非变性状态下蛋白质

蛋白质是生命的物质基础，通过与不同生物分子间的相互作用在生物体内执行着各项重要工作，其功能与结构直接相关。因此，解析蛋白质及其复合物高阶结构对于深入理解蛋白质功能、生理现象及药物研发具有重要意义。过去的60余年，随着X-射线晶体衍射(X-ray)、核磁共振(NMR)以及冷冻电镜(cryoEM)等技术的出现和不断发展，蛋白质结构解析取得了长足发展。然而，如何在分析蛋白质时使其保持近似自然生理环境的非变性状态，对其动态、异质性、相互作用等属性的研究是结构生物学领域的热点和难点。　　质谱技术的不断发展使其在蛋白质结构表征领域发挥了越来越重要的作用。非变性质谱(native MS)兴起于20世纪90年代，是一种可以分析蛋白高阶结构的生物质谱方法。与传统的破坏蛋白质立体结构和弱相互作用力的方法不同，非变性质谱采用质谱兼容的近生理pH值的溶液体系(主要为醋酸铵)和更温和的电离方式，使生物大分子在气相中能够最大程度地保持自然折叠状态、非共价相互作用和相关的生物学功能。因此，非变性质谱可以提供分子质量、寡聚态、构象(折叠vs 去折叠)、异质性、配体结合、靶蛋白-小分子亲和力以及复合物中蛋白亚基的相互作用网络关系等更具生物学意义的重要信息，为蛋白质“序列-结构-功能”关系提供分子基础，已成为结构生物学不可或缺的互补工具,在生物制药、蛋白一配体、蛋白一蛋白复合物结构分析等诸多领域具有广泛应用。　　近年来,蛋白质结构研究领域经历着剧烈的技术迭代。2021年人工智能(AI) AlphaFol2横空出世,将蛋白质3D结构预测的精度从60%提升到90%以上,在给传统结构解析技术带来冲击的同时,也为结构质谱的发展提供了契机。　　未来,非变性质谱技术的发展需要简化样品处理,提升仪器的灵敏度、分析通量和鲁棒性,实现内源性蛋白复合物样本的直接或原位分析,推动其在生物医药表征、蛋白多聚态等领域的更广泛应用。非变性质谱技术与离子消度(MS)、自上而下串联解离(top-down)、电荷检测质谱(CDMsS)等创新联用技术和方法的不断开发及完善,将极大地提升结构信息的广度、丰富度及精确度,补充生物物理学方法缺失的结构信息。同时,非变性质谱与cryoEM1、氢完交换质谱(HDX-MS)、交联质谱等技术联用将更加常态化,这些实验数据与AI结构预测算法的进一步整合将有效解决蛋白及蛋白复合物结构预测存在的精度问题,推动结构生物学发展,助力新药研发。　　此外,非变性质谱技术的应用发展将更加关注:1)蛋白复合物结构一功能关系的研究,通过与计算机模拟(MD)、HDX-Ms、cryoEM等技术联用,揭示标志物蛋白在人类疾病发展过程中的作用,推动靶向药物设计和精淮医疗 2)通过研究小分子与靶蛋白的相互作用获取二者结合的亲和力信息,加速靶向药物筛选 3)翻译后修饰(PTMS)、突变等因素导致的蛋白高度异质性及其对蛋白或亚基折叠动力学、构象及构象变化、结合计量比等造成的结构和功能影响 4)蛋白与其他生物分子(配体、DNAA/RNA、金属离子等)之间的相互作用。　　李惠琳，中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物大分子质谱新技术的开发及应用，其研究主要侧重于1)开发整合结构质谱技术，并对蛋白质机器结构、功能和动态变化及靶向药物作用分子机制进行深入研究2)开发middle-down/top-down蛋白质组学技术，探索蛋白翻译后修饰在生命过程中的调控机制。承担国家自然科学基金项目3项，荣获美国质谱学会颁发的Postdoctoral Career Development Award (2014) ，入选珠江人才计划(青年拔尖人才，2019)，其研究成果发表在Nature Chemistry, Analytical Chemistry, J. Am.Soc.Mass Spectrom.等杂志。　　"非变性质谱技术研究与应用"专栏共收录7篇论文,既介绍了非变性质谱技术的样品制备、离子源、质量分析器、联用技术等基础内容,也涵括了样品提取、样品引入、离子化及电荷操控等方式,以及在蛋白结构及构象解析、蛋白・蛋白相互作用等领域的应用,代表了国内非变性质谱技术的发展现状。希望本专栏能成为《质谱学报》广大读者颇有价值的科技文献,同时也希望更多的学者加入到非变性质谱研究领域,推动我国结构质谱技术的创新发展。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA,Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的Letter，Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics [1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授和Kyle A. Brown博士。非离子表面活性剂是从细胞中溶解和纯化蛋白质的通用工具，是结构生物学中使用的关键试剂。N-dodecyl-β-D-maltoside(DDM)是最受欢迎的非离子表面活性剂之一，用于从非变性环境中提取蛋白质进行下游生物学实验。然而，表面活性剂的存在，即使是像DDM这样温和的表面活性剂，依然会对自上而下蛋白质组学分析产生不利影响。与表面活性剂相关的信号抑制一般是由低分子量物质较高的电离效率和信噪比引起的。此外，表面活性剂的存在会对常见的前端蛋白质分离技术产生负面影响，例如对于反相液相色谱(RPLC)而言，可能会导致再现性和稳健性方面的潜在问题。克服表面活性剂在下游蛋白质组学分析中的不兼容性问题的一种方法是插入一个可裂解键(例如酸或光不稳定键)，能够在质谱分析之前降解为无害的副产物。然而通常用于蛋白质组学的可裂解表面活性剂含有变性阴离子基团，如硫酸盐，不能用于需要非变性条件的应用。因此，急需开发一种可以在非变性条件下辅助传统的蛋白质制备方法的可裂解表面活性剂，并能适用于下游蛋白质组学分析。本文中，作者首次使用了一种非离子型可裂解的表面活性剂N-decyl-disulfide-β-D-maltoside(DSSM)，用于自上而下的蛋白质组学。(图1)　　图1. DSSM在蛋白质组学中的应用　　首先，作者在变性条件下，用碳酸酐酶(29.1 kDa)评价了DSSM与ESI-MS分析的相容性。表面活性剂通过TCEP在4℃条件下降解2 h，在DSSM降解和离心后，没有观察到不溶性降解产物。　　　　图2. DSSM与完整蛋白ESI-MS分析的相容性。　　作者进一步评估了DSSM与RPLC-MS的兼容性，以研究膜蛋白。膜蛋白是一类重要的药物靶点，由于其固有的低溶解性和低丰度，通常难以使用自上而下蛋白质组学进行研究。作者对一种模型离子通道蛋白KcsA进行了DSSM辅助膜蛋白组学分析。使用氯仿:甲醇:水沉淀法去除不相容的缓冲组分(盐、洗涤剂等)后，在DSSM (2× CMC)中溶解KcsA。表面活性剂用TCEP(在水中或50%异丙醇中)降解，用CID进行RPLC-MS/MS破碎。结果显示，作者成功地表征了防止通道失活的突变(E71A)。(图3)　　　　图3.DSSM溶解膜蛋白的自上而下蛋白质组学　　最后，作者利用DSSM提取哺乳动物细胞内源性蛋白，表面活性剂降解后直接用RPLC MS/MS进行分析。在采用TopPIC对数据进行分析之后，作者通过四次LC-MS/MS实验从206个蛋白质组中鉴定出276种proteoform。作者证明了DSSM是一种有价值的用于细胞裂解的表面活性剂，并可以用于RPLC-MS/MS分析进行proteoform鉴定。　　图4. 使用DSSM从细胞裂解液中提取的内源性蛋白质的自上而下蛋白质组学总的来说，作者证明DSSM可以促进膜蛋白的自上而下蛋白质组学表征，以确定序列变异和翻译后修饰(PTMs)。未来在蛋白质组学实验和结构生物学研究中，DSSM可以作为DDM的一般替代品。　　撰稿：张颖编辑：李惠琳文章引用：Brown KA, Gugger MK, Yu Z, Moreno D, Jin S, Ge Y. Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics. Anal Chem. 2023 Jan 6.　　李惠琳课题组网址 www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Brown KA, Gugger MK, Yu Z, Moreno D, Jin S, Ge Y. Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics. Anal Chem. 2023 Jan 6.

【科技日报】探秘蛋白质的&ldquo 前世今生&rdquo &mdash &mdash 国家蛋白质科学中心· 上海(筹)印象 图为蛋白质科学研究(上海)设施核磁共振分析系统。 　　生活中的乌云总是不期而至。一位正值花季的美国女孩，突然被告知患上了一种非常难治的癌症。基因检测结果显示，她所患癌症的亚型发生率极低。 　　在患同一大类癌症的人群中，只有2%的人所患亚型和她一样。幸运的是，针对这一亚型恰好有一种特效药。经过不到3个月的治疗，她痊愈了。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)主任雷鸣用这个真实的案例，向科技日报记者生动阐释了精准医疗的未来图景。但并非所有的癌症患者都和那位女孩一样幸运。在人类通往精准医疗的道路上，蛋白质科学研究将扮演什么角色?身为国家大科学工程之一的蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称&ldquo 上海设施&rdquo )对推进蛋白质科学研究将起到怎样的作用? 　　为回答这些问题，科技日报记者近日走进国家蛋白质科学中心· 上海(筹)一探究竟。 　　不容小觑的&ldquo 仪器集群&rdquo 　　和以往走进的国家大科学工程相比，上海设施没能在视觉上给人造成强大冲击。 　　&ldquo 我们这里主要是一些体量相对较小的生命科学研究的仪器集群，以至于在立项之初，是否将上海设施列入大科学工程都存在争议。&rdquo 雷鸣说道。 　　可别小瞧这里的&ldquo 仪器集群&rdquo 。上海设施自2014年5月试运行以来，前来参观的10多位诺贝尔奖得主和其他国际知名专家对设备的先进性纷纷&ldquo 点赞&rdquo 。 　　雷鸣回忆道，十多年前，我国在蛋白质科学研究领域虽然已取得一批达到国际一流水平的研究成果，但整体上仍落后于国际先进水平。科研基础设施建设滞后，是制约蛋白质科学发展的关键因素。 　　在科学家们的不懈努力下，蛋白质科学研究设施国家重大科技基础设施项目于2008年被批准立项，成为我国生命科学领域第一个大科学工程项目。蛋白质科学研究设施分为上海和北京两部分，上海设施以建设蛋白质结构解析能力为主。 　　围绕从生物体的空间尺度和生命过程的时间尺度来研究蛋白质，上海设施构建了由规模化蛋白质制备系统、蛋白质晶体结构分析系统、核磁分析系统、集成化电镜分析系统、蛋白质动态分析系统、质谱分析系统、复合激光显微成像系统、分子影像系统和数据库与计算分析系统组成的9大技术系统，具备规模化蛋白质制备、多尺度结构分析、多层次动态研究、修饰与相互作用分析以及数据库与计算分析5大能力。 　　史蒂夫· 哈里森是雷鸣在哈佛大学读博士时的导师。参观上海设施后，史蒂夫感觉非常震撼，对雷鸣很年轻就有机会参与如此重大的项目表示赞赏和羡慕。收获羡慕之余，雷鸣多次被问道：&ldquo 在如此先进的科研平台上，你们能做出哪些世界一流的工作来?&rdquo 　　独一无二的蛋白质&ldquo 智能工厂&rdquo 　　每一个蛋白质就像一个人一样，有自己的脾气秉性。要把它研究透彻，需要时间。 　　上世纪六七十年代有句话叫&ldquo one protein，one career&rdquo ，意为一个教授一辈子只能研究透一个蛋白质。&ldquo 我主要研究端粒，从评上教授到现在，也只解析了数十个蛋白质的结构。&rdquo 雷鸣说道。 　　要摸清蛋白质的&ldquo 脾气&rdquo ，首先是要获取高纯度的蛋白质样品。想见到蛋白质的&ldquo 真身&rdquo ，就必须打破细胞。而细胞一旦被打破，里面90%的蛋白质就同时被破坏掉了，踪迹难觅。 　　找到目标蛋白质后，保存也是个难题。相对于&ldquo 皮实&rdquo 的基因，蛋白质要&ldquo 娇气&rdquo 得多。记载遗传信息的基因就像是张可以随意摆放的卡片，没有变性的担忧。蛋白质则不同，一旦温度、湿度、光线等环境因素发生变化，就会有变质的风险。 　　在传统的生物学实验室里，穿着白大褂的科研人员手持移液枪，往装有不同液体的瓶瓶罐罐里添加试剂是常见的场景。在上海设施的规模化蛋白质制备系统里，这一幕正在被自动化的机器操作所取代。 　　高通量克隆构建实验室的中心区域是一个用玻璃超净间封闭起来的自动化机械操作平台。操作台外有一台集成软件的计算机负责&ldquo 发号施令&rdquo 。科研人员启动预设程序后，白色的机械臂在平台的各个自动化仪器间来回挪动，轻巧地把一个个96孔板放置到指定的板位上。各个自动化仪器的板位分别可执行加液、振荡、离心、清洗等生物实验操作。 　　传统手工操作，一个人每天最多克隆十几个基因。眼前的这套自动化系统，一天可以克隆960个基因，生产效率相当于一个数百人规模的基因克隆企业。&ldquo 我们希望把自动化概念引入科研中，重复劳动让机器来做，科研人员可以有更多的时间去探索和思考真正的科学问题。&rdquo 规模化蛋白质制备系统主管邓玮告诉记者。 　　上海设施自主设计和研发应用流程的这套系统，如同&ldquo 智能工厂&rdquo 一般，能独立完成一整套从分子生物学到细胞生物学的全部实验操作。 　　&ldquo 集成化程度越高的自动化设备，出错的几率就越高。针对完全陌生的样品，我们这套系统的可靠性能达到70%，这已经是一个非常不错的结果了。&rdquo 雷鸣表示。 　　五线六站 透视蛋白质内部结构 　　蛋白质并不是由松散的氨基酸随机排列组合而成，每一种天然蛋白质都有自己特定的空间结构。结构决定着蛋白质的功能。 　　肌红蛋白是哺乳动物心肌和骨骼肌中贮存和分配氧的胞内蛋白质。1960年，英国科学家肯德鲁(John Kendrew)首次用X射线衍射法测定了来自抹香鲸的肌红蛋白的三级结构。这一发现，使他成为1962年诺贝尔化学奖的获得者之一。 　　大多数人都有医院照X光的体验，X射线衍射法相当于是给结晶后的蛋白质拍X光，拍出的是一幅蛋白质晶体原子尺度的三维结构图。 　　在建筑外观呈鹦鹉螺形状的上海光源里，有5条光束线和6个专用实验站(五线六站)用于蛋白质科学研究。五线六站包括4个X射线实验站和两个红外光谱实验站，它们构成了上海设施的蛋白质晶体结构分析系统和动态分析系统。 　　记者来到五线六站时，上海光源处在停光检修期，复合物晶体线站负责人秦文明正在进行设备调试，为第二天的复工做好准备。排成一长溜的设备间和操作间由厚重的屏蔽门把守，机器的轰鸣声给人置身工厂车间的感觉。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)副主任张荣光，是五线六站的负责人。2009年回国之前，他在美国阿贡国家实验室工作近20年。阿贡的APS(先进光子源)是世界上最先进的同步辐射中心之一，采用X射线衍射法在半小时内测定蛋白质晶体结构曾是阿贡的骄傲。在五线六站，这一时间被缩短为几分钟。 　　&ldquo 我们安装了先进的衍射仪和探测器，收集全套数据最快只需36秒，接着使用自建的软件系统，不到5分钟就能完成对数据的处理和分析，给出蛋白质的三维结构。&rdquo 张荣光表示，五线六站不仅配备了世界一流的硬件设施，在实验方法和自动化上也有了很大程度的改进和提升。 　　过去，科研人员带着蛋白质晶体样品来到线站做实验非常忙碌。因为不能确定收到的数据是否有用，针对同一个晶体样品，要反复不停收集多套数据，带回去做进一步分析。 　　&ldquo 现在很快就能看到结果，一次可以带上一批样品来线站做实验，节省了大量的时间和人力。我们的目标是，用户带到线站上来的是晶体，带回去的是蛋白质的结构。&rdquo 张荣光说道。 　　核磁共振拼搭蛋白质结构&ldquo 积木&rdquo 　　不是所有的蛋白质在纯化后都能顺利结晶。结晶了的蛋白质也可能由于晶体质量等原因，难以被X射线&ldquo 看清&rdquo 。此外，同步辐射产生的X射线能量很高，小一点的晶体在被它探测时有&ldquo 粉身碎骨&rdquo 的风险。 　　在晶体学力所不及的领域，同样借助X射线设立的生物小角线站能弥补一二。事实上，溶液状态下的蛋白质表现得更为&ldquo 动态&rdquo 和&ldquo 真实&rdquo 。小角线站负责人李娜介绍，小角散射技术能快速捕捉到溶液状态下蛋白质的瞬时结构。只需要秒量级，甚至毫秒量级的时间，就能看见两个分子是否形成复合物。 　　分辨率不高是小角散射的不足之处。张荣光进一步解释说，就像从远处看两个人的位置关系一样，能看清他们是靠在一起，但具体是手牵手，还是脚靠脚，就不得而知了。要在溶液状态下看清原子尺度的细节和运动，就要靠核磁系统了。 　　离开五线六站，记者来到了上海设施的核磁共振实验室。蓝色塑胶地板上，分布着5台白色圆柱状的&ldquo 大家伙&rdquo 。其中，体型最大的900兆核磁共振谱仪是目前国内在使用的最高场强的超导磁体设备之一。为了方便把样品放入仪器顶部，还专门搭建了高约四五米的扶梯。 　　和光束线站、电镜等设施的直接成像相比，核磁共振扫描得到的是&ldquo 间接&rdquo 信息&mdash &mdash 蛋白质分子里每2个氢原子之间的相对距离，据此勾勒出蛋白质的三维结构。对此，核磁系统技术主管刘志军打了个形象的比方：一个坐着的人，如果能测算出他的头、手、脚等部位两端的距离，就能画出他的大致轮廓。 　　&ldquo 也可以理解为，核磁共振扫描得到的是一盒子拼插积木，接下来的事情就是把积木一块块地搭建起来，难点就在于不知道这些积木分属于哪个部位，是头还是脚，需要先指认，再通过计算来还原成三维结构。&rdquo 刘志军说。 　　为了&ldquo 指认&rdquo 方便，刘志军和他的同事们正在构建一个大的数据库。理想状态是，核磁共振扫描溶液状态下的蛋白质后得到的实验信息，可以去数据库中进行对比，如果有类似的&ldquo 片段&rdquo ，就可判断出这块&ldquo 积木&rdquo 属于哪个部位，再进一步去还原。&ldquo 搭积木的效率高低，取决于已知信息的多少，还原蛋白质三维结构也是如此&rdquo 。 　　蛋白质研究为药物研发铺路 　　蛋白质(protein)的概念最早由瑞典化学家永斯· 雅各布· 贝采利乌斯在1838年提出。&ldquo protein&rdquo 源自希腊文&ldquo protos&rdquo ，意为&ldquo 第一的，首要的&rdquo 。其时，人们对于蛋白质在机体中的核心作用并不了解。 　　一直到上个世纪40年代，在美国的教科书里，蛋白质被认为都长着一副橄榄球的模样，为细胞提供黏稠度是它主要甚至唯一的功能。随着DNA(脱氧核糖核酸)双螺旋结构的提出和首个原子尺度的蛋白分子三维结构图的精准呈现，分子生物学时代的大幕开启，人们开始逐渐摸清蛋白质的&ldquo 长相&rdquo 和&ldquo 秉性&rdquo 。 　　细胞是生命体的基本单位。在构建细胞结构、生物催化、物质传输等方面，蛋白质发挥着重要的作用。生物体新陈代谢几乎离不开的催化剂&mdash &mdash 酶，绝大多数都是蛋白质。 　　然而，和DNA测序、基因组研究的耳熟能详相比，蛋白质研究似乎略显低调。事实上，蛋白质研究可视作基因研究的姊妹篇。雷鸣以肺癌为例说道，过去肺癌病人都用一种药物治疗，现在看来并不科学。尽管结果都表现为肺癌，但从分子尺度分析，发病机理千差万别。 　　上游致病的基因多种多样，不同基因组会产生数百种或数千种蛋白质组合，形成不同特质的癌细胞。每一种组合背后的原因也不尽相同，因为基因的表达方式错综复杂，同一个基因在不同条件、时期可能会起到完全不同的作用。如何找到精准的治疗靶点成为棘手的难题。 　　&ldquo 通过测序能知道多少种基因有病变，分析出主要矛盾是哪个，但基因检测只能用于诊断，给不了治疗的药物，下一步需要借助于蛋白质科学研究，为生物制药提供对症的&lsquo 靶点&rsquo 。在未来，精准医疗有望给每一种不同亚型的癌症患者提供有针对性的药物。&rdquo 雷鸣表示。

