克隆抗体药物

p 　　随着引领第二次生物医药产品浪潮的“单克隆抗体”的出现，抗体研发的一切正在慢慢改变。在抗体工程药物中，肿瘤抗体药物更是异军突起，独占一半天下，单克隆抗体药物以其独特的作用机制及高效性，在抗恶性肿瘤的治疗中发挥了不可估量的重要作用。目前，单克隆抗体已广泛应用于肿瘤的临床治疗，本文主要从抗体药物的发展、面临的挑战以及如何解决等方面进行了详细的分析。 /p p strong 　　抗体药物的前世今生 /strong /p p 　　和各种重大革命性技术的发展一样，抗体的研究也是经历了漫长岁月。直到Kohler和Milstein在1975年创建了淋巴细胞的杂交瘤技术并获得了专一识别抗原位并与之特异结合的单克隆抗体，才受到了相关领域学者们的高度重视。两位科学家因此被授予1984年的诺贝尔生理学或医学奖。 /p p 　　然而，由于通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体是鼠源性的，应用于人体不可避免地引起人抗鼠抗体(HAMA)反应，限制了单克隆抗体的临床应用。 /p p 　　为了克服这种缺陷，20世纪80年代中期研究者们寻求以基因工程技术对鼠源性单克隆抗体进行改造，尝试对其人源化处理。如将鼠源抗体可变区与人抗体恒定区拼接而形成嵌合抗体或将鼠抗体可变区的互补决定区(CDR区)与人的抗体的互补决定区互换构成人源化抗体等。 /p p 　　以上抗体技术的建立，基本解决了抗体药物异源性的问题，促进了抗体药物的广泛应用。迄今美国FDA已经批准上市了几十种治疗性抗体药物，抗体产业增长迅猛，产生了巨大的社会效益和经济效益。目前国内外处于临床前、临床研究的各类生物技术药物中也以抗体类制品最多，其中则以抗肿瘤抗体药物最多。 /p p 　　这其中除了单抗之外，新型抗体的开发也各施所长，其中包括双特异性抗体以及抗体偶联药物(ADC)。就开发热点而言，当然要数PD-1/PD-L1单抗、ADC药物、以及双特异性抗体了。目前，全球抗体药物产业已经步入了强劲发展的时代，与此同时，抗体技术的发展也面临着诸多挑战。无论是在抗体靶标和新抗体基因发现，还是在新抗体药物的研发和产品种类等方面，很多问题都亟待解决。在此，小编做了详细的总结。主要分为以下几个方面。 /p p strong 　　筛选肿瘤治疗新靶点 /strong /p p 　　与传统的小分子药物相比，抗体的靶点数量相对要少的很多。这主要首先由于抗体本身的性质。一般来说，抗体分子的分子量较大，结构复杂，绝大多数抗体只能对位于细胞膜表面及分泌出来的分子发挥作用，而对于细胞内的分子则很难产生功效。 /p p style=" text-align: center " img title=" 001.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/3fbc9274-4de1-4a6d-acf5-dc8ffbcad09f.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 针对不同靶标的抗体 /strong /p p 　　目前，在已经批准的抗体药物中仅有27个靶标。其中7个靶标分别有两个或两个以上的抗体药物，共计18个。其中5个靶标(TNF、CD20、VEGF、HER2、EGFR)所对应的抗体药物多数为重磅炸弹药物，共计10个。在2014-2017新上市的抗体中，几个特殊靶点已引发重大波澜，诸如CTLA-4、PD-1/PD-L1等都成了重磅炸弹的诞生地。其中以PD-1/PD-L1为靶点的抗体作为肿瘤免疫治疗中的先锋队更是各个公司追逐的热点。 /p p 　　多家国际巨头公司已在该领域做了充足的准备，包括辉瑞，安进，赛诺菲，再生元、罗氏、诺华、礼来、阿斯利康等。该靶点也必然引起新一轮的腥风血雨。但总体来说，抗体靶标十分有限，所以说，在研发的候选抗体药物中，新靶点和新适应证抗体是药物研发团队首要追求的目标 其次是老靶点的深度开发。 /p p strong 　　降低抗体的免疫原性 /strong /p p 　　最早通过杂交瘤技术制备的鼠源性单克隆抗体，应用于人体会不可避免地引起人抗鼠抗体(HAMA)反应。随着基因工程技术的发展，研究人员开始对鼠源性单克隆抗体进行改造，尝试对其人源化处理以解决单克隆抗体的这种缺陷。可分为嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。试图通过增加其可变区序列与人胚系基因的同源性来降低它们的预期免疫原性。 /p p style=" text-align: center " img title=" 002.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/d4eabd2b-11a8-492c-b317-7b62d2129725.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 鼠源性到完全人源化抗体 /strong /p p 　　嵌合抗体成功的例子包括罗氏公司的抗 CD20 抗体Rituxan，其用于治疗B 淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要来自于补体作用、ADCC作用和诱导肿瘤细胞凋亡。因为人鼠嵌合抗体仅仅消除了鼠源单抗的部分异源性，未经改造的可变区的鼠源序列依然可以诱导人体产生HAMA反应，因此对鼠源抗体可变区的进一步进行人源化改造是必然趋势。 /p p 　　通过研究大量小鼠抗体可变区序列，截取可变区中与抗原直接接触的序列与人抗体可变区的框架区嫁接，经过亲和力重塑，可在极大程度上保持亲本抗体的特异性和亲和力，同时在人鼠嵌合抗体的基础上进一步消除免疫原性和毒副作用。人源化抗体成功的例子包括罗氏的Herceptin，其用于治疗HER-2过度表达的转移性乳腺癌。 /p p 　　不容置疑，完全人源化抗体绝对是最理想抗体，其可以达到完全避免鼠源性单抗的种种缺点。目前主要通过抗体库技术以及转基因小鼠技术等方法来进行生产。 /p p strong 　　新型抗体药物 /strong /p p 　　抗体偶联药物(ADC)、双特异性抗体以及PD-1/PD-L1单抗绝对算的上是抗体圈的明星产品了。 /p p 　　ADC由单克隆抗体与有治疗作用的小分子药物两部分构成，借助抗体实现化学药物对肿瘤组织的靶向递送。ADC 在血液中稳定性高，药物分子不会脱落，因而毒副作用较小，但对肿瘤细胞的抑制作用远远高于裸抗体。这种设计策略既可提高抗体药物的杀伤能力，又提高小分子化学药物的治疗窗。 /p p style=" text-align: center " img title=" 003.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/c110a3a2-3d90-4c38-ab72-7b6cdd3ecafa.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 双特异性抗体 /strong /p p 　　传统抗体药物通过封闭单一信号通路抑制肿瘤生长，临床上易出现抗体药物的耐药性。所以双特异性抗体(BsAb)应运而生，其通过基因工程手段将两个分别靶向不同抗原的抗体片段组合在一起，具有两种抗原结合位点，可以发挥协同作用，进而提高治疗效果。这种结构设计能有效地改善抗体药物在体内的药物代谢动力学过程，增强临床治疗效果。然而，设计出疗效好、稳定性高且利于生产的BsAb仍需深入研究。 /p p 　　除了ADC和BsAb之外，肿瘤免疫治疗抗体药物也是火的不行。近几年，针对免疫检验点的PD-1/PD-L1单抗治疗不断在癌症治疗中取得突破性进展，尤其在黑色素瘤、肺癌、肾癌及膀胱癌等多种肿瘤的治疗中显示出很好的疗效，初步实现了利用免疫方法治疗肿瘤的梦想。 /p p strong 　　抗体组技术和抗体组药物 /strong /p p 　　抗体组技术是在基因组学和蛋白组学基础上，结合杂交瘤技术及基因工程抗体技术，经过抗体靶标高通量筛选、建立大规模抗体库，最终走向应用。相比传统的单克隆抗体技术相比，抗体库技术，具有库容量大、可筛选种类多、更易获得针对特定抗原表位的高活性单克隆抗体等无以替代的优势。同时抗体库技术在筛选过程中，更为省时、省力、高效、经济。 /p p style=" text-align: center " img title=" 004.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/7cd75911-64ed-4a38-aa94-c1179ab902e0.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 抗体库技术 /strong /p p 　　目前抗体库根据其宿主免疫状态来说，主要分为天然库和免疫库两大类。天然库从理论上来说可以筛选获得可与任何抗原特异结合的的抗体，同时人抗体库可以直接产生全人的抗体V区基因，避免了后续的繁琐的人源化过程，但这些天然抗体基因缺乏体内的重排与突变过程，因而很难获得高亲和的抗体，所筛选的抗体往往需要进一步的亲和力成熟改造，而且同时筛选背景较高，针对特定抗原的抗体丰度低。 /p p 　　相比较而言，免疫库中则含有大量针对该特定抗原的抗体，其筛选背景大大降低，并且这些抗体基因经过在宿主体内的成熟过程，往往具理想的亲和力。 /p p 　　小鼠目前依然是最容易进行免疫和其后续进行基因工程操作的动物品种，然而通过小鼠抗体库获得的依然是鼠抗体V区基因，想使其安全用于临床，还必须进行后续的人源化改造。近两年发展的全人抗体的转基因小鼠技术，使得我们可以通过转有全套人抗体基因的转基因小鼠来制备人的免疫抗体库，并从中直接筛选具有治疗价值全人的抗体V区基因，无需人源化的改造。 /p p strong 　　国内抗体药物产业如何突破瓶颈 /strong /p p 　　在全球抗体药物产业强劲发展的浪潮中，国内抗体药物产业也已经实现了从基础研究到产业化的跨越，抗体的产品逐渐增多，市场逐渐扩大。尽管我国抗体药物产业近年来发展迅速，但国产抗体药物的技术水平及市场占有率与国际先进水平仍有较大差距。 /p p 　　中国抗体药物上市以及原始创新产品开发都面临着严重不足的问题。无论是已上市销售的还是正在注册研究的抗体药物，国内企业在抗体靶标和新抗体基因发现、新抗体药物创制、产品种类等诸多方面都亟待提升。 /p p style=" text-align: center " img title=" 005.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/35b205bb-cafe-410d-88f4-0541881c8198.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong Custom mAb /strong /p p 　　要实现抗体药物产业发展的突破，应该结合抗体药物相关的产学研医用现状资源禀赋及医疗服务的需求，选定未来重点发展领域及其对应的产品方向，重点支持和引导相关领域目标性抗体药物产品的开发。加强研发平台建设、提升抗体药物自主研发、CRO、CMO及产业化水平，达到与欧美先进国家同步，打破国外医药巨头对我国抗体药物的市场垄断，增强我国在国际抗体药物领域的综合竞争优势。 /p

单克隆抗体药物是利用淋巴细胞杂交瘤或基因工程技术制备得到的药物，是生物制药领域的重要组成部分。在抗肿瘤方面，单克隆抗体药物通过干预肿瘤发生发展中的信号通路，或激活机体对肿瘤的免疫反应，实现对肿瘤的靶向杀伤作用。与传统化疗药物相比，单克隆抗体药物表现出专一性强、疗效显著的特点，因此在肿瘤治疗中起到重要作用。此外，单克隆抗体药物还用于自身免疫、心血管、感染等疾病的治疗。据有关资料显示，2015 年全球单克隆抗体药物的销售额已达到 980 亿美元左右，而同年中国的单抗药物市场已经达到了 72 亿人民币，估计2020 年有望达到 200 亿。 据美国 FDA 规定，对人体使用的单克隆抗体药物，其临床前及临床试验中需进行药代动力学研究，包括药物血浆浓度变化、体内分布和清除率等。然而，生物基质中单克隆抗体药物的定量分析面临巨大挑战。如今对抗体药物的检测主要是采用 ELISA 试剂盒完成，但 ELISA 方法的缺点主要有开发时间长、准确性一般、假阳性率高、线性范围窄。LC-MS/MS 方法可以很好地解决 ELISA 所存在的不足，而且灵敏度也满足实际检测需求，因此被越来越多地应用于抗体药物的检测。但是其前处理方法不成熟常常导致选择性和重现性不佳。 纳米表面分子导向限制性酶解（nSMOL, nano-Surface and Molecular Orientation Limited Proteolysis）技术通过对抗体药物 Fab 区域选择性酶解，获得靶标蛋白特异性肽段，之后通过LC-MS/MS 方法对特异性肽段进行检测，从而实现对抗体药物的定量分析。nSMOL 技术能确保获得靶标蛋白特异性肽段，同时尽可能降低样品的复杂程度，从而表现出良好的选择性和重现性。 岛津公司作为全球著名的分析仪器综合生产厂商，始终秉承创业宗旨“以科学技术向社会做贡献”，不断钻研领先时代、满足社会需求的科学技术。为了迎合客户需求和行业发展趋势，岛津公司本应用文集，汇总了当前应用 nSMOL 技术在国际期刊上发表的研究论文，以及岛津公司基于 nSMOL 技术开发的应用文章。主要内容包括：1. 基于nSMOL技术发表的SCI论文Selective detection of complementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nanosurface and molecular-orientation limited proteolysis The development of the validated LCMS bioanalysis of trastuzumab in human plasma using a selective detection method forcomplementarity determining regions of monoclonalantibodies: nano-surface and molecular orientation limited (nSMOL) proteolysis Fully validated LCMS bioanalysis of Bevacizumab in human plasma using nano-surfaceand molecular-orientation limited (nSMOL) proteolysis Application of nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis to LC–MS bioanalysis of cetuximab Validated LC–MS/MS analysis of immune checkpoint inhibitor Nivolumab in human plasma using a Fab peptide-selective quantitation method: nano-surface and molecular-orientation limited (nSMOL) proteolysis Validated LC/MS Bioanalysis of Rituximab CDR Peptides Using Nanosurface and Molecular-Orientation Limited (nSMOL) Proteolysis. 2.岛津中国分析中心应用报告nSMOL前处理技术结合Skyline软件加速抗体药物LCMS分析方法开发 基于nSMOL技术和Skyline软件的曲妥珠单抗LC-MS/MS定量分析方法开发 nSMOL技术结合Skyline软件对贝伐珠单抗药物的UHPLC-MS/MS定量方法开发 采用nSMOL试剂盒建立人血浆中贝伐珠单抗定量分析方法的重现性验证 nSMOL技术不同酶解缓冲体系对曲妥珠单抗灵敏度的影响 有关详情，请您向“岛津全球应用技术开发支持中心”咨询。咨询电话：021-22013542 期待我们的工作会给您带来有益的帮助! 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/。岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

重组蛋白和单克隆抗体药物研发讲座由利穗科技（苏州）有限公司于2015年4月24日在上海张江高科技园区主办。届时将邀请100余名国内外生物医药领域的著名专家学者前来参观交流。 本次讲座特邀主讲嘉宾，Joachim K.Walter 博士是著名的生物制品行业的科学家和顾问，有26年 哺乳动物细胞培养的蛋白生产和研发经验 ，拥有17年在德国的勃林格殷格制药企业的工作经验。演讲就蛋白药物市场及研发、单克隆抗体生产为主题，共同探讨蛋白分离纯化方法。 利穗科技一直专注于药物研发和生产领域内新型仪器/设备的研发与制造。产品的定位是基于色谱分离技术的全自动分离纯化系统，公司产品分离纯化设备用于生物医药研发和生产过程中的分离纯化，是分离工艺和分离介质的运行设备，广泛应用于中草药、天然产物、多肽、单克隆抗体、重组蛋白、疫苗和血液制品等生物制药医药领域的分离纯化过程，是生物医药领域的关键技术和设备。 在此，利穗科技诚挚邀请您参加重组蛋白和单克隆抗体药物研发及生产讲座，进行产品技术交流。 主题：重组蛋白和单克隆抗体药物研发及生产讲座主办单位：利穗科技（苏州）有限公司会议时间：2015年4月24日（9：00-17：00）地点：上海张江高科技园蔡伦路781号上海张江医药谷人数：100人 会议日程安排如下：上午 9.00 — — 12 ：001.导言? 市场概述及行业趋势介绍 2. 生物技术及蛋白药物基础介绍? 蛋白质的化学特性简述? 药物蛋白介绍 3. 蛋白药物研发和生产策略介绍? 工艺开发的复杂特性? 工艺技术的概述-上游 & 下游生产? 工艺设计? 工艺开发与生产的策略? 蛋白质分离纯化方法 — — 过滤和色谱法? 工艺开发的管理 4. 生物制药工艺设备解决方案 午餐： 12.00-13:00 下午 13:00 — — 16:005.单克隆抗体生产? 亲和层析的不同操作模式? 蛋白质降解路线? 蛋白酶解? 蛋白质结构的稳定性? 缓冲液的选择? 稳定性添加剂? 制剂缓冲液 6.生物仿制药的监管? 风险管理? 质量源于设计? PAT过程分析技术? 产品生命周期验证 7.一次性技术 技术咨询：16.00 — — 17:00? 15 分钟每个人或公司 （限于 4 组）。请提前预约并提交讨论问题。 演讲人简介： Dr. Joachim K. Walter, PhD Walter Biotech Consultancy公司创始人兼首席执行官目前为利穗科技（苏州）有限公司咨询顾问 生物制药行业知名学者，咨询顾问。具有超过27年生物药研发及生产经验。曾担任勃林格.英格翰公司新药研发及生产总监，参与75个不同规模的抗体及重组蛋白药物的工艺开发和放大，最大放大规模达12500L。曾担任GE Healthcare 膜过滤事业部全球副总裁，指导多个膜过滤产品及应用的开发。曾经在超过30个国际主流期刊上发表文章，作为Speaker被邀参加国际会议超过40个。目前主要致力于为制药企业进行工艺开发、放大，工艺验证及生产管理的咨询。客户包括华兰生物，Affimed AG, Medac GmbH, Innobiologics Sdn Bhd, Graffinity GmbH,等。 报名方式：姓名： 单位： 职务：手机：请将个人单位、姓名、职务、手机信息发送到市场部邮箱：caixin@lisui.net ，或可以直接电话报名：0512-69369998备注：本讲座免费（含午餐），人数有限，会议室99个固定座位，先到先得，交通住宿自理 会议联系人：蔡新 0512-69561800-8066 /18914086625 caixin@lisui.net 吴婷婷 0512-69369998 /18362618085 wutingting@lisui.net

