity（度拉糖肽，每周注射1次）、Ozempic （司美格鲁肽，每周注射1次）、Bydureon（艾塞那肽微球，每周注射1次）。这8款产品2022年全球市场规模大约为218亿美元，诺和诺德和礼来合计占比98.7%。礼来Trulicity和诺和诺德Ozempic和Rybelsus目前处于快速增长期。图表：GLP-1受体激动剂类降糖药全球销售收入(亿美元）资料来源：医药魔方，民生证券研究院诺和诺德作为GLP-1药物在减肥适应症领域的领跑者，在其2020年发表的文献：Influence of Production Process and Scale on Quality of Polypeptide Drugs: a Case Study on GLP-1 Analogs一文中也展示了反相条件下分别使用飞诺美的Synergi Max-RP和Kinetex C18对利拉鲁肽和司美格鲁肽进行杂质分析研究的示例；这给后续GLP-1相关药物的杂质分析方法提供了一个很好的借鉴。Synergi Max-RPC12 TMS封尾适用于中性pH下分析碱性化合物Fig. 9 Overlay of high-performance liquid chromatography quality control chromatograms of (a) Originator liraglutide (black) and Supplier 3 liraglutide (red) and (b) Originator semaglutide (black) and Supplier A (red). Impurities marked were obtained by liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS). For liraglutide, impurities marked were also collected by 2-dimensional LC-MS and fraction collection. AU, arbitrary unit LC-MS, liquid chromatography with mass spectrometry.参考文献：Influence of Production Process and Scale on Quality of Polypeptide Drugs: a Case Study on GLP-1 Analogs, Pharm Res. (2020) 37:120.

p 　　 strong 鸿运华宁(杭州)生物医药有限公司 /strong 自主开发的原研新药——重组抗人GLP-1受体人源化单克隆抗体注射液( strong 格鲁塔珠单抗注射液 /strong ，代号：GMA102)近日获得中国国家药品监督管理局颁发的2型糖尿病注册临床试验批件。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 194" title=" 2018.8.13 1-1.jpg" style=" width: 438px height: 154px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/0690b85e-bcce-4309-bc27-a749303bd9ab.jpg" / /p p 　　格鲁塔珠单抗注射液是鸿运华宁采用独特专有的GPCR抗体技术平台，自主开发的全新长效GLP-1抗体激动剂，目标适应症为2型糖尿病和肥胖症。目前，公司正在澳大利亚和新西兰开展该药的Ⅱ期临床试验。已有临床数据显示了良好的安全性和降糖效果，半衰期超过1周，有望开发成为超长效(2周甚至每月1次给药)的降糖药物。 /p p 　　作为全球首个GLP-1抗体激动剂，格鲁塔珠单抗注射液具有高效、长效、低毒等多重特性。借助国家深化药品审评审批制度改革创新的东风，作为十三五“重大新药创制”候选品种，鸿运华宁将积极与CDE沟通，基于在国外临床试验已经取得的研究成果，加速推动国内临床试验进程，让中国的患者早日用上世界一流的好药。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 关于鸿运华宁生物医药 /strong /span /p p 　　鸿运华宁生物医药是世界上GPCR领域屈指可数的原创抗体新药企业之一，主要致力于心脑血管、代谢系统以及癌症的抗体新药研发与产业化，全力成为细分疾病用药领域的全球领跑者。总部位于中国杭州，在澳大利亚和美国设有分支机构。产品目标定位于全球市场，在国内、外同步进行临床开发。 /p p style=" text-align: center " img width=" 330" height=" 390" title=" 2018.8.13 1-2.jpg" style=" width: 438px height: 253px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/192d5ed6-fac2-464f-acc6-8b9aa2ddc30b.jpg" / /p p 　　GMA102为GLP-1受体抗体/GLP-1融合蛋白，结构设计新颖，作用机制独特，是GLP-1领域和GPCR抗体领域的重要创新。希望GMA102临床进展顺利，早日获批上市，惠及中国糖尿病患者。 /p p /p

1) SPE 方法 订货号：C2160107-304 固定相： Thermo HyperSep Retain-CX 柱体积： 3mL 固定相重量：200mg 酶解: 动物源性样品2g (精确到0.01g)于50mL离心管中，加入0.2 mol/L乙酸铵溶液（pH 5.2）10mL,然后加入&beta －盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40&mu L，涡旋混匀3 min，于37℃下水浴避光振荡16h。 提取：样品酶解后放置至室温，涡旋混匀3 min，高速离心10min，取出上清液，加入1mol/L高氯酸溶液1mL，涡旋，混匀，高速离心10min后，转移上清液至另一50mL离心管内。 活化：3mL甲醇，3mL水，3mL 0.5mol/L高氯酸 上样：样品 清洗：3 mL水，3mL甲醇，柱子抽干 洗脱：3mL5%氨水甲醇溶液 2）LC/MS 方法 定货号：25005-152130 色谱柱：Hypersil Gold，5&mu m，2.1× 150mm 流动相：A：水（5mM乙酸铵）B：甲醇，梯度洗脱： 进样量：10&mu L 流速：250&mu L/min MS条件：电喷雾电离源（ESI），正离子模式 选择反应监控（SRM）扫描模式 喷雾电压：4500V 离子传输管温度：350℃ 结果： 1．典型LC/MS/MS 色谱图 2．定量限（LOQ）：本方法沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特 罗、喷布特罗和心得安在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中的定量限均可达0.1&mu g/kg，西马特罗、特布他林为0.5&mu g/kg。 3．提取回收率均可达75 - 120 %。

人肾上腺素受体是G蛋白偶联受体，是重要的药物靶标。目前已知肾上腺素受体有三类（α1, α2和β）九种亚型（α1A, α1B, α1D, α2A, α2B, α2C, β1, β2和β3）。2007年，β2肾上腺素受体的非激活这是第一个人源G蛋白偶联受体的晶体结构，是G蛋白偶联受体结构解析的重大突破。2011年，β2肾上腺素受体和G蛋白的复合物结构获得解析，该工作获得了2012年诺贝尔化学奖。这些结构的解析极大地推动了人们对G蛋白偶联受体（特别是β肾上腺素受体）机理的理解。然而，三类肾上腺素受体偶联的G蛋白不同：α1, α2和β类分别偶联Gq、Gi和Gs。通过序列比对，也可以发现三类受体的配体结合口袋也有明显区别。对肾上腺素受体下游信号选择的多样性以及配体的亚型选择性的理解，一直受制于缺乏α类受体的三维精细结构。2019年12月3日，上海科技大学赵素文和钟桂生课题组在Cell Reports上共同发表两篇论文，报道了两个α类受体的三个晶体结构，阐释了肾上腺素受体多样性和配体特异性的机理。在“Structural Basis of the Diversity of Adrenergic Receptors”一文中，作者通过解析α2A受体与部分激动剂和抑制剂的复合物结构，辅助细胞信号实验和计算生物学，分析阐明了在肾上腺素受体家族中序列多样性是如何导致功能多样性的。α2A受体的两个结构整体非常相似，而配体结合口袋的多个残基（包括在肾上腺素受体中不保守的F4127.39）则发生了剧烈的构象变化。通过观察结构和突变实验，研究人员解释了影响配体选择性的重要氨基酸F4127.39的功能：F4127.39是配体结构口袋的“盖子”，它与口袋中的另外三个芳香氨基酸一起形成了一个芳香笼来结合配体中的正电基团，使配体结合时空间和能量效应俱佳。突变F4127.39会使α2A受体的完全激动剂和部分激动剂均丧失效力。α2A受体具有双重药理学效应：激动剂浓度较低时，α2A受体主要和Gi偶联；激动剂浓度较高时，与GS的偶联占据更主导的地位。相应地，在临床中，α2A受体部分激动剂的效果比完全激动剂要好，如用于降压的可乐定(Clonidine)和用于ICU镇静（在我国也广泛用于手术麻醉）的右美托咪定(Dexmedetomidine)都是α2A受体的部分激动剂。为了更好地理解α2A受体的部分激活性(partialagonism)，研究人员对多个已知的α2A受体完全激动剂和部分激动剂进行了分子对接，他们发现可以用配体与Y3946.55形成氢键与否，来区分α2A受体的部分激动剂和完全激动剂。作者还发现了三个氨基酸（Y3946.55，I13934.51和K14434.56，第一个位于配体结合口袋，后两个位于G蛋白结合口袋）对α2A受体的G蛋白选择性具有重要作用。精心设计的三个突变体Y3946.55N，I13934.51A和K14434.56A，在细胞信号实验中对部分激动剂的刺激均表现出Gi通路的偏好性，而Gs通路的活性遭到削弱甚至完全被抑制。图1：α2A受体中对配体结合（紫色）和G蛋白通路偏好性（红色）起关键作用的残基而在“Molecular mechanism for ligand recognition and subtype selectivity of α2C adrenergic receptor”文章中，作者展示了α2C受体的三维结构，并通过分子对接、功能实验等手段揭示了α2亚型受体的结构特异性，为相关药物研发提供了分子基础。通过将α2C受体与α2A受体的结构进行对比和巧妙的嵌合体设计，作者发现α2C与α2A的结构主要差异存在于胞外域。在α2C受体口袋边沿，D206ECL2-R409ECL3-Y4056.58形成氢键-盐桥互作网络，特异地影响了α2C受体选择性拮抗剂JP1302和OPC-28326的作用。而在α2A受体口袋上方，由Y98ECL1、R187ECL2、E189ECL2和R4057.32形成的互作网络直接遮盖了部分入口，使得JP1302和OPC-28326这些较大的分子可能被阻挡在外。细胞信号实验结果也显示，破坏Y98ECL1-R187ECL2-E189ECL2-R4057.32互作网络并添加D206ECL2-R409ECL3-Y4056.58相互作用得到的α2A嵌合体对JP1302和OPC-28326有着很好响应。图2：α2CAR-RS79948复合物的结构和决定α2肾上腺素受体亚型选择性的胞外域这两篇文章很好地阐述了肾上腺素受体的多样性和α2受体的配体选择性，为基于精细三维结构的下一代α2受体药物开发奠定了基础。在这两篇论文中，均使用珀金埃尔默的EnVision微孔板检测仪对GPCR的cAMP实验进行定量测定。同时，在α2受体的配体结合实验中，珀金埃尔默提供了从放射性受体拮抗剂、耗材(UniFilter GF/B)到放射性微孔板检测仪MicroBeta的整体解决方案。珀金埃尔默为中国科学家药物研发加油助力。扫描下方二维码，或点击文末“阅读原文”，即可查看论文原文。

前情提要近日，据报道，某市食药监局发布今年第4期全市食品安全监督抽检信息通告，检出不合格产品达50批次。多家餐饮企业生产及销售的牛羊肉被检出禁用的瘦肉精，主，角，又，是，克伦特罗和沙丁胺醇，水产品检出孔雀石绿。什么是“瘦肉精”？在中国，通常所说的“瘦肉精”是指克伦特罗(Clenbuterol)，本身是一种能够增强心脏收缩、扩张骨骼肌血管和支气管平滑肌的药物，在兽医和临床上用于治疗休克和支气管痉挛。当超过治疗剂量5~10倍使用时，对牛、羊、猪、家禽等多种动物具有提高饲料转化率和增加瘦肉率的作用。然而，“瘦肉精”的副作用对心血管和神经系统产生影响，表现为肌肉震颤、剧烈腹痛、心跳和呼吸加快，严重者甚至死亡。除克伦特罗外，这样的药物还有沙丁胺醇、西马特罗、特布他林等，都属于β-受体激动剂类，同样能起到“瘦肉”作用，却对人体健康危害过大，因而造成安全隐患。因此，中国农业部于2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，分别下发文件明确禁止食用动物使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）如何让“瘦肉精”无所遁形？在经济利益的驱使下，不法商家铤而走险，“瘦肉精”一再“重出江湖”。作为食品安全检测利器的岛津三重四极杆质谱仪自然不能闲着。应对克伦特罗和沙丁胺醇检测，我们早有准备。除克伦特罗和沙丁胺醇外，还建立了25种β-受体激动剂类药物同时快速测定的检测方法。LC-MS/MS条件：流动相A: 2 mM醋酸铵水溶液流动相B: 乙腈色谱柱: Shim-packXR-ODS III （2.0 mm I.D.×75 mm L., 1.6 μm）MRM条件25种β-受体激动剂色谱图25种β-受体激动剂：特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、吡布特罗、齐帕特罗、西布特罗、非诺特罗、克伦塞罗、莱克多巴胺、羟甲基克伦特罗、克伦普罗、氯丙那林、克伦特罗、溴代克伦特罗、妥布特罗、溴布特罗、班布特罗、马布特罗、丙卡特罗、克伦异磅特罗、克伦潘特、马喷特罗、福马特罗、Clenhexerol、喷布特罗未完继续保卫舌尖上的安全，只管好“瘦肉精”是不够的。岛津针对食品安全检测中常见的兽药种类，重磅推出《LC-MS/MS兽药残留数据库》。其中包含247种适合LC-MS/MS检测的兽药的MRM参数信息，支持兽药残留多组分同时分析方法的建立，使得方法建立的过程变得简便。