图为蛋白质科学研究(上海)设施核磁共振分析系统。 　　走近中国大科学工程 　　生活中的乌云总是不期而至。一位正值花季的美国女孩，突然被告知患上了一种非常难治的癌症。基因检测结果显示，她所患癌症的亚型发生率极低。 　　在患同一大类癌症的人群中，只有2%的人所患亚型和她一样。幸运的是，针对这一亚型恰好有一种特效药。经过不到3个月的治疗，她痊愈了。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)主任雷鸣用这个真实的案例，向科技日报记者生动阐释了精准医疗的未来图景。但并非所有的癌症患者都和那位女孩一样幸运。在人类通往精准医疗的道路上，蛋白质科学研究将扮演什么角色?身为国家大科学工程之一的蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称&ldquo 上海设施&rdquo )对推进蛋白质科学研究将起到怎样的作用? 　　为回答这些问题，科技日报记者近日走进国家蛋白质科学中心· 上海(筹)一探究竟。 　　不容小觑的&ldquo 仪器集群&rdquo 　　和以往走进的国家大科学工程相比，上海设施没能在视觉上给人造成强大冲击。 　　&ldquo 我们这里主要是一些体量相对较小的生命科学研究的仪器集群，以至于在立项之初，是否将上海设施列入大科学工程都存在争议。&rdquo 雷鸣说道。 　　可别小瞧这里的&ldquo 仪器集群&rdquo 。上海设施自2014年5月试运行以来，前来参观的10多位诺贝尔奖得主和其他国际知名专家对设备的先进性纷纷&ldquo 点赞&rdquo 。 　　雷鸣回忆道，十多年前，我国在蛋白质科学研究领域虽然已取得一批达到国际一流水平的研究成果，但整体上仍落后于国际先进水平。科研基础设施建设滞后，是制约蛋白质科学发展的关键因素。 　　在科学家们的不懈努力下，蛋白质科学研究设施国家重大科技基础设施项目于2008年被批准立项，成为我国生命科学领域第一个大科学工程项目。蛋白质科学研究设施分为上海和北京两部分，上海设施以建设蛋白质结构解析能力为主。 　　围绕从生物体的空间尺度和生命过程的时间尺度来研究蛋白质，上海设施构建了由规模化蛋白质制备系统、蛋白质晶体结构分析系统、核磁分析系统、集成化电镜分析系统、蛋白质动态分析系统、质谱分析系统、复合激光显微成像系统、分子影像系统和数据库与计算分析系统组成的9大技术系统，具备规模化蛋白质制备、多尺度结构分析、多层次动态研究、修饰与相互作用分析以及数据库与计算分析5大能力。 　　史蒂夫· 哈里森是雷鸣在哈佛大学读博士时的导师。参观上海设施后，史蒂夫感觉非常震撼，对雷鸣很年轻就有机会参与如此重大的项目表示赞赏和羡慕。收获羡慕之余，雷鸣多次被问道：&ldquo 在如此先进的科研平台上，你们能做出哪些世界一流的工作来?&rdquo 　　独一无二的蛋白质&ldquo 智能工厂&rdquo 　　每一个蛋白质就像一个人一样，有自己的脾气秉性。要把它研究透彻，需要时间。 　　上世纪六七十年代有句话叫&ldquo one protein，one career&rdquo ，意为一个教授一辈子只能研究透一个蛋白质。&ldquo 我主要研究端粒，从评上教授到现在，也只解析了数十个蛋白质的结构。&rdquo 雷鸣说道。 　　要摸清蛋白质的&ldquo 脾气&rdquo ，首先是要获取高纯度的蛋白质样品。想见到蛋白质的&ldquo 真身&rdquo ，就必须打破细胞。而细胞一旦被打破，里面90%的蛋白质就同时被破坏掉了，踪迹难觅。 　　找到目标蛋白质后，保存也是个难题。相对于&ldquo 皮实&rdquo 的基因，蛋白质要&ldquo 娇气&rdquo 得多。记载遗传信息的基因就像是张可以随意摆放的卡片，没有变性的担忧。蛋白质则不同，一旦温度、湿度、光线等环境因素发生变化，就会有变质的风险。 　　在传统的生物学实验室里，穿着白大褂的科研人员手持移液枪，往装有不同液体的瓶瓶罐罐里添加试剂是常见的场景。在上海设施的规模化蛋白质制备系统里，这一幕正在被自动化的机器操作所取代。 　　高通量克隆构建实验室的中心区域是一个用玻璃超净间封闭起来的自动化机械操作平台。操作台外有一台集成软件的计算机负责&ldquo 发号施令&rdquo 。科研人员启动预设程序后，白色的机械臂在平台的各个自动化仪器间来回挪动，轻巧地把一个个96孔板放置到指定的板位上。各个自动化仪器的板位分别可执行加液、振荡、离心、清洗等生物实验操作。 　　传统手工操作，一个人每天最多克隆十几个基因。眼前的这套自动化系统，一天可以克隆960个基因，生产效率相当于一个数百人规模的基因克隆企业。&ldquo 我们希望把自动化概念引入科研中，重复劳动让机器来做，科研人员可以有更多的时间去探索和思考真正的科学问题。&rdquo 规模化蛋白质制备系统主管邓玮告诉记者。 　　上海设施自主设计和研发应用流程的这套系统，如同&ldquo 智能工厂&rdquo 一般，能独立完成一整套从分子生物学到细胞生物学的全部实验操作。 　　&ldquo 集成化程度越高的自动化设备，出错的几率就越高。针对完全陌生的样品，我们这套系统的可靠性能达到70%，这已经是一个非常不错的结果了。&rdquo 雷鸣表示。 　　五线六站 透视蛋白质内部结构 　　蛋白质并不是由松散的氨基酸随机排列组合而成，每一种天然蛋白质都有自己特定的空间结构。结构决定着蛋白质的功能。 　　肌红蛋白是哺乳动物心肌和骨骼肌中贮存和分配氧的胞内蛋白质。1960年，英国科学家肯德鲁(John Kendrew)首次用X射线衍射法测定了来自抹香鲸的肌红蛋白的三级结构。这一发现，使他成为1962年诺贝尔化学奖的获得者之一。 　　大多数人都有医院照X光的体验，X射线衍射法相当于是给结晶后的蛋白质拍X光，拍出的是一幅蛋白质晶体原子尺度的三维结构图。 　　在建筑外观呈鹦鹉螺形状的上海光源里，有5条光束线和6个专用实验站(五线六站)用于蛋白质科学研究。五线六站包括4个X射线实验站和两个红外光谱实验站，它们构成了上海设施的蛋白质晶体结构分析系统和动态分析系统。 　　记者来到五线六站时，上海光源处在停光检修期，复合物晶体线站负责人秦文明正在进行设备调试，为第二天的复工做好准备。排成一长溜的设备间和操作间由厚重的屏蔽门把守，机器的轰鸣声给人置身工厂车间的感觉。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)副主任张荣光，是五线六站的负责人。2009年回国之前，他在美国阿贡国家实验室工作近20年。阿贡的APS(先进光子源)是世界上最先进的同步辐射中心之一，采用X射线衍射法在半小时内测定蛋白质晶体结构曾是阿贡的骄傲。在五线六站，这一时间被缩短为几分钟。 　　&ldquo 我们安装了先进的衍射仪和探测器，收集全套数据最快只需36秒，接着使用自建的软件系统，不到5分钟就能完成对数据的处理和分析，给出蛋白质的三维结构。&rdquo 张荣光表示，五线六站不仅配备了世界一流的硬件设施，在实验方法和自动化上也有了很大程度的改进和提升。 　　过去，科研人员带着蛋白质晶体样品来到线站做实验非常忙碌。因为不能确定收到的数据是否有用，针对同一个晶体样品，要反复不停收集多套数据，带回去做进一步分析。 　　&ldquo 现在很快就能看到结果，一次可以带上一批样品来线站做实验，节省了大量的时间和人力。我们的目标是，用户带到线站上来的是晶体，带回去的是蛋白质的结构。&rdquo 张荣光说道。 　　核磁共振拼搭蛋白质结构&ldquo 积木&rdquo 　　不是所有的蛋白质在纯化后都能顺利结晶。结晶了的蛋白质也可能由于晶体质量等原因，难以被X射线&ldquo 看清&rdquo 。此外，同步辐射产生的X射线能量很高，小一点的晶体在被它探测时有&ldquo 粉身碎骨&rdquo 的风险。 　　在晶体学力所不及的领域，同样借助X射线设立的生物小角线站能弥补一二。事实上，溶液状态下的蛋白质表现得更为&ldquo 动态&rdquo 和&ldquo 真实&rdquo 。小角线站负责人李娜介绍，小角散射技术能快速捕捉到溶液状态下蛋白质的瞬时结构。只需要秒量级，甚至毫秒量级的时间，就能看见两个分子是否形成复合物。 　　分辨率不高是小角散射的不足之处。张荣光进一步解释说，就像从远处看两个人的位置关系一样，能看清他们是靠在一起，但具体是手牵手，还是脚靠脚，就不得而知了。要在溶液状态下看清原子尺度的细节和运动，就要靠核磁系统了。 　　离开五线六站，记者来到了上海设施的核磁共振实验室。蓝色塑胶地板上，分布着5台白色圆柱状的&ldquo 大家伙&rdquo 。其中，体型最大的900兆核磁共振谱仪是目前国内在使用的最高场强的超导磁体设备之一。为了方便把样品放入仪器顶部，还专门搭建了高约四五米的扶梯。 　　和光束线站、电镜等设施的直接成像相比，核磁共振扫描得到的是&ldquo 间接&rdquo 信息&mdash &mdash 蛋白质分子里每2个氢原子之间的相对距离，据此勾勒出蛋白质的三维结构。对此，核磁系统技术主管刘志军打了个形象的比方：一个坐着的人，如果能测算出他的头、手、脚等部位两端的距离，就能画出他的大致轮廓。 　　&ldquo 也可以理解为，核磁共振扫描得到的是一盒子拼插积木，接下来的事情就是把积木一块块地搭建起来，难点就在于不知道这些积木分属于哪个部位，是头还是脚，需要先指认，再通过计算来还原成三维结构。&rdquo 刘志军说。 　　为了&ldquo 指认&rdquo 方便，刘志军和他的同事们正在构建一个大的数据库。理想状态是，核磁共振扫描溶液状态下的蛋白质后得到的实验信息，可以去数据库中进行对比，如果有类似的&ldquo 片段&rdquo ，就可判断出这块&ldquo 积木&rdquo 属于哪个部位，再进一步去还原。&ldquo 搭积木的效率高低，取决于已知信息的多少，还原蛋白质三维结构也是如此&rdquo 。 　　蛋白质研究为药物研发铺路 　　蛋白质(protein)的概念最早由瑞典化学家永斯· 雅各布· 贝采利乌斯在1838年提出。&ldquo protein&rdquo 源自希腊文&ldquo protos&rdquo ，意为&ldquo 第一的，首要的&rdquo 。其时，人们对于蛋白质在机体中的核心作用并不了解。 　　一直到上个世纪40年代，在美国的教科书里，蛋白质被认为都长着一副橄榄球的模样，为细胞提供黏稠度是它主要甚至唯一的功能。随着DNA(脱氧核糖核酸)双螺旋结构的提出和首个原子尺度的蛋白分子三维结构图的精准呈现，分子生物学时代的大幕开启，人们开始逐渐摸清蛋白质的&ldquo 长相&rdquo 和&ldquo 秉性&rdquo 。 　　细胞是生命体的基本单位。在构建细胞结构、生物催化、物质传输等方面，蛋白质发挥着重要的作用。生物体新陈代谢几乎离不开的催化剂&mdash &mdash 酶，绝大多数都是蛋白质。 　　然而，和DNA测序、基因组研究的耳熟能详相比，蛋白质研究似乎略显低调。事实上，蛋白质研究可视作基因研究的姊妹篇。雷鸣以肺癌为例说道，过去肺癌病人都用一种药物治疗，现在看来并不科学。尽管结果都表现为肺癌，但从分子尺度分析，发病机理千差万别。 　　上游致病的基因多种多样，不同基因组会产生数百种或数千种蛋白质组合，形成不同特质的癌细胞。每一种组合背后的原因也不尽相同，因为基因的表达方式错综复杂，同一个基因在不同条件、时期可能会起到完全不同的作用。如何找到精准的治疗靶点成为棘手的难题。 　　&ldquo 通过测序能知道多少种基因有病变，分析出主要矛盾是哪个，但基因检测只能用于诊断，给不了治疗的药物，下一步需要借助于蛋白质科学研究，为生物制药提供对症的&lsquo 靶点&rsquo 。在未来，精准医疗有望给每一种不同亚型的癌症患者提供有针对性的药物。&rdquo 雷鸣表示。(原标题：探秘蛋白质的&ldquo 前世今生&rdquo &mdash &mdash 国家蛋白质科学中心· 上海(筹)印象)

