定量蛋白质组学

质谱是定量蛋白组学的主要工具。 近年来随着定量蛋白质组学研究的深入,传统质谱定量技术面临着复杂基质干扰、分析通量限制等诸多问题。 而最近一系列质谱新技术的发展,包括同步母离子选择(SPS)、质量亏损标记、平行反应监测(PRM)、多重累积(MSX)和多种全新数据非依赖性采集(DIA)等,为解决目前蛋白质组学在相对定量和绝对定量分析方面的局限提供了有效途径。 本文对定量蛋白质组学目前遇到的瓶颈问题进行了分析,总结了质谱定量采集技术的最新进展,并评述了这些新技术的特点以及在定量蛋白质组学应用中的优势。

赛默飞为蛋白质组学研究提供包括创新的化学试剂、高效的分离产品、领先的色谱质谱技术、以及蛋白质组学数据处理软件产品的最先进和完整的解决方案，帮助科学家们大幅提高研究工作的效率，更有信心地面对蛋白质组学研究的挑战。

在这篇工作中，我们采用内标掺入 SILAC 的定量方法对大鼠胰岛进行了蛋白质组以及磷酸化蛋白质组的定量研究。通过对 SILAC 培养基的成分比例调整，我们优化了 INS-1E 细胞的标记方法。胰岛内包含多种细胞类型，如α 细胞，β 细胞，δ 细胞等，我们发现采用 INS-1E 细胞系（一种β 细胞系）已经可以较好的覆盖胰岛的全蛋白质组和磷酸化蛋白质组。若关心胰岛中的α 细胞的话，则可以标记α 细胞系来作为内标掺入胰岛。此外，我们还可以采用多种细胞系作为内标，这种称为“Super SILAC”的方法来完成对复杂组织蛋白质的全覆盖。 在磷酸化蛋白质组学流程中，我们采用了自制的基于StageTip 的TiO2萃取小柱来灵活的实现小量样品的磷酸化肽段富集。样品量始终是磷酸化以及其他一些翻译后修饰研究绕不过去的话题，一般来说只有增加样品量，并采取适当的预分级手段才能更深度的去覆盖这些翻译后修饰蛋白质组。ThermoFisher 也提供了商业化的 IMAC 试剂盒（Cat # 88300），鉴于 IMAC 和 TiO2 对磷酸化肽段富集有着较好的互补性，这两者联用会对磷酸化蛋白质组的深度覆盖达到更好的效果。

Q Exactive HF， DDA，DIA，293T，定量蛋白质组学数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition， DIA）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式(1)。DIA 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差窗口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。 DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好，定量准确等优点，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的热门发展方向 (2)。Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(3, 4)。Q Exactive HF 采用了分段式四极杆技术（Advanced Quadrupole Technology，AQT）使离子传输效率至少提高了 2 倍；超高场 Orbitrap 技术，提高了 Orbitrap 扫描速度，在 15000 分辨率时，二级谱图的扫描速度是 18 Hz。这两项技术提高了 Q Exactive HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用 Q Exactive HF 质谱，170 min 色谱梯度对 293T 细胞蛋白质组进行 DIA 定量分析，考察 Q Exacive HF DIA 定量的能力。

全球首款单细胞蛋白质表达定量分析系统单细胞组学是精准医学研究计划的首要组成部分，在国家精准医疗计划申请指南，排在第一位。之前只有基因水平的手段，现在美国ProteinSimple率先提供蛋白质水平的检测方法。

新一代AI主导的(单细胞)深度视觉蛋白质组学

得益于增强型主动离子管控技术（AIM+），TSQ Altis三重四极杆适用于复杂生物学样本中低丰度蛋白的分析，可以完成蛋白组学中的相对定量和绝对定量实验，全面提升了蛋白组学中的定量验证能力。此外，基于高分辨Orbitrap的蛋白质组学的发现型研究到基于TSQ Alits的蛋白质组学定量可以实现无缝对接，用于潜在生物标志物的发现、验证和确认。

ACQUITY UPLC M-Class系统能够在蛋白质组学应用中以纳升级流速运行，具有以下优势：1.出色的色谱保留时间重现性、峰容量和灵敏度2.无论是分析相对简单的样品还是较为复杂的胰蛋白酶酶切的肽混合物，都能展现优异的性能