p 　　2018年5月28日， strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 中科院上海药物研究所吴蓓丽课题组与中科院生物物理研究所的研究人员合作在Nature Structural & amp Molecular Biology上在线发表了题为“Structural basis for signal recognition and transduction by platelet-activating-factor receptor”的研究论文。 /span /strong 这是继2018年1月5日吴蓓丽研究组在Nature报告与胰高血糖素类似物和部分激动剂NNC1702复合的全长人胰高血糖素受体(GCGR)的3.0Å 分辨率晶体结构和2018年4月19日在Nature发表题为“Structural basis of ligand binding modes at the neuropeptide Y Y1 receptor”的研究论文， strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 报告了2.7和3.0Å 分辨率结合两种选择性拮抗剂UR-MK299和BMS-193885的人Y1R的晶体结构 /span /strong 。并且首次，确定其N端与受体相互作用。对Y1R的这些基于结构的见解，可以实现靶向NPY受体的药物发现的又一重磅研究成果。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 1Nature子刊：血小板活化因子受体识别和转导信号的结构基础 /span /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/bf8ea427-658e-4ba7-a8be-0ce3466f51d9.jpg" / /p p 　　血小板活化因子受体(PAFR)对血小板活化因子(PAF)有反应，PAF是细胞间通讯的磷脂介质，表现出不同的生理效应。 PAFR被认为是治疗哮喘，炎症和心血管疾病的重要药物靶标。在这里，研究人员报告了分别与拮抗剂SR 27417和反向活化剂ABT-491在2.8Å 和2.9Å 分辨率下复合的人PAFR的晶体结构。由PAF的分子对接支持的结构提供对PAFR的信号识别机制的见解。 PAFR-SR 27417结构揭示了一种不寻常的构象，显示螺旋II和IV的细胞内尖端分别向外移动13Å 和4Å ，螺旋VIII采用向内构象。 PAFR结构与单分子FRET和基于细胞的功能测定相结合，表明螺旋束中的构象变化是配体依赖性的，并且在PAFR激活中起关键作用，因此极大地扩展了G蛋白偶联信号的知识受体。 /p p 　　原文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-018-0068-y /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 2Nature：2018年第一弹，中科院药物所吴蓓丽等研究组揭示GPCR复合物结构(糖原受体) /span /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/89bf1c1d-b8bb-4254-8306-136cbe73dc94.jpg" / /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 吴蓓丽研究组报告与胰高血糖素类似物和部分激动剂NNC1702复合的全长人胰高血糖素受体(GCGR)的3.0Å 分辨率晶体结构。 /span /strong 该结构提供了GCGR与肽配体之间相互作用的分子细节。吴蓓丽研究组进一步提出了GCGR激活的双结合位点触发模型，其需要茎，第一细胞外环和TMD的构象变化，这扩展了我们对先前建立的B类GPCR的双结构域肽结合模型的理解。 /p p 　　近日，中国科学院上海药物研究所在B型G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)结构与功能研究方面取得又一项重要进展： strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 首次测定了胰高血糖素受体(Glucagon receptor, GCGR)全长蛋白与多肽配体复合物的三维结构，揭示了该受体对细胞信号分子的特异性识别及其活化调控机制。 /span /strong 这项成果有助于深入理解B型GPCR发挥生理效应的结构生物学基础，加快2型糖尿病治疗新药的开发。相关研究论文于北京时间2018年1月4日在国际顶级学术期刊《自然》(Nature)上发表，通讯作者为吴蓓丽研究员和赵强研究员。 /p p 　　GPCR是人体内最大的膜受体蛋白家族，在细胞信号转导中发挥重要作用。GPCR与人体疾病关系密切，目前有40%以上的上市药物以GPCR为靶点。根据其相似性，GPCR可分为A、B、C和F等四种类型。B型GPCR包括GCGR等多种重要的受体蛋白，识别并结合多肽类激素，对于维持体内激素平衡至关重要。这类受体包含胞外结构域和跨膜结构域，两者共同参与识别细胞信号。由于获得稳定和完整的B型GPCR蛋白(尤其是B型GPCR与多肽配体结合的复合物)难度极大，其结构研究极具挑战性。 /p p 　　GCGR参与调节体内血糖稳态，是治疗2型糖尿病药物的重要靶点，其结构信息的缺失不仅严重制约了对该受体信号识别和转导机制的认识，也极大地影响了靶向GCGR的药物研发?目前尚无上市药物。2017年，由中国科学院上海药物研究所吴蓓丽、王明伟和蒋华良分别领衔的三个研究组合作解析了全长GCGR蛋白同时与一种小分子变构调节剂(NNC0640)和拮抗性抗体(mAb1)抗原结合片段结合的复合物晶体结构，首次在较高分辨率水平为人们呈现了全长B型GPCR蛋白的三维结构，并揭示该受体不同结构域对其活化的协作调控机制，迈出了阐明B型GPCR信号转导机制的关键一步。 /p p 　　尔后， strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 中国科学院上海药物研究所的相关科研团队再次联合攻关，成功解析了全长GCGR与胰高血糖素类似物NNC1702结合的复合物晶体结构，从而揭示了B型GPCR与多肽配体结合的精细模式。 /span /strong 该项目负责人吴蓓丽研究员表示：“这项成果是我们针对B型GPCR开展结构与功能研究的又一重要进展。GCGR与多肽配体相互作用模式的阐明不仅有助于深入理解B型GPCR对细胞信号分子的识别机制，并且为靶向GCGR的药物设计提供了迄今为止精度最高的结构模版，将在很大程度上促进治疗2型糖尿病的新药的研发”。 /p p 　　该团队成员在以往的研究中发现，GCGR连接胞外结构域和跨膜结构域的肽段通过与受体蛋白其他区域的相互作用在受体活化调控中扮演关键角色。分析GCGR与多肽配体NNC1702结合的复合物结构，并与以往解析的全长GCGR结构进行比较，他们进一步发现该连接肽段在受体结合多肽配体时发生了显著的构象变化，其二级结构由β折叠转变为α螺旋，并伴随结构的迁移，使受体的两个结构域之间的相对取向发生了巨大变化，从而促进受体与多肽配体的紧密结合，导致受体激活。此外，该连接肽通过与多肽配体中段区域的相互作用对受体跨膜结构域的构象进行精细调节，进而调控受体活化。该论文的共同通讯作者赵强研究员说：“这一发现着实令人惊叹，虽然只含12个氨基酸，但这个连接肽却发挥着如此重要的作用，这在过去的GPCR结构研究中从未被发现过，使我们对B型GPCR的信号调控机制有了更为深入的认识”。 /p p 　　基于GCGR与NNC1702结合的复合物结构，该团队还运用受体?配体竞争结合、计算机模拟和双电子共振等多种技术手段开展了一系列功能性研究，阐明了GCGR在不同功能状态下构象的动态变化，并对受体活化的调控机制进行了深入的探究。这项研究得到上海药物研究所、复旦大学和上海科技大学等多个研究组的大力支持。项目的主要合作者之一、上海药物研究所所长蒋华良院士强调：“这不仅是上海药物所GPCR研究团队取得的又一项重大研究成果，也标志着一个GPCR研究高地已在上海科创中心建设的核心区——张江高科技园区崛起”。 /p p 　　研究论文的第一作者是研究生张浩楠，该项目的主要合作者还有中国科学院上海药物研究所王明伟研究员、杨德华研究员，上海科技大学iHuman研究所Raymond Stevens教授，丹麦诺和诺德公司Steffen Reedtz-Runge博士，加拿大多伦多大学Oliver Ernst教授，美国GPCR研究联盟Michael Hanson博士，郑州大学杨琳琳博士以及华东师范大学阳怀宇教授等。中国科学院、国家自然科学基金委员会、上海市科学与技术发展基金和上海市教育委员会等部门资助了这项研究。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/666c231c-94ff-404e-b55a-21bdda1b803e.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 全长GCGR结构示意图 /span /strong ：GCGR参与调节体内血糖稳态，是治疗2型糖尿病药物的重要靶点。 /p p style=" text-align: center " 左图为全长GCGR蛋白与小分子变构调节剂NNC0640以及拮抗性抗体mAb1结合的复合物晶体结构 /p p style=" text-align: center " 右图为全长GCGR蛋白与多肽配体NNC1702结合的复合物晶体结构。 /p p style=" text-align: center " 两个结构以飘带图和表面图表示，GCGR的跨膜结构域为蓝色，胞外结构域为橙色，连接肽为绿色，第一个胞外环区为紫红色，NNC1702为红色(右图)，NNC0640为黄色(左图)，抗体mAb1为蓝绿色(左图)。细胞膜以灰色区域表示 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 3Nature：厉害了，2018年上海药物所吴蓓丽研究组再次发表重磅研究成果 /span /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/b7ee28c2-3ed2-44b5-baa2-ac490b0f1a3f.jpg" / /p p 　　2018年4月19日，上海药物所吴蓓丽研究组，德国雷根斯堡大学Keller研究组，莱比锡大学Beck-Sickinger研究组合作在Nature发表题为 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " “Structural basis of ligand binding modes at the neuropeptide Y Y1 receptor”的研究论文 /span /strong ，该论文报告 span style=" color: rgb(31, 73, 125) " strong 分别以2.7和3.0Å 分辨率结合两种选择性拮抗剂UR-MK299和BMS-193885的人Y1R的晶体结构 /strong /span 。结合诱变研究的结构揭示了Y1R与几种结构不同的拮抗剂的结合模式以及配体选择性的决定因素。 Y1R结构和内源性激动剂NPY的分子对接，以及核磁共振，光交联和功能研究，为激动剂的结合行为提供了深入的见解，并且首次，根据上海药物所吴蓓丽等研究组的知识，确定其N端与受体相互作用。 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 对Y1R的这些基于结构的见解，可以实现靶向NPY受体的药物发现。 /span /strong 这是继2018年1月5日吴蓓丽研究组在Nature报告与胰高血糖素类似物和部分激动剂NNC1702复合的全长人胰高血糖素受体(GCGR)的3.0Å 分辨率晶体结构的又一重磅研究成果。 /p p 　　神经肽Y(NPY)受体属于G蛋白偶联受体超家族，在食物摄入，焦虑和癌症生物学中具有重要作用。 NPY-Y受体系统已经成为具有三种肽配体(NPY，肽YY和胰多肽)与大多数哺乳动物中的四种受体结合的最复杂网络之一，即具有不同亲和力的Y1，Y2，Y4和Y5受体和选择性。 NPY是最强大的食物摄入兴奋剂，这种作用主要由Y1受体(Y1R)介导。许多肽和小分子化合物已被定性为Y1R拮抗剂，并且在治疗肥胖，肿瘤和骨丢失方面显示出临床潜力。然而，它们的临床使用受低效力和选择性，脑穿透能力差或口服生物利用度不足妨碍。 /p p 　　在这里，上海药物所吴蓓丽等研究组报告分别以2.7和3.0Å 分辨率结合两种选择性拮抗剂UR-MK299和BMS-193885的人Y1R的晶体结构。结合诱变研究的结构揭示了Y1R与几种结构不同的拮抗剂的结合模式以及配体选择性的决定因素。 Y1R结构和内源性激动剂NPY的分子对接，以及核磁共振，光交联和功能研究，为激动剂的结合行为提供了深入的见解，并且首次，根据上海药物所吴蓓丽等研究组的知识，确定其N端与受体相互作用。 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " 对Y1R的这些基于结构的见解，可以实现靶向NPY受体的药物发现。 /span /strong /p

各省、自治区、直辖市农业农村（农牧、畜牧兽医）厅（局、委），新疆生产建设兵团农业农村局，中国动物疫病预防控制中心（农业农村部屠宰技术中心），中国动物卫生与流行病学中心，中国农业科学院农产品加工研究所：字体：[大 中 小]　　为保证畜产品质量安全，强化屠宰环节风险物质监测，我部组织制定了2021年国家屠宰环节质量安全风险监测计划。现印发你们，请认真组织开展工作。　　 农业农村部办公厅　　 2021年3月15日2021年国家屠宰环节质量安全风险监测计划　　一、监测目的　　动态了解我国屠宰环节中主要污染物及有害因素的污染情况和趋势，确定影响动物产品质量安全的潜在风险隐患和危害来源，掌握我国屠宰企业动物产品质量安全状况，为开展有针对性的监督检查和监管决策提供科学依据。　　二、职责分工　　2021年国家屠宰环节质量安全风险监测计划包括部级监测和省级监测两部分。　　（一）部级监测　　针对跨省流通的生猪屠宰企业开展微生物风险监测，重点监测菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特氏菌。针对跨省流通的牛、羊屠宰企业开展违法添加风险监测，重点监测9种β-受体激动剂（克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗和喷布特罗）、2种糖皮质激素（地塞米松、倍他米松）、6种类固醇激素（醋酸美仑孕酮、甲基睾丸酮、17α-群勃龙、17β-群勃龙、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇）。监测任务由农业农村部屠宰技术中心、中国动物卫生与流行病学中心、中国农业科学院农产品加工研究所共同承担。监测样品采取监测任务承担单位现场采集和各省（自治区、直辖市）农业农村部门采集邮递相结合的方式采集。具体任务分工见附件1。　　（二）省级监测　　主要对猪肉（2号或4号肉）、牛肉（黄瓜条或外脊）、羊肉（后腿或里脊）中水分开展品质监测。对猪肝中9种β-受体激动剂（克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗和喷布特罗）、2种糖皮质激素（地塞米松、倍他米松）、6种类固醇激素（醋酸美仑孕酮、甲基睾丸酮、17α-群勃龙、17β-群勃龙、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇）等药物开展违法添加实验室检测。重点对省内流通屠宰企业的产品进行监测，样品采集按照《屠宰企业畜禽及其产品抽样操作规范》（NY/T3227-2018）执行，确保监测的科学性和代表性。每个省份监测2个以上地市，猪、牛、羊屠宰企业监测数量原则上每种不少于8家，各省具体监测样品数量见附件2，其中水分监测猪牛羊肉样品合计400份。　　（三）数据汇总与分析　　农业农村部屠宰技术中心负责部级和省级屠宰环节质量安全风险监测数据的汇总与分析工作。　　三、检测方法及判定依据　　猪肉、牛肉、羊肉水分含量检测及判定参照《畜禽肉水分限量》（GB 18394-2020）；肝脏中9种β-受体激动剂、2种糖皮质激素、6种类固醇激素检测方法及判定依据由农业农村部屠宰技术中心统一提供。　　四、时间安排及相关要求　　（一）屠宰环节质量安全风险监测在上、下半年各开展一次，可结合飞行检查等工作任务一并开展。各省级农业农村部门要按照本计划要求，结合实际情况，制定本辖区屠宰环节质量安全风险监测方案并报我部备案，自行保障经费并组织实施。　　（二）请各省级农业农村部门于3月30日前将监测方案、抽样单位、承检单位及汇总分析单位、联系人及联系方式（附件3）报农业农村部屠宰技术中心备案。承担省级监测工作的机构，由省级农业农村部门确定；各承担检测任务机构原则上需通过国家检验检测机构中国计量认证（CMA），具备按照规范进行检验的能力。　　（三）请各风险监测承担单位分别于6月25日、11月25日前将风险监测汇总数据表（附件4）和监测总结分析报告，以电子邮件形式报农业农村部屠宰技术中心。　　请农业农村部屠宰技术中心分别于7月底和12月底前将部级和省级屠宰环节质量安全风险监测分析报告报我部畜牧兽医局。　　（四）未经我部同意，任何单位和个人不得以任何形式发布风险监测结果、报告和相关信息。　　联系人及联系方式：　　1.农业农村部畜牧兽医局：徐亭，电话：010-59191530　　2.农业农村部屠宰技术中心：雷春娟，电话：010-59198970，监测汇总上报邮箱：xqjiance@aliyun.com　　3.中国动物卫生与流行病学中心：王淑婷，电话：0532-85632052　　4.中国农业科学院农产品加工研究所：单吉浩，电话：010-62815881　　附件: 1.2021年部级屠宰环节质量安全风险监测任务表　 2.2021年省级屠宰环节质量安全风险监测任务表　　 3.省（自治区/直辖市）2021年屠宰环节风险监测承担单位备案表　　 4.屠宰环节质量安全风险监测结果汇总表及填报说明

3.15 晚会 曝光回顾 央视315晚会曝光青县瘦肉精羊肉问题 央视曝光后，沧州市委、市政府高度重视，迅速召开处置工作调度会，成立处置工作领导小组，立即责成农业农村、市场监管、gong安等部门连夜赶赴现场进行调查核实。目前，涉事企业负责人已被控制，对问题羊肉进行封存，正在追溯瘦肉精来源。 何为瘦肉精？ 瘦肉精是一类药物的统称，任何能够抑制动物脂肪生成，促进瘦肉生长的物质都可以称为“瘦肉精”。能够实现此类功能的物质主要是一类叫做β-受体激动剂（也称β-xing奋剂）的药物，其中较常见的有盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺 、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗和硫酸特布他林等。家畜摄入“瘦肉精”后能加速生长、提高瘦率、降低脂肪沉积、提高饲料报酬等，使用“瘦肉精”后会在动物组织内形成残留，消费者使用后直接危害身体健康。 我国在2002年就已经严禁瘦肉精作为兽药和饲料添加剂，但在畜牧业生产中“瘦肉精”的使用仍屡禁不止。 全面排查，严厉打击，月旭科技，应用支招。 月旭科技参照《农业部1063号公告-7-2008 饲料中8种β-受体激动剂的检测 气相色谱-质谱法》，对饲料中4种β-受体激动剂进行检测。 净化步骤 SPE柱：月旭Welchrom® P-SCX小柱，规格60mg/3mL。活化：3mL甲醇，3mL水，弃去；上样：准确吸取2mL试样溶液加至小柱，弃去；淋洗：2mL乙酸溶液，3mL甲醇，弃去；洗脱：3mL洗脱液洗脱至10mL带盖玻璃试管衍生瓶中，压干；将洗脱液于40℃下氮吹至干。 衍生：在衍生瓶中加入甲苯100μL，衍生试剂100μL，充分涡旋混匀后，置70℃烘箱中，反应1h。冷却至室温后上机测定。 色谱条件 色谱柱：WM-5MS，30m×0.25mm×0.25μm。进样口温度：250℃；升温程序：100℃，保持1min，以10℃/min升温至280℃，保持4min；载气：高纯氮气（纯度99.999%）；进样方式：不分流进样；恒流模式：1.0 mL/min；进样量：1μL。 质谱条件 电离方式：电子鸿轰击电离源（ESI）；电离能量：70eV；传输线温度：280℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；监测方式：马布特罗：277.1/204.0/296.0/311.1；克伦特罗：262.0/212.0/243.0/277.0；沙丁胺醇：369.2/73.0/116.0/203.0；班布特罗：354.2/282.1/309.1/439.3；溶剂延迟：9min。 色谱图或加标回收率结果

近日&ldquo 瘦肉精&rdquo 事件的发生使人们再次将注意力集中到动物体内的&beta -受体激动剂的检测。 我们平常说的&ldquo 瘦肉精&rdquo 是一类动物用药，有数种药物被称为瘦肉精，例如莱克多巴胺（Ractopamine）及克伦特罗（Clenbuterol）等。沃特世作为色谱分析行业的领导者，再一次展现了公司集成样品前处理SPE产品、色谱产品、质谱产品于一体的技术优势，在第一时间推出了包含前处理在内的解决方案。 使用沃特世混合型强阳离子交换OASIS® MCX SPE固相萃取柱结合ACQUITY UPLC® /Xevo® TQ超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪，可以在5分钟内轻松、快速、准确的检测到极低含量的&ldquo 瘦肉精&rdquo 类物质。例如在猪肉基质中的克伦特罗（Clenbuterol）可以达到低于0.005ppb（5ppt）的检测限。并且在0.05ppb基质浓度下6针重复进样RSD为2.65%。对于猪尿液当中的克伦特罗（Clenbuterol）甚至可以达到0.001ppb（1ppt）的检测限。沃特世UPLC/Xevo TQ 免费附带的Quanpedia方法库已经自带了超过28种常见&beta -受体激动剂的MRM条件，您无需再对这些化合物进行质谱参数的调谐即可轻松获取分析方法。 图一：沃特世UPLC/Xevo TQ超高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪 图二：基质当中0.05ppb克伦特罗（Clenbuterol）的检出信噪比S/N(PtP)60 图三：克仑特罗系由尿样获得，按照(A)20pg/mL，(B)10pg/mL和(C)1pg/mL加样。 猪肉及猪肝脏中的&beta -受体激动剂（克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、塞曼特罗、塞布特罗、溴代克仑特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺）的前处理方法如下： 1. 取2 g 粉碎样品，加入8 mL 0.2 M 的pH为5.2的乙酸钠缓冲液，充分混匀后，加入50 &mu L &beta -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶混匀，于37 ℃水浴水解过夜。 2. 将水解液振荡15 min，在5000 rpm条件下离心分离10 min后，取4 mL上清液，添加100 &mu L10ng/mL的内标溶液(克伦特罗-D9,沙丁胺醇-D3)混匀,加入5 L0.1M高氯酸混合均匀 并 调节溶液pH 值到1 ± 0.3。以5000 rpm条件下离心分离10 min后，移取上清液并用 10 M 的氢氧化钠溶液调节pH值到11。 3. 加入10 mL 饱和氯化钠溶液和10 mL 异丙醇-乙酸乙酯(6:4)混合溶液，离心分离后取有 机相，在40℃ 水浴下用氮气将其吹干。 4. 提取残渣中加入5 mL 0.2 M乙酸钠缓冲液(pH 5.2)，超声混匀溶解残渣。 5．进行下一步固相萃取净化。（参考下图） 解决方案涉及产品信息： SPE固相萃取柱：Oasis MCX 3cc/60mg （产品部件号186000254） UPLC色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，1.8um 2.1mm*50mm（产品部件号186003538） HPLC色谱柱：Atlantis T3，5um 2.1mm*150mm（产品部件号186003736） 关于沃特世（www.waters.com） 沃特世通过提供实用、可持续的科学创新为那些基于实验室工作的机构建立了商业优势，能使他们在提供健康、环境保护、食品安全和水质量方面取得杰出成就。 五十年来，沃特世已帮助客户进行意义深远的研究探索、优化操作、提供产品性能、及保证法规遵从等。 沃特世是上市公司（NYSE:WAT），总部设在马萨诸塞州的米尔福德市。它还是标准普尔500指数成员单位之一。现有近4,700 名雇员人。其生产企业位于马萨诸塞州米尔福德和陶顿，以及爱尔兰的维克斯福德，新加坡和英国的曼彻斯特。 在大多数国家，沃特世采取直接销售的方式，以便能与使用其产品的客户保持最紧密的联系。 了解更多有关沃特世公司的详细信息，请访问www.waters.com。