#本文由马尔文帕纳科医药业务发展经理 韩佩韦博士供稿# 蛋白质的热稳定性研究对于加深对蛋白质的结构和功能的了解有着非常重要的意义。差示扫描量热技术（DSC）是直接测量热转变过程焓变（ΔH）唯一的分析方法，例如蛋白质，核酸或其他生物多聚物的热变性过程，为表征蛋白质及其他生物分子的热稳定性建立“金标准”技术。 一、焓变对于蛋白质的稳定性意味着什么？ 1，什么是焓（hán）变（ΔH）？ ΔH（焓变）是在恒压状态下将系统升高至温度T过程中摄取的总能量。对于蛋白质而言，这意味着用于使蛋白质发生去折叠所花费的能量（热量），此过程中 ΔH 是为正值，代表这是一个吸热过程。这种能量与蛋白质中所有原子和分子运动相关，以及维系蛋白质保持折叠构象中的键能。 通过将吸热谱图下方的面积进行积分（见图 1）可以计算得到焓变（ΔH）。焓变用每摩尔蛋白质的吸收的卡路里（或焦耳）来表示。由于蛋白质在 DSC 实验中暴露于升高的温度，因此蛋白质开始发生热变性，并伴随着非共价键的断裂。焓变（ΔH）与维系蛋白质天然（折叠）构象中所需的价键数量有关。焓变（ΔH）也取决于我们测量总蛋白质浓度的准确程度。如果蛋白质浓度不是很准确, 则会影响到计算出的ΔH值。 2，焓变（ΔH）值可以在实践中告诉我们什么？ 当您比较不同蛋白质的DSC结果时，具有较大ΔH值的蛋白质不一定比具有较小ΔH的蛋白质更稳定。由于ΔH值会对蛋白质摩尔浓度归一化，因此该值通常与蛋白质的尺寸成比例。大多数蛋白质具有相同的键密度（单位体积内的价键数量），因此，期待具有较大分子量的蛋白质也具有较大的焓变（ΔH）值也是合理的。 3，焓变（ΔH）的决定因素是什么？ 焓变（ΔH）取决于溶液中天然蛋白质的百分比。 一个非常重要的考虑是DSC仅测量初始处于折叠（天然）构象中的蛋白质的ΔH值。ΔH值取决于具有折叠（活性）构象的浓度。如果初始折叠蛋白质组分小于总蛋白质浓度（即活性浓度小于100％），则计算出的ΔH值将相应地变小。 下图显示了在储存期间的不同时间测量的相同蛋白质的DSC图谱。蓝色曲线图谱表示新鲜制备的蛋白质，是100％天然（折叠）蛋白质。当蛋白质样品在储存期间发生部分变性时，溶液中的天然蛋白质的比例开始下降，导致DSC图谱的焓变降低。当我们拥有100％天然蛋白质的参考DSC图谱时，我们可以根据不同状态样品的相对ΔH值来估计每个样品中的折叠蛋白质比例。 4，如何判断蛋白质是否失活？ 到目前为止，我们已提及的焓变是指通过DSC仪器直接测量到的“热”焓，也就是热力学焓变，通常表示为ΔHcal，这是其他任何非量热技术，例如圆二色谱（CD），表面等离子共振（SPR）等技术不能获取的焓变量。 还有另一种其他技术可以获取的焓变类型，即范霍夫焓变 - ΔHVH，我们同样可以通过DSC数据计算得出。范霍夫焓变（ΔHVH）可从通过DSC非两状态模型（non-2-state model）拟合得到。 两种不同的焓变对蛋白质热稳定性的测定又有什么实际意义呢？ 在DSC技术中，ΔHcal仅由DSC热转变峰曲线积分的面积来确定，而ΔHVH仅通过热转变峰曲线的形状来确定。转变峰形越尖锐，ΔHVH越大，反之亦然。ΔHcal是具有浓度依赖性的，但ΔHVH不是。 若ΔHcal/ΔHVH比例为1，通常意味着所研究的热转变状态符合两状态去折叠（Two-state unfolding model）模型。如果ΔHcal/ΔHVH比例大于1，则意味着存在显著密集的中间体存在 而ΔHcal/ΔHVH比小于1，则意味着存在分子间相互作用。 使用ΔHcal/ΔHVH可以帮我们估测是否有很大部分蛋白质是失活的。如果我们有一个简单的单结构域蛋白质，并且假定没有中间体，则我们可以预测，其去折叠过程的ΔHcal/ΔHVH的比值不会远离1。因此，如果ΔHcal显著低于ΔHVH，可以表明很大部分蛋白质已经失活。 综上所述，对DSC中ΔH数据的分析可以让我们了解蛋白质的去折叠机制，以及多少蛋白质处于其活性的天然构象。 二、TM值如何与和蛋白质稳定性相关？ 中点转变温度TM我们可以从DSC数据中提取多个热力学参数，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓变），ΔCP和ΔG，但最广泛使用的参数是TM。顺便提一下，这也是最容易和最准确的值 - TM是最大峰值所对应的温度。 “蛋白质稳定性”有多种定义。最常见的是，对于工业上有重要意义的蛋白质，该术语是指在生理温度下的功能（或操作）稳定性 即，他们可以在37°C下发挥多长时间的生物功能？这可以通过需要花几天或数周时间的等温研究来评估，或者，如果使用差示扫描量热法（DSC），则可以在几分钟内变性蛋白质。 通过DSC获得的哪个热力学参数与功能稳定性相关度最佳？事实证明，是TM值。 热力学稳定性（ΔG）是功能稳定性的较差的预测因子 技术上，ΔG仅适用于可逆去折叠过程，此外，它由TM，ΔH和ΔCP计算得到，后者可能很难获取。 一个例子是TM和ΔG与人肉杆菌蛋白抗原血清型C的半数聚集时间(half time)（作为功能稳定性的量度）的相关性，用作模型蛋白。ΔG与T1 / 2 agg. 相关系数（R）仅为0.4，而TM 与 T1 / 2 agg.的相关系数是0.92。（来自J Pharm Sci的数据，2011 Mar 100（3）：836-48） 思考TM的一种方式： 如下图所示，假设我们用 DSC 扫描两种不同配方中的蛋白质或两种不同的蛋白质构建体，则 TM 值向低温方向 5℃ 的负偏移（稳定性下降）实际上反映了在 37℃ 条件下的 Fu （蛋白去折叠比例）由2％增加到 3％。温度 T 下的 Fu 蛋白可以通过图像化的方式估算，即温度 T 以下的曲线下阴影区域面积和整个曲线下方面积的百分比。 由于聚集体的生成可能是浓度依赖的过程，因此较高浓度的去折叠蛋白质（红色扫描曲线）将导致较快的聚合（更大组分的去折叠状态（U）才能转换为不可逆变性状态（I）。参见下面的原理图。 这种解析的一个推论是，曲线的整体形状应该是相似的。我们假定这种情况是对于在不同配方中的相同蛋白质或由一个母分子衍生出来的具有相似构建体的蛋白质。但是，对于完全不同的蛋白质，使用TM值作为用于稳定性比较的预测指标则应该谨慎使用。 扩展阅读（www.malvernpanalytical.com）Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpracticeDifferential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and PowerThe Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪：DSC差式扫描量热法（DSC）是一种直接分析天然蛋白质或其他生物分子热稳定性的技术，无需外在荧光素或者内源荧光，它通过测定在恒定的升温速率下使生物分子发生热变性过程中的热容变化来实现。 马尔文帕纳科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪能够帮助用户快速确认维持高级结构稳定性的最佳条件，提供简介、无缝的工作流程和自动化批量数据分析，其所提供的热稳定性信息被业内视为“金标准”技术，是一种非标记、全局性的数据。 关于马尔文帕纳科马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的最近技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如最大程度地提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

蛋白质复合物是高度动态的实体，在组装、翻译后修饰和非共价相互作用方面表现出巨大的多样性，使它们能够在各种生物过程中发挥关键作用。天然状态下蛋白质复合物的异质性、动态性和低丰度给使用传统结构生物学技术进行研究带来了挑战。基于此，美国威斯康星大学麦迪逊分校葛瑛教授团队近期开发了一种天然纳米蛋白质组学策略，用于直接从人体心脏组织中富集内源性心肌钙蛋白 (cTn) 复合物并随后进行天然自上而下质谱分析。在非变性条件下，使用肽功能化的超顺磁性纳米粒子对 cTn 复合物进行富集和纯化，以实现 cTn 复合物的同位素解析，揭示其复杂的结构和组装。此外，nTDMS 阐明了 cTn 复合物的化学计量和组成，定位 Ca2+ 结合域，定义 cTn-Ca2+ 结合动力学，并提供蛋白质形态的高分辨率图谱。这种天然纳米蛋白质组学策略为内源天然蛋白质复合物的结构表征开辟了范例。（论文链接：）这一研究为深入了解心脏组织中内源性蛋白质复合物的神秘世界提供了一种前所未有的工具和方法。这不仅有助于揭示心脏疾病的分子机制，还为未来开发相关治疗方法提供了重要的基础。这项创新的纳米蛋白质组学技术将为生物医学研究开辟新的可能性，为科学家们提供了更深层次的洞察力，以探索蛋白质相互作用的微妙之处。

p 　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了? /p p 　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图1_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 图1 /strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图 /p p 　　目前， strong 非变性质谱技术主要应用在两个方面 /strong ：一是 strong 生物制药领域 /strong ，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为 strong 研究蛋白质多聚体 /strong ，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。 /p p 　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。 /p p span style=" COLOR: #002060" strong Orbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台 /strong /span /p p 　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图2_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图2 /strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析 /p p 　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图3_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 　图3 /strong Cys-ADC结构示意图 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图4_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图4 /strong 使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图5_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图5 /strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图6_20170406090915_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 非变性2_20170406090518_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图6 /strong 使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。 /p p 　　 strong 小结 /strong /p p 　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见! /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83. /p p & nbsp /p