9月18日至21日，美国Namocell公司参加了第五届抗体药物创新及产业化论坛，并且做了精彩报告。报告中不但介绍了单抗药物开发过程中的关键步骤---细胞系构建问题，提出了新的单克隆铺板方案，而且对于如何挑选高表达细胞株做了新的探索。报告受到了与会专家的一直好评。 美国Namocell公司，作为一家专注于单细胞分离技术的生物仪器公司，一直致力于打造高效、准确、便捷的单细胞分离平台。在此基础上，Namocell在单细胞分离平台上也在不断开发更多新的应用。近年来，单抗药物的开发领域又被推上了一个新的高度，越来越多的公司都纷纷投入到这个热潮当中，随之而来的相关法规的要求也是越来越严格。在众多的要求当中，FDA对药物来源的单克隆源性的要求非常严格，这就要求生产和研发的企业在细胞株开发阶段做到严格的单克隆验证。目前市面上已经有几款孔板扫描设备能够得到FDA的认可，他们的数据可以用来作为单克隆源性的证明。在这里我们要讨论的是在验证前的分离阶段，如何快速、准确、高效的获得单细胞。除了上面提到的有限稀释法之外，昂贵的流式细胞分选仪也可以用来作为单细胞铺板工具之一，当然流式除了操作复杂，需要专人维护之外，分选得到的细胞常常复苏比例比较低。在流式分选中，细胞受到较大的鞘液压力的影响，会有一定程度的损伤，导致后期单细胞克隆率低。Namocell单细胞分离仪为细胞铺板提供了全新解决方案。该设备采用新的微流体技术能够实现快速，高效，准确的细胞铺板工作。分离过程轻柔，不会影响细胞的后续生长。能广泛应用于单抗开发中的CLD环节，以及单细胞测序等。最后，在本次报告中，Namocell还介绍了公司新的应用开发进展，向与会者分享了高表达细胞株筛选的全新方案，引起了很大的反响。

目前，全球仍在继续竞相寻找抗击COVID-19 爆发流行的最有效策略。迫切需要有效的公共卫生干预措施和可靠的治疗手段来扭转这一激增趋势，与此同时也推动了多种用于改善患者预后的药物开发。感染早期进行治疗是最有希望的，在寻找早期重要的临床数据过程中，发现当前批准的药物有新的适应症（又称药物再利用）。基于这个情况，把早期治疗中，对人体安全有效的药物分子进行联合用药，用于各种筛选试验。据说这是一种具有成本效益的药物开发技术，相比新疗法可以更快地治疗新冠肺炎患者。人类与COVID-19的斗争仍在继续，从长远角度来看，接种新冠疫苗是最有效的预防手段，它有助于个体产生免疫力，在不良事件发生时使个人感染风险降到最低。疫苗是一种生物物质，在外来入侵物质（如病毒）刺激身体后做出应答并产生抗体。抗体是由免疫B细胞天然产生的蛋白质，其主要机制是通过与病毒部分特异性结合并阻止其进入细胞，从而免于感染或者控制感染发展为疾病。大多数获得批准的疫苗基本是通过皮下注射和肌肉注射这两种方式进行接种。通常，这些抗体在接种疫苗或感染后自然产生，但也可以在实验室中通过生物工程进行制备。实验室制备的抗体称为单克隆抗体 (mAb)，其产生的方式主要通过静脉注射以及注射给药。尽管最近全球疫情有所改善，但许多国家仍面临着早期治疗需求无法满足的困境，早期检测对于避免产生重症病例和免于住院治疗具有重要意义。因此，随着治疗方法的不断研究，抗病毒的口服固体制剂 (OSD)出现并应用。第一个用于早期COVID-19治疗的抗病毒口服药物是由默克公司研发的莫努匹韦，临床数据表明，在治疗初期或病毒仍在复制的阶段，该药品具有很高的治疗疗效，这种药物会增加病毒RNA突变的频率并削弱病毒复制。COVID-19防治方法cGMP生产设施在药物开发和制造的所有阶段，必须遵守国际和国家法规，这保证了这些无菌产品在投放市场时的安全性和有效性。当前良好生产规范（cGMP）是一项由食品和药物管理局（FDA）、世界卫生组织 （WHO）、欧洲药品管理局（EMA）、药品检验联合检验计划（PIC/S）、治疗品管理局（TGA）和其他地方监管机构等执行的法规。这种正式的法规在充分实施后，可以避免造成污染、混淆、偏差、故障和错误，并确保药品符合其质量标准。根据FDA cGMP和无菌指南，有两个对无菌药品质量特别重要的清洁区域：• 关键区域该区域被视为关键区域，因为该区域内的已灭菌药品易受污染，且在后续过程中不能对其直接接触的容器进行灭菌。因此，必须对周围环境进行严格控制，以保持产品的完整性和无菌性。在该区域开展的活动包括灌装区域、产品密封操作之前和期间过程对无菌材料进行操作（例如，无菌传递、无菌材料添加等）。区域中气溶胶颗粒数目非常重要，因为它们可能通过作为微生物载体而对产品造成外来或生物污染。根据FDA的cGMP/无菌指南以及ISO 14644-1:2015，关键区域空气洁净等级为ISO 5级。ISO 14644-1规定，空气清洁度由每立方米允许的最大颗粒浓度进行分类。• 辅助清洁区域辅助清洁区域可以发挥多种功能。通常，这些区域是准备、操作或转移非无菌成分、产品配方、产品处理中需要的材料、设备、和容器的地方。辅助洁净区的空气洁净度分类取决于此处开展活动的性质。美国食品和药品监督管理局建议，在动态条件下，无菌处理附近的直接接触区域应符合ISO 7级（最低）动态标准。生产厂家也可以将该区域划分为ISO 6级或将整个无菌灌装室保持在ISO 5级的水平。而按照 ISO 8级空气清洁度等级分类的区域适用于非关键操作（例如，设备清洁等）。一个区域的ISO分类等级越高，运营成本就越高。由于增加了大量的HEPA和ULPA过滤器，风机和暖通空调的功耗也随之增加，以满足所需的空气洁净等级。符合cGMP的洁净室洁净室旨在为无菌和非无菌产品的加工提供高水平的清洁度，以确保产品的质量、安全性和加工工艺效率。根据操作要求，洁净室环境需要控制单位体积的空气中所含确定数量的颗粒。为了实现这一控制，高效空气过滤器（HEPA）和超高效空气过滤器（ULPA）被投入使用，其目的是用来捕获和限制进入洁净室的颗粒数量。此外，风速也需保持在一定水平[根据相关无菌操作指南，通常为0.45 m/s（90 fpm）±20%]，以确保受控空间内每小时有足够数量的换气次数（ACPH）。上述条件将有助于降低污染风险，同时提供合适的环境来进行相关操作。还可以根据需要控制其他相关物理参数，例如温度、湿度、压缩空气参数、噪音和振动以及静电放电等。COVID-19的关键技术由于对 COVID-19 治疗的医疗需求很高，研究人员、制造商和定制研发生产（CDMO）将用以上4种方法重点研究如何提高新药能力。然而，这仍需要特定的专有技术来解决所涉及的复杂性和危险性问题。每个工艺步骤都需要调整设备以优化生产，从临床试验到生产和质量控制过程的监管过程中，需要选择符合cGMP的设备来获得优势。凭借大量的创新和完整的解决方案，Esco Pharma旨在提供符合国际认证GMP的技术，以期在未来制定出更有前景的战略解决方案。现在与Esco Pharma合作，即可为您提供高质量和极具性价比的cGMP洁净室整体解决方案。关于Esco PharmaEsco Pharma提供专业的整套制药核心设备、工艺流程解决方案和优质的服务，提高药品在研发和生产过程中每个过程的无菌水平，优化药品的无菌生产工艺，同时提高在操作过程中对产品的保护，有效地减低交叉污染的发生，提升公共职业健康水平和人类大健康水平。Esco Pharma提供优质定制化平台服务，帮助优化工艺流程使其符合国际职业健康和安全标准，并满足国际化药物、营养制剂、A**P药物、细胞治疗药物、基因治疗药物、疫苗以及药妆品等的研发和生产。 Esco Pharma拥有遍布全球和本地售后服务网点和办公室，配有专业的制药设备资深售后团队，设备备件本地化供应，可根据客户的需求快速反应，迅速为客户进行设备的维修和维护。

p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 沃特世宣布推出一种新的阳离子交换色谱柱产品线，该种专门的消耗品可以简化和改进单克隆抗体(mAb)疗法的表征和检测。新的BioResolve SCX mAb色谱柱和Vanguard FIT管状柱技术，连同一套补充消耗品，使基于世界卫生组织、美国食品药品监督管理局和人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)要求的、确认生物制剂和生物仿制药在发现、开发和制造应用中的有效性和安全性过程中的mAb电荷变异分析成为可能。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　“随着这些产品的推出，我们正在采取一种全面的方法来进行单克隆抗体分析，并将其向前推进了一大步。科学家们现在有了一套完整的工具来分析单克隆抗体的电荷变化，这将使他们对单克隆抗体以及单克隆抗体的结构和功能之间的关系有一个更完整和详细的了解，”沃特世公司化学品副总裁Erin Chambers博士说。“我们的目标是帮助简化分析流程，加快候选药物的开发，以便更快地为患者提供所需的治疗方法。” /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/032f7e7c-e24f-4ee5-bf7a-eece881b559c.jpg" title=" BioResolve_SCX_Family.jpg" alt=" BioResolve_SCX_Family.jpg" / /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　BioResolve SCX MAB色谱柱包含一种创新的强阳离子交换剂，该交换剂基于一种新的聚合物成分、亲水性涂层和多组分表面化学试剂，所有这些都是在沃特世的化学工厂合成的。基础材料由三微米无孔颗粒组成，以实现最佳扩散动力学、耐高压能力和与HPLC、UHPLC和UPLC 方法的兼容性。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　这些色谱柱还配备了首创的Vanguard全集成技术(FIT)，可防止微粒和其他污染物被带到色谱柱上，从而延长其使用寿命并降低每次分析成本，同时不会影响分离的质量。 BioResolve SCX mAb色谱柱和Vanguard FIT管状柱的每批材料都经过了专门的质量控制测试，采用了一种新的市售单克隆抗体电荷变体标准，该标准来自美国国家科学技术研究院参考材料8671(即人源化IgG1κ)，以帮助确保新产品的批次间一致性。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　当与配备Auto?Blend PLUS技术的沃特世液相色谱系统配合使用时，科学家们可以利用预先配置的Empower 软件方法，自动混合多达四种溶剂的任意组合或比例，并编程确定pH和离子强度。这将显着减少了人为错误，并消除了手动准备缓冲流动相的任务。 沃特世还专门为那些寻找mAb电荷变异分析整体解决方案的科学家配制了新的BioResolve SCX pH缓冲浓缩液，并推荐了梯度分离条件。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　新型BioResolve SCX单克隆抗体色谱柱和消耗品的引入，以及最近推出的BioAccord 系统，加强了沃特世对创新的承诺，并满足了生物制药行业不断变化的需求。 /p p br/ /p

p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp 单克隆抗体药物(mAb)是通过基因工程生产的蛋白质药物，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、经济效益大等优势，是近年来生物医药产业的重要增长点。 br/ /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 治疗性单克隆抗体（mAbs）的开发和制造是一个高度管制的过程，ICH的指导原则指出了相关产品质量参数允许的异质性水平。电荷异构体是单克隆抗体（mAb）的关键质量参数（CQA）之一，在药品稳定性研究、申报及放行等环节都必须检测、评估。抗体的电荷异构体是由细胞内的酶促和非酶促过程分泌到培养基后形成，电荷异构体可能具有明显不同的生物活性，影响单抗药物的功能、安全性及稳定性。导致电荷异质性的最常见变异之一是C末端赖氨酸剪切，随着一个或两个带正电荷的赖氨酸残基丢失，可导致碱性变异体的形成；另外，在N-和O-连接的聚糖上脱酰胺、糖化和带负电荷的唾液酸的存在都会导致负电荷增加和酸性变异体的形成。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 电荷异构体的检测方法有很多种，如：聚丙烯酰胺凝胶电泳，虽然仪器设备相对便宜，但其分辨率低、操作繁琐，目前应用较少；毛细管等电点聚焦（cIEF）电泳可进行蛋白的等电点测定，现已开发出毛细管电泳与质谱联用的技术，该方法可从完整蛋白水平进行分析，暂未推广使用；离子交换色谱（IEX）在电荷异构体的分析中使用较多，有盐洗脱与pH梯度洗脱两种方式，后续收集各个成分进行质谱检测分析其分子量及翻译后修饰。现已有在线的LC-MS方法，此方法不使用传统的盐缓冲液，改为质谱可以耐受的有机盐缓冲液来进行电荷异构体的分离，但其质谱图谱质量及普适性还有待考量，且不能实现肽段水平翻译后修饰的解析。中国计量科学研究院研制了人源化IgG1 κ型单克隆抗体标准物质，与军事科学院军事医学研究院钱小红、应万涛课题组合作，建立了cIEF-WCID及SCX-HPLC两种方法分离检测了单克隆抗体标准物质中的电荷异构体。运用蛋白质组学技术，从完整的分子量分布、肽图分析、进一步延伸到糖肽分析，建立了逐步深入的分析方法来研究单克隆抗体电荷异构体形成的影响因素，此方法可推广应用于其他单抗类药物的电荷异质性分析与评价。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 272px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/f26eb0c0-ed43-47b2-9965-eb69024d8360.jpg" title=" 图片1.png" alt=" 图片1.png" width=" 600" height=" 272" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 2020年11月10-12日，中国计量科学研究院和国际计量局拟联合举办 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 第三届 “药物及诊断试剂研发与质控——测量与标准，质量与安全（TD-MSQS 2020）” /strong /span 国际研讨会，以期进一步促进该领域的学术交流和技术发展，提升企业的研发水平和产品质量。本次会议将在南京市政府的支持下，在江苏省南京市举行。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 本次会议可通过官方网站http://tdmsqs.ncrm.org.cn注册或扫描二维码注册，注册成功后请填写参会回执发送至会议邮箱pptd@nim.ac.cn。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/11c12ff4-263b-48c2-aff9-f4640b0a1850.jpg" title=" 图片3.png" alt=" 图片3.png" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center " strong span style=" text-indent: 0em " 欢迎各位专家、同仁报名参会！ /span /strong /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 更多信息请关注会议官方网站： a href=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" _src=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: right " 供稿：崔新玲 胡志上 span style=" text-indent: 2em " & nbsp /span /p

获选日本药学会学术杂志Biological and Pharmaceutical Bulletin封面 岛津制作所基础技术研究所岩本典子等的单克隆抗体分析法“nSMOL法“有效性验证的相关论文，被评选为7月1日发行的日本药学会学术杂志Biological and Pharmaceutical Bulletin（39卷7号）的封面。该论文是国家癌症研究中心的产学合作共同研究成果之一。 该研究小组在2014年发表了使用高速液相质量分析仪（LC/MS/MS）对单克隆抗体的可变区肽进行选择性检测和分析的新方法（nSMOL法:nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis）。这个方法不依赖抗体药物种类就能够检测血液中浓度，具有里程碑意义。 针对该方法的实用化，研究小组依照日本厚生劳动省的《医药品开发过程中生物样品中药物浓度分析方法验证指导原则》(2013年,药食审查发0711第1号)，开展曲妥珠单抗（商品名称：赫塞汀）及纳武单抗 (同：Opdivo)等多种抗体药物的nSMOL方法的可靠性评价，并公开发表学术论文。论文对作为抗CD20人鼠嵌合抗体的利妥昔单抗(同：美罗华)的分析认证结果进行了报告。 准确的血液中抗体药物浓度监测，对于提高早期毒性、药效评价的开发效率以及探讨向精准医疗推广等方面极其重要。不依赖抗体种类，且使用能满足一定可靠性标准的nSMOL方法，为抗体药品的药物治疗监测领域发展做出贡献。通过可变区选择性分解，实现实用的生物分析（转载自日本药学会 Biol. Pharm. Bull.第39卷7号封面） 论文名： Validated LC/MS bioanalysis of Rituximab CDR peptides using nano-surface and molecular-orientation limited (nSMOL) proteolysis. Noriko Iwamoto, Megumi Takanashi, Akinobu Hamada, and Takashi Shimada Biol. Pharm. Bull. 2016, vol.39, No.7关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/ 。 岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