自2017年央视3.15曝光瘦肉精事件后，时隔4年之久，瘦肉精问题又再度登上315晚会。据315晚会报道，沧州青县是河北省的重要养殖基地，每年大约产出70万只羊，养殖户为了增加羊的出肉率，在饲料中偷偷混入“瘦肉精”，喂羊吃下，吃了瘦肉精的羊“一只可以多卖五六十元”。为了逃避监管，当地人一般会在运羊车上装上几只没有喂过瘦肉精的“绿色羊”应付检查。一肉联厂的负责人称：“无锡有客户，天津也有客户，河南也有客户。”目前，相关涉事企业负责人已被控制，郑州连夜突查流入市内的问题羊肉。什么是瘦肉精？瘦肉精的学名叫做「β2 肾上腺素受体激动剂」，它是一类物质的总称，而不是代表一种物质，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”，如一代瘦肉精：克伦特罗（clenbuterol）、沙丁胺醇（Salbutamol）和二代瘦肉精莱克多巴胺（Ractopamine）等等，这些药物都可以使动物体产生较多的瘦肉。使用“瘦肉精”后会在动物组织内形成残留，消费者食用后直接危害人体健康。国务院食品安全委员会办公室《“瘦肉精”专项整治方案》（食安办〔2011〕14号）规定的“瘦肉精”品种目录：盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。民以食为天，为了保障广大群众餐桌上的安全，支持国家和各地瘦肉精相关药物残留监测工作的开展，坛墨质检多年以来持续进行瘦肉精相关兽药残留的标准物质研制工作，为食品安全保驾护航。

血管生成血管生成，即从已存在的血管中生成新血管。此通路是通过人体中存在的诸多互补和复杂的信号途径调节的。正常情况下，血管生成的相关诱导剂和抑制剂之间保持平衡状态。但对于创伤、缺氧或炎症继发等微环境破坏的条件下，此通路能做出迅速的应答。在各种慢性病理和肿瘤的情况下，血管生成的平衡状态被打破，导致异常的血管生成或新生血管。血管生成信号通路转导过程血管生成的激活导致促血管生成生长因子（vegf、pdgf、fgf和tgf等）的释放，这些因子将其受体结合到已有血管内的内皮细胞上，从而诱导pi3k/akt、erk1/2、smad和notch等多种途径的信号转导，引起内皮细胞增殖和迁移。内皮细胞利用基质金属蛋白酶和整合素来消化细胞外基质，迁移到新的区域，在那里它们延长并形成管子，产生新的血管。在肿瘤血管生成过程中，癌细胞刺激新血管的形成，为肿瘤输送氧气和营养。随着肿瘤的生长，位于肿瘤中心的细胞缺氧，使得转录因子hif-1α（缺氧诱导因子-1）稳定表达。该转录因子与hif-1β结合上调几种促血管生成基因的表达。此外，生长因子信号还刺激hif-1活性，以维持生长细胞的氧稳态。血管生成信号通路图 产品列表 *flt项目号产品名称规格cas包装细胞靶点ic50kis129593sorafenib tosylate≥99%475207-59-150mg,100mg,250mg,1g,5g无细胞raf-16 nmb-raf22 nmvegfr-290 nmvegfr-320 nmpdgfr-β57 nmflt-359 nmc-kit68 nmt127762tozasertib≥98%639089-54-625mg,100mgflt330 nms125267sp600125≥98%129-56-625mg,100mg,500mg,1g,5g无细胞jnk140 nmjnk240 nmjnk390 nmf127011foretinib (gsk1363089)≥98%849217-64-75mg,25mg,100mg无细胞met0.4 nmkdr0.9 nmq127558quizartinib (ac220)≥99%950769-58-15mg,10mg,50mg,500mgmv4-11flt3(itd)1.1 nm/4.2 nm rs4 11flt3(wt)1.1 nm/4.2 nmd126778dovitinib (tki-258, chir-258)≥99%405169-16-610mg,50mg,250mg无细胞flt31 nmc-kit2 nmt126330fedratinib (sar302503, tg101348)≥98%936091-26-85mg,25mg,100mg无细胞jak23 nml126993linifanib (abt-869)≥99%796967-16-35mg,10mg,50mgkdr4 nmcsf-1r3 nmflt-1/33 nm/4 nmpdgfrβ66 nmc127776crenolanib (cp-868596)≥99%670220-88-95mg,10mg,50mgpdgfrα2.1 nmpdgfrβ3.2 nmr129910r406 (free base)≥99%841290-80-05mg,10mg,25mg,50mg,100mgsyk41 nmm127412amuvatinib (mp-470)≥98%850879-09-35mg,25mg,100mgc-kit10 nmpdgfα40 nmflt381 nmt125150tandutinib (mln518)≥98%387867-13-225mg,100mg,500mgflt30.22 μmt127523tg10120998%936091-14-45mg,25mg,100mg无细胞jak26 nmflt325 nmret17 nmk127169kw-2449≥98%1000669-72-65mg,25mg,100mgflt36.6 nme126318enmd-2076≥99%934353-76-15mg,10mg,50mgaurora a14 nmflt31.86 nml127618ldk378≥99%1032900-25-65mg,25mg,100mg,250mg无细胞alk0.2 nmigf-1r8 nminsr7 nmstk22d23 nmflt360 nmp129908prt062607 (p505-15, biib057) hcl≥98%1370261-97-45mg,25mg无细胞syk1 nms125098sorafenib≥99%284461-73-0250mg,1g无细胞raf-16 nmb-raf22 nmvegfr-290 nmvegfr-320 nmpdgfr-β57 nmflt-359 nmc-kit68 nmc129757cabozantinib malate (xl184)≥99%1140909-48-310mg,25mg,50mg,100mg,250mgvegfr20.035 nm无细胞c-met1.3 nmret4 nmkit4.6 nmflt-1/3/412 nm/11.3 nm/6 nmtie214.3 nmaxl7 nmt129806tcs 359≥99%301305-73-710mg,25mg,50mgflt343 nme129946enmd-2076 l-(+)-tartaric acid≥99%1291074-87-75mg,25mgaurora a14 nmvegfr(flt3)1.86 nml127298ly2801653-1206799-15-65mg,10mg,50mgmet2 nmc168062crotonoside95% (hplc)1818-71-95mg,10mg,25mgflt3hdac3/6g172979gilteritinib97%1254053-43-45mg,100mgflt30.29 nmaxl0.73 nmp171724pexidartinib97%1029044-16-35mg,100mgcsf-1r20 nmkit10 nmflt3160 nm *dna alkylator项目号产品名称规格cas包装细胞靶点ic50ec50kis129593sorafenib tosylate≥99%475207-59-110mg,50mg,250mg,1g,5g无细胞raf-16 nmb-raf22 nmvegfr-290 nmvegfr-320 nmpdgfr-β57 nmflt-359 nmc-kit68 nme129728sunitinib malate≥99%341031-54-7100mg,500mg,1g无细胞vegfr2 (flk-1)80 nmpdgfrβ2 nml125046lenalidomide≥99%191732-72-650mg,250mg,1g,5gpbmcstnf-α13 nmc126195cabozantinib (xl184, bms-907351)≥98%849217-68-15mg,10mg,50mg,100mg,250mg无细胞vegfr20.035 nmc-met1.3 nm ret4 nmkit4.6 nmflt-1/3/412 nm/11.3 nm/6 nmtie214.3 nmaxl7 nmp127550ponatinib (ap24534)≥99%943319-70-810mg,50mg,250mg无细胞abl0.37 nmpdgfrα1.1 nmvegfr21.5 nmfgfr12.2 nmsrc5.4 nmk125585ki20227≥98%623142-96-110mg,50mgkdr2 nmvegfr-212 nmc-kit451 nmpdgfrβ217 nma129732axitinib≥99%319460-85-010mg,50mg,250mg,1g猪主动脉内皮细胞vegfr10.1 nmvegfr20.2 nmvegfr30.1-0.3 nmpdgfrβ1.6 nmc-kit1.7 nmf127011foretinib (gsk1363089)≥98%849217-64-75mg,25mg,100mg无细胞met0.4 nmkdr0.9 nmn129725nintedanib (bibf 1120)≥98%656247-17-55mg,10mg,25mg,50mg,100mg,500mg无细胞vegfr134 nmvegfr213 nmvegfr313 nmfgfr169 nmfgfr237 nmfgfr3108 nmpdgfrα59 nmpdgfrβ65 nmv125180vandetanib (zd6474)≥99%443913-73-325mg,100mg,500mg无细胞vegfr240 nmvegfr3110 nmegfr500 nmr127804regorafenib (bay 73-4506)≥99%755037-03-75mg,10mg,25mg,100mg无细胞vegfr113 nmvegfr24.2 nmvegfr346nmpdgfr-β22 nmkit7 nmret1.5 nmraf-12.5 nmp129722pazopanib hcl (gw786034 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高分辨氢氘交换质谱技术解析天然免疫受体构象变化与信号传导机制 MDA5是细胞内的异体RNA监测蛋白，属于RIG-I样受体家族（RLRs）的重要成员。MDA5参与多种RNA病毒引起的免疫反应，是天然免疫的一道重要屏障。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三个成员，其中RIG-I和MDA5的N端均拥有串联CARDs结构域，可通过CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最终促进I型干扰素（IFN）通路的激活。在RLRs抗病毒信号的激活过程中，K63连接的多聚泛素链（K63-polyUb）起着关键作用[1]。前期研究发现，短链K63-polyUb可以通过共价锚定和非共价锚定两种方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2, 3]。形成的异源四聚体复合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纤维的核心[2, 3]。然而，K63-polyUb是如何调控MDA5 CARDs组装以及招募、激活MAVS CARD的分子机制，仍是待解决的科学问题。 Immunity近期中国科学院上海药物研究所郑杰团队在Immunity杂志上以Research Article形式在线发表了题为“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains”的研究成果，本研究通过生物大分子氢氘交换质谱技术（HDX-MS）以及冷冻电镜技术（Cryo-EM）揭示了长链，非锚定K63-polyUb促进MDA5-MAVS组装程序与信号传递的分子机制。MDA5-MAVS首先研究人员建立了K63-，K48-连接泛素链的生化合成平台，并制备了不同长度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（图1）。通过基于Orbitrap Fusion平台的氢氘交换质谱技术（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人员发现MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氢氘交换保护程度依赖于不同长度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8 RIG-I: n≥3）而不依赖于K48-polyUbn（n≥10）；并且保护强度随着K63-polyUb的长度增加而特异性加强。 图1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）对RLR CARDs寡聚的影响（点击查看大图） 为了研究K63-polyUbn介导的MDA5CARDs寡聚体的组装机制，研究人员利用冷冻电镜首次解析得到了分辨率为3.3Å的MDA5CARDs与K63-polyUb13复合体的结构。这也是MDA5CARDs第一个近原子分辨率的冷冻电镜结构。 那么MDA5CARDs-K63-polyUbn异源四聚体又是如何招募其下游信号蛋白MAVS？研究人员进一步通过Cryo-EM解析得到了分辨率为3.2Å的由长链K63-polyUb11拴系的“自下而上”的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD复合体结构。 同时研究人员通过生物大分子氢氘交换质谱技术，首次证明了人类MDA5全长蛋白的CARDs在初始状态下处于张开的构象并可与长链K63-polyUb10结合。然而在早期研究中，氢氘交换质谱已经证明了RIG-ICARDs在初始状态下呈闭合的构象[4, 5]。这也直接证明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液状态下构象上的巨大差异。其次，研究人员进一步发现K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs复合物在溶液中的稳定性受MDA5的RNA依赖的ATP酶活性别构调节。图2：HDX-MS分析全长MDA5在其识别配体或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的动态的构象变化与信号传导机制（点击查看大图）综上所述该研究通过生物大分子氢氘交换质谱和冷冻电镜技术发现长链，非锚定K63-polyUb类似于一个“分子桥梁”，促进了MDA5CARDs四聚体的组装，使之形成一个激动状态的构象来招募下游MAVSCARD，以进一步促进MAVSCARD的寡聚和激活（图2）。激活状态下的MDA5可以结合并水解ATP，远程提升CARDs-K63-polyUb10的稳定性以持续激活MAVS。该研究弥补了MDA5通路激活与信号传导研究的空白，进一步揭示了长链，非锚定K63-polyUb在细胞内作为内源性激动剂的免疫学功能，为理解泛素分子多样性在抗RNA病毒天然免疫信号传导与调控中的作用提供了新的线索。* 上海药物所博士后宋斌和美国NIH Research Associate陈运为论文第一作者，上海药物所郑杰研究员为论文的通讯作者。该工作得到了新加坡南洋理工大学罗大海教授、吴彬教授，美国Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海药物所罗成研究员和张乃霞研究员的大力支持，得到了国家自然科学基金、上海市浦江人才计划等项目的支持。 专家访谈郑杰（中国科学院上海药物研究所 研究员）Q根据您的经验对氢氘交换质谱技术的理解？以及这篇文章的主要的难点在哪里？答：我觉得HDX-MS是基于生物化学这个学科，围绕表征酶活反应机理的一个很实用的技术，HDX-MS第一个应用是来自美国工业界，可以很好地应用于药物发现。这个新工作的一个难点就是采用生化合成了不同长度的K63多聚泛素链，并对RLR CARDs进行了后续功能筛选和表征。如果无法系统合成K63-polyubn（n＞8），我们也无法解决这个科学问题。Q基于高分辨质谱技术的HDX-MS技术作为捕捉蛋白质溶液构象变化的重要研究工具，相对于冷冻电镜技术提供哪些不可或缺的生物学信息？答：HDX-MS和cryoEM提供的信息非常互补，首先，两者联用可以提供高分辨的结构和溶液中动态构象变化的信息。其次，在我们这个研究中，我们使用了HDX-MS去表征MDA5全长蛋白的一系列的构象变化，这对cryoEM研究是很有难度的，因为全长MDA5 的CARDs和Helicase之间的linker长度达到了120个氨基酸且在溶液中是非常活跃的，我们这次利用了HDX分析了MDA5与RNA，ATP互作如何远程调控CARDs与K63-polyub的构象变化。表征好这一系列的构象变化就是表征MDA5在溶液状态下是如果进行信号传导的机制。QHDX-MS技术目前有哪些应用方向，未来应用前景如何？答：HDX-MS捕捉的是溶液状态下蛋白质稳态的信息，研究蛋白质动力学，这对药物发现（drug discovery）研究非常关键，可以大大加速药物的发现与研发。HDX-MS可以直接提供药物与小分子互作，以及生物大分子抗体药物识别抗原等研究提供接近生理意义的重要信息。我博士后是在美国Scripps研究所Patrick Griffin教授进行的训练，当时实验室的同事很多都去了美国大药企利用HDX-MS参与药物发现。其中Mike还在礼来公司搭建了一套高通量全自动的HDX设备，专门为礼来的小分子药物发现筛选而设定。回国后我们也正朝着这个方向努力，实现HDX-MS软件和硬件的进一步自动化，希望未来在国内可以实现HDX-MS高通量。另一个努力的方向是早日实现单氨基酸残基分辨率的HDX-MS技术的升级，这可以 帮助精准表征药物作用关键氨基酸残基。为了实现这个目标，HDX-MS的自动化进样平台机械臂模块需要一定的改造，比如更严格的控温，更高频率的连续进样来优化质谱的采集效率。最终我希望可以利用高通量HDX-MS平台去建一个蛋白库，提供氢键，自由能，单氨基酸残基HDX等可以量化的参数，更精准的帮助科研工作者了解蛋白质的折叠，去折叠等稳态的信息。 关于作者中国科学院上海药物研究所郑杰实验室长期结合生物大分子氢氘交换质谱技术交叉解决由蛋白质（酶）的动力学异常变化所导致的重大疾病的发生机制，聚焦RNA天然免疫模式识别受体的内源，外源性配体识别与信号传导机制，以及自身免疫疾病发生机制。围绕氢氘交换及其应用，以第一作者或通讯作者在Immunity 2021，Anal Chem 2019，Nat Commun 2018，structure 2018， Nat Commun 2017，Nucleic Acids Res 2015等期刊上。感谢郑杰老师对本文的指导与支持参考文献：1. Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.2. Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.3. Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.4. Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.5. Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.扫描下方二维码即可获取赛默飞全行业解决方案，或关注“赛默飞色谱与质谱中国”公众号，了解更多资讯+