近日，连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员、刘哲益副研究员团队与西南交通大学封顺教授团队合作，利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器，揭示了质子化氨基酸侧链的正电荷在电喷雾离子化过程中影响蛋白质结构的分子机制，为质谱精确表征蛋白质高级结构提供了参考。非变性质谱（nMS）是研究蛋白质及其复合物组成和高级结构的前沿质谱技术。在nMS分析中采用生物兼容溶液和非变性电喷雾离子化将蛋白质从液相转移至气相并保持高级结构和相互作用。然而带正电荷的质子化氨基酸侧链在失去水分子的溶剂化稳定作用后，会与空间接近的蛋白骨架羰基形成氢键，通过分子内溶剂化稳定侧链正电荷。虽然有报道通过离子迁移—质谱检测到了分子内溶剂化引起的蛋白质碰撞截面积变化，但是对其发生的具体位点和引起结构变化的区域仍然缺乏有效分析手段进行精确表征。在本工作中，研究团队利用我所自主搭建的高能紫外激光解离—串联质谱仪器和蛋白质光解离质谱数据处理软件系统，通过蛋白质紫外光解离碎片离子的价态分布和位点解离碎片产率分析，探测到肌红蛋白带电残基侧链分子内溶剂化的具体位点，以及对蛋白质结构影响的区域位置。团队系统表征了不同价态（质子化数目）下的蛋白质结构差异，发现高电荷价态下蛋白质气相结构易受分子内溶剂化效应的影响而偏离溶液态结构，低电荷蛋白质离子的气相结构更加接近溶液状态。研究团队进一步证明，冠醚18C6与蛋白质带电侧链的络合主要发生在溶液中，随后在电喷雾离子化过程中起到稳定蛋白质结构的作用。紫外激光解离质谱分析揭示冠醚主要结合在蛋白质离子的高电荷密度区域，通过阻断带电侧链的分子内溶剂化使蛋白质气相结构更加接近溶液状态。相关研究结果展示了高能紫外激光解离质谱在同时获取蛋白质序列和动态结构信息中的显著优势，为nMS表征中蛋白质溶液结构的保持和高效表征提供了重要的理论和技术参考。近年来，我所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合创新攻关，在大连相干光源搭建了高能紫外激光解离—串联质谱实验线站，兼容50-150nm极紫外自由电子激光和193nm准分子激光解离模式，已在多肽（Anal. Chim. Acta，2021）、蛋白质（Cell Chem. Biol.，2022）、金属团簇（J. Phys. Chem. Lett.，2020；Sci. China Chem，2022）等大分子体系的解离和结构表征中取得了系列研究成果。相关研究成果以“Ultraviolet Photodissociation Reveals the Molecular Mechanism of Crown Ether Microsolvation Effect on the Gas-Phase Native-like Protein Structure”为题，于近日发表在《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）上。该工作的共同第一作者是我所1822组联合培养硕士研究生周伶强和刘哲益。

随着生命科学研究的深入开展,科学界对解析复杂生物大分子结构以揭示生命现象的渴望日益增加。在各种结构生物学技术快速发展的背景下,结构质谱技术凭借其独特的优势,日益成为连接静态结构与动态功能、实现从分子到细胞的跨尺度研究的重要手段。在12月12-15日即将召开的“第十四届质谱网络会（iCMS 2023）”同期，特别新增了“结构质谱新方法”主题专场,来自全国的顶尖科学家团队将汇聚一堂,围绕氢/重氢交换质谱、化学交联质谱、原位质谱等前沿技术,报告他们在蛋白质结构生物学研究中的最新进展。本次主题会议的召开,恰逢结构质谱技术发展的重要机遇,必将推动该领域技术的重要突破及交叉创新,开启生命科学研究的新篇章。热忱欢迎质谱界的科技工作者报名参会交流、了解前沿动态、开拓合作视野。部分报告预告如下，点击报名  》》》会议主持人：中山大学 教授 李惠琳中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用，侧重于（1）开发整合结构质谱技术（包括native top-down MS, HDX-MS, CX-MS等），用于药物作用分子机制及蛋白复合物结构研究；（2）Middle-down/top-down蛋白质组学新技术的开发及应用。共发表SCI收录论文40篇，其中第一作者或通讯作者15篇，主要发表在Nat. Chem.、Anal. Chem.等期刊；2014年获得American Society of Mass Spectrometry Postdoctoral Career Development Award；2019年入选“珠江人才计划”青年拔尖人才；主持国家自然科学基金项目3项。报告人：香港理工大学 教授 姚钟平报告题目：氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象复旦大学学士及硕士,香港科技大学博士,香港理工大学应用生物及化学科技学系教授。长期从事质谱、分析化学、化学生物学、组学的交叉学科研究，主要发展和应用质谱技术解决化学、生物、食品安全、信息科学等领域的基础和应用问题，在Nature Communications, PNAS, JACS等期刊发表论文100多篇。现任香港研究资助局专家委员会委员、深圳市中药药学及分子药理学重点实验室副主任、中国化学会有机分析专业委员会委员、Frontiers in Chemistry副主编以及Analytica Chimica Acta, Rapid Communications in Mass Spectrometry,《中国质谱学报》,《分析测试学报》等期刊编委。会上,姚钟平教授将作主题为《氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象》的报告。利用氢氘交换质谱（HDX-MS）并结合原态离子迁移质谱（Native IM-MS）以及分子动态(MD)模拟，发现不同亚型的A型β-内酰胺酶在几个主要的结构域存在显著的动态构象差异。进一步研究了A型β-内酰胺酶与抑制蛋白结合界面的动态结构变化，结果揭示了H10区域是一个可调节β-内酰胺酶抑制作用的别构部位。报告人：浙江大学 研究员 周默为报告题目：非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息浙江大学首位“求是实验岗”研究员，分析化学专业，长期从事前沿生物质谱技术和仪器的开发工作。2008年本科毕业于武汉大学，2013年博士毕业于美国俄亥俄州立大学，之后两站博士后分别在美国FDA和西北太平洋国家实验室PNNL。2018年成为PNNL的研究员开展独立研究，培养多名博士后和学生。2023年加入浙江大学。截至目前共发表60余篇学术论文，代表作包括在Angewandte Chemie, Nature Communications, Analytical Chemistry等期刊的论文。现任自上而下蛋白组协会（Consortium for Top Down Proteomics）的青年委员会主席，曾担任美国质谱协会（ASMS）的出版委员会委员、短课程讲师、评审委员等学术任职，努力推动新分析测试技术的开发和跨学科领域的应用研究。本次会议中，周默为研究员将为介绍题为《非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息》的报告。精准表征生物大分子的微观结构对各类生物工程、生物医药领域的研究至关重要。由于大部分质谱检测到的分子量范围有限，在分析之前生物大分子需要先被剪切为分子量更小的片段。但是剪切和碎片化的过程中会丢失一些关键的结构信息。前沿质谱技术提高了仪器的分子量上限，使非变性条件“自上而下”研究完整的生物大分子更加容易。我将以具体案例，阐述自上而下非变性质谱技术在异质性蛋白质复合体结构和功能解析中的贡献，以及与其他方法的互补性。报告人：北京大学 研究员 王冠博报告题目：生物样本中蛋白高级结构的质谱分析北京大学生物医学前沿创新中心研究员。北京大学学士，美国马萨诸塞大学博士，曾于荷兰乌特勒支大学暨荷兰蛋白组学中心从事博士后研究；曾任南京师范大学教授、博士生导师。主要从事免疫反应相关蛋白质的高级结构及相互作用研究，以生物质谱为核心工具，结合新型分析设备研发，应用于生物物理学、蛋白质药物分析等领域。长年与国际药企合作研发新型药物表征技术并应用于新药研发。获国际国内授权专利，出版《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等专著、译著、合著多部。任中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业分会委员、国际学术组织Consortium for Top-Down Proteomics青委会委员。本次会议中，王冠博研究员将围绕生物样本中蛋白高级结构的质谱分析主题分享报告。生物质谱已成为蛋白质多次结构表征的重要工具。为将蛋白结构质谱技术的应用拓展至生物样本乃至临床样本中，我们针对背景基质复杂、糖基化等修饰异质性高、超大分子量颗粒结构层次多样等问题，以非变性质谱等质谱手段为核心工具开发了一系列组合策略，提供生物样本乃至临床样本中的蛋白高级结构和相互作用关系信息。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 王方军报告题目：高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用2011年于中科院大连化物所获博士学位，师从邹汉法研究员。研究工作致力于生物大分子质谱新仪器、新方法及其在生命健康领域的应用研究，搭建了世界首台50-150 nm可调波长极紫外激光超快解离-串联质谱；提出了位点光解离碎片产率和原位化学标记效率定量表征蛋白质结构变化的两种质谱分析新原理，实现亚微克蛋白质复合物序列和结构变化单氨基酸位点分辨表征；发展了蛋白质-纳米材料界面相互作用精细结构的质谱分析新方法等。在Nat. Protoc.，J. Am. Chem. Soc.，Cell Chem. Biol.，Chem. Sci.，Anal. Chem.等期刊发表论文130余篇，他引5000余次。本次会议中，王方军研究员将分享题为《高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用》的报告。高能/真空紫外激光解离是表征生物大分子序列和动态结构的前沿结构质谱表征技术，但相关仪器和理论都亟待发展。报告人将介绍近年来自主研发的皮秒脉冲极紫外激光解离装置和蛋白质原位光化学标记仪器的原理、主要参数、与商品化质谱对比、及在蛋白质瞬态结构表征、蛋白-蛋白识别和相互作用机制分析等方面的应用情况。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 赵群报告题目：活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究中国科学院大连化学物理研究所研究员，博士生导师。本科毕业于西北大学化学基地班。同年进入大连化学物理研究所攻读博士学位，师从张玉奎院士和张丽华研究员，2014年获得理学博士学位。毕业后留所工作至今，主要从事蛋白质组定性定量及相互作用分析新技术研究，共发表学术论文62篇，其中近五年以通讯/第一作者（含共同）在Nat. Commun., Angew. Chem. Int. Ed.，Anal. Chem.等SCI期刊发表论文23篇；已获20项发明专利授权。作为课题负责人承担国家重点研发计划，作为项目负责人承担国家自然科学基金面上基金等，2023年获国家自然科学基金优秀青年基金支持；2018年入选大连市科技之星，2020年入选中国科学院青年促进会会员，2023年获中国化学会菁青化学新锐奖；兼任《色谱》青年编委、中国化工学会理事、中国蛋白质组学会青年委员、中科院青促会沈阳分会委员等。本次会议中，赵群研究员将围绕题为《活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究》的报告。作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合体等形式行使其特定的生物学功能。不同于细胞外的离体环境，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合体的结构和功能起着至关重要的作用。因此，实现细胞内蛋白质相互作用的精准解析对于深入研究其生物学功能，进而理解生命现象本质具有重要意义。近年来，化学交联质谱技术已逐渐成为蛋白质复合物解析的重要手段。它是利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键连接起来，再利用质谱对交联肽段进行鉴定，进而实现蛋白质相互作用的组成、界面和位点的解析。现有化学交联技术主要用于解析体外表达纯化的或细胞裂解液中的蛋白质复合物，而在细胞内蛋白质复合物的原位构像解析方面仍处于起步阶段。 针对上述问题，我们团队发展了一系列新型高生物兼容性的可透膜多功能化学交联剂，实现了活细胞内蛋白质复合物构像的原位交联捕获；建立了多种高选择性的低丰度交联肽段的富集方法和高可信度的交联肽段鉴定方法，显著提高了原位交联信息的鉴定灵敏度、覆盖度和准确度；进而，通过靶向富集特定亚细胞器内的交联蛋白质复合物，实现了亚细胞器空间分辨的蛋白质相互作用精准解析；在上述基础上，利用基于化学交联距离约束的分子动力学技术获得了蛋白质复合物的动态系综构像，实现了活细胞微环境下蛋白质复合物组成、相互作用界面及作用位点的规模化精准解析，为规模化地揭示蛋白质复合物功能状态下的结构调控机制提供了重要的技术支撑。为了分享质谱技术及应用的最新进展，促进各相关单位的交流与合作， 仪器信息网与北美华人质谱学会（CASMS）将于2023年12月12-15日联合举办第十四届质谱网络会议（iCMS2023）  。以上仅是部分报告嘉宾的分享预告，更多精彩内容请参加会议页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/iCMS2023/ （点击下图去报名）》》》