近年来，伴随着免疫检查点抑制剂PD-1/L1抗体、CAR-T等疗法在癌症领域取得的积极疗效，肿瘤免疫学（I/O）疗法成了行业热点。美国知名市场调研和咨询公司GrandView Research预估，全球癌症免疫治疗市场将从2018年的581亿美元增加到2026年的1269亿美元。 中国制药企业和初创公司也纷纷抓住机遇，加快生物药的研发步伐。3月22日， 赛多利斯斯泰帝（Sartorius Stedim Biotech）（以下称赛多利斯）与白帆生物科技（上海）有限公司（以下称白帆生物）就联合打造“单克隆抗体产业化基地”签署合作协议。合作双方公司的高层管理人员于3月21日分别接受媒体专访。作为一家专业从事单克隆抗体药物开发和生产的高科技企业，白帆生物计划在上海奉贤临港智造园内打造的产业化基地，该基地将搭建各类肿瘤治疗的单克隆抗体药物研发和生产平台。“我们希望，构建一个集研发、临床、生产和销售为一体的上海最大的单抗产业化基地。”白帆生物总经理邹洵在接受生物探索采访时表示，“预计，该产业基地ⅰ期工程将于2019年底完成，2020年完成美国FDA、欧盟EMA和中国NMPA的GMP验证工作并投入使用，预计投产后的年收益将达到10亿元。” 根据规划，“无交叉抗体工厂NONCROS”生产基地总投资将近6.9亿，建成后，生能将达到12,000L。赛多利斯作为一次性使用平台的主要供应商，提供1条200L单抗中试生产线和2条2,000L商业化生产线。 合作源于生物工艺理念、技术的契合 随着一次性使用技术作为整体工艺或者嵌合解决方案被广泛采纳，生物制药工艺变得更简单和灵活，同时极大的降低了固定资产的投入，缩短了建设周期。作为全球生物制药工艺完整解决方案提供商，赛多利斯可以将在与众多客户合作过程中积累的丰富经验直接转移给寻求产能快速增加的生物制药公司，帮助企业快速搭建产业化平台，从而助力企业加快项目进度。 谈及与赛多利斯的合作，邹总表示，“这是建立在两家十多年合作的基础之上的又一次更深度合作。赛多利斯在生物工艺开发、设备仪器研发以及售后服务上能够为生物医药企业提供全方位的服务和支持。以前双方的合作主要集中在早期和临床前项目，现在我们将合作模式进一步扩大到2，000l规模的商业化生产。”邹总肯定道，“赛多利斯的一次性使用技术正好与白帆生物的‘无交叉抗体工厂’理念相契合。” 目前，白帆生物的研发管线涵盖了PD-l1、CTLA-4、4-1BB、CD47、OX40、CLDN18.2 等多个免疫检查点靶点。其中，1个创新药（全人源抗PD-l1抗体）和2个生物类似药（西妥昔单抗和贝伐珠单抗）已经获得了国家药监局的临床批件。 “一次性平台”助力医药发展 “赛多利斯致力于创新，为生物制药企业提供整体生物制药工艺解决方案，帮助医药企业缩短新药上市的时间，提高有效产能，降低药物成本，从而提高患者对于生物药物的可及性。”赛多利斯全球执行董事René Fáber在采访中表示道。 据悉，本次合作赛多利斯提供的产品包括了高通量工艺开发平台、玻璃生物反应器和不同规模的一次性生物反应器、一次性流体管理技术平台以及下游分离纯化平台，同时配套了赛多利斯独有的冻融解决方案。涵盖了工艺开发、中试和商业化生产的各个阶段。除此之外，赛多利斯还提供细胞系构建、培养基优化以及产品分析和生物安全检测服务。整体解决方案加速了工艺开发过程，缩短产品开发周期，实现投资、风险和效益的最佳平衡。 关于一次性使用技术在制药领域中应用的法规仍在完善之中，药品监管部门、制药企业和一次性使用技术供应商一起共同讨论并不断完善相关内容。2017年，中国食品药品国际交流中心正式发行了《国际制药一次性使用系统应用及技术指南》。来自赛多利斯多位国内外专家参与了指南的编写工作，为一次性使用系统在生产过程中使用的风险评估、控制提供了有力的参考依据，推动一次性使用系统制造国产化。赛多利斯从一次性使用产品的生物相容性、完整性控制角度，提出了评估一次性使用产品从独立组件到完整系统的可提取物和浸出物的分析模型，着手建立全面的一次性组件可提取物数据库，帮助更多的制药企业在生物制药工艺中使用一次性技术。 早在2015年，赛多利斯就开始提高了在生物仿制药细分领域的市场投入，收购了一家位于苏格兰的BioOutsource和Cellca两个领域的著名外包公司，BioOutsource公司为全球生物制药公司提供合同测试服务，为客户提供生物安全检测以及功能、效应分析。Cellca公司可以为致力于生物类物药物开发的公司提供高表达量、高质量、背景清晰的生产用细胞株的开发，从而加快药物开发进程，降低风险。这两桩并购弥补了赛多利斯在该领域的技术空白，提升了整体服务的综合能力。 赛多利斯全球营销服务负责人 Bettina Berendsen女士告诉记者，“未来，我们将继续拓宽细分领域，为中国制药企业的研发、生产提供更完整的解决方案。” 关于Sartorius Stedim Biotech 赛多利斯斯泰帝 (Sartorius Stedim Biotech) 是国际领先的生物制药行业设备和服务的供应商，为全球生物制药的开发与生产提供安全、及时、经济的一体化解决方案。作为完整解决方案的供应商，赛多利斯斯泰帝提供几乎涵盖生物制药工艺所有步骤的产品组合。公司致力于推广一次性使用技术和增值服务，满足生物制药行业快速发展的技术需求。公司总部位于法国欧巴涅，在巴黎的欧洲交易所上市；因其位于欧洲、北美和亚洲的生产与研发中心以及遍布全球的销售网络而享誉世界。 关于白帆生物科技（上海）有限公司 白帆生物科技（上海）有限公司是上市公司桂林三金药业于2016年在上海投资成立的全资子公司，依托于2013年桂林三金收购的宝船生物医药研发中心，全力开拓生物制药板块，致力于研发肿瘤和自身免疫性疾病的单抗药物。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical chemistry上的文章Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)1，文章通讯作者是意大利锡耶纳葛兰素史克公司实验室主任Nathalie Norais和丹麦哥本哈根大学药学系教授Kasper Rand。抗体表位定位对理解适应性免疫、研究治疗性抗体和疫苗的作用方式至关重要。对疫苗接种后产生的多克隆抗体群（pAb）的结合特性的深入了解将为疫苗开发提供重要价值，但很少有表位定位方法能耐受pAb样品的复杂性。本文使用氢氘交换质谱（HDX-MS），通过检测存在不同量的pAb时抗原的HDX值变化，绘制了pAb样品识别的表位，并提供了表位与抗体的相互作用信息。因子H结合蛋白（fHbp）是被广泛研究的脑膜炎奈瑟菌抗原之一，在人体中能引发强大的保护性免疫反应。fHbp是27kDa的脂蛋白，N端为一个饼状的β-sheet，C端为一个8股β桶，两端由linker连接。本文的研究对象是fHbp和用fHbp免疫的兔pAb。首先作者进行了被pAb识别的fHbp抗原表位的鉴定。重组fHbp在不孵育和孵育两倍量的pAb下进行了30秒到20分钟的HDX实验，在抗原的多个区域检测到了抗体导致的HDX降低，标记10min后HDX的变化最为显著，因此接下来的HDX-MS实验选择了10 min时间点。随后作者进行了孵育比例的考察以判断结合亲和力，考察了Ag：pAb从1:2、1:5、1:10到1:15，氘代时间为10分钟（图1），可以观察到抗原的3-26、44-72、104-120三个区域的氘代被抗体显著的保护住了，从1:5时开始看出差异，从1:2到1:15，所有肽的平均氘代降低率从3%增加到了16%，104-120的氘代降低率最高。之前的研究表明，fHbp的兔抗中存在与抗原亲和力在1nM及以下的抗体，故氘代保护率随抗体用量增加的原因可能是，在低比例的多克隆抗体中，每种抗体的占比有限，高亲和力的抗体还没达到能与抗原形成1:1复合物的浓度。作者将实验结果与前人研究的fHbp的单克隆抗体结果进行比对，多个氘代减少的区域得到了印证，尤其是104-120区域，残基S112、G116和K117可被认定为抗原表位。同时，抗体之间也存在组合功能，即单个抗体无法发挥的功能会由两到三个抗体协同产生，本实验中使用多克隆抗体研究的优势在于，通过与单克隆抗体研究中氘代降低的区域对照，判断表位抗体间的组合功能和起到免疫效果所需的交叉区域。图1. 不同比例的Ag：pAb对抗原fHbp氘代率的影响。A.颜色由浅到深依次是1:2、1:5、1:10、1:15，正值代表加入抗体后氘代率降低。B.映射到晶体结构上的氘代变化（PDB：3kvd）。C. 15-31、44-71、102-120、209-234区域随抗体加入比例的变化，灰色线为不加抗体时的氘代值，所有氘代是最大氘代值（MX）的相对值，最大氘代值为1:15比例下氘代24h的结果。接着，作者使用VADAR分析研究fHbp的主要表位区。VADAR v1.8算法基于蛋白的X射线结构原子坐标测量fHbp单个残基的表面可及性，将其与HDX结果相结合可进一步描述fHbp的表位区域。可及表面积分数（ASA）超过50%的残基为暴露残基，图2总结了映射到fHbp晶体上的所有暴露的残基，每个识别的表位区域的范围为1992-2509 Å2，作者强调位于表位区的暴露残基不一定都参与表位组成，也可能是间接稳定抗体的结合引起的HDX保护。图2. 结合VADAR和HDX数据的抗原表位区。两个在N端结构域（黑灰、浅绿），两个在C端结构域（浅蓝深蓝、深绿），紫色代表不在HDX鉴定的表位区域内的暴露残基。最后，作者使用了变性剂和盐来评估结合特异性和非特异性相互作用。由于亲和力低的抗体在变性剂存在时可与抗原解离，作者将此策略应用到了HDX实验中，选择1:10结合比例进行HDX，标记缓冲液使用含有或不含有盐（0.5M NaCl）或变性剂（硫氰酸铵AT或尿素），探究这些情况对HDX结果的影响（图3）。在存在0.5M、2M和4M AT的情况下，fHbp的多个区域获得了更多的氘代，N端区域3-26和44-71，以及C端区域176-184显示出氘代增加（相对于不加AT结果），因此作者推断即便在0.5M的浓度水平下AT也能影响fHbp与抗体的结合，2M尿素存在下也是如此。但0.5M尿素和0.5M NaCl的存在没有明显影响fHbp与抗体的结合。因为非结构肽中酰胺氢的交换速率会受到溶剂离子强度、pH值、温度、以及相邻残基侧链的诱导和空间效应的影响，作者额外考察了0.5M尿素和0.5M NaCl是否会影响fHbp酰胺氢自身的交换速率，即在对照条件（PBS缓冲液）和实验条件（加入0.5M尿素或 NaCl）下分别标记5秒和30秒，控制缓冲液的pH相同且控温（在冰浴进行标记）。结果表明实验组序列覆盖率没有降低，相比于对照组，肽的回收率也高达91.8%，三次重复实验可表明0.5M尿素或 NaCl的加入不会对fHbp自身的氘代特性产生任何显著性影响，也不影响fHbp的构象。将0.5M尿素或 NaCl添加到抗原抗体孵育后的氘代实验中，发现fHbp上的所有表位在抗体结合后仍被显著保护，排除了抗体非特异性结合的可能。值得注意的是，在存在尿素或NaCl的情况下，fHbp的表位区域氘代降低变化幅度不同，尤其是在标记30秒时，这说明了不同表位在与抗体互作时的特性不同，例如残基3-26和104-120可能为静电相互作用（被NaCl破坏），残基133-166和209-234可能为氢键作用（被尿素破坏）。图3. 添加剂对抗原结构和抗原-抗体结合的影响。A.在0.5M AT存在下，30秒氘代后fHbp结构中氘代增加的区域（蓝色）。B.抗原-抗体1:10孵育对fHbp氘代的影响。C.49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，蓝色为添加0.5 M AT，紫色为添加0.5 M尿素。D. 抗原-抗体1:10孵育后，49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，橙色为对照组，蓝色为添加0.5 M NaCl，紫色为添加0.5 M尿素。总结：本文通过监测fHbp与多克隆抗体群pAb孵育后的HDX-MS变化，绘制了fHbp的抗原表位，并使用尿素和NaCl深入了解了抗体群的相对丰度和亲和力，以及潜在的非特异性结合，这种方法可以广泛应用于其他抗原和pAb样品，为免疫学和疫苗设计提供有价值的信息。参考文献：1. Ständer, S. R. Grauslund, L. Scarselli, M. Norais, N. Rand, K., Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS). Analytical Chemistry 2021, 93 (34), 11669-11678.

p 来自Postnova Analytics英国实验室的讯息： /p p 　　 strong Postnova Analytics发布了一份新海报，比较了两种用于测定单克隆抗体物理化学及生物物理学性质的测试方法——电场流及非对称场流分离色谱法(EAF4-Electrical Asymmetrical Flow Field Flow Fractionation)和体积排阻色谱法(SEC-Size Exclusion Chromatography)的适用性。 /strong /p p style=" text-align: center " strong img title=" 复杂单克隆抗体的对比分析.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/c124cda4-465c-4088-99f8-7208b46db509.jpg" / /strong /p p 　　据美国国家标准与技术研究院(NIST-U.S. National Institute of Standards and Technology)的工作所述，一种参比单克隆抗体(RM 8671 mAb)，被用于比较EAF4-UV-MALS(多重散射聚焦系统Multi Astigmatism Lens System)与SEC-UV-MALS之间分离量化、聚合量化及恢复参数的差异。NIST的这种mAb为治疗用蛋白质表征这一新技术的发展提供了一种代表性的检测分子。 /p p 　　该海报阐述了EAF4模组如何将抗体及蛋白质分子大小与表面电荷特性(电泳迁移率)的同时测量变为可能。FFF(场流分离色谱Field Flow Fractionation)系统测量显示蛋白质/抗体的聚集只占注入总量的10%，且无聚集体被SEC检测到。研究人员总结到，FFF的开放通道设计会顾及相比SEC更好的注入物的复原，这对于追求量化少量聚集体而言至关重要。 /p p 　　Postnova Analytics的EAF4技术独创性地将电场流分离色谱和非对称场流分离色谱的原理融合在同一系统中。在EAF2000系统中，电场流和交叉场流被同时应用于FFF通道，通过粒子不同的电泳迁移率，使得按粒子大小与电荷进行色谱分离成为可能。这两种强大分离技术在一个单独平台上的结合，为表征复杂的蛋白质、抗体、病毒，以及环境和带电纳米粒子或高分子打开了大门，而其他技术已证明了这一问题是多么棘手。 /p

单克隆抗体制备的原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力、B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的、将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术。单克隆抗体制备的过程：免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。(1)体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。(2)体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。单克隆抗体制备的意义：用于以下各种生命科学实验并具有医用价值（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离.（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 .（7）免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；

1用户背景介绍勃林格殷格翰(Boehringer-Ingelheim)是一家致力于人类生物制药化学和动物健康产品的医药公司，也是世界上最大的私有制药企业。名列全球前20位，高度研发驱动的领先医药公司，核心业务是包括处方药、 动物保健和生物制药，业务范围遍及全国各主要省市和地区。主要的研究领域包括：免疫及呼吸疾病、心血管及代谢疾病、中枢神经疾病、肿瘤。勃林格殷格翰成为第一家跨国公司在中国建立生物药物的制造企业。2014年，与百济神州签署战略合作协议，为其临床试验提供生物制药的生产。同年底，生物制药中试生产车间在上海张江工厂落成。2020年6月，勃林格殷格翰日前启动跨国药企在华首个外部创新合作中心。该中心采用了跨国药企中首个“三合一”业务模式，即集学术合作、业务拓展及许可、风险投资于一体。此举将整合公司的创新经验和合作伙伴在各自相关领域的独特技术和专业技能，共同开发创新药物和疗法，进而惠及更多患者。2为什么早期发现对蛋白质科研人员至关重要？单克隆抗体（mAb）是当今治疗性生物制剂的主要成分。由于其高度特异性和效力，它们被用于治疗多种疾病-从不同的癌症类型到自身免疫缺陷。新的蛋白质工程方法导致越来越多的治疗性mAb，它们还可以被修饰为双特异性、与其他生物制剂结合或用小分子药物修饰。而单克隆抗体（mAb）等生物药物的数量不断增加，以及mAb 变体之间的丰富异质性，需要一个彻底的开发过程，以最大限度地提高mAb的法规遵从性。因此，在开发过程的早期阶段就需要生物物理分析方法，以指导和简化进一步的抗体处理，并预测抗体的开发能力。抗体的构象和胶体稳定性是预测其稳定性和可开发性的关键参数，因为它们影响长期储存稳定性。开发管道中mAb和mAb变体的数量不断增加，需要使用能够快速评估这些参数的生物物理方法。在开发的早期阶段筛选条件和抗体构建体旨在确定最有希望的候选物，以满足药物批准的监管要求。在本案例中，勃林格殷格翰使用治疗性单克隆IgG1抗体的小规模配方筛选，以验证PR NT.48在确定关键稳定性参数方面的优异能力。通过PR NT.48搭载的nanoDSF技术跟踪色氨酸荧光发射的变化来评估热梯度中mAb构象稳定性。同时，PR NT.48可以检测胶体稳定性的变化和温度引起的聚集，是通过检测两次通过样品的光束的背反射强度实现的（图1）。图1：检测蛋白质聚集的背反射原理示意图(左) 光通过毛细管，被反向反射到检测器，光强度被量化。(右) 粒子散射光，导致入射光的消光和背反射光的反射--蛋白质聚集的直接测量。使用PR NT.48同时进行背向反射和荧光分析提供了几个重要信息：可直接关联热稳定性和胶体稳定性，这意味着可以识别引起聚集的展开事件，更重要的是，可以确定聚集起始温度。可确定抗体的未折叠状态的总体聚集程度，这在不同的配方和抗体类型之间可能有显著差异。应用案例分享: 了解勃林格殷格翰如何为其单克隆抗体寻找最佳缓冲条件_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)