随着“一小时酵母蛋白质组”的实现, 短梯度下实现蛋白质组深度覆盖成为可能.本文利用全新 Q-OT-qIT 三合一质谱系统进行“一小时蛋白质组”分析与优化. 50 min 有效梯度, 单次实验分别从1 μ g和50 ngHeLa全蛋白中鉴定到20860和14100条肽段, 对应到3865和 2877 个非冗余蛋白, 而目前的文献报道至少需要 2~3 h. 同时, 本文考察了 Q-OT-qIT 碎裂模式、检测方法、最大注入时间和自动增益控制等参数对蛋白质组快速分析的影响, 证明了不同采集方法间的互补性, 阐述了不同扫描参数对鉴定结果的影响. 此外, 还讨论了Q-OT-qIT 的并列运行原理和扫描组合模式, 为不同实验目的和样本类型的蛋白质组快速分析奠定了基础.

各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。

第二代“三合一”质谱——Orbitrap Fusion Lumos 通过诸多技术革新和性能深度优化，除解决复杂糖肽结构解析、完整蛋白Top-Down 分析等最具挑战的疑难问题外，也能够很好地进行复杂样品中的低丰度蛋白/化合物定性定量，更为高效地进行蛋白质组学深度测定，并应用于大规模临床样本等的高强度检测。

布鲁克在ASMS 2020发布了高通量dia-PASEF@方案，即将Evosep One LC与timsTOF Pro再次联合，最大程度发挥Evosep One LC快速分离和timsTOF Pro扫描速度和稳定性的优势。英国牛津大学Roman Fischer教授采用高通量dia-PASEF@方案，进行血液蛋白质组学大队列研究，43天完成4300针连续进样，总共采集2.5亿张二级谱图，整个采集过程只需一次离子传输管清洗。

使用ProSightPD可对复杂蛋白质混合物进行自动化的高通量top-down蛋白质组学研究。仅用5 µ g蛋白，即可鉴定到大肠杆菌核糖体蛋白复合物中超过90%的组成蛋白。得益于Orbitrap质谱的高分辨率和高质量串联谱图，ProSightPD可精准测定蛋白质序列、蛋白翻译后修饰类型及位点。这一工作流程可用于蛋白复合物的组成研究和翻译后修饰研究等，与bottom-up和native MS等蛋白质组学技术互为补充，提供更加全面的蛋白质结构信息。

数据非依赖性采集(DIA)是随着定量蛋白质组学而建立的质谱扫描技术。 DIA 能够获得扫描范围内所有母离子及二级子离子信息,不会造成低丰度离子信息的丢失,同时突破了高分辨质谱二级定量的通量限制。 本研究基于静电场轨道阱 Q-qIT-OT 三合一质谱,发展了经典 DIA 方法以及 WiSIM-DIA 和 Full MS-DIA两种全新 DIA 方法,并对 Hela 细胞全蛋白中添加的 10 条低浓度肽段进行定量分析,考察方法的线性、重现性和灵敏度。 结果表明,3 种方法的定量限均低至 amol (14 ~435 amol),并展示出良好的线性和定性确证可靠性。 其中,WiSIM-DIA 基于超高分辨一级监测定量,与经典 DIA 优势互补 Full MS鄄DIA 的选择窗口仅 3 amu,能够直接进行搜库鉴定,实现了数据依赖性采集(DDA)和 DIA 的统一,摆脱了 DIA 依赖于 DDA 建立谱图库的局限性。

血液是最重要的临床检验样品来源。精准医学研究中的大队列生物标志物研究对于分析方法提出了高通量和高稳定性的要求，利用Orbitrap Fusion Lumos质谱极佳的灵敏度和稳定性，我们发展了一种快速、稳定的高通量血浆蛋白质组研究策略。简化的前处理步骤通量高、稳定性好，仅用1小时梯度即可定量700种蛋白，2.5小时梯度可定量超过1000种蛋白。基于高通量的深度血浆蛋白质组解析，我们可从大规模临床队列中发现潜在的生物标志物，助力精准医学研究。