中国全面启动人类蛋白质组计划 　　&mdash &mdash 生物医学研究院杨芃原教授等复旦团队深度参与 　　&ldquo 中国人类蛋白质组计划&rdquo (CNHPP)6月10日在京全面启动实施，主要目标是以我国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，绘制人类蛋白质组生理和病理精细图谱、构建人类蛋白质组&ldquo 百科全书&rdquo ，全景式揭示生命奥秘，为提高重大疾病防治水平提供有效手段，为我国生物医药产业发展提供原动力。 　　该计划分为三个项目具体实施：&ldquo 中国人类蛋白质组草图&rdquo A类S973项目，&ldquo 人类蛋白质组大数据库和知识挖掘&rdquo 国际合作项目和&ldquo 蛋白质测序新技术新装备及配套试剂国产化&rdquo 863主题项目。复旦大学有关课题组作为核心团队之一深度参与CNHPP计划。化学系和生物医学研究院杨芃原教授担任专项管理委员会委员, 并作为首席科学家领衔&ldquo 蛋白质测序新技术新装备及配套试剂国产化&rdquo 863主题项目。生物医学研究院申华莉副研究员(课题组长)负责&ldquo 蛋白质测序新技术新装备及配套试剂国产化&rdquo 项目中的电喷雾-质谱仪器国产化课题, 化学系杨芃原、徐国宾博士参加激光解析基体辅助-质谱仪器国产化课题。中山医院钱菊英教授(课题组长)和生物医学研究院张莉娟博士负责&ldquo 中国人类蛋白质组草图&rdquo 项目中的循环系统蛋白质组课题(包括心脏和血细胞)，参加人员还有来自生命科学学院和肿瘤医院的课题组。中山医院刘银坤教授参加&ldquo 中国人类蛋白质组草图&rdquo 项目中的消化腺系统蛋白质组课题(肝脏和胰脏等)，肿瘤医院蔡三军教授和生物医学研究院陆豪杰教授参加&ldquo 中国人类蛋白质组草图&rdquo 项目中的消化道系统蛋白质组课题(胃、肠等)。化学系张祥民(课题组长)、陆豪杰(课题组长)、邓春辉(课题组长)、杨芃原等教授和基础医学院顾建新教授(课题组长)还为主参加了&ldquo 中国人类蛋白质组计划&rdquo 中建立新技术新方法的S973/863项目的有关课题。化学系杨芃原教授负责染色体蛋白质组计划中8号染色体蛋白质组任务，生物医学研究院钟凡副研究员(课题组长)负责染色体蛋白质组计划中缺失蛋白质的发现和验证课题。生物医学研究院吴飞珍副研究员和钟凡副研究员还参与&ldquo 人类蛋白质组大数据库和知识挖掘&rdquo 的有关任务。 　　人类蛋白质组计划(HPP)是继基因组计划之后人类全面探索自我奥秘征程中又一伟大科技工程，是新世纪第一个国际大型科技合作计划。中国科学家率先倡导并领衔了人类第一个器官(肝脏)国际蛋白质组计划(HLPP)，开中国引领国际大型科技合作计划之先河，所形成的理论框架、整体策略和技术标准被国际同行认可和应用，为人类蛋白质组计划的全面展开发挥了示范和指导作用。近4年，中国在这一领域国际核心刊物发文章1000多篇，跃居世界第二。在乙酰化新的代谢通路调控机制、炎症诱发肿瘤、骨形成调节、疾病易感性等方面取得系列原创成果。 　　CNHPP产生的大数据将全景式地揭示人体蛋白质组成及其调控规律，解读人类基因组这部&ldquo 天书&rdquo 。构建的人类蛋白质组生理和病理图谱，将准确呈现各种病理状态下蛋白质组的变化，揭示疾病的发病机制和病理过程，发现系列新型诊断标志物、治疗靶点和创新药物，为全面提高疾病防诊治水平提供新策略新手段。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nature communications上的文章，FLASHIda enables intelligent data acquisition for top–down proteomics to boost proteoform identification counts [1]，文章的通讯作者是德国图宾根大学的Oliver Kohlbacher教授。自上而下蛋白质组学(TDP)能够对完整的proteoform进行全面和深入的分析，目前已广泛应用于生物医学研究领域。proteoform在不同的生物系统中具有高度异质性，proteoform水平的信息可以为了解生物生化功能或疾病表型提供重要的信息。近年来，随着TDP样品处理方法、分离技术、碎裂技术和生物信息学方法的进步，proteoform变得更容易被检测和表征。在复杂样本的大规模研究，如微生物或人类细胞裂解液中，proteoform的鉴定数量已达到4000-6000(对应500-1000个蛋白质)。在单次TDP实验中，在大肠杆菌裂解液中可以鉴定出约800种proteoform，在人脑样本中可以鉴定出约1800种proteoform。由于proteoform的多样性和复杂性，完整蛋白质的DDA采集是非常重要的。然而目前的仪器软件在DDA采集中实施的碎裂技术优化主要针对自下而上蛋白质组学(BUP)，而不是TDP。尽管这些方案在BUP研究中有效地捕获了各种高质量的肽段离子，但这些选择标准对于TDP中的proteoform离子选择并不是最优的。与BUP中的肽段离子相比，单个proteoform由于其高质量和高电荷会产生许多峰，Top-N采集往往会导致从一个丰度较高的proteoform中选择多个峰，而不是从多个不同的proteoform中进行选择，这会导致proteoform的覆盖率较低。此外，基于强度进行选择可能不会选到能产生多种独特片段的高质量前体。目前，大多数大规模TDP研究使用具有特定调优参数的DDA采集，例如，Top-N采用相对较低的N值(3-5)和相对较高的隔离窗口(1.2-15 Th，超宽隔离)。然而对所选前体离子的分析表明，对proteoform的选择依然不理想。因此，采用更智能的数据采集方式(Intelligent data acquisition，IDAs)是非常有必要的。本文中作者提出了一种用于TDP的基于机器学习的智能在线数据采集算法FLASHIda，该算法可以确保实时选择不同proteoform的高质量前体，最大化TDP中的proteoform覆盖。FLASHIda通过iAPI与tribrid Thermo Scientific质谱仪连接，允许对MS数据进行实时访问。在LC-MS运行期间，将实时去卷积算法和评估前体同位素质量的机器学习技术结合，非冗余选择高质量前体离子,从而提高蛋白质的覆盖率。FLASHIda流程如图1所示，该算法能在20毫秒内处理每个MS全扫描，并优化下一个采集周期，以最大限度地提高采集中的异型多样性。FLASHIda包括以下3个关键步骤，第一步是将输入的m/z-强度谱转换为mass-quality谱图，第二步是在转换谱图中选择前体离子，最大化唯一识别的proteoform离子数量，最后，动态确定每个选定质量的电荷态和隔离窗口大小，以尽量减少噪声或共洗脱的干扰。确定的隔离窗口m/z范围通过Thermo iAPI连接提供给仪器。　　图1.FLASHIda总览　　在对大肠杆菌裂解液的分析中，与标准DDA模式相比，FLASHIda在三分之一的仪器时间内将proteoform鉴定数量从800增加到1500，或产生几乎相同的鉴定数量。此外，FLASHIda能够灵敏地绘制翻译后修饰和检测化学加合物。作为仪器的软件扩展模块，FLASHIda可以方便地用于复杂样品的TDP研究，以提高proteoform的鉴定率。　　图2. Proteoform分析　　这项研究展示了IDA在TDP研究中的应用，目前作者依然在开发该算法的不同变体，用于靶向proteoform分析，深度表征，甚至从头测序。此外，由于FLASHIda能够选择无干扰的前体离子，因此它可以用于提高proteoform定量准确性。作者预计，未来在FLASHIda内开发的高级数据采集方法将有助于通过TDP探索proteoform的异质性。　　撰稿：张颖编辑：李惠琳　　原文：FLASHIda enables intelligent data acquisition for top–down proteomics to boost proteoform identification counts　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin 　　参考文献　　Jeong K, Babović M, Gorshkov V, Kim J, Jensen ON, Kohlbacher O. FLASHIda enables intelligent data acquisition for top-down proteomics to boost proteoform identification counts. Nat Commun. 2022 Jul 29 13(1):4407.

大家好，本周为大家分享一篇发表在Accounts of Chemical Research上的综述，Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics [1]，文章的通讯作者是美国西北大学的Neil L. Kelleher教授。生命活动由一系列生物大分子相互作用驱动，这些相互作用距今已进化了数十亿年。正如乙酰化和磷酸化等共价修饰可以改变蛋白质的功能一样，与金属、小分子和其他蛋白质的非共价相互作用也可以改变蛋白质的功能。然而，传统的蛋白质组学方法会分离非共价相互作用并使蛋白质变性，导致许多蛋白质水平的生物学信息尚未被发现或仅靠推断获取。就在过去的几年中，质谱(MS)技术不断发展，目前已具备维持内源性蛋白复合物完整组成并表征其特征的能力。采用非变性质谱(Native Top-Down MS, nTDMS)激活蛋白复合体，可以释放部分或全部亚基，通过与中性气体或固体表面碰撞，在进一步表征之前分离。亚单位质量、母离子质量和活化亚单位的碎片离子可以拼凑出复合物的精确分子组成，包括蛋白质修饰在内的相互作用也能被阐明，并与人类疾病状态下的功能障碍联系起来。在本综述中，作者详述了nTDMS技术目前的发展和未来在表征更大的生物复合体方面所面临的挑战。目前，nTDMS可以靶向内源性核小体复合物，而病毒颗粒、外泌体和高密度脂蛋白颗粒表征或将在未来几年内得到深度解析。为充分解决这类大小为兆到千兆道尔顿级别的复合物的表征，未来的工作将主要集中于非变性分离、单离子质谱(Single ion mass spectrometry)和新的数据类型。为了实现这一目标，Kelleher教授课题组近年来发展了一系列策略，概括为以下几个方面（1）靶向非变性质谱表征整个核小体（图1）；（2）非靶向蛋白质组学深度解析内源性蛋白质复合物；（3）单分子质谱(Single molecule MS)。其中提到，阻止对非变性蛋白质进行整体表征最大的障碍之一可能是分子量分布于100 kDa到1 MDa的复合物的分辨率较差。而电荷检测MS通过直接测量离子电荷提供大型复合物的分子分布。此外有研究表明，通过对单分辨离子进行centroiding和rebinning，Orbitrap仪器的有效分辨率可以在电荷检测工作流程之上大大提高。在这种被称为“单离子质谱法(Individual Ion Mass Spectrometry, I2MS)”的技术中，可以同时检测数千个单离子，并允许在复杂混合物中分配约500种proteoforms的质量（前提是它们先前已被表征并且在数据库中可查找）。I2MS可用于分析病毒样颗粒和AAVs（图2）。图1. 核小体表征图2. 病毒颗粒检测未来随着技术的发展和创新，nTDMS都将扩展到研究极其稀缺和高度异质的生物复合物，了解蛋白质间的相互作用以及它们是如何出错的（例如错误折叠，在功能失调的化学计量和组成中形成复合物）。这些将不仅为疾病治疗的发展提供信息，还将深化我们在分子水平上对生命的理解。撰稿：张颖编辑：李惠琳原文：Native Mass Spectrometry at the Convergence of Structural Biology and Compositional Proteomics

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录 　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成 　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。 　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。 　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。 　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。 　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。 　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。 　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。

大家好，本周为大家分享一篇预发表的文章，Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　肌球蛋白作为肌节的“分子马达”，产生心肌收缩所必需的收缩力。肌球蛋白轻链1和2 (MLC-1和-2)在调节六聚体肌蛋白分子结构中起着重要的功能作用。轻链中存在“心房”和“心室”亚型，在心脏中呈现出腔限表达。然而，近年来MLC亚型在人心脏的腔室特异性表达受到了质疑。在本文中，作者使用自上而下蛋白质组学质谱分析了成人非衰竭供体心脏的四个心脏腔室中MLC-1和-2心房和心室亚型的表达。　　MLC-1v和MLC-2a是在所有供体心脏中呈现出腔限表达模式的MLC异构体。重要的是，作者的结果明确地表明，MLC-1v，而不是MLC-2v，在成年人心脏中是心室特异性的。图1展示了LV(left ventricle)、RV(right ventricle)、LA(left atrium)和RA(right atrium)中MLC异构体的检测和定量。作者发现MLC-1v存在心室特异性表达，而MLC-2v没有特异性，并在心房组织中发现了与MLC-2v和pMLC-2v分子质量相匹配的峰。此外，在所有(n=17)无心脏疾病的捐赠者的每颗心脏的心房组织中都能检测到MLC-2v。MLC-2v占总MLC-2含量的百分比采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行定量分析，认为MLC-2v占总MLC-2含量的百分比具有统计学意义，心室和心房间差异显著，LA和RA间横向差异显著。　　图1. MLCs Top-down MS分析　　接下来作者使用串联质谱(MS/MS)鉴定了MLC-2v蛋白质序列。位于心房组织MLC-2v上的去酰胺化翻译后修饰(PTM)被定位到氨基酸N13。去酰胺化位点与调控磷酸化位点Ser14相邻。磷酸化位点附近的脱酰胺基团所带来的额外负电荷模拟了MLC-2a在Ser22/23位点的双磷酸化模式(图2C)。心房特异性的MLC-2v去酰胺化可能与心房内心力的产生有关。磷酸化诱导了MLC-2的构象变化，而第二负电荷的加入可能有助于提高钙敏感性并诱导蛋白质进一步的构象变化。　　图2. Top-down MS/MS 鉴定　　总的来说，自上而下蛋白质组学对整个人类心脏的MLC亚型表达进行了无偏差分析，揭示了之前意想不到的亚型表达模式和PTMs。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　文章引用：Bayne EF, Rossler KJ, Gregorich ZR, Aballo TJ, Roberts DS, Chapman EA, Guo W, Ralphe JC, Kamp TJ, Ge Y. Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart. bioRxiv [Preprint]. 2023 Feb 26:2023.01.26.525767. doi: 10.1101/2023.01.26.525767.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Bayne EF, Rossler KJ, Gregorich ZR, Aballo TJ, Roberts DS, Chapman EA, Guo W, Ralphe JC, Kamp TJ, Ge Y. Top-down Proteomics of Myosin Light Chain Isoforms Define Chamber-Specific Expression in the Human Heart. bioRxiv [Preprint]. 2023 Feb 26:2023.01.26.525767. doi: 10.1101/2023.01.26.525767.

2015年8月4日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）近日发布了基于 Orbitrap 高分辨质谱技术的《医学中的蛋白质组学应用》文集。文集全面、简要地向医学及其它非蛋白质组专业的学者介绍了蛋白质组学研究的基本思路及方法，期望能够成为帮助大家快速开启蛋白质组学研究的视野之窗。本文集从常见的体液、组织和细胞三类实验样本出发，通过介绍权威期刊发表的医学研究相关论文，帮助读者了解蛋白质组学的研究方法、思路和成果，促进研究人员将蛋白质组学技术运用到实际科研工作中。文集还结合多种不同疾病，介绍了上述三类样本的处理方法，进而描述了如何通过蛋白质组学技术，发掘不同病理状态下样本中发生含量及修饰变化的蛋白质，以开发疾病标志物、探究疾病发生发展机制、开拓免疫学等基础理论的边界。本文集适合无蛋白质组学经验或基础较少的科研人员阅读。除具体应用外，文集还在附录部分介绍了大分子质谱的基础概念及关键考量点，以及发掘差异样品特性的蛋白质组学研究理念，因而可帮助读者快速了解蛋白质组学研究思路，根据研究目的选择恰当的质谱类型及质谱方法。 如果您是非蛋白质组学研究领域的学者，希望对蛋白质组学有初步了解，可发送邮件至 jerry.jia@thermofisher.com，索取纸质版文集。了解更多组学应用，欢迎关注微信公众号：----------------------------------------------------------关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有约50,000名员工。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于首要品牌Thermo Scientific、Applied Biosystems、Invitrogen、Fisher Scientific和Unity Lab Services，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数约3700名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站：www.thermofisher.cn

布鲁克在第64届美国质谱年会(ASMS 2016)宣布推出布鲁克HDX Solution —氢氘交换解决方案。BHDX解决方案将LEAP H/D-X PAL自动样品处理系统与布鲁克maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统以及HDExaminer软件相结合，提供了一套自动可靠的HDX-MS工作流。Bruker HDX解决方案通过H/D比值获得单一同位素精确定量分析结果，为深入了解生物分子结构提供可靠依据。　　这些年来，生物制药表征分析需要对生物蛋白的空间构象有更加深入的了解，还要了解多种因素如pH值、温度和压力等对蛋白的影响。对于这一挑战，HDX-MS已经成为了一种有价值的分析技术。生物制药分析方法需要运用强大的分析统计工具，自动化的提供高质量数据。HDX-MS已成为生物制药领域的常规而可靠的分析方法。　　关键结构的鉴定、药物/蛋白的解析以及蛋白之间相互作用、蛋白质构象变化等是目前生物治疗发展过程中面临的关键问题。Bruker HDX解决方案使得液相分离和MS/MS检测自动化，简化数据分析和解析工作，并能获得可靠的蛋白结构解析结果。　　布鲁克道尔顿生物制药副总裁Bob Galvin博士评论说：“最新Bruker HDX解决方案的推出，进一步加强了布鲁克生物表征产品系列，使得生物制药领域的研究者能够更快、更准确的深入了解到蛋白质构象和相互作用。”关于HDX解决方案　　Bruker HDX解决方案提供了完整的工作流程，将LEAP H / DX PAL自动进样器应用于预定标记实验，并结合了UHPLC系统与高分辨质谱系统。maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统的质量准确度达到ppm级以下，高灵敏度与同位素保真度提高了系统获取准确H/D比值的能力。再加上HDX-MS解析软件Sierra Analytics HDExaminer的应用，创造了更大的应用空间与简便的应用环境。LEAP H / DX PAL自动进样器与maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统　　在市场处于领先的超高质量分辨率QTOF质谱与ETD(电子转移解离)能力结合，开创了布鲁克maXis II系统HDX-MS实验的新纪元。比起在肽段水平的研究，在更微量水平的探索能更容易的提供特异性识别位点。LEAP H/D-X PAL自动进样设备将稳健可靠的样品处理整合到布鲁克HDX 解决方案。革新的时间安排软件能够自动安排样品处理步骤，包括贴标签、培养、消化和灭活等，提高LC的效率与整个实验室效率。　　用HDExaminer软件获得的信息可用于研究在干扰状态下蛋白质的构象变化。通过数据输出，有关这些变化的数据信息可被容易的可视化，也可通过导入如PyMol的晶体结构可视化程序更深入的了解这些变化。　　海德堡大学分子生物学中心的Matthias P. Mayer教授表示：“通过布鲁克HDX解决方案，我们能够以高精度、高重复性和最小的动手时间测量氢交换反应动力学。系统的自动安排软件帮助我们充分利用仪器使用时间，从而提高我们的实验室效率”编译：郭浩楠