近期，Analytical Chemistry杂志上发表的一篇文章提出了一项创新性的用于抗体药物电荷异质性表征的分析技术——icIEF-MS。icIEF-MS联用技术平台与传统的SCX-MS对蛋白异质性进行交叉验证，而且更高的灵敏度、更出色的重复性和更低的样品残留，这将为蛋白药物电荷异质性表征提供一种新的策略。 原文见：Anal. Chem. 2023, 95, 4, 2548–2560 蛋白质的电荷异质性是由多种复杂机制所共同作用形成，包括细胞过程、化学降解和制造过程中的生产条件。这些因素中的许多修饰会引起蛋白质等电点 (pI) 值的变化，例如翻译后修饰（PTMs) 的发生，包括 c 端赖氨酸缺失、焦谷氨酸形成、脱酰胺化、唾液酸化和糖基化等，都会导致电荷变异体的形成，从而对药物的稳定性和溶解度产生重要影响。因此，对电荷异质性的可靠表征是评估关键质量属性 (CQA) 的重要步骤，也是确保治疗性mAbs在整个临床和商业开发期间保持一致质量的关键所在。 目前，全柱成像毛细管等电聚焦 (icIEF) 和离子交换色谱 (IEX) 是治疗性mAbs在研发和质量控制中进行电荷异质性分析的两种常用技术。然而，传统的cIEF-MS联用技术在研究蛋白质电荷变异体方面还存在着许多缺陷，如重复性差、操作复杂以及与MS离子源不兼容等问题。 CEInfinite icIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统 基于一体化的icIEF-MS技术平台，使用加拿大品牌艾易尔斯生物科技（AES）开发的分析与制备一体的CEInfinte系统，可实现快速的icIEF分离，并配合使用高分辨率的Thermo Q-Exactive Plus质谱平台对蛋白质的电荷变异体进行鉴定。icIEF分离部分采用了与MS兼容的两性电解质，无需使用甲基纤维素和尿素作为添加的的涂层毛细管柱。通过创新的纳流ESI接口，检测蛋白质药物电荷变异的灵敏度和重复性得到了极大提高，整个icIEF-HRMS分析可在25分钟内完成，比传统cIEF-MS所需的60分钟更加迅速。此外，该平台还可以灵活切换到icIEF馏分收集模式，对蛋白质的电荷变异体组分进行组分收集，并进行深入表征，包括LC-MS肽图分析、IEX-MS 完整蛋白分析、生物相互作用等研究。整合icIEF-MS和基于icIEF的馏分收集将在mAb电荷异质性表征的全新MS策略。图1 icIEF-MS的原理图 利用该icIEF-MS系统对9种不同的治疗性mAb的电荷变异体进行表征，并对icIEF-MS的方法进行了系统验证。同时，我们还使用SCX-MS分析了所研究mAb的电荷异质性。两种手段的分析结果表明，icIEF在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和精确分子量测量精度等方面都具有明显优势。我们相信，结合传统的IEC-MS技术平，台icIEF-MS将成为电荷异质性表征领域中的一项重要技术，为研究人员提供更加快速、准确、灵敏和高效的分析手段。 表1 九种单抗的等电点信息和使用的icIEF试剂● icIEF和SCX分离9种单克隆抗体的性能比较 ●在最优化条件下，通过icIEF-UV和SCX-UV分别分离了9种单克隆抗体，并进行了性能比较。两种分离工具均在10分钟内完成了高通量分离，所研究的单克隆抗体获得了相同的峰序列。在icIEF分离中，首先洗脱的是酸性最强的异质体，其次是主峰和碱性异质体，这与SCX分离的顺序相同。然而，对于大多数异质性mAb混合物，icIEF的分离效率显著高于SCX，这是因为iCIEF基于pI差异进行分离，微小pI差异的蛋白质异质体就可以得到高分离度的分离。在某些情况下，如英夫利西单抗，通过icIEF可以实现4种电荷变异体和一个主成分的基线分离，但使用SCX的分离效率却不佳。类似地，对于帕博利珠单抗、阿替利珠单抗和地诺单抗，使用icIEF可以很好地检测出所有电荷变异体；然而，在使用SCX时，一些电荷变体却丢失了。尽管icIEF由于不同的分离机制而比SCX具有更宽的峰宽，但由于其pI的微小差异，icIEF表现出了更好的分离性能。图2 九种mAb的icIEF-UV图谱和SCX-UV谱图● icIEF和SCX串联MS的比较 ●如图3所示，icIEF-S和SCX-MS都可以用于鉴定阿替利珠单抗的电荷变异体。在SCX分离中，MS检测到的酸碱峰顺序与UV一致。而在icIEF分离中，碱性峰首先被纳流泵推向ESI源，因此MS检测中的酸碱峰顺序与UV检测的顺序相反。另一个显著的区别是，由于SCX-MS使用更高的流速，从UV到MS检测，柱外的峰展宽程度都较轻，这意味着UV峰形状与MS峰形状更一致。相比之下，icIEF-MS的较低迁移流速意味着柱外效应对icIEF分离的影响更大，从UV检测到MS检测，峰呈现更为明显的展宽，尤其是主峰，强度更高，并与稍低pI的酸性峰部分重叠。为了进一步提高icIEF-MS的分离度以克服峰展宽造成的分辨率损失，可以使用窄pH的两性电解质、新型的涂层分离毛细管柱和纳流ESI源。图3 以阿替利珠单抗为研究对象，比较icIEF-MS 和 SCX-MS分离效果：UV谱图(左)和MS-TIC谱图(右)。 在分析单克隆抗体时，icIEF-MS的信号响应比SCX-MS高。虽然icIEF-MS的样品载量只有SCX-MS的十分之一，但如图3所示。icIEF-QE Plus MS的TIC强度与SCX-Orbitrap Exploris 240相同（Orbitrap Exploris 240比QE Plus MS具有更高的检测灵敏度）。icIEF-MS比SCX-MS灵敏度高的原因有两个：首先，icIEF-MS的纳流流速（小于5μL/min）远低于SCX-MS的流速（300 μL/min），这导致icIEF-MS的去溶剂化效率和离子化效率较高，从而极大的提高了MS灵敏度和动态范围，即使样品量低至1 ng。此外，在icIEF-MS中，补偿液采用含0.5% FA的50%乙腈，流速为5 μL/min，纳流泵速为50-100 nL/min。在此比例下，进入MS的最终流动相处于酸性条件，而文章中用于SCX-MS的洗脱流动相的pH接近mAb的pI点 (pH 7~10)，洗脱是在中性碱性条件下进行的，而在中性/碱性条件下，蛋白质与质子结合的能力比酸性条件下弱得多。因此，与SCX-MS相比，icIEF-MS在较低的电荷状态下具有更多的电荷数量，从而增加了电离和质谱效率。 总之，icIEF和SCX是两种有效的单克隆抗体分离工具，在高通量条件下分离效率都很高。然而，在icIEF-MS中，由于低迁移流速和酸性流动相的使用，其灵敏度比SCX-MS更高。这些结果表明，icIEF-MS是一种具有优越性能的单克隆抗体分离和表征方法，可以应用于生物制药的研究发现和质量控制。(A)(D) 图4 阿替利珠单抗的高灵敏度icIEF-MS表征分析:不同浓度(0.0 5 ~ 2 mg/mL ) 阿替利珠单抗(A) 的UV谱图，TIC (B) 和 MS(C )谱均为0.05 mg/mL；电荷变异体的浓度与MS响应强度的关系如图(D)所示。 图4展示了icIEF-QE Plus MS 在不同浓度阿替利珠单抗的结果，见图4。从酸性变异体和碱性变异体的 TIC和MS谱图得出，即使在 0.05 mg/ mL的最低浓度 (3倍S/N的UV信号)下，MS仍然检测到所有电荷变异体的明显信号。而SCX-QE Plus MS不能达到0.05 mg/ml的检出限。而在已报道的传统cIEF-MS研究中，典型的蛋白质分析浓度为 0.1~ 2 mg/mL。● icIEF-MS和SCX-MS的质量准确度比较 ●icIEF-MS 不仅在灵敏度上表现更优，而且在质量准确度方面也优于 SCX-MS。质量准确度是 MS 检测的一个关键指标，这取决于 MS 的分辨率。可达到的质量分辨率不仅取决于仪器的质量分辨率极限，还受电离过程的影响。加合物会使离子信号变宽，因为它们不仅来自于多重质子化的分析物，还来自于携带加合物的分析物。因此，更多的加合物会导致较差的分辨率和较大的质量误差（即较差的精度）。虽然源内碰撞诱导裂解（CID）可以减少加合物的形成，但并不是所有加合物都可以被去除。如表2所示，尽管使用了110 V 的源内CID值，但SCX-MS 获得的质谱峰仍然比 icIEF-MS 获得的质谱峰宽，导致SCX-MS 主成分的 MW 偏差（5.4 ppm）大于 icIEF-MS（2.7 ppm）。另一个例子是贝伐珠单抗，在没有脱盐预处理的情况下，SCX-MS 对贝伐珠单抗的 MW 偏差高达33.9 ppm。脱盐后进行分析，贝伐珠单抗的偏差降低到12.8 ppm。而 icIEF-MS，由于加合离子形成较少，即使不脱盐，获得的贝伐珠单抗的偏差也仅为9.6 ppm。表2 阿替利珠单抗的电荷变异体的icIEF-MS和SCX-MS分析结果比较● icIEF-MS和SCX-MS的残留效应 ●相比 SCX-MS，icIEF-MS 的残留效应要小得多。在对阿替利珠单抗分析后，icEF-MS 使用含有4% HR 8.5&minus 9.5 两性电解质的水溶液作为空白样本，而 SCX-MS 使用水作为空白样本。在 icIEF-UV 检测中未观察到明显信号，而 SCX-UV 在阿替利珠单抗峰值处检测到了信号残留。SCX-TIC 和 icIEF-TIC 中有信号峰相对明显，保留时间分别为6.82和21.5 min，。从这两个信号峰提取的 MS 数据通过去卷积得出，SCX-TIC检测到的残余信号是阿替利珠单抗，而 icIEF-TIC 检测到的信号只是两性电解质，这意味着 icIEF-MS 中没有检测到残余分析信号。低残留率使得 icIEF-MS 对微量蛋白电荷变异体的检测更加准确和可靠，避免了假阳性结果。图5 icIEF-MS和SCX-MS的残留效应的比较：SCX-MS (A-C)显示残留阿替利珠单抗信号，而icIEF (D-F)没有残留分析物信号。如图4和图5所示，观察到1500~2500 m/z 的背景信号，MS信息证实它们不是蛋白质，而是来自两性电解质和溶剂背景，背景离子不干扰mAb电荷变异体的鉴定。 ● icIEF-MS鉴定蛋白质的可重复性 ● 针对阿替利珠单抗电荷变异体进行的重复性考察表明，icIEF-MS 平台对其测定表现出良好的重复性。通过 icIEF-MS 对批间蛋白质样品进行鉴定，所有批间检测到的相同电荷变异的质量偏差都很小（表3列出了所有9种mAb的电荷变异体的修饰鉴定结果。酸性变异体的表征比碱性变异体更具挑战性，因为酸性变异体具有更复杂的修饰。虽然这种酸性修饰通常可以通过 pI 来区分，但它们在分子质量上的差异相当小。icIEF在线串联高分辨率质谱可以通过结合完整的蛋白质分子量和测量的pI值来阐明蛋白质的结构信息，为解决酸性电荷变异体的难题提供一个有用的icIEF-MS联用平台。表3 九种单克隆抗体的电荷变异体的iCIEF-MS表征结果在对一系列不同的治疗性单克隆抗体进行电荷变异体表征时，icIEF-MS 和 SCX-MS 可以获得类似的结果。然而，icIEF-MS 在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和 MW 测量准确度方面比 SCX-MS 展现出更多的优势。因此，将 icIEF-HRMS 分析与更常见的 SCX-MS 相结合，通过正交的验证，可以为分离和鉴别蛋白电荷变异体提供更加全面的分析策略。 如需进一步了解相关信息，可联系我们获取更多文献。艾易尔斯生物科技（AES）致力于全柱成像毛细管等电聚焦技术（icIEF）技术与质谱的联用、馏分制备以及高分辨分离等领域。

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2013年6月21-22日 广州 　　2012年全球销售额前10名的药物中，抗体药物占据“半壁江山”，且市场增速势头不减 在中国，乐观估计，到2015年，抗体药物市场规模将达到325亿-650亿元。对抗体药物生产企业而言，机遇和挑战并重。 　　易贸医药第三届抗体药物高峰会，在两届成功召开的基础上，将于2013年6月21-22日在广州举行。在议题上，本届会议更为专注的讨论抗体治疗药物产业化。从市场概况、前期研发、药物开发、临床试验、生产工艺出发，通过总、分会场的形式，更为细致、深入的探讨抗体治疗药物在发展过程中面临的挑战。 　　战略合作伙伴： 　　华南新药创制中心 　　广东华南新药创制中心(以下简称中心)是在广东省政府主导下，由广东省科技厅等多家政府机构及部分骨干医药企业共同出资，于2008年10月成立的科技类民办非企业机构，坐落于广州科学城。理事单位包括：广东省科学技术厅、广东省财政厅、广东省发展和改革委员会、广东省卫生厅、广东省食品药品监督管理局、广州市科技和信息化局、广州开发区、广州中大控股有限公司、广州华银医药科技有限公司、广州白云山制药股份有限公司、广州药业股份有限公司等 　　主会场 　　抗体药物产业发展趋势及项目合作 　　分会场一 　　抗体药物临床前与临床研究 　　分会场二 　　抗体药物的产业化流程 　　2013年抗体药物高峰会发言嘉宾： 　　郭亚军教授 　　中国人民解放军总医院肿瘤中心主任，第二军医大学肿瘤研究所所长，抗体药物国家工程研究中心和抗体药物国家重点实验室主任 　　倪健教授 　　苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司董事长兼首席科学家，卫生部抗体技术重点实验室学术委员会副主任，被中央六部委(中央组织部、中央宣传部、中央统战部、人事部、教育部、科技部)评为全国留学人员先进个人及留学回国人员成就奖(国家主席胡锦涛等亲切会见)曾任二届美国华人生物医药科技协会会长(2001-2003年)，上海市优秀留学回国人才，上海市优秀学科带头人，上海市科学预见专家， 2005年享受国务院政府特殊津贴人员。 　　周新华博士 　　嘉和生物药业有限公司首席执行官。国际公认的著名生物制药，特别是单克隆抗体药物专家，是生物医药领域新技术创新的领军人物，是膜层析技术应用于生物医药大规模生产的先驱，单克隆抗体药物工艺病毒验证专家，曾任全球最大生物制药公司Amgen工艺开发总监，首席科学家，现担任北京大学客座教授。他是具有十多年会龄美国制药科学家学会资深会员，目前也是美国化学学会会员和美国华人生物医药协会终身会员。 　　Dr. Dorothee Ambrosius 　　Head Global Process Science at Boehringer-Ingelheim。Dr Ambrosius has a broad expertise in biochemistry/protein chemistry and over 15 years of experience in identification and development of novel biopharmaceutical proteins (antibodies and proteins factors) from different sources. She completed her PhD in biology at the RWTH in Aachen and joint Boehringer-Mannheim, biotechnology Research Center in 1989. She held several research management positions at Boehringer-Mannheim and Roche in the area of recombinant protein production. 　　关于主办方 　　易贸医药，作为易贸商务旗下独立业务，自2008年开始紧密跟踪，秉承易贸十多年来对于各个行业深入研究，并保持与业内人士紧密联系的优良传统，以专业第三方的角度，定期举办围绕市场热点的行业高端峰会，打造品牌峰会、市场调研、公关路演、商务合作等一系列活动。我们致力于增进国际与国内同行的了解，促进科研与生产企业的沟通，提升政府和产业企业的交流，借助会议的平台，在政府、企业和园区之间建一个信息共享的桥梁。 　　官方网址：http://antibody.cbichina.com