本申请说明将描述如何创建Lowry、Biuret和紫外-可见吸收分析方法的校准曲线，以确定蛋白质浓度。关键词：V-630，紫外-可见光/NIR，校准曲线，定量，生物化学

采用TriSep ® -3000高效微流电动液相色谱系统，配备ESI-MS检测器，通微 EP-100-20/30-3- C18色谱柱，通过在线富集，可以实现对低浓度蛋白质的检测。蛋白质标准品的检出限可提高20-100倍，此方法已成功应用于浓度为20 mg / mL的蛋白质的分析。结果表明我们提出的方法可能在蛋白质组学研究中发挥重要作用。

从上述结果可以得出，LTQ-Velos-Pro-Orbitrap-Elite检测结果可靠性高，系统稳定性高，质谱质量轴稳定性高，在短时间内可以鉴定到大量高可信的磷酸化修饰肽段以及磷酸化位点，可以很好的应用于磷酸化蛋白质组学研究，同时本次实验还说明对样本使用TiO2进行多次重复富集可以显著提高样本中磷酸化肽段的比例，提高磷酸化肽段与位点的鉴定数目。

蛋白质的定量方法分为有很多种，而但在生物药物制造的生产等中，要求需要更简单、更加微量的可以更加微量且简便地测定上述内容蛋白质定量方法。本文介绍了使用最小可测定1~2μ L样品量的生命科学紫外可见领域分光光度计BioSpec-nano，通过OD280 nm法和BCA法等2种方法定量分析免疫球蛋白（IgG）浓度的案例。

蛋白质晶体学通常用于结构生物学应用，如临床前靶点验证。由于蛋白质结晶条件要求高，结晶条件必须经过严谨地改进，蛋白质晶体的高通量筛选是个一个非常关键的环节。蛋白质晶体的形成依赖于zui佳化的条件。这个zui佳化的条件需要多次连续稀释和重复，以优化盐、缓冲液和沉淀剂的不同组合和浓度。人工制备这些反应蛋白质结晶板不仅费时又容易出错，尤其不适合于高通量筛选应用。该过程的自动化制备提高了生产能力、可靠性和效率，同时减少了浪费。

SAXS是一种快速、没有破坏性的测试溶液中蛋白质结构的方法。在溶液中蛋白质处于其天然态。从溶液中蛋白质颗粒的质量可以快速判断其聚集状态，同时它作为质量控制参数也可以认定溶液中的蛋白质是否处于我们不欢迎的变性或聚集状态。而且， SAXS能够确定蛋白质在其自然环境中的低聚状态。即使我们可以从晶体学数据中得到蛋白质的高分辨结构，但我们仍无法获知蛋白质在其自然状态下是单体还是低聚体。

在这部分工作中，我们采用了高 pH 反相色谱结合二氧化钛富集以及二氧化钛富集结合强阳离子交换分级两条技术路线来对实现对 Hela 细胞的磷酸化蛋白质组的深度覆盖。最终我们的实验一共鉴定到了 8,696 个蛋白质上的近 40,000 个磷酸化位点。 在二氧化钛富集结合强阳离子交换分级的技术路线中，SCX 分级的梯度还值得进一步优化，对于这种组分较少的预分级方法，阶梯洗脱会是一个更好的选择。这种大规模的磷酸化肽段富集方法对样品的起始量要求比较高，如果样品较少的话，建议采用二氧化钛富集结合强阳离子交换的策略，一般 2 mg 起始蛋白就能得到较多的磷酸化位点鉴定。ThermoFisher也提供了商业化的 IMAC 试剂盒（Cat # 88300），鉴于 IMAC 和 TiO2 对磷酸化肽段富集有着较好的互补性，这两者联用会对磷酸化蛋白质组的深度覆盖达到更好的效果。

凝胶电泳是研究蛋白质性质的一种相对简单、快速和高灵敏度的工具。它是分析化学、生物化学和分子生物学的主要工具。通过电泳分离蛋白质是基于这样一个事实，即带电分子将在施加电场时通过基质迁移。