兽药非法添加物通常指的是在兽药生产过程中未经批准或超出规定范围添加的化学物质，这些物质可能对动物健康和人类食品安全构成风险。及时对兽药非法添加物进行检测，可以确保兽药的安全性和有效性，防止非法添加物对动物和人类健康造成危害，同时保障食品安全和公共卫生。兽药非法添加物检测通常在以下情况下进行：1. 兽药生产过程中的质量控制。2. 兽药上市前的注册检验。3. 市场监管中的随机抽检。4. 怀疑兽药存在质量问题时的专项检测。通过这些检测，可以及时发现并处理非法添加问题，保护消费者权益，维护市场秩序。检测主要用到的仪器为：高效液相色谱仪、液相色谱-质谱联用仪、显微镜等。中国农业农村部已经组织制定了多项兽药中非法添加物的检查方法标准，以加强兽药监管。这些标准包括《兽药制剂中非法添加磺胺类药物检查方法》、《兽药中非特定非法添加物质检查方法》等，旨在规范兽药生产，确保兽药中不含有非法添加物质。据仪器信息网查询和统计，截至2024年6月30日，农业农村部官方网站上一共公告了61种兽药非法添加物检测标准与方法，整理如下表所示，供各行业的读者参考借鉴。序号名称兽药制剂非法添加物发布时间文件/公告号01《硫酸卡那霉素注射液中非法添加尼可刹米检查方法》硫酸卡那霉素注射液尼可刹米2016.05.09农业部公告第2395号02《恩诺沙星注射液中非法添加双氯芬酸钠检查方法》恩诺沙星注射液双氯芬酸钠2016.05.19农业部公告第2398号03《中药散剂中非法添加呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因检查方法》中药散剂：止痢散、清瘟败毒散、银翘散呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因2016.09.23农业部公告第2448号《兽药制剂中非法添加磺胺类药物检查方法》等34项检查方法（修订31个；新建3个）04《中兽药散剂中非法添加氯霉素检查方法》中兽药散剂：白头翁散、苍术香连散、银翘散氯霉素2016.09.2305《中药散剂中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇检查方法》中药散剂：止痢散、健胃散、清瘟败毒散、胃肠活、肥猪散、清热散、银翘散乙酰甲喹、喹乙醇2016.09.2306《黄芪多糖注射液中非法添加解热镇痛类、抗病毒类、抗生素类、氟喹诺酮类等11种化学药物（物质）检查方法》黄芪多糖注射液解热镇痛类：对乙酰氨基酚、安乃近、氨基比林、安替比林；抗病毒类：利巴韦林、盐酸吗啉胍；抗生素类：林可霉素；氟喹诺酮类：诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等11种化学药物（ 物质）2016.09.2307《肥猪散、健胃散、银翘散等中药散剂中非法添加氟喹诺酮类药物（物质）检查方法》肥猪散、健胃散、银翘散氟喹诺酮类药物（物质）：氧氟沙星、诺氟沙星等2016.09.2308《氟喹诺酮类制剂中非法添加乙酰甲喹、喹乙醇等化学药物检查方法》氟喹诺酮类制剂：氧氟沙星制剂、诺氟沙星（及其盐）制剂、恩诺沙星（及其盐）制剂、环丙沙星（及其盐）制剂乙酰甲喹、喹乙醇2016.09.2309《氟苯尼考粉和氟苯尼考预混剂中非法添加氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星检查方法》氟苯尼考粉、氟苯尼考预混剂氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星2016.09.2310《氟苯尼考制剂中非法添加磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶检查方法》氟苯尼考制剂：氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考粉、氟苯尼考预混剂、氟苯尼考溶液、氟苯尼考注射液磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶2016.09.2311《乳酸环丙沙星注射液中非法添加对乙酰氨基酚检查方法》乳酸环丙沙星注射液对乙酰氨基酚2016.09.2312《阿莫西林可溶性粉中非法添加解热镇痛类药物检查方法》阿莫西林可溶性粉解热镇痛类药物：对乙酰氨基酚、安替比林、氨基比林、安乃近、萘普生2016.09.2313《注射用青霉素钾（钠）中非法添加解热镇痛类药物检查方法》注射用青霉素钾（钠）解热镇痛类药物：安乃近、对乙酰氨基酚、氨基比林、安替比林、2016.09.2314《氟苯尼考制剂中非法添加烟酰胺、氨茶碱检查方法》氟苯尼考制剂：氟苯尼考粉、氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考预混剂烟酰胺、氨茶碱2016.09.2315《氟喹诺酮类制剂中非法添加对乙酰氨基酚、安乃近检查方法》氟喹诺酮类制剂：氧氟沙星、诺氟沙星（及其盐）、恩诺沙星（及其盐）、环丙沙星（及其盐）注射液、可溶性粉及粉剂对乙酰氨基酚、安乃近2016.09.2316《硫酸庆大霉素注射液中非法添加甲氧苄啶检查方法》硫酸庆大霉素注射液甲氧苄啶2016.09.2317《氟苯尼考固体制剂中非法添加β-受体激动剂检查方法》氟苯尼考固体制剂：氟苯尼考粉、可溶性粉、预混剂β-受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、氯丙那林2016.09.2318《盐酸林可霉素制剂中非法添加对乙酰氨基酚、安乃近检查方法》盐酸林可霉素制剂：盐酸林可霉素可溶性粉、注射液乙酰氨基酚、安乃近2016.09.2319《黄芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸钠检查方法》黄芪多糖注射液地塞米松磷酸钠2016.09.2320《氟苯尼考液体制剂中非法添加β-受体激动剂检查方法》氟苯尼考液体制剂：氟苯尼考注射液、溶液β-受体激动剂：克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、西马特罗、西布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、氯丙那林2016.09.2321《柴胡注射液中非法添加利巴韦林检查方法》柴胡注射液利巴韦林2016.09.2322《柴胡注射液中非法添加盐酸吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺检查方法》柴胡注射液盐酸吗啉胍、金刚烷胺、金刚乙胺2016.09.2323《柴胡注射液中非法添加对乙酰氨基酚检查方法》柴胡注射液对乙酰氨基酚2016.09.2324《鱼腥草注射液中非法添加甲氧氯普胺检查方法》鱼腥草注射液甲氧氯普胺2016.09.2325《鱼腥草注射液中非法添加林可霉素检查方法》鱼腥草注射液林可霉素2016.09.2326《鱼腥草注射液中非法添加水杨酸、氧氟沙星检查方法》鱼腥草注射液水杨酸、氧氟沙星2016.09.2327《中兽药散剂中非法添加金刚烷胺和金刚乙胺检查方法》中兽药散剂：白头翁散、苍术香连散、银翘散金刚烷胺、金刚乙胺2016.09.2328《扶正解毒散中非法添加茶碱、安乃近检查方法》扶正解毒散茶碱、安乃近2016.09.2329《黄连解毒散中非法添加对乙酰氨基酚、盐酸溴己新检查方法》黄连解毒散对乙酰氨基酚、盐酸溴己新2016.09.2330《酒石酸泰乐菌素可溶性粉中非法添加茶碱检查方法》酒石酸泰乐菌素可溶性粉茶碱2016.09.2331《硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加诺氟沙星检查方法》硫酸安普霉素可溶性粉诺氟沙星2016.09.2332《硫酸黏菌素预混剂中非法添加乙酰甲喹检查方法》硫酸黏菌素预混剂乙酰甲喹2016.09.2333《硫酸安普霉素可溶性粉中非法添加头孢噻肟检查方法》硫酸安普霉素可溶性粉头孢噻肟2016.09.2334《阿维拉霉素预混剂中非法添加莫能菌素检查方法》阿维拉霉素预混剂莫能菌素2016.09.2335《甘草颗粒中非法添加吲哚美辛检查方法》甘草颗粒吲哚美辛2016.09.2336《兽药制剂中非法添加磺胺类药物检查方法》阿莫西林可溶性粉、氟苯尼考粉、盐酸林可霉素注射液、伊维菌素注射液、恩诺沙星注射液、盐酸环丙沙星可溶性粉、鱼腥草注射液、止痢散、黄芪多糖注射液、健胃散磺胺类药物：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑2016.09.2337《兽药中非法添加甲氧苄啶检查方法》替米考星预混剂、磷酸泰乐菌素预混剂、盐酸多西环素可溶性粉、乳酸环丙沙星可溶性粉及注射液、恩诺沙星注射液甲氧苄啶2016.10.08农业部公告第2451号38《兽药中非法添加氨茶碱和二羟丙茶碱检查方法》环丙沙星注射液及可溶性粉、恩诺沙星注射液、替米考星注射液及预混剂、盐酸多西环素可溶性粉、酒石酸泰乐菌素可溶性粉、磷酸泰乐菌素预混剂、金花平喘散、荆防败毒散、麻杏石甘散氨茶碱、二羟丙茶碱2016.10.0839《兽药中非法添加对乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸钠检查方法》氟苯尼考粉及预混剂、泰乐菌素预混剂、替米考星预混剂及注射液、板蓝根注射液、穿心莲注射液对乙酰氨基酚、安乃近、地塞米松和地塞米松磷酸钠2016.10.0840《兽药中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹检查方法》硫酸黏菌素可溶性粉及预混剂、黄连解毒散、白头翁散喹乙醇和乙酰甲喹2016.10.0841《硫酸黏菌素制剂中非法添加阿托品检查方法》硫酸黏菌素制剂：硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸黏菌素预混剂阿托品2016.10.0842《鱼腥草注射液中非法添加庆大霉素检查方法》鱼腥草注射液庆大霉素2017.02.27农业部公告第2494号43《兽药中非法添加非泼罗尼检查方法》阿维菌素粉非泼罗尼2017.08.31农业部公告第2571号44《兽药中非法添加药物快速筛查法（液相色谱-二级管阵列法）》兽药兽药及其原料与辅料中紫外光谱图库中所列153种药物2019.05.16农业部公告第169号45《麻杏石甘口服液、杨树花口服液中非法添加黄芩苷检查方法》麻杏石甘口服液、杨树花口服液黄芩苷2019.07.31农业农村部公告第199号46《兽药中非特定非法添加物质检查方法》兽药非特定非法添加物质：对人或动物具有药理活性或毒性作用等的物质2020.05.09农业农村部公告第289号47《中兽药固体制剂中非法添加物质检查方法—显微鉴别法》不含动物类、矿物类药材的中兽药散剂；中兽药散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂化学成分；其他药味2020.05.0948《兽药中非法添加硝基咪唑类药物检查方法》盐酸多西环素可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉罗硝唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奥硝唑或异丙硝唑2020.05.0949《兽药中非法添加四环素类药物的检查方法》麻杏石甘散、银翘散、替米考星预混剂、氟苯尼考预混剂、磺胺氯吡嗪钠可溶性粉四环素类药物：土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素2020.11.19农业农村部公告第361号50《兽药固体制剂中非法添加酰胺醇类药物的检查方法》健胃散、止痢散、球虫散、胃肠活、阿莫西林可溶性粉、氨苄西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、盐酸大观霉素林可霉素可溶性粉、盐酸土霉素预混剂、注射用盐酸土霉素、盐酸金霉素可溶性粉、酒石酸泰乐菌素可溶性粉、硫酸红霉素可溶性粉、替米考星预混剂、盐酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、恩诺沙星可溶性粉、盐酸环丙沙星可溶性粉、氧氟沙星可溶性粉、盐酸环丙沙星小檗碱预混剂、阿苯达唑伊维菌素预混剂、阿维菌素粉、地克珠利预混剂、维生素C可溶性粉、复方维生素B可溶性粉酰胺醇类药物：甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素2020.11.1951《兽药制剂中非法添加磺胺类及喹诺酮类25种化合物检查方法》黄芪多糖注射液、维生素C可溶性粉、硫酸卡那霉素注射液磺胺脒、磺胺、磺胺二甲异嘧啶钠、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、磺胺吡啶、马波沙星、磺胺甲基嘧啶、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯达嗪钠、沙拉沙星、磺胺多辛、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺苯甲酰、磺胺氯吡嗪钠、磺胺地索辛、磺胺喹噁啉或磺胺苯吡唑等磺胺类及喹诺酮类25种化合物2021.01.11农业农村部公告第384号52林可霉素注射液中非法添加盐酸左旋咪唑检查方法林可霉素注射仦盐酸左旋咪唑2021.11.8农业农村部公告第485号53硫酸新霉素可溶性粉中非法添加苯并咪唑和大环内酯类抗寄生虫药物检查方法硫酸新霉素可溶性粉氧阿苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、三氯苯达唑、乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、伊维菌素2022.10.13农业农村部公告第611号54复方麻黄散中非法添加喹烯酮检查方法复方麻黄散喹烯酮2022.10.13农业农村部公告第611号55恩诺沙星注射液中非法添加呋噻米检查方法恩诺沙星呋噻米2022.10.13农业农村部公告第611号56鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法鸡传染性支气管炎活疫苗-2023.10.23农业农村部公告第717号57鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法鸡传染性法氏囊病活疫苗-2023.10.2358鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法

建设世界一流的国产稳定同位素标记物产业化基地，为食品安全检测提供长期可靠的保障是十三五国家重点研发计划“食品安全关键技术研发”重点专项的任务之一。作为任务承接单位，阿尔塔科技有限公司开展科研攻关，已开发十余种稳定同位素标记物制备共性关键技术，实现了上百种的稳定性同位素标记农药、兽药、食品添加剂的量产和可持续供应，提前超额完成课题指标，稳定同位素标记物产业化基地建设成果斐然，国产化和替代进口成绩显著。阿尔塔科技将陆续推出稳定同位素标记物产业化基地建设成果系列报道，展示阿尔塔科研团队的研发成果，包括但不限于十三五项目开发的稳定同位素标记RM。产品的化学结构、化学纯度和同位素丰度、均匀性和稳定性均经过严格的检测和评估，质量媲美进口产品，价格较进口产品大幅降低。阿尔塔科技期待与更多的科研机构、检测实验室进行合作，持续开发市场需求的高品质产品，为我国食品安全检测提供助力。作为系列报道的开篇之作，本期向您推荐稳定同位素标记的beta-受体激素类化合物。部分稳定同位素标记beta-受体激素类化合物产品号中文名称英文名称包装规格溶剂1ST1352克伦特罗-D9盐酸盐Clenbuterol-d9 hydrochloride100μg/mL, 1mL甲醇1ST1353沙丁胺醇-D3Salbutamol-d3100μg/mL, 1mL甲醇1ST1304D9A特布他林-D9盐酸盐Terbutaline-d9 hydrochloride5mg；100μg/mL, 1mL甲醇1ST1381莱克多巴胺-D3盐酸盐Ractopamine-d3 hydrochloride100μg/mL, 1mL甲醇1ST1360莱克多巴胺-D6盐酸盐Ractopamine-d6 hydrochloride100μg/mL, 1mL甲醇1ST1355西马特罗-D7Cimaterol-d7100μg/mL, 1mL甲醇1ST1363克伦普罗-D7Clenproperol-d75mg；100μg/mL, 1mL甲醇1ST1385喷布特罗-D9盐酸盐Penbutolol-d9 hydrochloride5mg；100μg/mL, 1mL甲醇1ST1328D3苯乙醇胺A-D3Phenylethanolamine A-d35mg；100μg/mL, 1mL甲醇1ST1371沙美特罗-D3Salmeterol-d3100μg/mL, 1mL甲醇1ST1303D9盐酸妥布特罗-D9Tulobuterol-d9 hydrochloride100μg/mL, 1mL甲醇1ST1313D7氯丙那林-D7Clorprenaline-d75mg；100μg/mL, 1mL甲醇了解更多产品或需要定制服务，请联系我们！