大家好，本周为大家分享一篇文章，Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates [1]，文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。　　抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物，它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷，以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上，给ADC带来了额外的异质性，增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用，与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比，TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而，对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质，TD-MS的断裂效率较低，获得的序列和药物偶联位点信息有限。　　为了增加TD-MS的序列信息含量，一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中，这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中，作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上，并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC，几乎60%的假定药物偶联位点被识别。　　内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域，因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法，并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖，例如，轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A)，重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B)，而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%，这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说，轻链的序列覆盖率从54%提高到83%，重链从28%提高到72%，合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著，这表明随着蛋白质分子量增大，分配内部片段变得更有价值。　　图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率，包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)　　图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z和by/cz片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率，序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键，浅灰色表示受二硫键约束的序列区域，橙色表示互补决定区域(cdr)。　　HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干，因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段，以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰，以表明它们的完整性。对于轻链，52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键，清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键，S - S键I和S - S键IV，被89个末端片段和9个内部片段穿过 而中间的两个二硫键，S−S键II和S−S键III，只有24个内部片段穿过，没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性，重要的是，中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外，分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时，额外分配了25个含有G0F的片段，42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段，这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。　　图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链，在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后，通过HCD TD-MS生成片段位置图。　　内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法，将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段，定位了3个偶联位点(K106, K114, K133)，并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述，对于完整的ADC，仅用末端片段确认了16个偶联位点，而在包含内部片段后，这一数字增加到52个，覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。　　图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。　　在这项工作中，作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域，显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息，包括二硫键模式和N糖基化，可以通过包含内部片段获得。最重要的是，内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates

安捷伦公司大力支持首届抗体工程高峰会暨抗体药物成果展 （Antibody Engineering Summit & Antibody Therapeutics Exhibition） 随着生物医药市场的快速开发，探寻不同的抗体研发方法及需要应对的挑战变得日益重要和紧迫。对于蛋白治疗药物研发企业来说，从蛋白设计、抗体工程、生产工艺到技术应用，每一个环节都至关重要。2011年7月21-22日在上海银星皇冠假日酒店办的&ldquo 首届抗体工程高峰会暨抗体药物成果展&rdquo ，聚集了有关抗体研发、生产等全球领先企业高层，共同探讨抗体行业的研发进展和实际应用情况，并深入讨论了&ldquo 新医改&rdquo 环境下，抗体药物相关企业所面临的重大挑战、主要进展和应对方案、全球趋势、以及当前国内生产和应用市场分析等。 此次峰会围绕主题&mdash &mdash 国际抗体药物研发与合作，邀请到约100名来自抗体药物生产、抗体工程及新药研发、CRO、CMO、科研院校的国内外领先企业高层参会。 作为世界领先的生物医药行业分析解决方案供应商，安捷伦致力于帮助生物医药领域用户开发专业、安全、高质、高效的药物治疗产品，并且帮助用户以更快的速度，更低的成本将产品推向市场，经过近年来的先进技术及行业经验的不断积累，安捷伦目前可为广大生物医药领域用户提供广泛的完整应用方案，包括： 生理化学性质表征 完整新生物成分（NBE）分析 糖基化与磷酸化蛋白分析 氨基酸分析 肽谱分析 产物相关的杂质分析 工艺流程相关的污染物检测 蛋白和抗体的质量保证/质量控制 稳定性和剂型测试 蛋白治疗药物的生产工艺优化等 7月21日进行的首日大会报告上，来自安捷伦公司的液质联用技术应用工程师陶定银博士进行了题为&ldquo 利用安捷伦HPLC、Chip-cube HPLC 及Q-TOF等仪器针对抗体药物的表征策略&rdquo 的精彩报告。报告中提到，单克隆抗体药物与抗原存在很强的相互作用且具有高特异性，目前在科研以及各种疾病治疗中备受关注。抗体药物在应用之前，需要进行一系列的表征，比如抗体药物的氨基酸序列、完整蛋白质、甲硫氨酸氧化、二硫键、以及糖基化等翻译后修饰。采用安捷伦的HPLC、Chip-cube HPLC 及Q-TOF等仪器方案可充分实现抗体药物的一系列表征。安捷伦开发的单克隆抗体-糖链分析芯片，可以快速高效的分析抗体药物的糖基化修饰，结果与LC-FLD方法相当。新颖的报告内容及创新的技术理念引发与会者强烈的关注和兴趣。 更多安捷伦生物制药解决方案，请参考： http://www.chem.agilent.com/zh-cn/solutions/biopharma/pages/default.aspx 更多安捷伦生物制药分析解决方案在线讲座视频及应用材料，敬请联系我们：yunxia_shi3@non.agilent.com 订阅Access Agilent电子刊物，请登录: www.agilent.com/chem/accessagilent:cn 关于安捷伦科技 安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是全球领先的测量公司，同时也是通信、电子、生命科学和化学分析领域的技术领导者。公司的18500 名员工为100 多个国家的客户提供服务。在2010 财政年度，安捷伦的业务净收入为54 亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：www.agilent.com.cn。

相比于低水平重复，高水平重复对企业的影响往往更为严重，因为创新药投入更大，研发周期更长。　　还记得去年南方所年会上关于“新药高水平重复现象也已经呈现交错的态势”的观点。与业内广泛认同的“低水平重复”不同，“高水平重复”还未得到部分企业的重视，在某些领域(如替尼类)创新药的研发已经出现了扎堆情况。　　在一系列利好因素的作用下，国内生物药研发非常活跃，尤以抗体类药物最受关注。相比于替尼类等，国内抗体类药物过热态势还不明显，但我们也看到不少国内优秀企业也开始或准备涉水抗体类药物研发。从靶点上看，国内抗体类药物研发依然集中在TNF-α 、CD20、HER2、VEGF等热门靶点，而对于一些国外研发比较活跃的新靶点，国内还比较滞后。　　据笔者统计，截至2016年10月，国内已上市或在研的抗体类药物(不含融合蛋白类药物，排除鼠源单抗)总数达到180个(数据来源于CDE公开数据，在研品种仅包括至少申报临床的品种，不含前期研发品种)。其中，国内企业开发的品种为128个，占71.1% 跨国企业开发的品种为52个。　　180个品种中，创新抗体药有85个，其中国内企业开发的品种为35个，占41.2% 生物类似药共95个，除了2个是国外企业的品种，其余均是国产品种。虽然从分布来看，国内单抗类药物仍以生物类似药为主，但创新药的数量已经大幅增长。同时，一定数量生物类似药的开发无疑也是非常节约研发资源的方式，可以降低开发风险。　　相比于化药品种，抗体类药物的研发投入巨大，难度也更高。不少国内企业对于抗体类药物开发难度并没有清醒的认识，看到类似凯美纳、朗沐、泰欣生和艾坦这样的品种上市后获益颇丰，就简单认为抗体类药物一旦获批就能轻松获得数亿元的销售额。　　比如网上就有大量类似的提法：“某某公司的某产品是全球某畅销品种的相似品种，一旦上市该药销售额有望超过**亿元”。殊不知，这些销售成绩都需要大量的市场推广才有可能实现，加之国内如赫赛汀、美罗华、安维汀和修美乐等品种普遍已有超过10家以上的类似药申请。部分靶点的生物仿制药已经明显过热，一堆产品蜂拥而至，仅在研究阶段的临床基地筛选，病例入组就将让不少企业苦不堪言。　　此外，尽管在小试及中试阶段，生物药的开发已经难度不大，但如何在质量和成本可控的情况实现产业化，这一步依然非常漫长。即便是顺利上市，单抗类药物同样会面临激烈的竞争，尤其对于某些目标人群本就有限的品种。　　因此，对于抗体类药物的研发，国内企业还需冷静思考，切莫跟风。本文梳理出国内抗体类药物的8个研发热门靶点，对各靶点市场情况和趋势进行精辟分析，为国内抗体类药物研发提供参考和建议。　　NO.1 TNF-α 靶点　　[已上市/在研品种] 28种　　[生物类似药热点] 阿达木单抗(17种)　　TNF-α 靶点是单抗取得最为成功业绩的靶点。即便排除TNF-α 融合蛋白药物依那西普，仅抗TNF-α 单抗就有4个重磅炸弹级品种：首个获批的英夫利西单抗，“药王”阿达木单抗，以及新获批的戈利木单抗和赛妥珠单抗。这4个品种2015年全球销售额合计达266亿美元。　　不过，相比于TNF-α 单抗在全球大放异彩，其在国内的表现却相当惨淡。根据样本医院销售数据，尽管类克(英夫利西单抗)及修美乐(阿达木单抗)已在国内上市，但两个产品样本医院销售合计仅为1.33亿元，且连续两年销量止步不前。这也提示，短期内国内类风湿关节炎生物制剂还难以获得市场认可。　　虽然国内销售不佳，却也无碍TNF-α 单抗成为国内最受关注的单抗研发类别，已上市及在研的单抗达到28个。其中英夫利西单抗、阿达木单抗及各自的生物类似药共有22个。　　尤其是英夫利西单抗生物类似药，作为人鼠嵌合单抗，在阿达木单抗上市多年的情况下，国内研发依然活跃。进度最快的上海百迈博制药已经申报生产，值得期待 还在申报临床的几个厂家，则建议进一步评估继续开发的价值。　　阿达木单抗类似药仅仅已申报品种就达到17个，更值得注意的是还有不少准备申报临床的企业。目前申报进度最快的是百奥泰生物和信达生物，均已进入Ⅲ期临床 此外，北京绿竹生物、嘉和生物、江苏众合、复宏汉霖和浙江海正都已获得临床批件。　　在TNF-α 创新药方面，全人源、抗体小型化以及长效是TNF-α 单抗的主要发展方向。因此，与英夫利西单抗和阿达木单抗相比，杨森长效全人源的戈利木单抗和UCB的长效抗体片段赛妥珠单抗有一些优势，这两个品种在国内研发分别进展到申报生产和Ⅲ期临床。　　国内自主创新的一类TNF-α 药物中，目前主要有丽珠的注射用重组人源化TNF-α 单抗，以及三生的人源化抗人TNF-α 单抗注射液(CHO细胞)，两个品种目前都在进行临床研究。　　NO.2 VEGF靶点　　[已上市/在研品种] 26种　　[生物类似药热点] 贝伐珠单抗(19种)　　与TNF-α 一样，VEGF也是药物获得巨大成功的靶点，贝伐珠单抗的上市及其肿瘤饥饿疗法的提出在当时的影响力不亚于PD-1及其肿瘤免疫疗法。　　VEGF单抗除了在肿瘤领域取得巨大成功，也广泛用于眼底新生血管疾病的治疗。包括贝伐珠单抗、雷珠单抗，以及2个VEGF融合蛋白类药物(阿柏西普和康柏西普)，都广泛用于包括年龄相关性黄斑病变在内的多种新生血管疾病。VEGF单抗药物治疗眼底疾病的地位甚至高于其治疗肿瘤的地位。2015年，贝伐珠单抗(安维汀)和雷珠单抗(诺适得)的全球销售额分别达70亿美元和36亿美元。　　　　在国内，目前已上市和在研的VEGF单抗达26种。其中，贝伐珠单抗的类似药达19种，信达生物进度最快，已进入Ⅲ期临床，此外还有多个厂家已经获批临床。雷珠单抗由于上市较晚，目前国内类似药获批临床的仅有齐鲁1个品种。　　VEGF单抗创新药中，礼来最新在FDA获批的Ramucirumab也已在中国进入Ⅰ期临床，该药在国外已获得包括非小细胞肺癌和胃癌在内的多个适应症。先声的Sevacizumab是其联合开发的VEGF单抗，也在中国开展Ⅰ期临床。　　此外，泰康生物正在开展Ⅰ期临床的重组抗VEGF人源化单抗注射液，应该是一个针对眼底疾病的VEGF单抗，该药作为为数不多的针对眼底疾病的创新药，更值得期待。　　NO.3 CD20靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 利妥昔单抗(15种)　　CD20靶点单抗主要用于非霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞白血病的治疗。全球首个获批的CD20类单抗罗氏的利妥昔单抗(美罗华)，2015年全球销售额高达73亿美元。在国内市场，美罗华也是最畅销的抗肿瘤单抗药物，根据PDB样本医院数据，2015年样本医院销售额达到7.93亿元。　　　　在美罗华的刺激下，国内CD20类抗体药物的研发一直非常活跃，目前已上市和在研的CD20单抗共有19个，其中利妥昔单抗及其类似药共有16个。　　在利妥昔单抗类似药的研发竞争中，三生国健的速度最快，已经完成临床研究，正在申报上市。此外，复宏汉霖、神州细胞和信达生物已进入Ⅲ期临床，浙江海正已进入Ⅱ期临床，还有6家企业已获得临床批件。　　CD20创新药方面，目前国内有3个在研品种。考虑到利妥昔单抗是人鼠嵌合单抗，故降低其免疫原性是一个发展方向。　　罗氏的Obinutuzumab是第一个被FDA认定为“突破性治疗”的单抗，与利妥昔单抗一样靶向CD20单抗，但其属于人源化单抗，且通过糖基化修饰其Fc片段增加其对Fcγ 受体的亲和力。GSK的奥法木单抗(Ofatumumab)是全人源的CD20单抗，该药用于CLL同样获得了突破性治疗认定。目前Obinutuzumab和Ofatumumab都在中国开展Ⅲ期临床研究，有望分享美罗华的市场份额。　　国内CD20创新药也有了先行者，北京天广实生物的重组人源化单抗MIL62注射液是人源化CD20单抗，该药目前正在申报临床。　　NO.4 EGF靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 西妥昔单抗(11 种)　　EGF类单抗主要用于结直肠癌的治疗。第一个获批的EGF类单抗是Imclone的西妥昔单抗(爱必妥)，该药2015年全球销售额超过14亿美元。　　在国内，除了爱必妥，百泰生物联合开发的尼妥珠单抗(泰欣生)也获批上市，两个品种上市早期都经历了快速增长，不过目前增速有所放缓，2015年两个品种样本医院销售合计达3.4亿元。　　　　爱必妥的成功和泰欣生的上市促进了国内EGF类抗体的研发，目前已上市和在研的EGF类单抗一共有19个，其中西妥昔单抗及其类似药共有12个。在西妥昔单抗类似药研发竞争中，张江生物的速度最快，目前正在Ⅲ期临床阶段，其余大部分处于Ⅰ期临床或获批临床批件阶段。　　西妥昔单抗的最大问题同样是免疫原性，该药属于人鼠嵌合单抗，因此EGF类单抗研发也着眼于解决免疫原性问题。帕尼单抗(帕妥木单抗)是安进研发的全人源EGF单抗，单药一度被认为有望替代西妥昔单抗，不过上市后大规模临床研究并未支持其在疗效或安全性上优于西妥昔单抗。目前帕尼单抗国内由贝达安进开发，正在开展Ⅲ期临床研究。除了针对西妥昔单抗的类似药，目前国内还有多个针对其他EGF单抗的类似药。齐鲁和上海津曼特生物的EGF单抗类似药都已获批临床，其中前者可能是帕尼单抗的类似药。　　创新药方面，目前国内有4个自主研发品种。神州细胞的重组全人源抗人表皮生长因子受体单抗注射液目前已经进入Ⅰ期临床，而上海赛伦生物和重庆智翔金泰生物各自的重组全人源抗EGFR单抗注射液均已经获得了临床批件，这些品种可能都是采用不同的方式使西妥昔单抗实现全人源。　　NO.5 HER2靶点　　[已上市/在研品种] 19种　　[生物类似药热点] 曲妥珠单抗(10种)　　HER2靶点单抗主要用于乳腺癌等HER2高表达的癌症治疗。第一个获批的HER2类单抗是罗氏的曲妥珠单抗(赫赛汀)，该药2015年全球销售额达到68亿美元，在国内该药销量同样增速迅猛，样本医院2015年赫赛汀销售额达6.66亿元。对于HER2高表达的乳腺癌、胃癌等疾病，曲妥珠单抗的疗效优越，并已经被国内外指南一致推荐为HER2阳性的乳腺癌等疾病的一线用药。　　中国是乳腺癌的高发国，患者众多，故HER2单抗市场巨大。目前已上市和在研的HER2类单抗一共有19个，其中曲妥珠单抗及其类似药共有11个。在曲妥珠单抗类似药研发竞争中，复宏汉霖和嘉和生物的速度最快，目前正在Ⅲ期临床阶段，安徽安科和齐鲁则进入Ⅰ期临床。　　尽管曲妥珠单抗已经得到临床认同，但业内还是希望能在HER2药物中有新的突破。帕妥珠单抗是罗氏新获批的HER2单抗，该药尽管同属HER2单抗，但作用靶点与曲妥珠有所区别。　　临床研究发现曲妥珠单抗联合帕妥珠单抗的疗效较单用曲妥珠单抗大幅提升。目前帕妥珠单抗正在国内开展Ⅲ期临床。对于帕妥珠单抗，国内不少企业也跃跃欲试，其中齐鲁的帕妥珠单抗类似药获批进入临床，丽珠的重组抗HER2结构域Ⅱ人源化单抗注射液同样定位于HER2的结构域Ⅱ，作为创新药该药已经获批临床。　　抗体偶联技术在HER2单抗使用最多，罗氏的Trastuzumab Emtansine(Kadcyla)是第一个在HER2领域获得成功的抗体偶联物，该药利用曲妥珠单抗和微管蛋白类药物DM1，偶联物较曲妥珠单抗的疗效显著提升，该药目前正在国内开展Ⅲ期临床研究。　　国内针对HER2的抗体偶联物研发活跃，目前已经有百奥泰生物的注射用重组人源化抗HER2单克隆抗体-美登素偶联物和烟台荣昌的注射用重组人源化抗HER2单抗-MMAE偶联剂获批开展临床研究。　　在HER2领域还有一个值得大书特书的国产创新药：武汉友芝友这样一个名不见经传的创新企业正在开发注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体，该药是国内自主研发的首个申报临床的双特异性抗体，从理论上该药可以同时靶向HER2和T细胞，实现靶向免疫。　　NO.6 PD-1/PD-L1靶点　　[已上市/在研品种] 7种　　抗肿瘤无疑是抗体类药物最为关注的领域，而在抗肿瘤领域，以PD-1、PD-L1为代表的抗肿瘤免疫治疗又是其中最闪亮的类别。2014年《Forbes》破例将两个肿瘤免疫药物分别是Opdivo(Nivolumab)和Keytruda(Pembrolizumab)列为该年度最重要的创新药，各大专业医药数据分析公司也纷纷预测两个产品全球销售额将轻松突破50亿美元大关，甚至有望挑战修美乐的药王地位。除了这两个品种，罗氏的Atezolizumab也获批上市，该药是全球首个获批的PD-L1药物。三个药物目前都已进入中国，正在开展Ⅲ期临床研究，都有可能成为首个中国上市的PD-1/PD-L1药物。此外，默克雪兰诺的PD-L1药物Avelumab正在申请临床研究。　　PD-1/PD-L1类药物是国内抗体类药物创新的热点，国内在研的自主研发PD-1/PD-L1药物达7个，其中君实生物的重组人源化抗PD-1单抗注射液已经进入了Ⅰ期临床，此外百济神州的PD-1类药物BGB-A317、恒瑞的PD-1类药物SHR-1210和信达生物的PD-1类药物IBI308均获批临床。而基石药业、誉衡和嘉和生物各有1个PD-1/PD-L1类药物申报临床。　　NO.7 IL-6靶点　　[已上市/在研品种] 7种　　IL-6类单抗主要用于类风关等自身免疫疾病。类风关的生物制剂治疗一度被TNF-α 抑制剂垄断，但欧美最新指南普遍将各类生物制剂放到了等同地位，这使得包括IL-6类在内的各种非TNF类药物获得了巨大的市场机会。　　IL-6类药物目前最畅销的是罗氏的托珠单抗，该药2015年全球销售额达到15亿美元。在国内，IL-6治疗类风关的理念还有待推广，目前仅有静脉注射也阻碍了托珠单抗的推广。尽管不属于国内抗体类药物研究热点，但目前已上市和在研的IL-6类单抗依然达到7个，其中托珠单抗及其类似药共有4个。　　创新药方面，杨森的Sirukumab和Siltuximab(司妥昔单抗)都已申请在中国开展临床研究，其中全人源IL-6单抗Sirukumab已获得临床批件，在免疫原性方面有一定优势。国内IL-6创新药领域目前仅有药明康德的重组全人抗白介素-6单克隆抗体注射液，该药是药明康德和阿斯利康旗下的MedImmune共同研发的产品。　　NO.8 RANK靶点　　[已上市/在研品种] 6种　　核因子-κ B受体活化因子(RANK)及其配体RANKL与破骨细胞的成熟等一系列骨代谢相关信号通路有关。对RANK及其配体RANKL的抑制，可在某些情况下改善骨代谢，减少骨质疏松和骨折等疾病风险。　　根据该机制，安进成功开发了针对RANKL的狄诺塞单抗，该药已获批用于恶性肿瘤骨转移(SREs)和骨质增生等4种有巨大市场容量疾病的治疗。狄诺塞单抗尽管上市时间不长，但市场表现优异，2015年其全球年销售额已达30亿美元。　　国内RANK单抗均属于狄诺塞单抗及其类似药。安进的原研药目前已经在中国进入Ⅲ期临床。5个类似药中，齐鲁进度最快，已获得临床批件 其他厂家则还处于申报临床阶段。