今天上午，&ldquo 中国人类蛋白质组计划(CNHPP)&rdquo 在军事医学科学院召开第一次工作部署会，国家科技部、总后勤部相关领导、重点专项管理委员会成员及全国40多个科研单位的70余名院士、专家出席，这标志着CNHPP全面启动实施，这是我国科学界乃至世界生命科学领域一件具有里程碑意义的大事。 &ldquo 中国人类蛋白质组计划(CNHPP)&rdquo 正式启动 　　人类蛋白质组计划(HPP)是继基因组计划之后人类全面探索自我奥秘征程中又一伟大科技工程，是新世纪第一个国际大型科技合作计划。在国家科技部等部门的大力支持下，中国科学家率先倡导并领衔了人类第一个器官(肝脏)国际蛋白质组计划(HLPP)，开中国引领国际大型科技合作计划之先河，所形成的理论框架、整体策略和技术标准被国际同行广泛认可和应用，为人类蛋白质组计划的全面展开发挥了示范和指导作用，得到学术界高度评价。 　　中国科学家构建了人类第一个器官(肝脏)蛋白质组图谱，出版人类首个器官蛋白质组&ldquo 百科全书&rdquo ，相关数据得到国际著名专业机构等认同及广泛使用，成为人类蛋白质百科全书主体内容之一，部分工作被《自然》杂志最近发表的人类蛋白质组草图的文章引用。近4年，中国在该领域国际核心刊物发文量直线上升，历史性地达到1000多篇，跃居世界第二。在新的代谢通路调控、炎症诱发肿瘤、骨形成调节、疾病易感性等方面取得系列原创成果，相关论文发表在《科学》、《自然》等国际一流刊物，并被国际同行评述为重大突破性进展。总体来说，我国蛋白质组学研究已处于国际先进水平。 　　亚太蛋白质组组织主席、该计划首席科学家贺福初院士介绍说，CNHPP是在系统总结HLPP成功经验基础上，经过4年迭代论证提出的，主要目标是以我国重大疾病的防治需求为牵引，发展蛋白质组研究相关设备及关键技术，绘制人类蛋白质组生理和病理精细图谱、构建人类蛋白质组&ldquo 百科全书&rdquo ，全景式揭示生命奥秘，为提高重大疾病防诊治水平提供有效手段，为我国生物医药产业发展提供原动力。这是我国863高技术计划、973基础研究计划、国际合作计划再次联手资助的重点专项，也是国家大科学设施与大科学计划的首次会师，将在我国开创大科学设施、大科学计划、大数据产出、大发现孕育的新时代。 　　当前，全球每年产生的生物数据总量高达EB级，生命科学领域正在爆发一次数据革命。据统计，2000 年以来，国际上共发表2万余篇有关高通量生物数据的文献 近几年，《自然-遗传》近三分之一的论文是介绍关于高通量生物数据的工作。数据已成为矿物或化学元素一样的原始材料，未来可能形成&ldquo 数据探矿&rdquo 、&ldquo 数据化学&rdquo 等新学科和&ldquo 数据驱动&rdquo 的新模式，孕育着科学大发现、大突破和产业大发展的前所未有的重大机遇。 　　大数据的产生、管理和利用正逐步成为衡量一个国家创新能力以及竞争力的关键要素。但目前生物大数据的产生和分析还被美国、欧洲、日本等少数国家所垄断。我国生物数据主权受到严重威胁。从过去来看，生物数据最大的是基因组数据，基因组计划实施和完成后，蛋白质组数据无疑将成为最大、最重要和最核心的科学数据。我国已部署建设蛋白质科学基础设施，这是国际上最大的蛋白质组学研究基地，将有力支撑和推动CNHPP的实施和大数据的产生，有望迅速改变现有格局，打破垄断，维护国家生物数据主权。 　　CNHPP产生的大数据将全景式地揭示人体蛋白质组成及其调控规律，解读人类基因组这部&ldquo 天书&rdquo 。构建的人类蛋白质组生理和病理图谱，将呈现多种病理状态下蛋白质组的变化，揭示疾病的发病机制和病理过程，发现系列新型诊断标志物、治疗靶点和创新药物，为全面提高疾病防诊治水平提供新策略新手段。 　　最近英国《自然》杂志同时刊登两篇文章，介绍了美国和德国、印度等合作完成的人类蛋白质组草图的工作。中国科学院院士饶子和说，这是蛋白质组学领域乃至整个生命科学领域和人类科技史上具有里程碑意义的一项重要科学贡献，拉开了新一轮科技竞赛的序幕。中国科学院院士张玉奎指出，逆水行舟不进则退，中国科学家在这场新世纪最重要、最核心和最具代表性的大数据资源争夺中没有犹豫的时间，没有回头的道路，只有勇往直前，直面竞争的选择。我们必须充分发挥体制优势，借鉴&ldquo 两弹一星&rdquo 、&ldquo 载人航天&rdquo 等国家重大工程实施的成功经验，集中力量，重点突破，打赢这场没有硝烟的科技竞赛和资源争夺战。 　　贺福初院士表示，在人类基因组计划中，中国作为六国中唯一的发展中国家，做出了1%的贡献，2001年，江泽民总书记与美英等国首脑共同宣布了人类基因组草图的问世 在人类蛋白质组计划中，中国作为第二大经济体和复兴崛起的大国，将做出不少于30%的贡献，并有望成为最大的贡献国。我们梦想在2017年，习近平总书记可以代表主要完成国宣布人类蛋白质组精细图的问世。我们将为实现这一梦想而不懈努力!中国必须为人类做出更大贡献!中国必然为人类做出更大贡献!

近日，威斯康星大学麦迪逊分校葛瑛教授应《自然综述方法导论》（Nature Reviews Methods Primers）邀请，联合了多位蛋白质组学领域科学家共同撰写的”自上而下蛋白质组学“（Top Down Proteomics）综述文章成功发表。本文的第一作者是葛瑛教授的博士生David Roberts，他目前正于斯坦福大学诺贝尔化学奖得主Carolyn Bertozzi教授的指导下进行博士后研究。《自然综述方法导论》（Nature Reviews Methods Primers）创刊于2021年1月，致力于加强多学科对综合性、复杂性科学问题的协同攻关，通常围绕一个重要主题，邀请跨地区、跨学科的多名顶尖学者合作撰写介绍和总结先进方法或技术的引导性综述，旨在面向更为广泛的读者，概述该主题相关方向的发生发展、方法与应用。葛瑛等在该文中详细介绍了自上而下蛋白质组学技术方法和最新应用，并梳理了该领域所面临的技术挑战和未来发展前景。自上而下蛋白质组学（Top-Down Proteomics，TDP）是一种前沿的分析技术，通过直接分析完整的蛋白质分子，提供了对蛋白质组的全貌视角。与传统的自下而上方法不同，后者需要将蛋白质消化成肽段进行分析，自上而下蛋白质组学保留了蛋白质的完整性和所有的翻译后修饰（PTMs）信息。这对于全面了解蛋白质的功能和动态变化至关重要。TDP的核心优势在于其能够准确识别和表征蛋白质变体（proteoforms），这些变体是由基因多态性、RNA剪接和各种PTMs产生的。通过高分辨质谱技术，TDP可以精确地测量蛋白质的分子量，解析其一级结构，并识别其修饰位置和类型。这种能力使得TDP在揭示蛋白质功能、疾病机制以及生物标志物发现方面具有巨大潜力。在实验操作上，TDP涉及从样品制备、蛋白质分离、质谱分析到数据处理的多个步骤。样品制备需要特别注意蛋白质的提取和纯化，以保持其完整性。质谱分析则依赖于高分辨质谱仪器，如四极杆飞行时间质谱（Q-TOF）和傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）等。数据处理和分析方法也在不断发展，以应对TDP产生的大量复杂数据。近年来，TDP技术在多种应用中取得了显著进展，包括生物医学研究、疾病诊断和生物制药开发。例如，人类蛋白质变体项目旨在全面绘制人类蛋白质变体图谱，为精准医学提供基础数据支持。此外，TDP还在探索生物标志物和治疗靶点方面展现出巨大的潜力。尽管如此TDP仍面临一些挑战，如高复杂度的样品处理、数据分析难度大和仪器要求高等。未来的研究将继续致力于优化这些技术细节，提高TDP的灵敏度和准确性，扩大其应用范围随着技术的不断进步，自上而下蛋白质组学有望在更多领域发挥重要作用，推动生命科学和医学研究的前沿发展。综述论文链接：https://www.nature.com/articles/s43586-024-00318-2.epdf?sharing_token=COpcr8STB7LLuFGw1WzSb9RgN0jAjWel9jnR3ZoTv0Pexs-IoMaC2jUJ4NS8tHNjD4ZV9O4HC1i8tk8NHMk8_JHuptH_gUjNdkoANzz1ye5kvJZe-CkjPcGqZUDgZ1z5dRXEy0mPxl8WCdrHVEaUgsR7hRkijTIS-rAweHYCqgA%3D