瘦肉精是一类动物用药，有数种药物被称为瘦肉精，例如莱克多巴胺（Ractopamine）及克伦特罗（Clenbuterol）等。将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。在中国，通常所说的&ldquo 瘦肉精&rdquo 则是指克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。 动物源性样品中瘦肉精的检测方法： 1. 动物源性样品中&beta -受体激动剂的检测（SPE-LC/MS） 1) SPE方法 货号：60107-304 固定相：Thermo HyperSep Retain-CX 柱体积：3ml 固定相重量：200mg 酶解：动物源性样品2g（精确到0.01g）于50ml离心管中，加入0.2mol/L乙酸铵溶液（pH5.2）10ml，然后加入&beta -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40&mu l，涡旋混匀3min，于37℃下水浴避光振荡16h。 提取：样品酶解后放置至室温，涡旋混匀3min，高速离心10min，取出上清液，加入1mol/L高氯酸溶液1ml，涡旋，混匀，高速离心10min后，转移上清液至另一50ml离心管内。 活化：3ml甲醇，3ml水，3ml0.5mol/L高氯酸 上样：样品 清洗：3ml水，3ml甲醇，柱子抽干 洗脱：3ml5%氨水甲醇溶液 2）LC/MS方法 色谱柱：Hypersil Gold，5&mu m，2.1× 150mm 货号：25005-152130 流动相：A：水（5mM乙酸铵）B：甲醇，梯度洗脱程序： 表1 流动相梯度洗脱条件 Time（min） A（%） B（%） 0 90 10 0.5 90 10 5 10 90 10 10 90 10.1 90 10 12 90 10 进样量：10&mu L 流速：250&mu L /min MS条件：电喷雾电离源（ESI），正离子模式 选择反应监控（SRM）扫描模式 喷雾电压：4500V 离子传输管温度：350℃ 结果 1. 典型LC/MS/MS色谱图 3. 定量限（LOQ）：本方法沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗、喷布特罗和心得安在猪肝、猪肉、牛奶和鸡蛋等动物源性食品组织中的定量限均可达0.1&mu g/kg，西马特罗、特布他林为0.5&mu g/kg。 提取回收率均可达75-120%。

p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/a52597f0-6ebf-4fa2-b903-6fc7ff0bbc8a.jpg" / p 　　前天(8月28日)是我国的七夕，两家业内熟知的医药公司吉利德和Kite Pharma“联姻”了! p 　　119亿美元，吉利德全现金“迎娶”Kite Pharma /p p 　　前日，吉利德和Kite Pharma联合宣布，双方已经达成最终收购协议，吉利德将以每股180美元的现金价格收购Kite，总计119亿美元，相比Kite Pharma上周五的收盘价溢价29%，值得一提的是，此次收购采用的是全现金收购，该交易得到了吉利德公司董事会和风筝医药公司董事会的一致批准，预计将在2017年第四季度完成。 /p p 　　吉利德作为财大气粗的“金主”，手握几大重磅丙肝药物，自然不差钱，近几年，吉利德凭借其雄厚的财力对不少公司或药物进行了收购，且眼光独到，用现在的话说就叫“稳准狠”。 /p p 　　2011年，吉利德以每股137美元现金共计113亿美元收购Pharmasset公司，当时，业界都认为吉利德做了一次赔本买卖，因为当时Pharmasset公司有82名员工，净亏损9120万美元，没有产品上市，然而Sovaldi和Harvoni上市第一年就连本带利收回当年投入。 /p p 　　2014年，吉利德以6亿美元收购PI3K抑制剂Idelalisib，该产品后被FDA同一天批准用于3个血癌的治疗 /p p 　　2015年1月，吉利德宣布以4.7亿美元收购德国生物制药公司Phenex，当时Phenex最重要的资产是二期临床的法尼酯X受体激动剂PX-104，主要适应症是非酒精脂肪肝(NASH)，这个机理在代谢疾病这个大领域有很多其它潜在用途 /p p 　　2015年12月，吉利德以20亿美元高价收购Galapagos公司JAK抑制剂filgotinib，刷新了自免疫疾病药物史上最“壕”的收购记录，然而filgotinib因为仅需口服，相比于其他抗TNF药物通常以皮下注射的给药方式，其优势不言而喻。 /p p 　　而此次收购Kite Pharma，有分析人士认为，这笔收购将使得吉列德顷刻间变为免疫治疗行业的领导者之一，与诺华并驾齐驱。 /p p 　　为何如此“钟情” /p p 　　吉利德为何愿意以如此高的价格购买一家没有任何产品上市的公司? /p p 　　Kite Pharma于2009年6月1日在特拉华州成立，是一家临床阶段的生物制药公司，专注于新的癌症免疫治疗产品的设计，过去12个月，其全部收入仅仅只有3200万美元，净亏损3.59亿美元，迄今为止还没有一款已经获批上市的药物，即使这样，也丝毫不影响其在免疫领域的领先地位。 /p p 　　Kite最受期待的新疗法之一是作为一种针对非霍奇金淋巴瘤的药物—axicabtagene ciloleucel(KTE-C19)。 /p p 　　axicabtagene ciloleucel是一款以CD19为靶点，以CD28为共刺激结构域的细胞免疫治疗CAR-T产品，它从患者体内分离出T细胞，并使用工程化的手段，让这些细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，靶向CD19抗原。这种抗原在B细胞淋巴瘤和白血病细胞上多有表达。因此，通过这些CAR，经过改造的T细胞能够靶向癌细胞，并对它们进行杀伤。 /p p 　　2015年12月，axicabtagene ciloleucel曾获得FDA颁发的突破性疗法认定，治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、转化滤泡性淋巴瘤(TFL)、以及原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)这三种非霍奇金淋巴瘤，这也反映出了这款疗法的潜力 /p p 　　2016年12月4日，Kite Pharma宣布，向FDA递交了axicabtagene ciloleucel的滚动新药申请用于不适合自体干细胞移植的复发/难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者，这是首个向FDA提交申请的CAR-T疗法，也成为了细胞治疗领域的里程碑事件。在去年年底，《福布斯》杂志将其评为2016年世界范围对抗癌症的八大里程碑事件之一 /p p 　　2017年5月26日，美国FDA授予axicabtagene ciloleucel的BLA优先审查申请，PDUFA预定审批期限是2017年11月29日 /p p 　　2017年7月31日，Kite Pharma宣布，已向欧洲药品管理局(EMA)提交了axicabtagene ciloleucel的上市申请，这是第一家向欧盟提交CAR-T疗法上市申请的制药公司 /p p 　　2017年8月8日，FDA已经从肿瘤专家调研组KTE-C19足够的临床数据，并在FDA专家咨询委员会(AdComm meeting)上给予该公司一张“通行证”，这张通行证意味着监管机构将对该产品的上市快速得到支持。 /p p 　　而在axicabtagene ciloleucel之外，Kite Pharma还有多款创新型的细胞疗法正在紧锣密鼓的研发中。同样是在本月初，Kite宣布其下一代CAR-T疗法KITE-585的IND申请已经得到了美国FDA的批准，即将启动1期临床试验。这款疗法基于Kite Pharma的内部筛选与研发，且采用了下一代生产工艺，有望增强细胞活性。它将靶向多发性骨髓瘤细胞表面常见的BCMA抗原。在临床前试验中，这款疗法与靶点的结合能力已经得到了验证。 /p p 　　就在本月中下旬，Kite Pharma创新的TCR-T细胞疗法也收获喜讯。TCR是T细胞受体(T cell receptor)的缩写。在普通的T细胞上，这些受体能特异性地识别癌细胞表面或内部的靶点。在一项剂量递增的研究中，17名患有转移性实体瘤的患者在化疗后，接受了MHC II类限定(MHC class II restricted)，针对MAGE A3的TCR-T疗法。其中，4名患者出现了缓解，1名转移性宫颈癌患者出现了完全缓解，并持续了29个月。先前，细胞疗法在血液癌症中大放异彩，针对实体肿瘤的治疗能力则有待验证。Kite的这款创新疗法，也让我们看到了细胞疗法在实体瘤上的潜力。 /p p 　　以上总总，让吉利德心甘情愿出高价购下Kite Pharma就不难理解了。 /p p 　　正式踏入肿瘤治疗领域 /p p 　　本次交易或许标志着吉列德正式向肿瘤领域发起冲击，吉利德首席执行官John Milligan表示：“收购Kite Pharma将使得吉利德成为细胞治疗领域的领导者，并为推动惠及晚期癌症患者的持续创新提供坚实的基础，细胞治疗领域发展很快，科学技术已开辟了一条明确的可以为患者提供治疗方案的途径，我们对Kite Pharma团队和他们所取得的成就印象深刻，相信细胞治疗将成为治疗癌症的基石，未来，细胞治疗将转型成为我们的主要战略之一，将继续在肿瘤治疗这一该公司迄今尚未取得巨大成功的领域继续寻找优秀资产，我们不会在这起交易之后就偃旗息鼓。” /p p 　　同时，Milligan还指出，Gilead的重金收购不止是为了axicabtagene ciloleucel一款产品，而是为了整个开发抗癌细胞疗法的技术平台，“在未来的几十年里，它会是一个可持续的出色肿瘤学平台。” Milligan指出。 /p p 　　值得一提的是，Kite Pharma的交易消息也让该领域的“小伙伴”们受益，包括Juno Therapeutics、Bluebird Bio、Bellicum Pharmaceuticals、Ziopharm Oncology 和Cellectis SA等免疫治疗公司的股价也一并飙升。 /p p 　　这或许意味着CAR-T作为一种新的治疗药品，即将正式打开市场大门! /p p 　　原文检索 /p p 　　《Gilead Sciences to Acquire Kite Pharma for $11.9 Billion》 /p p /p p /p /p /p

目前，来源于肉类食品的饮食污染、其他食品或药物误服而导致的食源性兴奋剂困扰事件层出不穷，食源性兴奋剂的预防控制也成为各类体育赛事管理机构和供应服务基地保障的重要内容。 食源性兴奋剂食源性兴奋剂是指来源于食品中的兴奋剂，包括一般性食品及保健食品中从生产到加工过程中天然存在或故意添加而残留的兴奋剂成分，如肉类食品多次被爆出的“瘦肉精”。“瘦肉精”是一大类药物的总称从兴奋剂的分类来看，它属于β-肾上腺素受体激动剂。克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺是常见的三种在畜牧养殖使用的“瘦肉精”，同时也是常见的人为服用兴奋剂。[1]世界反兴奋剂机构在其2021年的指导性文件里特别指出，如果克伦特罗、莱克多巴胺等四种违禁物质的阳性结果显示浓度低于5纳克/毫升，他们将进行调查。[2] 兴奋剂成分检测仪器灵敏度及相应物质的检测标准的不断提升、新技术的应用为反兴奋剂管理机制提供了坚强保障。有关单位通过开展微生物检验、样品制备管理等，高质量、高标准、高效率开展食品检验检测工作，监测评估食品安全风险，竭力保障食源性兴奋剂“零检出”，使运动员得以安心训练备战。[3] 食品中4种瘦肉精类残留量测定依据《GB/T 22286-2008 动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》，试样中的β-激动剂经过酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白后离心，上清液用氢氧化钠调节pH后用异丙醇-乙酸乙酯提取，用阳离子交换柱净化，采用液相色谱-串联质谱法进行测定，内标法定量。仪器和耗材1 仪器Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪；Auto EVA 60全自动平行浓缩仪；Agilent 1290II/6470 高效液相色谱-串联质谱MCX固相萃取柱（RayCure，60mg/3mL）全自动固相萃取仪全自动氮吹浓缩仪 2 试剂乙酸乙酯、异丙醇、甲醇均为色谱纯；甲酸、高氯酸、氨水、氢氧化钠；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。0.2mol/L乙酸钠缓冲液：称取13.6g乙酸钠，溶解于500ml水中，用适量乙酸调节pH至5.2。标准品：莱克多巴胺盐酸盐，克伦特罗盐酸盐，沙丁胺醇，特布他林硫酸盐，100ng/ml。内标物：沙丁胺醇-D3，克伦特罗-D9，10ng/ml。 样品制备1 酶解准确称取5g（精确到0.01g）经捣碎的样品于50mL离心管内，加入0.2moL/L乙酸钠溶液（pH=5.2）20mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶100μL，漩涡混匀，于37℃下避光水浴水解12h。2 提取添加1ml的内标工作液于待测样品中，加盖置于水平振荡器震荡15min，5000r/min高速离心10min，准确取10mL上清液于另一50mL离心管中，用高氯酸调节PH至1.0±0.3，4000r/min离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中，用10moL/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入4~5g氯化钠，加入异丙醇：乙酸乙酯=6:4 15mL，充分提取，4000r/min离心5min，吸取全部有机相到睿科全自动氮吹浓缩仪EVA-60plus 50℃下氮气吹干，加入0.2M乙酸铵溶液5mL溶解，超声混匀，使残渣充分溶解后备用。3 净化将MCX固相萃取柱安装在Raykol Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪上，依次用甲醇3 mL、水3 mL活化。备用液全部过柱，用水2 mL、2%甲酸水2ml、甲醇2 mL依次淋洗，抽干，用5％氨水甲醇溶液2 mL洗脱，收集洗脱液，使用EVA-60plus全自动氮吹浓缩仪于40℃水浴氮气吹干，用10％乙腈水溶液（含0.1%甲酸）1.0 mL溶解，滤过，液相色谱-串联质谱测定。具体的固相萃取方法见图。 结果与讨论为了验证该方法的回收率，本实验分别在猪肉样品中加入盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林4种混合标准品进行加标回收验证(n=3)，加标水平为0.5ug/kg，数据如表-2所示。加标回收率在87.8-112.4%之间，RSD值控制在10%以内。说明该方法能够很好地运用于猪肉中瘦肉精残留量的检测。表-2.猪肉样品加标回收率及RSD值注：其中克伦特罗的内标为克伦特罗-D9；沙丁胺醇、特布他林与莱克多巴胺的内标为沙丁胺醇-D3。 本解决方案操作方便、提取和浓缩效率高、回收率好。符合GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》要求。 食源性兴奋剂的风险控制不仅要依靠检测标准，还应借鉴“预防为主”原则，加强“从农田到餐桌”整个链条中食品安全的监控，与时俱进的检测方法和技术手段的应用利于防止误食兴奋剂事件的发生，运动员得以吃得健康、吃得安心。 参考文献[1]黄炜：运动员冬奥会期间不要吃中国肉！反兴奋剂机构又来了… … ,观察者网[2]冬奥会食品符合食源性兴奋剂“零检出”特殊要求,新华每日电讯/2022 年/1 月/19 日/第 006 版[3]严字当头“零容忍” 全力以赴“零出现”——心怀“国之大者”，反兴奋剂中心备战北京冬奥会,国家体育总局反兴奋剂中心

日前，卫生部汇总发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，博纳艾杰尔可提供的相关检测方法如下(点击相应链接查看具体方法），如有任何技术产品问题交流请拨打400-606-8099 序号 名称 可能添加的食品品种 检测方法 违法 2 苏丹红 辣椒粉、含辣椒类的食品（辣椒酱、辣味调味品） 食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法 4 蛋白精、三聚氰胺 乳及乳制品 博纳艾杰尔三聚氰胺分析方法包组件清单 6 &beta -内酰胺酶 乳与乳制品 7 玫瑰红B 调味品 食品中罗丹明B（玫瑰红）的现场快速检测及实验室检测方法 17 革皮水解物 乳与乳制品 含乳饮料 HPLC法测定牛奶中羟脯氨酸 21 废弃食用油脂 食用油脂 食用植物油中餐饮回收油测定（Cleanert EOS） 28 肾上腺素受体激动剂类药物（盐酸克伦特罗，莱克多巴胺等） 猪肉、牛羊肉及肝脏等 LC-MS/MS法测定火腿肠中的3种&beta -受体激动剂（沙丁胺、盐酸克伦特罗，莱克多巴胺等 30 玉米赤霉醇 牛羊肉及肝脏、牛奶 动物源食品中玉米赤霉醇类药物残留LC/MS检测 25 敌敌畏 火腿、鱼干、咸鱼等制品 蔬菜中有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类等农药多残留检测方法 41 孔雀石绿 鱼类 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱-串联质谱法 47 敌百虫 腌制食品 蔬菜中有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类等农药多残留检测方法 易滥用 1 渍菜（泡菜等） 着色剂（胭脂红、柠檬黄等） 超量或超范围（诱惑红、日落黄等）使用。 HALO C18食用色素检测 葡萄酒 着色剂（胭脂红、柠檬黄、诱惑红、日落黄等） 4 酒类（配制酒除外） 甜味剂（甜蜜素） HPLC法测定山梨醇、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜含量 山梨酸 乳制品（除干酪外） 关于博纳艾杰尔更多请访问www.agela.com.cn