在生物药众多的品类中，抗体药物是当前最大的治疗用生物剂类别，单克隆抗体是研发最早、研究最为深入的抗体药，具有较高的安全性与有效性。近年来随着单抗药物各个靶点不断进入红海竞争状态，双抗项目研发日渐火热。双特异性抗体药物（简称“双抗”）是新型的二代抗体，拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤。与但双抗药物开发复杂性和技术壁垒更高，对于技术平台和靶点选择的适配性要求也有所提高。抗体-药物偶联物（ADC）是通过化学反应，把传统的小分子抗癌药物与重组单克隆抗体（mAb）分子通过连接分子结合，所形成的新分子。抗体工程在10年间也已经取得了相当大的进展，允许更多的位点特异性偶联，提高了ADC的均一性和稳定性。新的第二代和第三代ADC已经进入临床，以期获得更好的治疗效果和安全性。几十种基于半胱氨酸残基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶联技术也已经在临床前研究获得了验证。此外，更多的肿瘤特异性抗原靶点和肿瘤内细胞毒性药物的释放机制使ADC获得了爆炸式的发展，ADC药物进入了黄金时代。为促进我国抗体药物产业持续快速发展，仪器信息网将于2022年9月14日-15日举办第五届“抗体药物研发与质量分析”主题网络研讨会，特别邀请二十余位多位业内研发专家、质量控制专家，对当前抗体药领域研究热点双抗、ADC相关研发、分析技术开发、质量研究、CMC开发、生命周期管理等广受关注的内容进行精彩分享，欢迎广大相关从业人员免费报参会！点击图片报名参会大会亮点一、专家阵容：恒瑞、信达、复宏汉霖等国内知名生物医药企业总经理、高级副总裁、研发总监、质量控制总监等大咖阵容二、热点内容：双抗、ADC药物研发策略和案例分享、 质量研究、质谱、色谱分析方法解析、 CMC开发、全生命周期管理考量和经验分享3、 参会人员专业、垂直：制药企业、CRO/CDMO、生物技术公司、政府主管部门、药检机构、科研院所免费报名链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/antibodydrug2022/大会日程时间 Time报告题目Topic演讲嘉宾The Speakers抗体药物研发（上）(09月14日)9:00聚焦热点——ADC药物张娟(中国药科大学 教授)9:30更新中锐欧森中国10:00双特异抗体生物学活性分析方法的开发易继祖(友芝友生物 高级副总裁)10:30心血管代谢系统的抗体新药研发张成(鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 高级副总裁和首席科学官)11:00肿瘤免疫新药研发策略赵永浩(江苏康宁杰瑞生物制药有限公司 研发总监)抗体药物研发（下）-双抗、ADC药物(09月14日)13:30ADC研发进展与挑战陶维康(恒瑞医药股份有限公司 副总经理)14:00自动化时代下聚焦细胞株开发的自动化解决方案刘达潍(贝克曼库尔特生命科学 自动化应用专家)14:30高通量分析技术助力双抗新药开发探讨谢红伟(信达生物制药集团 产品开发部副总裁)15:00更新中SCIEX中国()15:30抗体偶联药物的CMC研发挑战及策略黄鹏(东曜药业有限公司 ADC研发负责人)16:00创新全人双抗设计/筛选及双靶点ADC新药开发案例杨勇飞(百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司 新药研究院 总监)抗体药物分析与质量控制(09月15日)9:00抗体药物的质量研究策略及质控标准建立黄懿(上海探实生物科技有限公司 总经理)9:30更新中多宁()10:00复杂蛋白质药物体系异质性的质谱解析王冠博(北京大学生物医学前沿创新中心 研究员)10:30线性pH梯度分析单克隆抗体变体的创新技术李国荣(苏州科技大学 兼职教授)11:00高通量质谱用于抗体药物的结构表征卢颖洪(南京理工大学 副教授)抗体药物后期工艺开发和商业化生产(09月15日)13:30质量研究对抗体药物CMC研发关键节点的把控吕品(上海博威生物医药有限公司 质量分析部/执行总监)14:00基于cIEF-MS联用技术的抗体药物电荷异质性分析解决方案张为(永道致远科学技术有限公司 应用科学家)14:30抗体药物工作参比品的全生命周期管理李镭(浙江博锐生物制药有限公司 研发质量副总监)15:00抗体药后期CMC开发和商业化郭文晖(KKH Consultant LLC Principal Consultant)15:30全生命周期管理下生物药技术转移考量李孟捷(三生制药集团 质量 商务负责人 高级工程师)16:30抗体委托生产期间委托方和受托方的质量责任李醒(杭州奕安济世生物药业有限公司 QA执行总监)免费报名链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/antibodydrug2022/ 专家阵容（更新中）第五届抗体药物会议交流群

抗体药物是生物药物中最重要的组成之一，约占全球生物药市场五成，也是全球生物技术领域产业化最为成功的产品。抗体药物是以基因工程、细胞工程、发酵工程为工艺研发的生物技术药物，主要分三类：单克隆抗体药、多克隆抗体药与基因工程抗体药物；基因工程抗体药物包含源化改造抗体药物（嵌合抗体、人源化及完全人源化抗体）与小分子抗体药物（单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体及人源Fab片段）。抗体药物因抗体药物与靶抗原结合具有高特异性、有效性和安全性，在恶性肿瘤、自身免疫疾病等重大疾病的临床治疗中发挥着越来越重要的作用。虽然我国抗体药物产业起步相对较晚，但近几年，中国抗体药物研发进入快车道。据了解，目前国内进行抗体药物研发的企业有百余家，上市的抗体药物达27个，此外还有数百个抗体药物正处于研发阶段，在研药物包括单抗、双抗和ADC药物等多种类抗体药。随着抗体药物产业的不断发展，研发、质量分析和生产等各个环节的技术方法和工艺等也在不断创新发展，从业人员需要及时了解相关进展，以便更好地开展工作。2021年9月14-16日，仪器信息网将举办第四届“抗体药物研发与质量分析”网络会议，聚焦抗体药物从研发到生产全流程的技术和方法，为行业从业人员提供免费、高效的学习交流平台。点击下图，可免费报名参会。点击图片免费报名会议看点• 设“单抗药物研发”、“双抗、ADC药物研发”、“抗体药物质量控制”、“抗体药物生物工艺”等多个主题会场，内容涉及单抗、双抗、ADC多类型抗体药、覆盖抗体药物研发生产全流程；• 30位专家参与，多位国内知名抗体药物企业（信达、奕安济世、武汉友芝友、亿一生物）高管和技术负责人结合实际案例详述研发进展与关键技术，可在线与大咖互动交流（对于社恐症人士更是绝对福利~）• 企业结合科研人员的知识盛宴，多位高校科研专家进行技术讲解，未来意向从事抗体药物事业的学生党不可错过！• 更多会议亮点，报名了解。扫码免费报名参会会议日程分会场一（9月14日上午）：单抗药物研发时间报告主题报告嘉宾9：00-9：30特异性靶向CLDN6的卵巢癌治疗抗体袁纪军上海吉凯基因 副总经理9：30-10:00数字化转型助力生物制药研发与数据合规黄皓珀金埃尔默 信息科学业务部售前总监10:00-10:30基于抗体分子的创新药物研究张娟中国药科大学 教授10:30-11:00自动化移液工作站在生物大分子药物研发领域的主要应用刘健德国耶拿 生命科学部移液工作站产品经理11:00-11:30基于精准医学大数据的新药研发和伴随诊断楼敬伟宝藤生物 董事长兼总裁分会场二（9月14日下午）：双抗、ADC药物研发13:30-14:00双特异性抗体开发中的杂质研究易继祖友芝友生物 副总裁14:00-14:30Hamilton自动化移液工作站让蛋白纯化如此简单姜超哈美顿 应用工程师14:30-15:00肿瘤免疫治疗：过去，现在和将来王常玉康诺亚生物医药 高级副总裁15:00-15:30待定拜泰齐贸易（上海）有限公司15:30-16:30基于糖链的ADC定点偶联技术与应用黄蔚中国科学院上海药物研究所 课题组长/研究员分会场三（9月15日上午）：抗体药物质量控制（上）9：00-9：30单抗药物LC-MS/MS与ECL生物分析方法比较(Case Study: SHR-1603和SHR-1222)高宇雄恒瑞医药 临床研发9：30-10:00BioAccord系统在抗体药物研发与质量控制上的应用邵锴沃特世 大中华区生物制药高级市场专员10:00-10:30抗体药物工艺开发的过程监控和高通量质量控制谢红伟信达生物制药集团 产品开发部副总裁10:30-11:00粘度流变在高浓度制剂中的应用刘兵锐欧森 产品经理11:00-11:30实验设计(DoE)在单克隆抗体工艺开发中的应用李国荣苏州美极医疗 总裁分会场四（9月15日下午）：抗体药物质量控制（下）14:00-14:30对单克隆抗体及其复合物的“自上而下”质谱分析王冠博北京大学生物医学前沿创新中心 研究员14:30-15:00抗体类生物大分子色谱表征田海玉纳谱分析 液相色谱柱产品线负责人15:00-15:30生物分析及临床相关的考量—抗体偶联药及双特异性抗体药张辰浦PPC佳生 生物分析实验室负责人15:30-16:00Q-TOF和LC在抗体药物质量研究中的应用唐雪岛津 应用工程师16:00-16:30磁共振在抗体药物研发与质量控制中的应用邓惠文布鲁克 制药市场拓展经理16:30-17:00高通量质谱用于抗体药物的结构表征卢颖洪南京理工大学 副教授分会场五（9月16日上午）：抗体药物生物工艺（上）9：00-9：30数据分析在细胞培养工艺开发和优化中的应用赵亮上海倍谙基生物 副总裁，研发中心负责人9：30-10:00东曹FcR亲和色谱技术在抗体药物研发、质控及工艺优化中的应用杜耀杰东曹 应用开发10:00-10:30抗体药物的开发过程和质量标准杨晓明杭州奕安济世 总经理10:30-11:00基于微芯片CE-MS联用技术的全自动培养基生化分析仪 REBEL 加速生物药上游工艺开发王亮908Devices Inc. （美国） Science leader, APAC11:00-11:30抗体快速纯化工艺耿信笃西北大学 教授分会场六（9月16日下午）：抗体药物生物工艺（下）14:00-14:30应用平台技术快速助推双抗从开发到生产李巍巍 白帆生物 工艺总监14:30-15:00中美双报的工艺验证设计戚波亿一生物 中国区COO/总经理15:00-15:30表位模拟肽识别技术：从抗体药物生产纯化到临床精准分析江正瑾暨南大学药学院 副院长/教授15:30-16:00蛋白药物制剂中的可见异物问题探讨吴用百奥泰 制剂高级经理扫码下方二维码，进入本次会议交流群，第一时间获取相关技术内容及会议回放视频。扫描进入会议交流群

p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 说到抗体药物，主要是指单克隆抗体及其相关的大分子蛋白类生物药物。2019年全球药物销售排行榜的前15名中就有8个是单克隆抗体药物，其中艾伯维公司的阿达木单抗（修美乐）已连续8年蝉联榜首。 /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 单克隆抗体药物因具有更高的靶向性，可直达病变细胞，具有减少正常细胞受损，减少副作用等独特优势，一直是近几年来药物研发的热点。与小分子药物的原研药和仿制药情况一样，抗体药物在专利到期后，一般会迎来大批的生物类似药上市。包括目前国产已经上市的生物类似药：复宏汉霖的利妥昔单抗（汉利康），百奥泰生物的阿达木单抗（格立乐），海正药业的阿达木单抗（安健宁）和齐鲁制药的贝伐珠单抗（安可达）。其中的利妥昔单抗和贝伐珠单抗都是抗肿瘤生物类似药。另外我国还有将近400个在研的生物类似药。 /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 随着越来越多的单抗生物类似药的研发和上市，建立稳定可靠的生物基质样品中抗体药物生物检测方法对阐述其药代动力学，药效动力学及毒理学等方面的性质至关重要。尤其像在药物上市后临床使用阶段的治疗药物监测过程中，抗体药物的生物分析方法建立对临床合理用药具有重要的指导作用。 /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 2020年4月28日，由中国药理学会、中日友好医院发起，中国药理学会CTDM-GP项目组、中国药理学会治疗药物监测研究专业委员会、《中国医院用药评价与分析》杂志主办的“抗肿瘤生物类似药治疗药物监测专家共识线上发布会”成功召开。为广大临床药师和医师在临床真实世界如何开展抗肿瘤生物类似药治疗药物监测（TDM）提供技术指导，以强化抗肿瘤生物类似药在临床中的个体化用药策略，推动安全有效使用。 /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun text-indent: 2em " 《抗肿瘤生物类似药治疗药物监测药学专家共识（2020版）》中明确提到推荐建立液相色谱-质谱分析方法（LCMS）测定贝伐珠单抗、曲妥珠单抗和利妥昔单抗的血药浓度，并进一步评价血清、血浆与全血样本的测定差异性。其推荐程度最高等级“强”这一列中，专家比例高达74.65%。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/4a7ece57-8cc7-457f-8e9c-9045c3933df9.jpg" title=" 21.png" alt=" 21.png" / /p p /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 针对抗肿瘤生物类似药物的生物分析方法开发，岛津除了可以提供LCMS分析仪器，更有基于纳米表面分子导向限制性酶解技术（nSMOL,nano-Surface and Molecular Orientation Limited Proteolysis）的定量试剂盒产品提供！ /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/bb077e01-6f29-4dad-95f7-0447bfa6bf5c.jpg" title=" 22.png" alt=" 22.png" / /p p /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " nSMOL 技术可在近生理条件下，完成对抗体药物的选择性酶解，并获得与之相应的特征性肽段组分。其工作原理是利用抗体树脂对样品中单克隆抗体药物进行捕获，之后通过蛋白酶纳米颗粒对树脂上抗体成分进行限制性酶解，得到多肽片段。 /span span style=" font-family: 宋体, SimSun " 该酶解主要针对抗体的 Fab 区域，Fab 区域外余下部分不受酶解作用且仍保留在原树脂上（如下图所示）。因此，nSMOL 技术不仅能够保证获得特异性的抗体序列片段，而且限制性酶解技术大大降低了样品的复杂性，缩短样品前处理时间，提高了检测灵敏度。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/cbd0bbc9-2957-4f4b-a7d1-7429a7260e60.jpg" title=" 23.png" alt=" 23.png" / /p p style=" text-align: center" img style=" " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/8904d059-e668-47b7-8b86-2a3feab64929.jpg" title=" 24.png" / /p p /p p /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 针对抗肿瘤抗体药物，岛津公司开发了针对人血浆中曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、利妥昔单抗等单克隆抗体药物，基于nSMOL技术的定量分析方法，研究成果已在多个国际期刊中发表。另外针对自身免疫性疾病治疗用抗体药物（英夫利昔单抗、阿达木单抗、尤特克单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、依那西普、阿巴西普），岛津开发了基于nSMOL技术的同时定量检测方法。 /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 对于生物药LCMS定量方法的开发，岛津同样可以提供针对定量肽段定制13C，15N高品质稳定同位素标记的服务，以及针对高通量样品处理的96孔前处理填料板！ /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/c5f44149-61ab-4727-a083-4b5f2a780e44.jpg" title=" 25.png" alt=" 25.png" / /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " /span br/ /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " br/ /span /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: right " span style=" font-family: 宋体, SimSun " 供稿人：岛津（上海）实验器材有限公司 市场部 周可鹏 /span /p p /p p style=" line-height: 1.75em text-indent: 2em text-align: justify " span style=" font-family: 宋体, SimSun " & nbsp /span /p p br/ /p