11月18日凌晨，神舟八号飞船搭载的生物培养箱在神八落地后几乎是刻不容缓地被送回北京。据介绍，培养箱中装载样品33种，开展了17项空间生命科学实验。如今实验有了什么进展?我们就从中选取几项实验，介绍给您—— 　　神八实验揭秘 　　线虫的太空之旅 　　我是一条线虫,但不是你想象中的寄生虫，你可以叫我的英文名字：C.elegans。我坐着神八飞船，在太空进行了长达十六天半的旅行。 　　自然状态下，我生活在泥土中，以细菌为食。成年后身长约1毫米，人类在显微镜下才能看清。我通体透明，长得不好看。可大连海事大学环境系统生物学研究所孙野青教授和同事们，却常夸我是“可爱美丽的小天使”，还给我起了个好听的名字：秀丽隐杆线虫。 　　不是吹牛，我是天生的“航天员”。在空间生命科学领域，我的家族可谓声名远播。从1975年开始，我的同类就先后搭载美国国家航空航天局的航天飞机邀游太空。 　　为什么选择我们呢?一是因为我们在-80℃长期冻存后仍能恢复活力，是目前已知的唯一能低温冻存的多细胞真核动物。我在逆境时进入休眠期，像熊冬眠一样，不发育、不吃东西，时间可以长达2个月左右。二是我们基因组很小，仅为人类基因组的3%，但有约40%的基因与人类同源。据科学家们说，我们身上很多调控发育的基因和人类很相似，一旦研究清楚在空间辐射环境或空间辐射和微重力同时存在的环境下，我们的这些基因是如何变化的，将给航天医学及空间辐射损伤预警做出巨大贡献。 　　因此，我们在太空中要接受辐射，再把这些辐射损伤的印记带回来。所以我们在地面不能有任何损伤，坐飞机时都不能过安检，临上太空前还要在航天城“集训”两周，看我们能否顺利登舱。 　　这次上太空，我的“房子”是德国航空航天中心DLR研制的SIMBOX(生物支持系统实验盒)内的38个小盒子之一，大约18ml。这么小的空间，却住了十万伙伴。SIMBOX可不简单，它的里面安装了1g的离心装置，模拟地球的引力。我们分成两组，分别被装入在1g的离心机上和附近固定的房子里，有些伙伴只接受空间辐射，有的既接受空间辐射又感受微重力的。当返回地球后，我们就可以被比较分析变化的差别。我们屏住呼吸，停止发育，把空间环境影响的印记尽量留在身上。 　　接下来我们将继续配合孙教授课题组，给人类带来更多惊喜，大家拭目以待吧! 　　放线菌勇闯无重力空间 　　放线菌是“神八”的另一位旅客，它们比缝衣针尖还要小100倍，却是中科院微生物所黄英教授的心肝宝贝们。 　　别小瞧了放线菌!知道抗生素吧?70%是放线菌产生的。它们还是环境保卫者——难降解的塑料、化学除草剂、杀虫剂，可能都是放线菌的“美餐”，只要很短的时间，它们就能消灭这些顽固有机物。 　　黄英说，这次送上太空的有三种微生物，第一种是放线菌里的经典“美人”，它产生的色素像天空般蔚蓝，因此叫天蓝色链霉菌，正是出于颜色易于观察的原因，它是这次上太空的首选“模特” 第二种是放线菌里的“新人类”，它生命力旺盛，产生抗生素的能力又强又稳定，它有个暂定的名字叫卷须链霉菌C 第三种不是放线菌，叫枯草芽孢杆菌，有些洗衣粉里的酶，就是从它的分泌物中提取的。这次，它的命运是被两个同伴杀死，从而测试它们在太空环境下的抑菌能力。 　　放线菌被小心翼翼地放进通用生物培养箱，箱子保持23℃恒温和恒定的湿度，连空气成分都是照搬地球的，并且准备了充分的营养物。 　　送上太空，为什么又模拟地球环境呢?这叫微重力效应实验。地球引力对生物的影响，经常被人们忽视，但确实存在。比如，树木之所以能将根深深扎进土地里，就是因为地球引力的影响。对于放线菌而言，没有了地球引力，又会发生什么样的变化?这就是送放线菌上太空的原因所在。 　　此前科研人员曾在地面模拟微重力效应实验，结果发现它们产生抗生素的周期从1周缩短到4—5天，抗生素的产量也有所增加。 　　将它们送入太空，就是要看看在真实的微重力环境中，它们会发生什么变化。事实证明，在太空的微重力环境下，放线菌的生长和模拟微重力效应环境下相似，甚至效果更好一些。天蓝色链霉菌和卷须链霉菌C在太空中肆无忌惮的生长，杀死了更多的枯草芽孢杆菌，这说明它们释放出的抗生素浓度高于地球上的同类。 　　中科院微生物所接下来的工作，是进一步比对这些从太空中回来的“贵客”们的细微模样和抑菌能力，分析它们的基因性状，抓紧让它们“传宗接代”，看看下一代中会不会出现更美更壮的“佼佼者”。 　　太空中长出蛋白质 　　大约10厘米长、4厘米宽、5厘米厚——这个小黑盒就是由神八携带的、用于蛋白质晶体生长研究的“秘密武器”。打开这个“秘密武器”，可以看到120个排列整齐、大小一致的“小抽屉”，中科院生物物理所研究员仓怀兴解释说，每个“小抽屉”都装满了实验溶液，实验溶液中“漂浮”着一根内径1毫米、长12毫米的玻璃毛细管，毛细管里装着蛋白质溶液。“我们这个实验的主要目的，就是要在太空环境中让蛋白质溶液与实验溶液发生反应，看看能不能生长出质量更好的蛋白质晶体。” 　　蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质分子是由氨基酸构成的，氨基酸的不同排列方式、也就是蛋白质分子的不同结构导致其产生不同的功能。 　　“要想知道哪种蛋白质有何功能，必须先了解它的结构。”仓怀兴说：“研究蛋白质分子的结构有两种方法，一是让其长出晶体，再用X射线照射 二是用核磁共振。”但当蛋白质分子比较大时，“比如一些病毒的蛋白质结构，核磁共振就看不到了。” 　　研究蛋白质分子结构是国际学界的热点。“近些年比较热门的应用是生物制药领域，因为很多病毒的外壳都是蛋白质。”仓怀兴介绍说，美、日、欧盟等发达国家早就将蛋白质分子送入太空，以便获得质量更好的蛋白质晶体，从而更加精细地了解蛋白质的结构。“据我了解，到目前为止，大概有25种蛋白质分子的高分辨率结构，是利用在空间实验中获得的蛋白质晶体取得的。我相信还有更多，不过很多制药公司都将其视为机密，在新药研制成功之前不会对外宣布。” 　　虽然有120个“小抽屉”，但此次实验只携带了14种蛋白质溶液。仓怀兴解释说：“蛋白质是种很奇怪的物质，不是说两种溶液相反应就必然能得到晶体，因此我们都做了充分的‘后备’。”仓怀兴说，得到的晶体已经被研究人员带到上海同步辐射光源进一步研究，“很快就会有结果了!” 空间微重力样品 　　神八里的绿色植物 　　“我们利用神八搭载水稻种子，进行高等植物在空间的代谢生物学研究。”中科院植物所的温晓刚说。水稻是空间生命支持系统中重要的食物来源，也是高等植物研究的模式植物，这是“神八”选择水稻种子的原因。 　　这些水稻种子被放置在植物生长容器中，以透光、透气、不透水的生物膜覆盖。“这些水稻种子在太空中萌发，生长成水稻幼苗。”温晓刚说，这些情况与地面上同一温度、湿度情况下生长的水稻种子进行对比，中科院植物所的研究人员就能够分析水稻幼苗在空间环境下的生长发育情况，考察空间飞行对植物代谢过程的影响。 　　温晓刚说：“经过空间飞行，水稻幼苗生长状态良好，发芽率达到91%以上，与地面实验一致。初步的光合生理实验结果显示，水稻幼苗在微重力等空间环境下，其光合系统的活性受到一定程度的影响，其中对光系统Ⅰ的影响大于对光系统Ⅱ的影响。”温晓刚解释，空间微重力会造成高等植物光合机构叶绿体中的类囊体膜结构发生改变，比如类囊体膜垛叠的基粒组分减少等，这种变化可能对植物光合系统的功能造成一定的影响。“实验结果正在进行进一步研究分析中。”接下来科学家们将深入分析得到的光合生理数据，并进行水稻幼苗叶片和根尖的亚显微结构分析，以及水稻叶片的蛋白质组学研究，同时研究空间飞行对水稻幼苗蛋白质组学的影响，特别是与光合作用相关的代谢过程以及与光合能量传递相关的蛋白的影响，分析空间环境下植物光合系统的变化规律。 　　神八中的“生物圈” 　　如果能在飞船密闭的空间里，建立这样一个“生物圈”：让食物产生、氧气供给、二氧化碳去除和废物再循环都变成现实，那宇航员们长期居住太空将不再是梦想。神八里就有一项空间简单密闭生态系统探索研究，我国科学家迈出了在太空自主建立受控生态生命保障系统(简称CELSS)的重要一步。 　　CELSS是生命科学、空间科学、环境科学、自动化和遥感科学诸多高新技术的集成。首先要在空间飞行器上进行模型实验，积累基本数据。神八飞船上，中科院水生生物研究所的科学家们构建了一个简单水生态系统，以纤细裸藻和小球藻作为主要生产者，澳洲水泡螺作为主要消费者，同时以自组织形式共培养细菌作为分解者。在硬件设计上，除了提供藻类生长与产氧所需的光源外，还增加了藻类生长密度检测装置，即时传送生长状态数据进行监控 并以特定的技术进行系统内的气体传质分布，增进气体在不同腔室的传递，以期在系统中实现气体、食物与废物处理的良性循环。中科院水生生物研究所的李小燕介绍，从目前得到的数据来看，藻与螺的生长都符合预期目标和已知规律，系统中的各要素基本实现自循环、自组织的功能。同时从神舟八号返回的样品中，可以在生物的空间飞行效应、空间共培养系统的物种相互关系，空间封闭生态系统的结构与功能三个方面剖析出重要的科学信息。

几种不同折叠模式的蛋白质模型(图片来源Protein Data Bank Japan ) 　　上个世纪初，科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质，而具有独特的作用。随着这个理论被证伪，真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而，蛋白质作为生命体的重要大分子，其重要性也从未被忽视，而且在1950年代开始，科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时，蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性，因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用。 　　本文简要回顾了蛋白质结构解析的重大历史事件，并总结了蛋白质结构解析的常用方法和结构分析方向。通过了解蛋白质结构，能够让我们更好地理解生物体的蛋白的理化特性，以及其相关联的化学反应途径及其机制，对于我们认识生物世界和研发治疗方法和药物都起着关键作用。在即将召开的2015高分辨率成像与生物医学应用研讨会上，各位专家学者将会进一步讨论相关议题。 　　蛋白质结构解析六十年来大事件 　　在1958年，英国科学家John Kendrew和Max Perutz首先发表了用X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构，然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin。因此，这两个科学家分享了1962年的诺贝尔化学奖。事实上，这项工作在早在1937年就开始了。 　　然后在1960年代，蛋白质结构解析方法不断进步，获得了更高的解析精度。这个时期，蛋白质序列和DNA序列间关系也被发现，中心法则被Francis Crick提出，然后科学界见证了分子生物学的崛起。分子生物学(Molecular Biology)的名称在1962年开始被广泛接受和使用，并逐渐演变出一些支派，如结构生物学。然后在1964年，Aaron Klug提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构。因为这项研究，他获得了1982诺贝尔化学奖。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。 　　进入1970年代，很多新的方法开始发展。存储蛋白质三维结构的Protein Data Bank(1971年) 开始出现，这对于规范化和积累蛋白质数据有着重要意义。1975年新的一种仪器叫做多丝区域检测器，让X-ray的检测和数据收集更加快速高效。次年，Robert Langride将X-ray衍射数据可视化，并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室。同年，KeithHodgson和同事首次证明了可以使用同步加速器获得的X射线并对单个晶体进行照射，并取得了很好的实验效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白质结构的解析 同年首个高精度病毒(西红柿丛矮病毒)衣壳蛋白结构被解析。 　　在1980年代，更多蛋白质结构被解析，蛋白质三维结构的描述越来越成熟，而且蛋白质结构解析也被公认成为药物研发的关键步骤。在1983年，冷冻蚀刻的烟草花叶病毒结构在电子显微镜结构下得到描述。两年后德国科学家John Deisenhofer等解析出了细菌光合反应中心，因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。次年，两个课题组解析了HIV与复制相关的蛋白酶结构，对针对HIV的药物研发提供了理论基础。 　　下一个十年，因为大量同步加速器辅助的X射线衍射的使用，数千个蛋白质结构得到解析，迎来了蛋白质结构组的曙光。1990年多波长反常散射方法(MAD)方法用于X射线衍射晶体成像，与同步辐射加速器一起，成为了近二十多年来的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年发表了第一个高精度的钾离子通道蛋白结构，对加深神经科学的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的诺贝尔化学奖。Ada Yonath等领导的课题组在1999年首次解析了核糖体结构(一种巨大的RNA蛋白质复合体)。　　进入新千年，更多的技术细节被加入到蛋白质解析研究领域。2001年，Roger Kornberg和同事们描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构，正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。2007年，首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来，越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟，并开始广泛用于蛋白质结构的解析。 　　蛋白质结构解析的常用实验方法 　　1.X-ray衍射晶体学成像 　　X射线衍射晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。X射线是一种高能短波长的电磁波(本质上属于光子束)，被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此析获得粒子的位置信息。利用这种特点，布拉格父子研制出了X射线分光计并测定了一些盐晶体的结构和金刚石结构。首个DNA结构的解析便是利用X射线衍射晶体学获得的。 　　后来，获得X射线来源的技术得到了改进，如今更多地使用同步辐射的X射线源。来自同步辐射的X射线源可以调节射线的波长和很高的亮度，结合多波长反常散射技术，可以获得更高精度的晶体结构数据，也成为了当今主流的X射线晶体成像学方法。由X射线衍射晶体学解析的结构在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。 　　X射线衍射成像虽然得到了长足的发展，仍然有着一定的缺点。X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且，X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。 　　上海同步辐射加速器外景(图片来源 上海同步辐射光源网站) 　　2.NMR核磁共振成像 　　核磁共振成像NMR全称Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年诺贝尔奖)描述，在上世纪的后半叶得到了长足发展。其基本理论是，带有孤对电子的原子核(自选量子数为1)在外界磁场影响下，会导致原子核的能级发生塞曼分裂，吸收并释放电磁辐射，即产生共振频谱。这种共振电磁辐射的频率与所处磁场强度成一定比例。利用这种特性，通过分析特定原子释放的电磁辐射结合外加磁场分别，可以用于生物大分子的成像或者其他领域的成像。有些时候，NMR也可以结合其他的实验方法，比如液相色谱或者质谱等。 　　RCSB Protein Data Bank数据库中存在大约11000个用NMR解析的生物大分子结构，占到总数大约10%的结构。NMR结构解析多是在溶液状态下的蛋白质结构，一般认为比起晶体结构能够描述生物大分子在细胞内真实结构。而且，NMR结构解析能够获得氢原子的结构位置。然而，NMR也并非万能，有时候也会因为蛋白质在溶液中结构不稳定能难得获取稳定的信号，因此，往往借助计算机建模或者其他方法完善结构解析流程。 　　使用NMR解析的血红蛋白结构建模(图片来源RCSB PDB) 　　3.Cryo-EM超低温电子显微镜成像 　　电子显微镜最早出现在1931年，从设计之初就是为了试图获得高分辨率的病毒图像。通过电子束打击样本获得电子的反射而获取样本的图像。而图像的分辨率与电子束的速度和入射角度相关。通过加速的电子束照射特殊处理过的样品表明，电子束反射，并被探测器接收，并成像从而获得图像信息。具体做法是，将样品迅速至于超低温(液氮环境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于样品池，在电子显微镜下成像。图像获得后，通过分析图像中数量众多的同一种蛋白质在不同角度的形状，进行多次的计算机建模从而可以获得近原子级别的精度(最低可以到2.0埃)。 　　Cyro-EM解析TRPV1离子通道蛋白(图片来源Structure of the TRPV1 ion channel ) 　　将电子显微镜和计算机建模成像结合在一起的大量实践还是在新世纪之后开始流行的。随着捕捉电子的探测器技术(CCD技术，以及后来的高精度电子捕捉、电子计数electron counting设备)的提升，更多的信息和更低的噪音保证了高分辨率的图像。 　　近些年来，Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体)，取得了非常好的结果。同时，单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备，减少了图像中的噪音和信号衰减，同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步，也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而，Cyro-EM与X-ray不同，该方法不需要蛋白质成为晶体，相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。 　　除去介绍的这三种方法以外，计算机建模技术也越来越多地被用在了蛋白质结构解析中。而且新解析的结构也会提高计算机建模的精确度。未来，我们或许能够用计算机构建原子级别的细胞模型，构建在芯片上的细胞。 　　蛋白质结构对了解生命体的生化反应、有针对性的药物研发有着重要意义。从1958到如今已经接近60年，蛋白质结构解析得到了较快的发展。然而，在如今DNA测序如此高效廉价的时代，蛋白质和DNA结构解析并没有进入真正高速发展阶段，这也导致了在如此多的DNA序列数据非常的今天，结构数据却相对少的可怜。大数据时代的基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等飞速发展的时候，蛋白质结构组也得到了更加广泛的重视。发展高精度、高效的结构解析技术也一直都有着重要意义。未来，蛋白质结构解析，对针对蛋白质的药物筛选，和计算机辅助的药物研究研究不应被低估。未来说不定在蛋白质结构领域有着更多惊喜，让我们拭目以待。 第一届电镜网络会议部分视频回放

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

日前，两个国际小组均在《自然》杂志上公布了人类蛋白质组第一张草图，这些在大部分非患病人体组织和器官中表达的精选蛋白，为更好的理解疾病状态下发生的机体变化，奠定了坚实的基础。 　　英国新一期《自然》杂志公布两组科研人员分别绘制的人类蛋白质组草图。这一成果有助于了解各个组织中存在何种蛋白质，这些蛋白质与哪些基因表达有关等，从而进一步揭开人体的奥秘。 　　上世纪90年代，人类基因组计划开始成形时，有科学家提出了破译人类蛋白质组的想法。其目标是将人体所有蛋白质归类并描绘出它们的特性、在细胞中所处的位置以及蛋白质之间的相互作用。但人类蛋白质组的规模和复杂性使此类研究困难重重。 　　德国慕尼黑工业大学等机构研究人员报告说，尽管人类已对基因组有所了解，但大约2万个编码基因中，哪些会指导合成蛋白质、合成哪些蛋白质都是未知数。为探明这一问题，他们从人体多个组织样本和细胞系中提取蛋白质并将它们&ldquo 切&rdquo 成小块，然后用质谱分析法分析出形成每个蛋白质片段所需的氨基酸序列。 　　研究人员借助计算机对这些蛋白质片段与基因组进行了大量比对工作，并据此列出一个&ldquo 清单&rdquo ，描绘出哪些组织中的哪些基因表达与蛋白质的形成有关。在另一项研究中，美国约翰斯· 霍普金斯大学研究人员与印度等国同行也采用质谱分析法绘制出一张蛋白质组草图。 　　这两个团队均发现，有数百种蛋白质是由此前认为不具备相关功能的DNA片段(脱氧核糖核酸)及&ldquo 假基因&rdquo 形成，&ldquo 假基因&rdquo 是指由于发生突变，丧失原有功能的基因。此外他们还发现了一些与蛋白质产生无关的&ldquo 多余&rdquo 基因。 　　研究人员表示，绘制人类蛋白质组图谱有助于了解人体内蛋白质的出处、功能和特性，这对于生命科学、医学等领域都有重要意义。