瘦肉精相关检测标准SPE固相萃取小柱等产品选择指南 瘦肉精是一类动物用药，有数种药物被称为瘦肉精，例如莱克多巴胺（Ractopamine）及克伦特罗（Clenbuterol）等。将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。在中国，通常所说的&ldquo 瘦肉精&rdquo 则是指克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。 近期央视曝光某些知名公司收购含&ldquo 瘦肉精&rdquo 猪肉，瘦肉精再次引起人们的关注，因此汇总整理出瘦肉精相关检测标准所提到SPE固相萃取等产品，供广大客户参考。 一、 Speedisk 亲水性SC-DVB固相萃取柱 B8111-04，50mg，3mL,15um 适用于以下检测方法： GB/T 22147-2008 饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定 液相色谱质谱联用法 GB/T 21313-2007 动物源性食品中&beta -受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 GB/T 22286-2008 动物源性食品中多种&beta -受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法 NY/T 1030-2006 饲料中沙丁胺醇的测定 气相色谱-质谱法 SN/T 2624-2010 动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱-质谱质谱法 农业部1025号公告-11-2008 猪尿中&beta -受体激动剂多残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中&beta -受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-6-2008 饲料中13种&beta -受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 农业部1063号公告-7-2008 饲料中8种&beta -受体激动剂的检测 气相色谱-质谱法 B8111-02，35mg，1mL,15um 适用于以下方法： 农业部1063号公告-3-2008 动物尿液中11种&beta -受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 二、 Speedisk 亲水性DVB固相萃取柱 B8108-09，200mg，6mL,15um 适用于以下方法： GB/T 21313-2007 动物源性食品中&beta -受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 B8108-04，50mg，3mL,15um 适用于以下方法： NY/T 1030-2006 饲料中沙丁胺醇的测定 气相色谱-质谱法 SN/T 2624-2010 动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱-质谱质谱法 B8108-02，35mg，1mL,15um 适用于以下方法： NY 438-2001 饲料中盐酸克仑特罗的测定 三、 Bakerbond SCX固相萃取柱 B7090-03，500mg，3mL 适用于以下方法： NY/T 468-2006 动物组织中盐酸克伦特罗的测定 气相色谱-质谱法 SN/T 1116-2002 进出口饲料中克伦特罗、沙丁胺醇残留量的检验方法 液相色谱法 SN/T 1924-2007 进出口动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 农业部958号公告-4-2007 动物组织及动物尿液中莱克多巴胺残留检测方法 气相色谱-质谱法 农业部958号公告-8-2007 牛可食性组织中克仑特罗残留检测方法 气相色谱-质谱法 农业部1025号公告-16-2008 动物尿液中盐酸克伦特罗残留检测 气相色谱-质谱法 农业部1031号公告-3-2008 猪肝和猪尿中&beta -受体激动剂残留检测气相色谱-质谱法 四、 Bakerbond WCX固相萃取柱 B7211-03，500mg，3mL 适用于以下方法： GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定 更多相关产品内容，您可以点击下载： 《瘦肉精相关检测标准SPE固相萃取小柱等产品选择指南》 关于J.T.Baker ： 　　杰帝贝柯化工产品贸易（上海）有限公司（JTBs）于2009年正式成立，是美国Avantor&trade Performance Materials的全资子公司。Avantor&trade Performance Materials拥有的J.T.Baker和Macron&trade 两大品牌有140多年的历史，其化学品领域的高品质产品，最优化的应用方案和功能性检测可以满足客户的高端应用需求，并确保高精度和高重现性的结果。

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)是设计和优化创新药的必要方法。本篇综述将深入探讨冷冻电镜(cryo-EM)在SBDD领域中的快速崛起及它的主要作用，以及阐释它如何为高价值药理学靶点提供丰富的全新结构信息。冷冻电镜技术相比X射线晶体学的主要优势在于，它可以跳过繁琐的结晶步骤，从而直接对玻璃化的生物大分子进行成像；冷冻电镜也可以提供更多维度的信息，包括异质性和动态性。此外，本综述还将讨论冷冻电镜近期和未来的发展，并探讨该技术将在SBDD的管线中产生何种广泛的影响。冷冻电镜时代的SBDDSBDD是一种基于靶点的原子级结构基础信息，针对该靶点进行理性药物设计的研发方法。20世纪80年代，随着Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向药物获批上市，SBDD方法初露锋芒。这一批由FDA批准的药物结合了晶体结构模型与计算机辅助分子建模这两大新兴技术，并成功解决了传统湿实验室的高通量筛选方法(HTS)所面临的昂贵、耗时及低回报率等问题。此后，随着计算技术的不断革新，大量药物靶点的晶体结构得以解析，SBDD方法进入了飞速发展阶段。从1999年到2013年，在113个获批的first-in-class药物中，有78个是基于SBDD方法发现的。尽管SBDD的发展足够迅速，但学界及制药行业内对它的期望显然更高。SBDD方法往往能另辟蹊径，对过往认为不可成药的靶点进行验证，并进一步开发新药。如K-Ras(G12C)靶点，它利用晶体学结构确定了一个以前未知的结合口袋，以避免与皮摩尔亲和力的GDP/GTP竞争。由于靶点验证是发现和开发工作中的主要难题之一，first-in-class药物分子可以为靶点的有效性和疾病应用提供新的见解，例如bromodomain溴结构域抑制剂(+)-JQ-1和I-BET762，这些化合物被成功用于表征和验证溴结构域在各种疾病中的重要性，并催生了大量的临床候选药物。即使是FDA批准的已知药物靶点，临床上也常常需要进一步的SBDD，比如有些药物需要进行更好的选择性的优化设计。厄菲替尼(erdafitinib)在经过针对性的设计改造后，表现出了相对于原先药物对成纤维生长因子受体更高的选择。此外，有一些药物可能需要优化效力或疗效，或提供特定受体亚型的选择性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制剂西波尼莫德(siponimod)对S1P1而非对S1P3的选择性，是提高其在疗效和安全性上优于非选择性S1P抑制剂的关键。该药物靶向S1P1，而非S1P3，此外，许多抗病毒、抗菌和抗癌药物正面临着抗药性问题，SBDD方法能够基于产生耐药性的靶点结构，对药物进行持续改进。SBDD工作的瓶颈在于获取高分辨率的生物靶点结构信息。虽然一些小而有序的生物分子满足X射线晶体学的研究范畴，但大部分已知靶点中的蛋白质，例如跨膜受体或动态复合物，都难以结晶，导致这些靶点蛋白无法利用晶体手段进行高分辨率结构解析。此外，X射线晶体学往往会对靶点蛋白进行改造，如进行截短体设计、引入热稳定性突变或插入一段外源的结构域，从而影响后续的SBDD结构信息分析。还需要考虑的一个关键因素是，大量的靶点蛋白性质上达不到结晶的条件要求。不过，上述的这些难点正被冷冻电镜技术逐一攻克。冷冻电镜技术的分辨率已足够高，其产生的大量数据也可用于计算辅助药物设计(CADD)方法，这也是本综述的核心议题。与X射线晶体学不同的是，冷冻电镜无需对目标靶点进行结晶：纯化过的靶点生物大分子会被瞬间冻结在一层薄薄的非结晶玻璃体冰中，再经由透射电镜成像以记录下几十万到几百万个冷冻电镜颗粒数据，用于重构三维静电势图并对大分子进行精确建模。因此，这种技术很适合于蛋白质复合物、热稳定性较低和动态运动较高的蛋白质以及脂质胶束中的跨膜蛋白质的结构测定。随着分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为药物设计的强大工具。冷冻电镜与药物发现在2014年之前，冷冻电镜几乎无法解析出优于4.0Å分辨率的结构，这直接导致它无法对SBDD工作提供有效的数据支持。然而，在过去的几年里，冷冻电镜方法的爆炸性突破产出了大量高分辨率的结构数据，这在以前是无法实现的。这一质的飞跃要归功于许多技术革新，如用于记录图像的直接电子探测器、改进的计算方法和处理大型数据集的硬件集群，这些技术的飞跃在其他文献内有详细回顾。此外，作为一种直接可视化的技术，冷冻电镜能够快速判断样品的聚集性和稳定性等问题，从而通过遗传和生物化学手段，用互作因子稳定蛋白、或通过优化去垢剂从细胞膜环境中提取膜蛋白等方法来快速改善样品质量。综合以上，在PDB中的分辨率为4.0Å或更高的冷冻电镜结构的数量已经从2014年之前的合计16个增长到仅2020年一年提交1753个新结构的规模(图1, A)。在新上传的结构中，分辨率高于4.0和3.5 Å的比例分别从2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奋人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0Å和2.5Å的冷冻电镜结构比例，分别达到了18%和3%，实现了冷冻电镜结构解析前所未来的突破(图1, B)。为了系统评估冷冻电镜对SBDD领域的影响，我们(作者)调查了2018年美国200种最常用处方药的靶点相关结构数据。72%的靶点在PDB数据库中含有结构信息。细分而言，这些结构信息是通过X射线晶体学技术(42%)、冷冻电镜技术(15%)或两者结合(15%)而确定的(图1, C)。通过冷冻电镜技术解析的靶点涵盖了许多跨膜蛋白，如离子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活态的G蛋白偶联受体(GPCRs)和转运体蛋白(5-羟色胺转运体、NaCl转运体)。图1.冷冻电镜分辨率的提高及其对蛋白质药物结构表征的贡献。(A) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的绝对数量；(B) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的百分比的。(C)2018年200个热门处方药的靶点图，按靶点的结构特征分类；(D)44个热门GPCRs处方药的靶点图，按结构特征分类；(E)2018年200个销量最高的药物的靶点图(作为新药的代表)，按靶点的结构特征分类。2020年的数据是由Njardarson实验室公示的2018年200种最受欢迎的处方药和200种销量最高的药物的蛋白质靶点(如果适用)，然后在PDB中确定相关结构，进行人工筛选。在200多种最常见的处方药中，GPCRs占据了44种，这些药物包括靶向GPCRs的激动剂、拮抗剂和反向激动剂(图1, D；注意，拮抗剂和反激动剂在药理学上不同，但在这里我们(作者)把它们统一归为拮抗剂)。这些GPCRs中的32个(73%)已经进行了某种形式的结构解析，包括与拮抗剂(44%)或激动剂(7%)结合的晶体结构，与激动剂(9%)结合的冷冻电镜结构，或由X射线晶体学和冷冻电镜手段共同进行的结构解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度动态结构使其难以获得高质量的晶体，因此大多数的GPCR晶体结构都是与拮抗剂结合后才得以进行结构解析的。综上所述，冷冻电镜技术在针对市场上已经存在多年的处方药中中具有深刻影响。为了更加深入了解冷冻电镜技术在未来药物发现中的作用，我们(作者)还调查了2018年取得最高利润的200种药物，以代表那些市面上新进发现的药物(图1, E)，我们简称新药。这批新药和之前提到的那些最常用的药物之间存在明显的差异。相当一部分新药已经用晶体学进行了表征，反映了结构数据在当今药物研发工作中的重要性：即便不是由结构驱动的，也很少有不追求结构的情况，因为结构信息可以为先导化合物的优化和进一步发现提供关键数据。此外，考虑到漫长的药物开发时间，冷冻电镜这一最近几年才崛起的新技术在这份名单中的占比虽小，但贡献仍相当可观。这些药物和靶点包括生物制药、离子通道和GPCRs，以及其他不适合结晶的高活性大分子。冷冻电镜对SBDD的贡献解析新型结构虽然有许多FDA批准的药物靶点结构可被X射线晶体学解析，冷冻电镜正在为越来越多的难结晶、甚至不可结晶的靶点打开大门，如分子量更大、更动态的蛋白质和蛋白质复合物。冷冻电镜也显著降低了对细胞内复合体的研究难度，如病原体的核糖体、染色质修饰复合体和转录机器。例如冷冻电镜技术近期解析了一种与线粒体体RNA聚合酶复合体相关的first-in-class 抑制剂的结构。值得注意的是，在膜蛋白领域，冷冻电镜的贡献无可比拟。不管是传统的药物，还是新型处方药，很多药物靶向针对GPCRs、离子通道和转运体蛋白。然而，利用X射线晶体学手段来解析膜蛋白的结构非常困难。尽管脂质立方结晶在GPCR领域取得了一些进展，但在结晶过程中，GPCR蛋白通常需要进行热稳定突变，或融合其他蛋白进行改造，以促进晶体的形成。并且，为了获取某种改造后的稳定的构象，还需要对克隆构建、实验方法及条件进行大量繁琐复杂的筛选。相比之下，冷冻电镜结构可以直接用来解析经过去污剂或纳米盘处理后的在生化上性质稳定的膜蛋白，并获得处于或者接近生理状态的蛋白的结构。冷冻电镜的在解析庞杂的膜蛋白的结构中能力势不可挡，并且已有大量的高分辨率结构被成功解析。长久以来膜蛋白一直都是获批药物的热门靶点，它们的结构也只是近期才被冷冻电镜揭示(图2)。图2. G蛋白偶联受体、转运体(上排)和离子通道(下排)，每个受体有相应的FDA批准的配体分子(蓝框)。利用冷冻电镜解析膜蛋白结构的突出进展，部分原因受益于新试剂的设计和使用。这些试剂可以在体外纯化过程中维持跨膜蛋白的结构，在冷冻制样过程中保护蛋白，并为高分辨率的结构解析提供均质样品。去垢剂如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地从细胞膜上溶解跨膜蛋白，并维持蛋白质的生理状态构象。去垢剂的使用也会产生一些问题，如去垢剂形成的空胶束和与包裹蛋白质的去垢剂同时存在存在会引起样品的不均一，对后期的数据处理处理产生影响；也可能会导致冷冻样品制备时的气液界面收到破坏，产生一些不好的结果。脂质纳米盘是去垢剂的一种替代品，原则上可以为结构和生物物理研究提供接近胜利状态的脂质双分子层。脂质纳米盘在膜蛋白药物靶点上的应用已经非常关键和广泛。举例而言，将纳米盘与冷冻电镜技术相结合，成功阐明了TRPV1和TRPV5离子通道(在TRPV1的情况下，脂质对抑制剂的结合至关重要)、GABAA配体门控离子通道、人类P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin复合物的高分辨率结构和机制。关于纳米盘的进一步介绍可查阅。冷冻电镜还可以用来解析嵌入脂质体中的蛋白质的结构，允许在更接近生理状态的的电化学梯度中对离子通道以及孔蛋白进行可视化研究。在过去的几年中，冷冻电镜也在生物制药领域产生了巨大影响。在较新的药物中，生物制药的占比正越来越高。如果仅将目光聚焦于药物靶点识别这一领域，生物制药的结晶技术确实称得上有所改善。然而，冷冻电镜已经为一些关键的生药物研发提供了基于全长蛋白的结构信细节息胰岛素受体一种二聚化的酪氨酸激酶受体蛋白，在调节人体的葡萄糖平衡方面起着关键作用。胰岛素受体信号通路的失调会引起一些疾病，如II型糖尿病，全球约有9.3%(4.63亿人)受到影响两个独立的研究小组利用冷冻电镜在胰岛素受体结构解析方面取得了突破进展；第一个小组以4.3Å和7.2Å的分辨率分别解析了与一个或两个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构，第二个小组以3.1Å的分辨率获得了与四个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构(图3, A)。这些结构解释了胰岛素受体结合胰岛素的不同结合位点，以及激活这一关键药物靶点所进行的构象变化。类似的例子比比皆是：从HER2-trastuzamab-pertuzumab复合物到SARS-CoV-2和中和抗体的结构解析，冷冻电镜为生物治疗的新老靶点提供了新的视点，为进一步发现和开发仿制药和first-in-class药物铺平了道路。另一个值得注意的例子是B淋巴细胞抗原CD20，它是治疗白血病和自身免疫性疾病的一个重要的治疗靶点，尽管其功能作用仍不清楚。尽管CD20的分子量较小，只要35kDa左右，但分别与单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法图单抗(ofatumumab)和奥比努单抗(obinutuzumab)的Fab结合形成复合物后，都解析获得分辨率较高的CD20复合物结构(图3, B)。负染结果显示，利妥昔单抗与CD20结合后，可诱导形成高度有序的高级结构，这一发现对激活先天免疫的补体系统提供了全新见解。由于复合物中的高度动态和跨膜结构域的存在，利用结晶手段结构解析几乎不可能实现，冷冻电镜技术的应用实现了这一可能。图3.冷冻电镜(cryo-EM)在小分子和生物制药发现方面的效用。(A)与胰岛素结合的胰岛素受体(PDB ID 6PXV)和(B)CD20与利妥昔单抗复合物(PDB ID 6VJA)冷冻电镜密度图。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)将小分子PETG精确地建模到β-半乳糖苷酶的冷冻电镜图像中。(D)基于片段的PKM2的发现，冷冻电镜密度允许正确识别和放置发现片段(PDB ID：6TTF)尽管冷冻电镜在膜蛋白结构测定领域已经迈出了一大步，但短板仍然存在。其中一个短板是解析小于50-70kDa的没有明显的胞内或胞外结构域的单体膜蛋白，由于几乎没有胞外结构域特征，因此难以对去垢剂胶束或脂质纳米盘进行降噪处理，以这种方式收集到的数据难以产出高分辨率结构，比如解析没有上下游偶联蛋白的处于非活性状态的的GPCR结构。然而，大量的蛋白质属于这一类型，解析这一类型的的膜蛋白因此也成为了一个重要的研究领域。目前，有一些解决方案正处于研究阶段，且已经取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。随着利用增加融合蛋白、抗体片段、纳米抗体、纳米抗体衍生物或其他支架蛋白以增加靶点蛋白的分子量等方法的应用，预计冷冻电镜在膜蛋白结构测定方面会有更多进展。计算赋能冷冻电镜冷冻电镜单颗粒技术利用数百万个颗粒的可视化投影来重建静电势图，这通常涉及数十万亿字节的原始数据。因此，该方法从计算方法的快速发展中获益匪浅，这些计算方法同时满足了对更高的分辨率的需求并加深了对粒子动力学的理解。然而，与X射线晶体学相比，冷冻电镜在获取配体-靶点复合物的高可信度模型时仍然面临着一些难题。其中一个难题是冷冻电镜难以解析得到高于2.5Å的蛋白结构，而这通常是建模人员能够精确放置配体并解析出结合位点处水分子的最低分辨率。此外，冷冻电镜的结构建模流程与晶体学完全不同：在晶体学中，模型和密度图之间有一套严格而完善的统计测量方法，该方法能够提供和模型精度相关的关键信息。而在冷冻电镜方法中，基于密度图的建模是一个完全独立的过程，仅适用收集的电镜投影来进行密度图重构，然后基于密度图进行结构建模和实空间下的微调。该过程的独立性使得模型的精度被降低了。这一问题在最近已得到改善。此外，两种方法之间还存在一些物理上的差异，如晶体学依赖电子密度图，而冷冻电镜依赖静电势图。这些差异加在一起，使得晶体学的模型验证工具无法应用于冷冻电镜模型。因此，我们可能需要为精确性开发一些新的指标。一种解决方案是使用强大的计算技术和精确的分子力场对大分子及其配体在冷冻电镜结构中的相互作用进行模拟。比如PHENIX软件包结合实空间和傅里叶空间微调和OPLS3e力场的分子动力学模型，从而生成生物分子和小分子的几何统计精修模型。OPLS3e微调工具已经被整合进到我们(作者)的自研软件GemSpot，它将各种计算方法整合为一个工作流程，从而提高冷冻电镜密度图中配体位置的准确性(图3C)。新的计算工具也推动冷冻电镜在基于片段的药物发现(Fragment-based drug discovery)中发挥作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多个不同结构的化合物组成的生物分子靶点中。解析复合体的结构可以解释配体与结合口袋之间关键位点的相互作用，然后可以将其组合成一个先导化合物。然而，这种方法要求配体密度质量高、分辨率高，才能正确区分配体的姿态和原子类型，目前对于冷冻电镜来说还是一个难题。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和颇具治疗意义和挑战性的激酶PKM2的场景中成功地将冷冻电镜用于FBDD。尽管他们为了将配体置放于密度图中，而不得不将干法和湿法实验结合，但他们成功地建立了一个与β-半乳糖苷酶结合的大约150kDa的精准片段模型。更令人印象深刻的是，他们能够从四种化合物的鸡尾酒中确定哪些片段与PKM2结合(图3, D)。因此，不断发展的计算方法为冷冻电镜密度图的构建提供了一个强大的平台，可以在高分辨率下对大分子复合物进行建模。冷冻电镜的快速发展可及性与通量的提升冷冻电镜是极为精密且昂贵的仪器，需要大量的费用和人力成本来搭建、维护与操作。这一特性在很大程度上限制了冷冻电镜的发展，并将冷冻电镜的机时资源集中在了那些受政府资金扶持的大型机构上。因此，在科研界中，冷冻电镜资源的获取门槛极高。然而，这一门槛正在被逐渐降低：许多国家级设施都启动了冷冻电镜人才培养计划，以降低冷冻电镜运维的人力成本。一些大型制药公司也开始进行内部投资，设立最先进的冷冻电镜设施。此外，冷冻电镜设施的可复制性远超晶体学极其昂贵的同步加速器和线性加速器，使得该技术更有发展前景。随着100kV电子束技术的发展，未来可能会出现性价比极高的冷冻电镜，增加其在药物发现领域中的应用场景。鉴于2018年FDA批准的药物中有49%来源于中小型公司，降低冷冻电镜的成本将使冷冻电镜技术得到更广泛的应用。最近对SARS-CoV-2相关蛋白的结构表征证明了冷冻电镜的无限潜力。在病毒爆发后的几个月内，科学家们利用冷冻电镜，以极快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的几种构象，以及它与人源血管紧张素转换酶或许多中和人源抗体片段的复合物的结构。最近获得FDA批准的用于治疗COVID-19的再利用药物瑞德西韦(Remdesivir)与SARS-CoV-2 RNA聚合酶结合的结构也已被冷冻电镜解析。鉴于X射线晶体学一直是病毒RNA聚合酶结构测定的传统方法，对新冠病毒的冷冻电镜结构解析是一个颠覆性的创新，凸显了冷冻电镜的高时效性特点在快速反应研究中的应用。此外，冷冻电镜的分辨率仍在大幅提高，最近的一份报告指出，作为冷冻电镜的代表性复合物结构，去铁蛋白apoferritin的分辨率达到了1.25Å，该分辨率足以对单个原子进行精准定位，在某些情况下甚至可以解析氢原子和质子化态。毋庸置疑，在样品制备良好的情况下，冷冻电镜的不断改进将持续打破结构解析的分辨率记录。冷冻电镜在药物发现和开发方面的应用将进一步受益于该技术的全面自动化。在载网准备方面，一些自动化工具正在出现，以解决不可重复性和样品浪费的难题。这些技术的改进不仅会提高自动化的程度和可及性，还可能解决冷冻电镜载网制备中的其他难题，如减少颗粒在空气及水中的暴露程度。此外，机器学习方法和深度神经网络也是提高颗粒筛选速度和准确性的关键。这些自动化方法甚至有望在未来成为冷冻电镜的核心技术，从而推动冷冻电镜在药物发现领域的发展。主流硬件和软件的改进也有望提高冷冻电镜在SBDD领域的可及性。例如，更高效的检测设备能显著提高冷冻电镜的产能。在一个标准的数据收集过程中，老式的检测器相机可以每次收集1个影像，每小时产生50个影像，而较新的检测器可以每次收集9-16个影像，每小时可以产生超过200个影像，进而转化为每24小时收集的数百万颗粒投影数据。此外，虽然今天许多最高分辨率的结构是用300kV冷冻电镜获得的，但这些机器非常庞大，且前期和维护成本昂贵。在许多情况下，对于单颗粒分析中使用的薄样品，200kV的显微镜可能就足够了，甚至100kV的显微镜也可以用来获得分辨率高达3.4 Å的结构。分子动力学的新窗口结合硬件和数据处理方面的改进，冷冻电镜的潜力将进一步被释放。当X射线晶体学受限于结晶条件而无法解析时，冷冻电镜的低样品需求大幅降低了数据收集的门槛，使我们得以看到样品的构象连续体或一系列不同的能量最低状态，为大分子动力学提供了新的窗口。图4.单一的冷冻电镜数据集，投影的三维分类显示了两种不同的构象，代表了两种不同的G蛋白偶联受体-G蛋白相互作用的状态，代表了两种热力学上可比较的构象。在典型状态下(左边，PDB ID 6OS9)，受体以典型的方式与G蛋白结合，其中核苷酸结合口袋为GTP结合做准备。在非经典状态下(右图，PDB ID 6OSA)，G蛋白异源三聚体与经典状态相比旋转了45°，代表了沿G蛋白偶联途径的中间配体结合受体状态。缩写：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷冻电镜；TM=跨膜螺旋。一些计算工具，例如二维和三维分类以及子区域的重点细化，能够利用数据集内颗粒的异质性来模拟大分子活性成分的运动。在我们(作者)小组最近的一个例子中，对神经紧张素1受体的冷冻电镜单颗粒分析结果揭示了先前识别的G蛋白、激动剂结合状态和G蛋白偶联通路上的一个新的中间状态(图4)。最近，我们(作者)还将AI深度学习网络应用于冷冻电镜数据集，揭示了26S蛋白酶体的构象动态，使解析出的结构细节达到了前所未有的原子级水平。随着分辨率和分类工具的不断改进，我们将获得更精细的构象变化。有了以上这些技术，再加上分子动力学模拟和机器学习方法等计算技术，我们将得以对配体结合的复杂过程进行更精确的建模，从而揭示全新的、可成药的中间状态。结语尽管冷冻电镜已经在SBDD领域取得了飞跃性的进展，但它的潜力远不止于此。在三维分析重构及深度学习算法等领域，若能将计算工具与更大、更高质量的数据集结合并进行训练，我们将能够描述蛋白质甚至其配体的更小幅度、更高分辨率的动态运动。我们还期望冷冻电镜在时间维度上的结构解析方法将使人们对大分子复合物的结合和解离过程有更深了解，为靶向药物的研发提供更多思路和机会。目前晶体学和大多数冷冻电镜结构所提供的只是能量最小值的瞬间结构，但对于开发新的药物作用模式而言，对机制和中间状态的理解至关重要，所以我们若能获取构象的动态信息，则对理性药物设计具有突破性意义。在综合了冷冻电镜的软硬件及方法的快速发展之后，我们可以得出结论：冷冻电镜有望为药物发现和人类健康做出巨大贡献。词表：1. 激动剂一种通过增加受体活性以产生生物反应的物质。2. 拮抗剂(也称中性拮抗剂)一种能阻断激动剂或反向激动剂的物质，在不存在激动剂或反向激动剂的情况下便没有活性