p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/9537c51b-c218-4822-b839-7c19b1cd2048.jpg" title=" yimiao.jpg" alt=" yimiao.jpg" / /p p 　　 strong 大会背景： /strong /p p 　　人用疫苗和抗体是生物医药产业的重要组成部分。接种疫苗是公认的最经济、有效的感染性疾病防控手段。当前全球上市的疫苗种类约68种,可预防34种疾病。近年来,全球疫苗市场年销售总额保持在300亿美元左右。抗体药物是现代生物医药产业的主力军,目前占全球生物药物市场的50%,是生物医药产业增长最快的细分领域。抗体药物以其高特异性成为全球药品市场上炙手可热的药品，而单克隆抗体作为抗体的一种，主要用于恶性肿瘤、免疫性疾病、移植排斥反应、感染性疾病和心血管疾病等治疗中。 /p p 　　 strong 【时间】 /strong 2019年7月11日-12日 /p p 　　 strong 【地点】 /strong 北京 亦庄生物医药园 /p p 　　 strong 【形式】 /strong 大会主题报告、分会场技术报告、新技术与产品展示 /p p 　　 strong 【会议规模】 /strong 500人 /p p 　 strong 　参会人员 /strong /p p 　　诚挚邀请各高校科研院所、国内外著名专家学者、抗体研发中心，研究所，重点实验室的主要负责人、疫苗抗体生产和销售企业的高管、相关厂商、届时将吸引500余名专业人士齐聚北京。 /p p 　　 strong 参展费用 /strong /p p 　　标准展位(2m× 3m=6m)：14800元人民币 /p p 　　统一配置：三面隔板(高度250cm,可用高度246cm)一块楣板(标注公司Logo 与名称)地毯、两盏射灯、一张洽谈桌、两把椅子、220V电源插座。 /p p 　　 strong 参展范围 /strong /p p 　　1、疫苗、抗体、诊断试剂、实验室设备 /p p 　　2、细胞培养基、动物血清等方面的技术与产品 /p p 　　3、生物培养箱、发酵罐、酶标仪、生物传感器 /p p 　　4、疫苗抗体技术解决方案的厂商 大会组委会秘书处-联络方式 /p p 　　联系人：范老师 15910266159 (微信同步) /p p 　　邮 箱：fanyu@swjslt.com Q Q 咨询：3030466696 /p p 　　 strong 论坛日程安排 /strong /p p 　　 strong 2018年7月11日上午 /strong /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　07:30-09:00 strong 参会代表报到 /strong /p p 　　09:00-09:15 strong 开幕式 /strong ：园区领导致开幕词 /p p 　　09:15-09:45 中国生物医药现状与发展趋势 /p p 　　09:45-10:15 疫苗创新的机遇及挑战 /p p 　　10:15-10:35 中场休息 参观展览 /p p 　　10:35-11:05 创新生物药在中国的挑战及应对策略 /p p 　　11:05-11:35 连续工艺操作在抗体药物生产中运用与进展 /p p 　　11:35-12:05 病毒疫苗高效工业化生产关键问题及其对策 /p p 　　12:00-13:00 strong 自助午餐 /strong /p p 　　 strong 7月11日下午 专题论坛一 新型疫苗研发与评价 /strong /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　13:30-14:00 新型疫苗研发趋势与新技术应用 /p p 　　14:00-14:30 病毒疫苗工艺杂质控制及检测方法 /p p 　　14:30-15:00 新疫苗临床前安全性评价 /p p 　　15:00-15:20 中场休息 参观展览 /p p 　　15:20-15:50 H7H9流感疫苗安全性及免疫性探讨 /p p 　　15:50-16:20 癌症疫苗的开发进展及未来机会 /p p 　　16:20-16:50 佐剂研发推动创新疫苗发展 /p p 　　16:50-17:20 疫苗过程中的病毒颗粒纯化 /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　 strong 7月12日上午 专题论坛二 抗体药物研发新技术 /strong /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　09:00-09:30 中国生物制药的工艺开发和商业规模生产-优势和挑战 /p p 　　09:30-10:00 抗体类药物创新研发策略 /p p 　　10:00-10:20 中场休息 参观展览 /p p 　　10:20-10:50 生物制药过程的效率和效益：过程模拟和评价 /p p 　　10:50-11:20 抗体药物下游工艺开发与产业化关键技术 /p p 　　11:20-11:50 单克隆抗体唐的质量控制技术 /p p 　　12:00-13:30 自助午餐 /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　 strong 7月12日下午 专题论坛三 抗体药物研发新技术 /strong /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　　13:30-14:00 抗病毒治疗性抗体的研究进展 /p p 　　14:00-14:30 从抗体设计到产业化生产看QBD的重要性 /p p 　　14:30-15:00 双特异抗体药物研发技术 /p p 　　15:00-15:20 中场休息 参观展览 /p p 　　15:20-15:50 蛋白(单抗)药物制剂的开发策略 /p p 　　15:50-16:20 抗体药在肿瘤和传染病治疗中的应用 /p p 　　16:20-16:50 单抗药物的药学研究开发重点与案例分析 /p p 　　............................................................................................................................................... /p p 　 strong 　1，参展商确定参展请与组委会联系索取“参展申请表” /strong /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 温馨提示：参展企业须尽早报名,以便获得相对优越位置。 /span /p p br/ /p

连接子 - 抗体与药物结合的关键因素抗体-药物偶联物（Antibody-drug conjugate, ADC）结合了抗体的高特异性和小分子药物的强细胞毒性。这种组合结合了抗体的独特和非常敏感的目标能力，可以区分健康组织和癌组织。它还具有细胞毒性药物的细胞杀伤能力，可能最大限度地减少剂量限制性毒性，同时最大限度地提高所需的治疗效果。ADC的主要优点是可以在体循环中作为药物使用，最终在靶肿瘤细胞中释放游离药物。在这一过程中，连接子在释放有效药物靶向肿瘤细胞，决定ADC的药代动力学特性、治疗指标和选择性，甚至整体成功方面发挥着关键作用。目前使用的连接子可分为可切割连接子和不可切割连接子两大类，它们之间的区别在于它们在细胞内是否会被降解。一、用于连接的可切割连接ADC连接子的主要类别是可切割连接子。可切割连接子被设计为对细胞外和细胞内环境差异（pH、氧化还原电位等）表现出化学不稳定性，或者可以被特定的溶酶体酶切割。在大多数情况下，这种连接子被设计成在键断裂后释放有效载荷分子。这种无迹可循的药物释放机制使研究人员能够根据已知的游离有效载荷的药理学参数估计共轭有效载荷的细胞毒性。2.1 可切割接头的类型可裂解接头腙是一种酸不稳定基团，当ADC被转运到核内体（pH 5.0-6.0）和溶酶体（pH约4.8）时，它被用作可切割的连接子，通过水解释放游离药物。组织蛋白酶B响应连接子组织蛋白酶B是一种溶酶体蛋白酶，在多种癌细胞中过表达，参与人类许多致癌过程。组织蛋白酶B的底物范围相对较广，但它优先识别某些序列，如苯丙氨酸-赖氨酸（Phe-Lys）和缬氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）。这种序列的c端切割肽键。Val-Cit和Val-Ala连接物偶联p -氨基苄氧羰基（Val-Cit- pabc和Val-Ala- pabc）是adc最成功的可切割连接物。PABC片段使自由有效载荷分子以无迹方式释放。双硫键连接子谷胱甘肽敏感连接子是另一种常见的裂解连接子，其策略依赖于细胞质中较高浓度的还原分子（如谷胱甘肽）（1-10 mmol/L）。二硫键嵌入在连接子中，在循环中抵抗还原性裂解。然而，内化后，大量细胞内谷胱甘肽减少二硫键，释放自由有效载荷分子。为了进一步提高循环中的稳定性，通常在二硫键旁边安装一个甲基。焦磷酸二酯连接子该阴离子连接子具有比传统连接子更高的水溶性和优良的循环稳定性。此外，在内化后，焦磷酸二酯通过内核体-溶酶体途径快速裂解，释放未修饰的有效载荷分子。图1. 可切割连接子。（Kyoji Tsuchikama & Zhiqiang An. 2018）二、不可切割的连接子不可切割连接子由稳定的键组成，抵抗蛋白质水解降解，确保比可切割连接子更高的稳定性。不可切割连接子依赖于细胞质和溶酶体蛋白酶对ADC抗体成分的完全降解，并最终释放与降解抗体衍生的氨基酸残基连接的有效载荷分子。与可切割连接子相比，不可切割连接子的最大优点是其等离子体稳定性增强，与可切割连接子相比，这可能提供更大的治疗窗口。此外，与可切割的偶联物相比，它有望降低脱靶毒性，因为不可切割的adc可以提供更大的稳定性和耐受性。图2. 不可切割的连接子。不可切割连接的化学稳定性可以承受蛋白质水解降解。单抗的细胞质/溶酶体降解可以释放与降解的单抗衍生氨基酸残基相连的有效载荷分子。（Kyoji Tsuchikama & Zhiqiang An. 2018）三、总结结论保证游离药物在肿瘤细胞内的特异性释放是选择Linker的最终目的。该连接子对ADC的稳定性、毒性、PK特性和药效学等具有重要意义。每个环节都有其优点和缺点。在选择连接子时，必须考虑许多因素，包括单克隆抗体和细胞毒性药物中的现有基团、反应性基团和衍生功能基团。最后，需要通过个案分析确定如何优化选择合适的连接物、靶点和毒性分子，平衡ADC药物的有效性和毒性。表1. 连接子类型及优缺点比较参考文献1. Kyoji Tsuchikama & Zhiqiang An. Antibody-drug conjugates: recent advances in conjugation and linker chemistries. Protein & Cell. 2018 9:33-46.2. Jun Lu. Feng Jiang. Aiping Lu. and Ge Zhang. Linkers Having a Crucial Role in Antibody–Drug Conjugates. Int J Mol Sci. 2016 Apr 17（4）:561.3. Monteiro Ide P, Madureira P, de Vasconscelos A, Pozza DH, de Mello RA. Targeting HER family in HER2-positive metastatic breast cancer: potential biomarkers and novel targeted therapies. Pharmacogenomics. 2015 16（3）:257-71.阿拉丁提供相关产品，详情请见阿拉丁官网：Linkers - A Crucial Factor in Antibody–Drug Conjugates (aladdin-e.com)

抗体偶联药物是指将具有高度靶向性的单克隆抗体，通过特定的一段连接片段，实现同具有细胞毒性抗肿瘤药物的偶联，从而将抗体的高度选择性与药物的抗肿瘤活性合二为一。2021年8月8日，荣昌生物与Seagen（SeagenInc. 纳斯达克：SGEN）达成一项全球独家许可协议，以开发和商业化其抗体偶联药物（ADC）维迪西妥单抗，9月22日，国家药品监督管理局（NMPA）药品审评中心（CDE）官网显示，荣昌生物（09995.HK）靶向Claudin18.2的抗体偶联药物（ADC）RC118获得临床试验默示许可，适应症为Claudin18.2表达阳性的局部晚期不可切除或转移性恶性实体瘤。国内研发实力增强，中国ADC药物研究大有可为，期待为患者造福。 目前在研的ADC药物见下表：ADC结构主要由靶向抗体，连接子linker以及高效价小分子细胞毒性药物。药物研究过程涉及到重要关键质量属性，包括药物/抗体比率DAR（drug-to-antibody ratio），药物荷载分布，未偶联抗体，残留药物，大小异质性以及电荷异质性，以关键的DAR研究为例，DAR表示与抗体偶联细胞毒性药物的平均数量，是ADC药物重要质量属性。现在研厂家的pepline DAR值有不同设计的缘由，低药物荷载时，ADC效力可能会降低或达不到要求，高药物荷载，可能会影响毒性以及代谢问题。表.ADC药物重要关键质量属性 对于ADC药物DAR值分析，推荐使用液相以及液相串联质谱方法分析。根据该指南要求，岛津推荐：Nexera生物惰性液相以及Nexera LC40液相 Nexera Bio生物兼容液相系统 岛津生物兼容液相Nexera Bio系统流路采用生物惰性材料，不仅耐腐蚀，而且能减少生物大分子的吸附，保证生物大分子的完整性，有效保障分析重复性和仪器耐用性。 Nexera Bio生物兼容液相系统特点：● 泵头、混合器、进样针、样品环和接头配件等均采用生物惰性材料，耐腐蚀、抗吸附；● 耐高压不锈钢包覆的Peek管路，提升系统耐压至66MPa；● 标配输液泵柱塞清洗蠕动泵，有效降低盐析，实现良好的送液稳定性，并防止泵头腐蚀。 Nexera LC-40 系列 Nexera系列HPLC与人工智能和物联网结合，实现智能化和自动化。融合“AI”和“loT”技术，轻松应对RNA类物质分析液相色谱仪。 ADC样品DAR值分析案例通过岛津液相以及HIC色谱柱可自动化分析得到DAR值计算报告。 更多内容了解或仪器配置应用了解，请联系岛津工作人员！ 参考文献：[1] Wagh A , Song H , Zeng M , et al. Challenges and new frontiers in analytical characterization of antibody-drug conjugates[J]. mAbs, 2018:0-0. 岛生物药， 津心为您