北京大学物理学院凝聚态物理与材料物理研究所、人工微结构和介观物理国家重点实验室、国家生物医学成像科学中心、北大-清华生命科学联合中心、定量生物学中心毛有东教授团队利用自主研发的深度学习高精度四维重建技术，发展并应用时间分辨冷冻电镜，阐明了原子水平人源蛋白酶体动力学调控和构象重编程机制。2022年4月27日，相关研究成果以《时间分辨冷冻电镜解析人源蛋白酶体在USP14调控下的变构》（“USP14-regulatedallostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM” ）为题，在线发表于国际顶级学术期刊《自然》（Nature）。同期，研究人员、审稿人和Nature编辑团队联合，在研究简报（Research Briefing）专栏在线发表了题为《人体蛋白质降解机制的控制揭示》（“Control of human protein-degradation machinery revealed” ）的推介文章，其中审稿人评价“该工作是一项重大研究，终于在原子水平解决了USP14活化和其调控蛋白酶体功能的机制问题”；Nature编辑团队指出“这一工作通过时间分辨冷冻电镜，结合功能分析… … 呈现了蛋白质降解过程中USP14和蛋白酶体的构象连续体”。这是首次将人工智能四维重建技术应用于大幅提升时间分辨冷冻电镜分析精度，针对重大疾病靶蛋白复合体，实现原子水平功能动力学观测的国际领先原创成果，展示了一类新型的蛋白质复合动力学研究范式。蛋白质降解调控是极其重要的基本生物化学过程，在细胞周期、信号转导、免疫响应、基因调控、新陈代谢、神经退行、癌症肿瘤、病毒感染以及蛋白毒性响应等主要细胞分子过程中发挥着关键的调控作用。在真核细胞中，绝大部分胞内蛋白都是通过泛素蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteasome pathway），经过泛素化标记被蛋白酶体全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover，Irwin Rose和AvramHershko三位科学家因“对该泛素化通路介导蛋白质降解的历史性发现”被授予诺贝尔化学奖。蛋白酶体全酶，又称为26S proteasome，是由中间一个圆柱形20S核心颗粒和两端覆盖的一个或两个19S调节颗粒组成。19S包含一个环形异源六聚体马达——AAA-ATPase，通过多个协同ATP水解模式调控蛋白酶体降解泛素化底物。蛋白酶体功能紊乱与人体多种疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶体是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的多种治疗癌症的上市小分子药物的直接靶标。在正常细胞中，蛋白酶体的功能受到多个水平的严格调控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶体调控分子，被认为是一个潜力巨大的治疗癌症和神经退行性疾病的重要靶标，其小分子抑制剂曾进入过美国一期临床研究，但围绕USP14功能机制的一系列悬而未决的关键问题极大地限制了其靶向药物分子的开发和临床应用。USP14通过结合26S而被激活，然后以毫秒的时间尺度剪切底物上的泛素链；但其如何被蛋白酶体激活并调控蛋白酶体功能，一直是全球研究机构和生物制药领域期待解决的关键科学问题。生命分子机器通过高度复杂的非平衡动力学过程和结构变化来实现其特殊功能，这一过程进而受到各种复杂分子间相互作用的精准调控。如何在原子水平直接观察天然态超大分子机器的功能态动力学过程，给现有的原子结构动态分析技术提出了空前挑战。毛有东教授团队长期致力于发展基于冷冻电镜的动力学重建方法，围绕蛋白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统的结构功能、动力学机制和靶向调控分子设计深入开展前沿交叉研究：2016年，在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上报道了人源蛋白酶体基态的3.6 Å冷冻电镜结构及其他三个亚纳米分辨构象，并首次发现一个亚稳态构象的核心颗粒物转运通道处于开放状态（PNAS2016 113: 12991-12996）；2017年，利用冷冻电镜解析高分辨率蛋白酶体19S调控复合体在结合组装伴侣p28的自由态的三维结构，阐释了组装伴侣蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶体组装过程中构象选择的组装机理（Molecular Cell 2017 67: 322-333）；2018年4月，在《自然通讯》（Nature Communications）上报道了6个ATPγS结合状态下的26S蛋白酶体动态结构，包括三个核心颗粒复合物开放态对应的亚稳简并态近原子分辨（4~5 Å）结构（Nature Communications 2018, 9: 1360）；2018年11月，在《自然》（Nature）上首次报道了人源蛋白酶体26S在降解底物过程中的七种中间态构象的高分辨（2.8~3.6Å）结构，在原子水平呈现了蛋白酶体和底物相互作用的动态过程，首次实现了对AAA-ATPase六聚马达分子内ATP水解全周循环的完整过程的原子水平观测（Nature 2019 565: 49-55）。这一系列工作揭示了蛋白酶体的原子架构、组装原理和降解泛素化底物的动力学基本规律。(A) USP14调控下蛋白酶体复合体降解多泛素化底物的原子结构模型之一；(B) 时间分辨率冷冻电镜解析13种中间态的统计分布随蛋白质降解进程的时间演化（Youdong Mao, CC BY 4.0）科学研究的过程总是艰难曲折，要克服的首要困难是“时间分辨”：蛋白酶体降解底物的过程很快，时间尺度在毫秒至秒之间，正常条件下，想要通过冷冻电镜技术捕获此过程的中间态结构非常困难，因此，首先要让这个过程慢下来。研究团队通过大量的条件摸索，重建反应动力学体系和优化反应条件，包括优化缓冲体系、反应温度等条件，优化出较为可行的实验方案，从而使得时间分辨冷冻电镜技术应用成为可能，最终获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，挑取了3,556,806个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像。接下来面临的极端挑战是“三维分类”，冷冻电镜捕获的复合体图像需要经过一系列的分类，将它们归为不同的构象类别，才能呈现出蛋白反应的动态过程。USP14结合到26S蛋白酶体后，使得降解底物的动力学过程更加复杂，想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解过程的各个时态的高分辨率非平衡构象，传统的三维分类方法是无法实现的。低精度的三维分类将导致低分辨的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，无法对含时的数据赋予自洽的动态变化的物理意义。研究团队结合经过数年自主开发的新型深度学习高精度三维分类和四维重建方法，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物过程的13种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6Å）非平衡构象，通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期，并结合分子生物学功能和基因突变研究，阐明了USP14和26S相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制。研究发现USP14的活化同时依赖于泛素识别和蛋白酶体RPT1亚基的结合。出人意料的是，USP14通过别构效应，诱导蛋白酶体同时沿着两条并行状态转变路径发生构象变化；研究团队成功捕获到了底物降解中间状态向底物抑制中间状态的瞬时转化。在底物降解途径中，USP14活化变构地重编程AAA-ATP酶马达的构象景观（Conformational landscape）和统计分布，并刺激20S底物通道的打开，从而观察到底物持续转运过程的ATPase六聚马达非对称ATP水解和近乎完整的全周循环周期。USP14-ATPase的动态相互作用，使得ATPase马达底物识别与26S自身的去泛素化酶RPN11催化发生去耦合效应，并在26S的泛素识别、底物的起始易位和泛素链回收过程中引入三个调控检查点（动力学分岔点）。这些发现为USP14调节26S的完整功能周期提供了全新的高分辨见解，并为USP14靶向药物治疗发现奠定了极为重要的机制基础。通过时间分辨冷冻电镜分析获取的USP14调控蛋白酶体底物降解的并行路径模型（Youdong Mao, CC BY 4.0）北京大学“博雅”博士后张书文和北京大学物理学院2019级博士研究生邹士涛为论文的共同第一作者，毛有东为通讯作者。研究工作中的全部冷冻电镜数据在北京大学电子显微镜实验室和冷冻电镜平台上完成采集，大部分数据分析工作在北京大学高性能计算平台上完成。上述研究工作得到北京市自然科学基金、国家自然科学基金、国家杰出青年科学基金，北大-清华生命科学联合中心等支持。

1 人类蛋白质组草图公布 　　之前，尽管不少大型的蛋白质组数据集，已经收集约上万个蛋白数据，然而覆盖80%的人类蛋白质组的草图却并未绘制。此次的研究，则突破了这一局限。 　　该图谱由德国慕尼黑工业大学、约翰霍普金斯大学/印度生物信息研究所等机构的两个团队独立完成。其中，在印度生物信息研究所和美国约翰霍普金斯大学等机构绘制了17 924个基因编码的蛋白质草图，其总数约占人类基因总数的84% 而慕尼黑理工大学领衔的团队，则对19 629个基因编码的蛋白质绘制草图，其总数约占人类基因总数的92%。不过，印度和美国团队，与德国团队所采用的实验数据来源略有不同，印度和美国的研究者从30个人体组织的许多不同的样品及细胞系(包括7种胎儿组织和6种血细胞类型)中提取、纯化所有蛋白质，并用质谱技术揭示组成各蛋白片段的氨基酸序列，因而两种数据的分析方法相对统一 德国的团队所采用的数据从公共数据库收集获得，而后与实验室生成的数据合并完成分析。在德国的研究中，慕尼黑工业大学的Bernhard Kü ster等人建立了搜索性公共数据库ProteomicsDB，而公共数据库收集获得的质谱分析数据约占ProteomicsDB数据的60%，其他的数据来自于60个人类组织体液，13个体液，147个癌细胞系。 　　这些蛋白大多为健康人群中组织和器官中表达的蛋白，对于理解疾病状态下发生的变化，具有现实的意义，如德国团队完成的数据能用于识别数百个翻译的基因间非编码RNAs(lincRNAs)，比较分析通过蛋白质对癌症药物的敏感性，发现mRNA和组织中蛋白的定量关系等。同时，这两项研究也发现了许多新蛋白，而编码这些蛋白的基因之前被认为位于基因组的非编码区域，因而也丰富了对于遗传学研究的认识。 　　2 研究团队的基本背景 　　此次研究的美国和印度团队，由约翰霍普金斯大学的副教授Akhilesh Pandey领衔，而他也是印度生物信息学研究所首席科学顾问。此前，印度生物信息学研究所和约翰霍普金斯大学的生物信息学团队就有广泛的合作，例如两个机构的26名科学家经过18个月的努力，排列出了人类的X染色体顺序，并将其与黑猩猩、老鼠的基因组相比较，发现了新基因。 　　慕尼黑工业大学的化学和功能蛋白质组学分析者Bernhard Kü ster，其研究的主要领域是探索蛋白质的相互作用及其与活性药物成分的相互作用，分析癌症发生发展的分子机制，以及开发相应的临床治疗方法。作为研究者，Bernhard Kü ster也曾参与了蛋白质组技术平台上具有雄厚基础的Cellzome公司的发明(新的酶相互作用化合物的方法)。而Cellzome公司的药物研发平台，可对于特定蛋白相互作用的药物进行筛选，其具有高度的灵敏性，而葛兰素史克(GSK)公司也正在看中了这一点已将其并购。 　　3 中国人类蛋白质组计划(CNHPP) 　　在人类蛋白质组草图公布的同时，&ldquo 中国人类蛋白质组计划(CNHPP)&rdquo 已经由科技部正式批准启动实施。此前，中国科学家已倡导并领衔人类第一个器官(肝脏)国际蛋白质组计划(HLPP)。 　　在&ldquo 中国人类蛋白质组计划&rdquo 中，&ldquo 激光解析基体辅助离子源-蛋白测序仪器&rdquo 课题是重点研究方向之一，致力于蛋白质测序仪器和试剂国产化，从而加速蛋白质组学和生物质谱技术在临床领域的研究与应用。 　　4 蛋白质组测序技术的开发 　　蛋白质组是一个细胞、组织、有机体在一定时间内表达的所有蛋白质(总蛋白质)。对蛋白质组进行系统的、全面的研究，而快速、准确、低成本的蛋白质分离纯化技术(如双向电泳、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术等)的发展，则是系统、全面研究的基础。有了基因组计划和基因组测序技术的发展经验，人类在蛋白质组草图公布的前后，也就有了对低成本、高效率的蛋白质组测序技术的格外重视。例如，亚利桑纳州立大学的Stuart Lindsay团队正在致力于研究让单链肽段穿过纳米孔的技术，从而将纳米孔单分子DNA测序技术(第三代基因测序技术，采用纳米孔的单分子读取，与之前的测序技术测序时间长、价格比较昂贵、测序分子需要大量扩增、还需要进行荧光标记等相比，第三代测序技术读取数据更快，测序成本明显降低)的设计理念应用于蛋白质组的测序，开发蛋白质单分子测序技术。 　　5 蛋白质组学与个性化医疗 　　人类蛋白质组草图的成果表明，有数百种蛋白质是由此前认为不具备相关功能的DNA片段(脱氧核糖核酸)及&ldquo 假基因&rdquo 形成。这也说明了基因组和蛋白质组之间的巨大差别。例如，表观遗传研究的核心内容即是基因的拼接和翻译后修饰，而蛋白质随时间和空间的动态变化等，使得蛋白质组的研究远比基因组研究复杂。 　　尽管目前的个性化医疗以基因解析为特征，然而真正衔接基因型与疾病表型的还是蛋白质。随着蛋白质组测序技术的快速发展，也许蛋白质组学的研究会带动个性化医疗新的发展阶段。 　　本文作者：中国科学院上海生命科学信息中心 于建荣 江洪波。

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤——01 材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。02 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。03 蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。04 样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。05 蛋白质的分析测定通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。蛋白质的分析纯化，不仅仅是选择合适的方法，必备的工具，例如微量均质器、干燥器、抗体保存盘等，也很重要。Bel-Art蛋白质分析纯化工具推荐本篇我们根据不同耗材在蛋白质分析纯化过程中的不同作用，分类为大家推荐几款合适的耗材。细胞裂解 热门优选 微量均质器-手持式货号：F65000-0000研磨组织和破碎细胞层析 热门优选 磁珠分离架货号：F19900-000分离结合在磁珠上的蛋白质以快速纯化透析热门优选 透析袋夹持器货号：F18237-0000测定热门优选贝塔盾货号：F24976-0001在进行C14分析时减少接触电泳热门优选 Spindrive&trade 轨道摇床平台货号：F37041-0001提供彻底、温和的凝胶混合，同时*限度地扩大实验室空间

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作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能。近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华、研究员赵群等研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。相关成果发表在《德国应用化学》上。大连化物所供图　　细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。而化学交联技术，尤其是原位化学交联质谱技术具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。但是，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。　　本工作中，团队基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更加优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。　　在此基础上，低能量的糖苷键—高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可以将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，极大地降低了交联肽段谱图分析的复杂性，显著地提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。