在奥运会这样大大小小的体育盛事中，兴奋剂检测始终是备受关注的焦点。截止到目前，巴黎奥运会出现的三例兴奋剂检测阳性事件，分别是对美雄酮和宝丹酮（属促蛋白合成类固醇）、呋塞米（属利尿剂和掩蔽剂）、类固醇司坦唑醇检测呈现阳性。本届巴黎奥运会兴奋剂检测由世界反兴奋剂机构（WADA）负责组织和监督检测工作，负责检测的实验室均需获得世界反兴奋剂机构的认可。反兴奋剂本身其实是一项专业性极强、有着复杂体系的工作。那么兴奋剂检测包括什么？兴奋剂违规的行为有哪些？反兴奋剂工作人员是如何完成整个流程的？其兴奋剂检测技术手段又有哪些？兴奋剂检测（Doping Control）的范围广泛，包括赛前、赛后及日常检测，以确保运动员未使用任何违禁物质或违禁方法。食源性兴奋剂检测是奥运赛事中最关注的部分，其主要指来自于食品的兴奋剂，包括两大类，一类是天然存在的，即内源性兴奋剂；一类是人为添加而残留在食品中的，即外源性兴奋剂。禁用方法及禁用物质：按照联合国教科文组织《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》和国务院《反兴奋剂条例》的有关规定，在2023年12月29日国家体育总局发布了2024年兴奋剂目录。（目录清单见链接：https://www.sport.gov.cn/kjs/n5084/c27260605/part/27262172.pdf）1. 禁用方法：篡改血液/血液成分：包括血液回输或增加红细胞；人为提高氧气摄入输送或释放的方法等；化学/物理方法：包括置换/变更样本；12小时内静脉输液和/或静脉注射剂量不得超过100mL等；基因/细胞兴奋剂：包括使用核酸或核酸类似物（基因编辑、基因沉默和基因转移技术）；使用常规或经基因修饰的细胞。2. 禁用物质：蛋白同化制剂品种、肽类激素品种、麻醉药品品种、刺激剂（含精神药品）品种、药品类易制毒化学品品种、医疗用毒性药品品种以及其他品种共391种兴奋剂。在公布的兴奋剂目录中还有其他多种特殊品类的补充说明，比如有常见的：合成类固醇等：具有促进蛋白质合成的作用，可以使肌肉增大和力量增强，同时严重干扰体内激素平衡；玉米赤霉醇类：可促进蛋白质合成，有助于运动员提高肌肉力量；β激动剂类：可减少脂肪囤积，增加肌肉含量，短期效应会使得心率变快、血压升高、发热。运动员可借助此类药物获得热量和抗代谢效应，提高肌肉练力量；刺激剂：刺激中枢神经；生长激素：促进红细胞生成；利尿、遮掩剂：稀释、降体重等。并且在目录最后，提到该目录中尚未涉及的、且未经任何政府健康管理部门批准用于人体治疗的药物（例如尚在临床前或正在临床试验阶段或已经终止临床试验的药物、策划药物、仅批准作兽药的物质），在所有情况下禁用。检测手段：自国际奥委会在1964年奥运会上首次试行兴奋剂检测以来，国际上一直采用的是尿检。直到1989年，国际滑雪联合会才在世界化学锦标赛上首次进行血检。血检只是作为尿检的一种辅助手段，用来检测一些尿检中难于检测的违禁物质和违禁方法，主要针对异体输血等。尿样通过A、B瓶检查获取，两只瓶子上只有一串6位数的编码用于识别运动员身份，整个检测过程中，无人得知瓶子主人的真正身份。兴奋剂检测中心保存b瓶，a瓶送到兴奋剂检测实验室检查，兴奋剂检测实验室收到尿样后应尽快完成检测分析，样品分析严格采用经国际奥委会医学委员会批准的技术方法。检测技术：兴奋剂的检测难度在于检测品种广、项目多、时效性强。尤其是对于食源性兴奋剂，其在食物中含量很低属于ppb级甚至ppt级，比药物中的兴奋剂更难甄别。要准确检测这些痕量物质，需要低检测限的高端精密分析设备和先进的检验方法。通常的食源性兴奋剂检测的常用方法有酶联免疫法、高效液相色谱（HPLC）法、LC-MS法、GC-MS法等。奥运赛事对食源性兴奋剂检测的要求更加严格，《大型赛事食源性兴奋剂防控工作指南》推荐使用LC-MS、LC-MS/MS法，测定不同食品基质中的低浓度药物和兴奋剂及代谢物的残留，主要是因其灵敏度、选择性和特异性较好，同时部分样品前处理及净化工作较为简便，多被应用于尿液、血浆、肝脏以及动物肌肉等样品中β2-受体激动剂的检测。（*以下列出的仪器厂商及检测仪器设备等为仪器信息网收录行业应用方案以及发布在仪器信息网资讯栏目的部分产品，不具全面性，如有遗漏，欢迎大家留言补充。联系邮箱:wugq@instrument.com.cn）方法兴奋剂类型检测技术/仪器仪器厂商色谱＋质谱外源性类固醇稳定同位素技术德国元素AnthrovisION曲马多 (tramadol) 及其代谢物 O-去甲基曲马多干血斑 (点) 技术+LC-MS/MS（DBS-MS 500 HCT系统）瑞士 CAMAG公司 蜕皮甾酮、各类禁用物质及方法类兴奋剂检测Agilent 7000D 三重四极杆气质联用系统安捷伦（Agilent)Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统动物源性食品中克伦特罗等48种兴奋剂QSight220三重四极杆液质联用系统珀金埃尔默类固醇LC-FAIMS-MS/MS赛默飞尿检中微量代谢物DFS高分辨质谱检测分辨内源性和外源性激素DELTA同位素质谱仪各类禁用物质及方法类兴奋剂检测超高效液相色谱-四极杆串联质谱联用系统沃特世动物性食品中糖皮质类激素兴奋剂Oasis® HLB 固相提取技术和ACQUITY UPLC® 超高效液相色谱/TQD 串联四极杆质谱系统多种高极性兴奋剂（包括米屈肼和如辛弗林、去甲苯福林、依替福林、奥洛福林及奥克巴胺等肾上腺素能药物）二维液相三重四极杆质谱联用法岛津麻醉类：海洛因、吗啡、美沙酮等；刺激类：咖啡因、可卡因、麻黄碱GCMS-QP2020麻醉类：海洛因、吗啡、美沙酮、、氯胺酮等；刺激类：安非他明、肾上腺素等；类固醇：β-激动剂、睾丸激素等；利尿剂：甘露醇、Dexa-trim等；其他：β-阻断剂、局部麻醉药等LCMS-8045LCMS-8050LCMS-8060肽类激素：人类生长激素（HGH）、促红细胞生长素（EPO）等LCMS-IT-TOF其他促红细胞生成素(EPOs)蛋白印迹杂交（Western Blotting）美国Precision Biosystems公司的Blotcycler肽类兴奋剂检测多功能水平电泳仪Multiphor II北京德泉尿检自动比重、酸碱度计鲁道夫（RUDOLPH）血检自动血液分析仪希森美康（SYSMEX）\（辅助设备）干血点检测专用摇床（THERMOMIER F1.5）艾本德（EPPENDORF）真空干燥离心机总之，兴奋剂检测不仅是科技与体育的结合，更是维护体育公平与正义的最后一道防线。虽然兴奋剂的使用手段在不断翻新，但反兴奋剂工作依然面临着巨大的挑战。需要各方共同努力，加强反兴奋剂宣传教育，完善反兴奋剂法规制度，提升检测技术水平，才能有效遏制兴奋剂的使用，维护体育竞赛的公平公正，保障运动员的健康权益。