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " 1月10日，挪威，BerGenBio公司今天宣布其在研的治疗性抗AXL单克隆抗体BGB149的1期临床研究已经完成第一位受试者的给药。BGB149是目前第一个进入临床开发的能够功能性阻断AXL活性的完全人源化单克隆抗体，临床前研究已证实其作用机制和功效。此次的期临床试验将招募多达36名受试者，在进行单剂量给药后以评估BGB149的安全性、耐受性和药代动力学特性。 /span br/ /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/32833091-b2c9-4ba7-84e3-eadadbc4381d.jpg" title=" 微信图片_20190114104504.jpg" alt=" 微信图片_20190114104504.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " AXL激酶是细胞膜受体，在癌症的发生发展中，AXL激酶可以抑制身体对肿瘤的免疫反应，同时该蛋白也是目前众多患者治疗失败的重要原因。因此AXL抑制剂在肿瘤联合治疗中具有潜在的高价值，可以解决更多的临床需求，蕴藏着较大的市场潜力。 /p p br/ /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Journal of Proteome Research上的文章，Template-Assisted De Novo Sequencing of SARS-CoV‑2 and Influenza Monoclonal Antibodies by Mass Spectrometry [1]，文章的通讯作者是德克萨斯大学生物医学研究支持中心的Maria D. Person。抗体在对病毒和其他病原微生物的适应性免疫反应中起着重要作用。对病毒中和抗体的详细表征对于开发能够有效预防病毒疾病的新疫苗和单克隆抗体疗法至关重要。目前，仅从蛋白质中获得抗体的完整氨基酸序列仍然具有挑战性，且许多用于氨基酸从头测序的软件对计算、硬件及操作人员知识和经验的要求较高。另一种蛋白基因组学方法是使用来自DNA序列的数据库作为起点，以数据库序列和实验数据之间的最佳匹配作为模板。这种方法在分析抗体时特别有用，因为大部分抗体序列（不包括CDR3区域）通常与种系序列非常相似。此外，准确区分Ile和Leu在抗体CDR区测序时尤为重要，而大多数蛋白质从头测序软件都没有解决这个问题。Supernovo是从种系序列模板开始的测序程序之一，该模板可以利用ETD和EThcD片段数据来自动区分Ile/Leu。在这项研究中，作者利用SARS-CoV-1人类抗体来开发模板辅助从头测序的方案，对两株SARS-CoV-2人类单克隆抗体进行了测定，最终优化的方案使用四种蛋白酶、双片段化方法、优化补充激活归一化碰撞能量和Supernovo获得99%准确的氨基酸序列，并以该方案对25株流感人单抗进行了测序。一、模板辅助从头测序方法的建立Supernovo的工作原理是，首先将MS/MS数据与种系数据库中的序列进行匹配，在初始种系序列选择之后，使用通配符搜索来确定接合（J）区域，以与可变区和恒定区候选最佳结合，然后进行in silico重组以生成模板。接下来，限制的从头测序和Byonic通配符搜索通过在迭代过程中改变单个氨基酸来改进模板，实现实验数据最佳匹配。最初由种系序列确定的Ile和Leu残基通过蛋白酶切割特异性和w离子的存在进行修正。利用多种蛋白酶从基因组数据库中选择种系支架序列，并通过通配符搜索获得从头测序所需的各种肽。胰蛋白酶和糜蛋白酶是根据其不同的切割特异性选择的，并选择特异性较低的弹性蛋白酶和胃蛋白酶提供额外的切割位点。由于Supernovo利用来自特异性和非特异性裂解肽的所有信息来构建序列，因此具有许多重叠的裂解位点对于序列测定至关重要。作者首先用序列已知的重组单抗CR3022制定和优化方案。CR3022用胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和胃蛋白酶酶切，用HCD和EThcD LC-MS/MS分析酶切溶液。实验显示使用EThcD可以在不针对选定的单个z离子的情况下全局碎裂肽混合物，并且产生足够的w离子来区分Ile/Leu。b、c、y、z和w离子的产率取决于SA-NCE， 35%的SA-NCE值产生了最高数量的高置信度Ile/Leu分配，并被选择用于最终方案。图1显示了两种含有Leu和Ile的重链肽，其中检测到w离子z-43（Leu）和z-29（Ile），从而允许Supernovo区分Ile和Leu。虽然在碎裂谱中可以检测到w离子，但使用单一SA-NCE值的宽带碎裂，其丰度较低，这是该方法的主要限制。将多重断裂能量相结合，可以提高对w离子的检测，而使用额外的蛋白酶增加切割位点的数量，有助于分离位置相近的Ile/Leu。图1 使用EThcD对Ile/Leu进行MS/MS分配图2显示了用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和弹性蛋白酶酶切的重链Fab区域在HCD碎裂下的序列覆盖图。由于四种蛋白酶的不同切割特异性以及Supernovo对非特异性切割肽的匹配，可以观察到肽在许多氨基酸残基上的切割。除脯氨酸外，大多数残基的MS/MS中都观察到对应碎片离子。图3显示了DNA确定的参考CR3022序列（DNA sq）、通过将IMGT数据库中的序列片段与MS数据（SNO-gm）进行数据库匹配而识别的种系模板，以及通过对抗体可变区Fab的MS数据（SNO-MS）进行Supernovo分析而生成的最终从头序列之间的比较。所有CDR区域均实现100%正确的氨基酸序列（灰色高亮）覆盖，具有正确的Ile/Leu分配。Supernovo的错误分配（蓝色高亮）主要发生在HC和LC上的N-末端残基以及LC上的C-末端序列。与DNA衍生序列不匹配的外来N和 C-末端残基均与初始种系支架存在偏差，如图3中重链末端的洋红高亮所示。末端氨基酸具有较少的裂解和片段数据，并且可能具有混杂的修饰。半胱氨酸残基可导致附近氨基酸的错误分配，因为半胱氨酸硫的氧化修饰。总的来说，99%的单克隆抗体序列是通过这种方法正确测定的。结合HCD和EThcD数据，68个Ile/Leu中有67个被正确分配。图2 用胰蛋白酶（黑色）、糜蛋白酶（蓝色）、弹性蛋白酶（红色）和胃蛋白酶（黄色）酶切并用HCD裂解的CR3022重链Fab的肽覆盖图。图3 对CR3022 DNA衍生序列（DNA sq）、MS Supernovo种系模板（SNO-gm）和Fab区域的实验结果（SNO-MS）进行比对接着，作者使用两种具有DNA衍生序列的SARS-CoV-2抗体CM66和CM67来测试该方案的最终版本（即四蛋白酶酶切，HCD和EThcD活化，SA-NCE 35%）。表1总结了该方法对已知序列的三种抗体CR3022、CM66和CM67的测试结果。CDR区氨基酸在HC和LC中的分配均正确，只有两个Ile错误分配给Leu。在高通量方法中，产生足够强度的诊断性w离子仍然不一致，但当与蛋白水解切割偏好和种系模板结合使用时，该方法是有效的，至少提供97%的正确Ile/Leu分配。因此，四酶酶切双活化法被确定足以对抗体进行高度准确的序列测定。表1 受试单抗的氨基酸序列和Ile/Leu分配置信水平以及正确匹配的总结二、基于质谱的25种流感抗体分析产生高置信度序列作者用最终确定的方案分析了另外25种序列信息不确定的抗体，以评估该方法在更大规模的实验下是否能产生与SARS-CoV-1和2抗体相同水平的高置信度结果，并最终确定生成的序列是否可用于产生克隆和表达功能性抗体的基因。对于25株流感单克隆抗体，平均97%的序列和76%的Ile/Leu分配可在高置信度下确定。大多数置信度较低的氨基酸分配位于N端和C端，因此不太可能影响抗体结合。与半胱氨酸残基相邻的序列也有较高的中低置信度分配和偏离种系序列的发生率。在25株单克隆抗体中的24株中，两条链上三个CDR区域的所有残基都得到了高度可信的鉴定。由于该方法不总是在可检测水平上产生可区分的w离子，CDR区域具有一些中低置信度Ile/Leu分配。因此，当大规模应用于各种IgG抗体时，该方案提供了高置信度氨基酸序列。获得的流感单克隆抗体序列随后用于通过克隆和在HEK293细胞中表达产生抗体。三、流感病毒HA特异性人单克隆抗体的生物学活性及序列分析在克隆、表达和纯化后，通过ELISA评估原始25种流感病毒和相应重组表达的HA特异性单克隆抗体的生物活性。图4显示了25种单克隆抗体与原始和重组单克隆抗体的HA抗原的结合曲线。通过评估单克隆抗体对相应HA抗原的结合活性，证实了单克隆抗体对H1N1、H3N2和B型流感病毒HA的特异性。如图4所示，流感特异性单克隆抗体表现出与季节性和大流行性流感病毒株的重组HA（rHA）的差异结合，与原始抗体显示的结合活性相当。图4 原始MS测序（左曲线）和重组表达（右曲线）流感HA特异性单克隆抗体的ELISA结合曲线总的来说，作者通过对25个未知序列单克隆抗体进行测序，确认所采用的方法在不同单克隆抗体上产生的残基测定置信度与已知序列或商业来源的单克隆抗体相同。蛋白质组学方法可以用来检查基于DNA的方法，这些方法被认为更准确，或者可以用来清除样本处理和标记中的错误。通过ELISA结合试验观察并验证了CDR序列的多样性。这些分析证实，当克隆和重组表达时，质谱模板辅助从头测序产生的高置信度序列会产生与特异性流感病毒rHA抗原结合的重组单克隆抗体，从而对该方法进行生物学验证。撰稿：夏淑君 编辑：李惠琳文章引用： Template-Assisted De Novo Sequencing of SARS-CoV-2 and Influenza Monoclonal Antibodies by Mass Spectrometry.

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

我国生物制药产业发展正处于快速上升期，而单克隆抗体药物无疑是其中表现最为活跃的组成。2011年，全球单抗药物的市场总量已经达到628亿美元，国内市场规模超过10亿元，并且每年以50%以上的速度递增，高于国际单抗市场的增长速度。 全球重磅单抗历年销售额 　　目前，我国的单克隆抗体产业已经形成了以北京、上海、西安以及武汉等产业化基地，而单克隆抗体也发展到了第四代，我国已经上市的十几个单抗药物多为鼠源性，正在研究中的多为嵌合或者人源化单抗，而全人源单抗还没有。而在全球的单克隆抗体市场，全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。在FDA批准上市的80多种基因工程和抗体工程产品中，抗体类产品有26种，其中18种为人源化抗体。目前基本上所以有关抗体的制药技术都被欧美国家垄断，致使国内制药企业在抗体药物研发方面备受掣肘。2012年10月23-24日，"2012生物制药工程论坛"在上海万豪虹桥大酒店召开，近二十位嘉宾就生物制药工程工艺发表了精彩的演讲，围绕生物制药研发和生产过程中的技术要点、生产关键工艺等问题与参会者展开了深入探讨。大家一致认为：我国抗体药物产业化的主要限制因素有三个方面：动物细胞大规模培养、抗体大规模纯化及药物质量分析和质量保证。 　　动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点 　　动物细胞大规模培养技术在抗体、重组蛋白和病毒疫苗等生物医药产品的研发和工业化生产中具有广泛的应用，动物细胞表达药物已经成为当今生物医药产业发展的主流。由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性，大大促进了动物细胞大规模培养技术的深入研究与发展。当前动物细胞大规模培养技术已成为各个国家生物医药产业化的核心竞争点。 　　动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择，应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间，以加速其产品产业化的进程。当前，在被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌流培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是：获得最大生产力的同时注重维持产品的质量，去除所有培养环境中外源因子的污染，更为精确有效的工艺控制手段，规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。 　　我国动物细胞工程行业起步晚，目前上市产品数量和种类少，工程细胞株表达水平低，工业化生产规模小，最大规模只有3000L。华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室谭文松教授在"2012生物制药工程论坛"演讲中指出：“我国动物细胞生物医药产业面临诸多瓶颈，如细胞培养生产工艺技术落后，受产能和成本制约严重 无血清培养基、生物反应器和原辅料等过分依赖进口 表达产物质量低，标准缺失 分工不够明确，产学研用合作严重不足，对相关人才培养和储备远远不够。而根本问题在于忽视工程问题，轻视工程研究。” 　　针对如上问题，谭教授也提出了自己的建议，他认为：“我国应该致力于各种无血清无蛋白培养基开发和生产，加大力度进行工程细胞株的代谢工程改造以早日拥有真正属于中国的CHO工程细胞，也需加强对细胞培养过程的理解和优化，提高抗体表达速率，开发高产量、高质量的细胞培养工艺。在生物反应器放大和强化技术方面，应致力于突破千升级、万升级动物细胞生物反应器的设计、制造和操作，重视培养过程计算机实时监测和控制技术，更好地理解生物反应器中的代谢规律，满足高密度培养过程的需要。” 　　北京天广实生物技术有限公司副总经理叶培在报告中也提到，在动物细胞大规模培养工艺开发过程中，需要从生产过程工艺、培养条件参数设置和罐体控制三个方面进行优化，包括设备的配置、搅拌桨设计、sparger选择和流加条件、溶解氧、气体流量、代谢产物等方面，是一个涉及到生物、化工、机械等的综合学科知识。 　　抗体下游纯化成本已占45%到70%高质量纯化工艺研究刻不容缓 　　随着越来越多的生物药物得到批准和投入生产，临床使用量达到数十到数百毫克，对生产制造纯化工艺的效能和成本要求也越来越高。生物技术药物产业的发展对生产制造规模和产品纯度的要求也越来越严格。 　　据统计，抗体药物开发的60%资金投入都在下游纯化工艺的建立，药物制造成本可达到售价的20-25%。上海交通大学生物制造实验室主任李荣秀教授指出：“细胞培养产率从0.1g/L提高到1g/L，可以引起下游纯化成本比例从45%到70%，这是所有生物制药企业不可忽视的一个环节。生产中可以减少纯化步骤，缩短生产周期，降低生产成本，提高生产效率，将在生物技术药物制造纯化方面发挥重要作用。” 　　嘉和生物药业有限公司产品及工艺研发部总监李晓辉认为：“抗体药物下游纯化工艺的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑纯度、收率、成本、时间等因素。” 　　抗体药物质量分析：QbD(质量源于设计)理念重要性凸显 　　抗体药物质量检测标准的建立和验证是药物最终获得批准进入生产流通的核心环节，目前我国还没有完全形成标准，需要学术界和产业界积极配合共同制定符合标准的抗体药物质量标准。 　　上海药明康德新药开发有限公司蛋白质分析及生物分析服务执行主任王少雄博士在报告中提到：“根据目前美国FDA通用的QbD理念，质量分析检测需要贯穿整个过程，对最终产品有着至关重要的影响。在抗体药物研发过程中，从细胞株构建、细胞工艺开发、纯化和制剂等环节都需要进行严格的检测，包括蛋白A高效液相法色谱滴度分析，糖基化分析，聚体分析、肽图、结合力分析、效价分析、宿主细胞DNA、残留细胞DNA、残留蛋白A等的检测。” 　　QbD(质量源于设计)理念在制药领域中愈受重视 　　在制药技术发展及“十二五”医药生物产业相关规划的推动下，我国抗体产业发展迅速，"2012生物制药工程论坛"演讲嘉宾们也纷纷看好抗体药物发展前景，上海药明康德新药开发有限公司副总裁陈智胜更直言：“中国生物药平台已非常成熟，在接下来的两到三年里，中国会出现世界上最新的一个单克隆抗体产品。”

使用“nSMOL Antibody BA Kit”实现对血液中治疗药物的监测预处理试剂盒“nSMOLTM Antibody BA Kit”岛津制作所和京都大学的研究小组领先全球开发出自身免疫性疾病１）治疗用抗体药物的同步定量分析技术。检测环节使用了岛津制作所的超快速液相质谱联用仪“LCMS-8050/8060”和预处理试剂盒“nSMOLTM Antibody BA Kit”２)。6月12日，联合研究成果发表在免疫学领域学术刊物《Journal of Immunological Methods》的网络版上。３)该研究从2017年4月开始历时2年，开发了从人血清中同步定量分析多种治疗用抗体的技术。具体来说，是指在相同分析条件下，对治疗自身免疫性疾病所用的7种抗体药物品（英夫利昔单抗、阿达木单抗、尤特克单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、依那西普、阿巴西普）进行同时测定的技术。定量分析技术的有效性依据美国食品药品监督管理局（FDA）的指导标准４)进行了验证。从2017年12月开始的大约1年内，使用京都大学医学部附属医院收集的备检样品，对备检样品中所含的多种抗体药物的浓度进行检测，确认了同步定量分析值与过去取得的定量分析值之间仅有5%误差，属于高度一致的结果。本研究是在取得京都大学大学院医学研究科?医学部及医学部附属医院 医学伦理委员会的批准后实施的（批准编号：R0357、R0012、R1632）。在自身免疫性疾病的治疗中，关键是抗体药物的正确使用，为此，须使“血药浓度监测”（Therapeutic Drug Monitoring，以下简称“TDM”）生效。近年来，有报告表明部分疾病所使用的药物的血药浓度与药效具有相关性。例如，在关节风湿病方面，美国风湿病学会（ACR)和欧洲风湿病学会(EULAR)致力于通过血药浓度监测制定药效标准值。由于自身免疫性疾病伴有多种病情，因而会在多个诊疗科使用分别针对各种病情的抗体药物。针对各种药物单独进行TDM，存在着成本高、患者负担重等课题。本研究成果通过实现了自身免疫性疾病的抗体药物同步TDM，解决了上述课题，并开创了对多种疾病进行一元化且交叉式检查、制定相应治疗方针的可能性。此外，在医药品开发一线，本研究成果还可应用于生物仿制药的治疗效果验证等。岛津制作所通过正确使用医药品，减轻患者及医疗工作者的负担，并为控制医疗费增加而做出贡献。免疫细胞对自身的正常细胞及组织也反应过度并对细胞发起攻击而导致的疾病。关节风湿病等结缔组织病等为典型代表。超快速液相质谱分析系统用预处理试剂盒。与“LCMS-8050/8060”配合使用，可简便、迅速、高精度且低成本地实现抗体药物的药物动态分析。nSMOL法对抗体分子的N末端Fab领域进行选择性地解离和回收，通过质谱分析对单克隆抗体药物进行定量分析的本公司独有技术（nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis）Multiplexed monitoring of therapeutic antibodies for inflammatory diseases using Fab-selective proteolysis nSMOL coupled with LC-MS. Iwamoto N, Takanashi M, Yokoyama K, Yonezawa A, Denda M, Hashimoto M, Tanaka M, Ito H, Matsuura M, Yamamoto S, Honzawa Y, Matsubara K, and Shimada T*. J Immunol Methods. 2019. pii: S0022-1759(19)30141-3. doi: 10.1016/j.jim.2019.06.014.https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf“nSMOL Antibody BA Kit”未进行基于医药品医疗器械法的医疗器械审批/认证等。不可用于治疗诊断目的及其相关手续。图片：超快速液相质谱联用仪“LCMS-8050”