导读“瘦肉精”属于β-激动剂类化合物，包括盐酸克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等十几种物质，是一类动物用药的统称，属于肾上腺类神经兴奋剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。瘦肉精在减少脂肪增加瘦肉方面的作用非常明显，能让猪的单位经济价值提升不少，但也存在引发心律不齐甚至是心脏病等极具危险性的副作用。近年来（2011年），因食用被“瘦肉精”污染的食物导致中毒事件屡有发生，且后果极其严重，引起了世界各国的高度重视。检验方法为了保证畜产品质量安全，保护人类健康，许多国家都禁止在食源性动物的生产中使用盐酸克伦特罗，美国食品与药品监督管理局（FDA）将肉品中的盐酸克伦特罗残留作为必检项目，欧盟也严禁在饲料中添加“瘦肉精”类药物。我国虽然于2000年提出禁止使用“瘦肉精”类药物，但在畜牧业生产中“瘦肉精”的使用仍屡禁不止，如：在2011年河南省和江苏省发生济源双汇的“瘦肉精”事件以及2021年“3.15晚会”中曝光的沧州青县瘦肉精羊肉问题，都具有很大的社会影响力。依据《GB/T 22286-2008 动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》，试样中的β-激动剂经过酶解，用高氯酸调节pH值，沉淀蛋白后离心，上清液用氢氧化钠调节pH后用异丙醇-乙酸乙酯提取，用阳离子交换柱净化，采用液相色谱-串联质谱法进行测定，内标法定量。 图-1.盐酸克伦特罗的结构式 图-2.莱克多巴胺的结构式图-3. 硫酸沙丁胺醇的结构式 图-4. 特布他林的结构式睿科应用方案仪器与耗材NO.1 仪器与耗材Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪；Auto EVA 60全自动平行浓缩仪；Agilent 1290II/6470 高效液相色谱-串联质谱MCX固相萃取柱（RayCure，60mg/3mL）净化：高通量全自动固相萃取仪浓缩：全自动氮吹浓缩仪NO.2 试剂乙酸乙酯、异丙醇、甲醇均为色谱纯；甲酸、高氯酸、氨水、氢氧化钠；β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。0.2mol/L乙酸钠缓冲液：称取13.6g乙酸钠，溶解于500ml水中，用适量乙酸调节pH至5.2。标准品：莱克多巴胺盐酸盐，克伦特罗盐酸盐，沙丁胺醇，特布他林硫酸盐，100ng/ml。内标物：沙丁胺醇-D3，克伦特罗-D9，10ng/ml。 样品制备NO.1 酶解准确称取5g（精确到0.01g）经捣碎的样品于50mL离心管内，加入0.2moL/L乙酸钠溶液（pH=5.2）20mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶100μL，漩涡混匀，于37℃下避光水浴水解12h。NO.2 提取添加1ml的内标工作液于待测样品中，加盖置于水平振荡器震荡15min，5000r/min高速离心10min，准确取10mL上清液于另一50mL离心管中，用高氯酸调节PH至1.0±0.3，4000r/min离心5min，将上清液转移至另一50mL离心管中，用10moL/L氢氧化钠溶液调节pH至11，加入4~5g氯化钠，加入异丙醇：乙酸乙酯=6:4 15mL，充分提取，4000r/min离心5min，吸取全部有机相到睿科全自动氮吹浓缩仪EVA-60plus 50℃下氮气吹干，加入0.2M乙酸铵溶液5mL溶解，超声混匀，使残渣充分溶解后备用。NO.3 净化将MCX固相萃取柱安装在Raykol Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪上，依次用甲醇3 mL、水3 mL活化。备用液全部过柱，用水2 mL、2%甲酸水2ml、甲醇2 mL依次淋洗，抽干，用5％氨水甲醇溶液2 mL洗脱，收集洗脱液，使用EVA-60plus全自动氮吹浓缩仪于40℃水浴氮气吹干，用10％乙腈水溶液（含0.1%甲酸）1.0 mL溶解，滤过，液相色谱-串联质谱测定。具体的固相萃取方法见图。Fotector Plus固相萃取方法液质检测条件

瘦肉精十年2011年，央视的315晚会，曝光了某食品集团在食品生产中使用了含有瘦肉精的猪肉。受此影响，该加工企业随之陷入了“瘦肉精”漩涡之中。时间来到了2021年，央视315晚会在报道中关注到河北省沧州市青县存在部分经销商贩售瘦肉精羊肉问题。报道提到，央视记者对天一肉联厂当天屠宰的羊肉进行采样并做瘦肉精快速检测条检测，结果呈阳性。晚会播出后，农业农村部不仅立即责成河北省、河南省迅速组织开展查处工作。目前，涉事企业负责人已被控制，当地政府已对问题羊肉进行封存，正在追溯瘦肉精来源。十年的时间，瘦肉精依然屡禁不绝，只不过猪肉换成了羊肉。瘦肉精事件爆发后，网络上骂声、声讨声一片，其实这次事件只是压倒骆驼的最后一根稻草。在此之前，2018年国家食品药品监督管理总局发布有关食品的抽检公告，全国多地畜肉检出瘦肉精“克伦特罗”。农业农村部公布的2020年食用农产品市场监管部门抽检不合格情况显示，在畜禽类食用农产品抽检中，克伦特罗检出83批次，主要从牛肉、羊肉中检出，表明“瘦肉精”问题还是比较突出。何为瘦肉精？“瘦肉精”是指能够促进瘦肉生长的添加剂，主要包括盐酸克仑特罗、莱克多胺、沙丁胺醇等肾上腺素受体激动剂。猪、羊、牛等牲畜摄入后能加速生长，提高瘦肉率，但“瘦肉精”会在动物体内残留，消费者使用后会对健康形成危害。早在2002年，我国就已严禁瘦肉精作为兽药和饲料添加剂。2019年底再次发文公告。但我国各地瘦肉精中毒事件仍然时有发生，为了避免此类事件的发生，十分有必要对饲料和畜禽产品中的瘦肉精开展监测，加强市场监督。瘦肉精的检测A仪器确证从检测角度来说，瘦肉精的国标检测方法十多年依然还是液质的方法，方法国标主要是涉及饲料和动物源性食品，测定所用仪器为液质联用。GB/T 22147-2008饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定-液相色谱质谱联用法GB/T 22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定-液相色谱串联质谱法GB/T 21313-2007动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法-液相色谱-质谱/质谱法为了保证畜产品质量安全，保护人类健康，PerkinElmer建立了QSight® LC-MS/MS系统应用于动物源食品中13种β-受体激动剂残留的检测方法。克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的标准曲线B快速筛查可以参考美正集团瘦肉精快速检测方案：

近期央视曝光双汇济源分公司收购含“瘦肉精”猪肉，瘦肉精再次引起人们的关注，因此汇总整理出瘦肉精相关检测标准，供大家参考。本汇总于2011年3月16日整理完成。 　　GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定 　　GB/T 20189-2006 饲料中莱克多巴胺的测定 高效液相色谱法 　　GB/T 21036-2007 饲料中盐酸多巴胺的测定 高效液相色谱法 　　GB/T 22147-2008 饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的测定 液相色谱质谱联用法 　　GB/T 21313-2007 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 　　GB/T 22286-2008 动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法 　　NY 438-2001 饲料中盐酸克仑特罗的测定 　　NY/T 933-2005 尿液中盐酸克仑特罗的测定 胶体金免疫层析法 　　NY/T 468-2006 动物组织中盐酸克伦特罗的测定 气相色谱-质谱法 　　NY/T 1030-2006 饲料中沙丁胺醇的测定 气相色谱-质谱法 　　NY/T 1460-2007 饲料中盐酸克仑特罗的测定 酶联免疫吸附法 　　SN/T 1116-2002 进出口饲料中克伦特罗、沙丁胺醇残留量的检验方法 液相色谱法 　　SN/T 1924-2007 进出口动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 　　农业部958号公告-3-2007 动物源食品中莱克多巴胺残留量的测定 高效液相色谱法-质谱法 　　农业部958号公告-4-2007 动物组织及动物尿液中莱克多巴胺残留检测方法 气相色谱-质谱法 　　农业部958号公告-8-2007 牛可食性组织中克仑特罗残留检测方法 气相色谱-质谱法 　　农业部1025号公告-6-2008 动物性食品中莱克多巴胺残留检测 酶联免疫吸附法 　　农业部1025号公告-11-2008 猪尿中β-受体激动剂多残留检测 液相色谱-串联质谱法 　　农业部1025号公告-16-2008 动物尿液中盐酸克伦特罗残留检测 气相色谱-质谱法 　　农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法 　　农业部1031号公告-3-2008 猪肝和猪尿中β-受体激动剂残留检测 气相色谱-质谱法 　　农业部1063号公告-3-2008 动物尿液中11种β-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 　　农业部1063号公告-6-2008 饲料中13种β-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法 　　农业部1063号公告-7-2008 饲料中8种β-受体激动剂的检测 气相色谱-质谱法

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 澳大利亚游泳协会7月27日证实，澳大利亚游泳选手莎娜· 杰克(Shayna Jack)在日前的赛外兴奋剂检查中呈阳性结果。“霍顿拒绝与孙杨合影”一事刚刚平息，同为澳大利亚国家队的选手被爆出药检丑闻，顿时引起舆论一片哗然。 /p p 　　涉事运动员莎娜· 杰克(Shayna Jack)28日发布长文，为自己服用禁药进行辩护，声称“不知情”。 /p p 　　“由于我被指控使用违禁药物，我不得不离开赛场，现在我感到非常悲伤和心痛。我没有故意服用这种物质。自从我10岁起，游泳一直是我的热情所在，我绝不会故意服用一种不尊重我的运动并危及我职业生涯的禁用物质。现在有一个正在进行的调查，我的团队和我正在尽一切努力找出这种物质何时以及如何与我的身体接触。如果你尊重我的隐私，我将不胜感激，因为现在这一切对我来说很难对付。” /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 400px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/c3caed69-bbdf-45be-a1b2-43dd32a6b2cf.jpg" title=" 莎娜· 杰克 图自视觉中国.png" alt=" 莎娜· 杰克 图自视觉中国.png" width=" 600" height=" 400" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 莎娜· 杰克 图自视觉中国 /strong /p p 　　一度处于舆论漩涡的孙杨也曾在2014年因尿检出兴奋剂成分被禁赛三个月。 /p p 　　 strong 兴奋剂到底是什么?有哪些物质属于兴奋剂? /strong /p p 　　兴奋剂在英语中称“Dope”，原义为“供赛马使用的一种鸦片麻醉混合剂”。由于运动员为提高成绩而最早服用的药物大多属于兴奋剂药物刺激剂类，所以尽管后来被禁用的其他类型药物并不都具有兴奋性(如利尿剂)，甚至有的还具有抑制性(如b-阻断剂)，国际上对禁用药物仍习惯沿用兴奋剂的称谓。因此，如今通常所说的兴奋剂不再是单指那些起兴奋作用的药物，而实际上是对禁用药物的统称。 /p p 　　根据世界反兴奋剂机构《2019年禁用清单国际标准》，兴奋剂可分为以下11个大类： /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 未获批准的物质 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　蛋白同化制剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　肽类激素、生长因子、相关物质和模拟物 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　b2-激动剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　激素及代谢调节剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　利尿剂和掩蔽剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　刺激剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　麻醉剂 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　大麻(酚)类 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　糖皮质激素类 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 　　β -阻断剂 /span /strong /p p 　　以上11类兴奋剂还可根据比赛时期进一步细分： /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 赛内和赛外禁用的物质 /strong /span /p p 　　S0. 未获批准的物质 br/ /p p 　　在本清单所有章节中尚未涉及的、且未经任何政府健康管理部门批准用于人体治疗的药物(例如尚在临床前或正在临床试验阶段或已经终止临床试验的药物、策划药物、仅批准作为兽药的物质)，在所有情况下禁用。 /p p br/ /p p 　　S1. 蛋白同化制剂 /p p 　　蛋白同化制剂禁用。 /p p 　　1. 蛋白同化雄性类固醇(AAS) /p p 　　a. 外源性蛋白同化雄性类固醇 /p p 　　b. 外源性摄入的内源性蛋白同化雄性类固醇及其代谢物和异构体 /p p 　　2. 其他蛋白同化制剂 /p p br/ /p p 　　S2. 肽类激素、生长因子、相关物质和模拟物 /p p 　　1. 促红素类以及影响红细胞生成的制剂，包括但不仅限于： /p p 　　1.1. 促红素受体激动剂 /p p 　　1.2. 缺氧诱导因子激活剂 /p p 　　1.3 GATA抑制剂 /p p 　　1.4 转化生长因子-β (TGF-β )抑制剂 /p p 　　1.5 先天修复受体激动剂 /p p 　　2. 肽类激素及其释放因子 /p p 　　2.1 男性禁用绒促性素(CG)及促黄体生成素(LH)及其释放因子 /p p 　　2.2 促皮质素类及其释放因子 /p p 　　2.3 生长激素(GH)及其片段和释放因子 /p p 　　3. 生长因子以及生长因子调节剂 /p p br/ /p p 　　S3. b2-激动剂 /p p 　　所有选择性和非选择性b2-激动剂，包括其全部相应的光学异构体均禁用。 /p p br/ /p p 　　S4.激素及代谢调节剂 /p p 　　下列激素和代谢调节剂禁用： /p p 　　1. 芳香酶抑制剂 /p p 　　2. 选择性雌激素受体调节剂(SERMs) /p p 　　3. 其他抗雌激素作用物质 /p p 　　4. 激活素受体IIB 活化抑制剂类(Agents preventing activin receptor IIB activation) /p p 　　5. 代谢调节剂 /p p br/ /p p 　　S5. 利尿剂和掩蔽剂 /p p 　　利尿剂和掩蔽剂以及其他具有相似化学结构和相似生物作用的物质禁用。 /p p br/ /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 赛内禁用的物质 /strong /span /p p 　　S6. 刺激剂 /p p 　　所有刺激剂，包括相关的所有光学异构体(如：d-型和l-型)禁止使用。 /p p 　　a: 非特定刺激剂 /p p 　　b：特定刺激剂 /p p br/ /p p 　　S7. 麻醉剂 /p p br/ /p p 　　S8. 大麻(酚)类 /p p br/ /p p 　　S9. 糖皮质激素类 /p p br/ /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 特殊项目禁用物质 /span /strong /p p 　　P1. β -阻断剂 /p p br/ /p p 　　孙杨被检测出的兴奋剂成分为曲美他嗪（trimetazidine），属于激素及代谢调节剂。 /p p 　　根据当时的媒体报道，2008年11月，孙杨因感冒后出现了胸闷、心悸不适等症状，专家会诊之后认为孙杨存在心肌缺血情况，与感冒病毒感染损伤心肌有关，心肌同位素扫描显示局部灌注差，很难痊愈，只能通过药物改善，达到保护心脏的作用。 /p p 　　会诊后专家建议让他服用“万爽力”以治疗心肌缺血、保护心肌。“万爽力”作为治疗心肌缺血、营养心肌类药物，在医学临床上比较常用，也是心血管专科医生治疗心肌缺血症状的常用一线药物。 strong “万爽力”主要成分为盐酸曲美他嗪，在2014年1月1日之前世界反兴奋剂机构允许运动员使用，2014年1月1日起为赛内禁用，平时仍然允许使用。 /strong 在其后的几年中，孙杨在大运动量训练后偶尔会出现胸闷、心悸不适等症状。出于治疗心脏缺血，保护心肌的目的，孙杨均按照专科医生的建议服用“万爽力”，症状改善明显，对心脏的保护也较为理想。 /p p 　　2014年5月16日，孙杨在参加全国游泳冠军赛暨亚运会选拔赛期间再次出现了胸闷、心悸不适等情况。工作人员对“万爽力”已在2014年1月被列入赛内禁止使用目录的情况不了解，仍遵照医嘱按照以往的方法让孙杨服用了“万爽力”，造成了误服事件的发生。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 400px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/61506dfe-1f23-450e-b9ba-78be1a2296f7.jpg" title=" 孙杨.jpg" alt=" 孙杨.jpg" width=" 600" height=" 400" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 孙杨 图自东方体育 /strong br/ /p p 　　澳洲游泳女选手莎娜-杰克发文公布导致自己药检不过关的物质为Ligandrol(选择性雄激素受体调节剂(SARM) LGD-4033)，并且B瓶兴奋剂样本检测结果同样呈阳性。 /p p 　　其实早在2018年11月，澳洲体育反兴奋剂机构(ASADA)就特地在官网上发表名为《LGD-4033的兴起》的文章，对运动员们作出重点提醒。 /p p 　　“LGD-4033最初是为治疗肌肉萎缩症，如衰老、骨质疏松症、肌营养不良和癌症而开发的，被推广为一种选择性非甾体类合成代谢药物。” /p p 　　据称，它是可以诱导肌肉(和骨骼)生长，而不会产生与类固醇使用相关的副作用。LGD-4033不仅在运动中被禁止，而且还由于缺乏中长期临床试验，相关的安全信息非常缺乏。因此中长期它对身体的影响尚不清楚，可能会对心脏和肝脏带来健康风险。 /p p 　　据悉，LGD-4033在反兴奋剂工作中呈上升趋势，2017年有9例、2016年有6例、2015年有2例。2017年，NBA中锋乔金-诺阿(Joakim Noah)检测出Ligandrol呈阳性之后，被联盟禁赛20场；今年5月，加拿大足球运动员斯塔夫罗斯-卡桑托斯因此被禁赛四年。 /p p 　　世界反兴奋剂机构每年公布的兴奋剂目录长度逐年增长，同时兴奋剂检测标准也越来越严格，兴奋剂检测的常用方法主要有气相色谱法、HPLC法、GC-MS联用、LC-MS联用法、免疫分析法、流动注射电化学发光、高效毛细电泳、毛细电泳-离子阱质谱等。 /p p 　　 /p p br/ /p