鸭血为家鸭的血液，鸭血中含有丰富的蛋白质及多种人体不能合成的氨基酸，所含的红细胞素含量也较高，还含有微量元素铁等矿物质和多种维生素，这些都是人体造血过程中不可缺少的物质。本文参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》测定鸭血中的蛋白质含量。

蛋白质测定仪是一种用于快速测定奶粉中蛋白质含量的仪器。在奶粉生产过程中，控制蛋白质含量是非常重要的，因为蛋白质是婴儿生长发育所必需的营养素。通过使用蛋白质测定仪，可以及时了解奶粉中蛋白质的含量，确保产品质量和婴儿的健康。

目前，在蛋白质的分析中，使用质谱仪及利用基因组数据库搜索引擎进行蛋白质鉴定的蛋白质组分析是主流的分析技术。体内表达的蛋白质经过翻译后修饰而具有各种功能，并且前体和成熟蛋白质之间可能具有不同的理论质量数。在不使用数据库的情况下，使用质谱仪鉴定氨基酸序列非常复杂和困难。另一方面，作为常规方法，使用埃德曼降解法的蛋白质测序仪所得到的氨基酸序列结果的可靠性高，即使在数据库不充分的情况下，也可以轻松地鉴定氨基酸序列。本次为您介绍使用蛋白质测序仪PPSQ™ -50A系统（等度系统和梯度系统）对含有半胱氨酸和胱氨酸的样本进行氨基酸序列分析的实例。

不同烹饪方式对牡蛎蛋白质营养品质的影响热处理是食品加工和食用中必不可少的步骤。与新鲜牡蛎比较，4种常见的烹饪方式均会造成牡蛎营养成分的部分损失，但能提高蛋白质的体外消化率，改善牡蛎蛋白质的营养品质和质构。4种烹饪方式比较而言，水煮导致部分易消化的水溶性成分流失，蛋白质的体外消化率最低；清蒸烹饪的热传递效率较高，牡蛎营养成分的流失最少，氨基酸的含量最高，蛋白质的营养品质最好；焙烤处理的温度高，长时间的烹饪会影响蛋白质的结构，促进美拉德反应的进行，导致蛋白质、糖类和脂肪等营养素的含量下降；与传统方法相比，微波加热能快速熟化食品，但也会导致蛋白质、碳水化合物、脂质等营养成分流失严重，蛋白质的营养价值较低，但因微波加热能够引起蛋白质分子结构的展开，促进蛋白质的消化吸收，牡蛎蛋白质的体外消化率提高。因此，从营养学的角度分析，清蒸烹饪处理能最大程度地保留牡蛎的营养成分，提高牡蛎蛋白质的营养品质，易于人体利用吸收。

毛细管电泳法能够根据蛋白质的分子量快速分离蛋白质并在含有蛋白质的样品中进行蛋白质定量。该法是基于SDS蛋白复合物在一个狭窄的熔融石英毛细管填充低粘度凝胶，在施加电场的作用下进行差分迁移，对其在220 nm波长处的吸光度进行检测。由于低粘度凝胶的存在，SDS蛋白复合物仅根据它们的分子量大小进行分离，因此它也能够确定未知蛋白质的分子量。与SDS-PAGE分离蛋白质相比，毛细管电泳具有几个重要的优点：1.完全自动化；2.直接蛋白质定量；3.无需染色；4.低分析成本；5.分析时间短。

大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂。大豆分离蛋白中蛋白质含量在90%以上，氨基酸种类有近20种，并含有人体必需氨基酸。蛋白质含量为其重要的理化指标之一。本实验参照《GB 5009.5 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》使用杜马斯定氮仪对大豆分离蛋白的粗蛋白质进行定量测定。

蛋白质被用在很多领域，比如食物，制药学、生物化学、生物学，而且经常是比较高的浓度。医学领域为了药物适合长期服用或减少注射次数，蛋白浓度通常较高，这时科学仪器表征方法很大程度上受到高度浓缩的蛋白质分散性的挑战。高浓度蛋白质悬浮液出现不稳定性的影响因素有温度，盐浓度和氨基酸加量等。蛋白质的变性程度经常用粘度来表征，如蛋白质变性导致粘度增加。DLS或zeta电位也是常用方法，缺点是需要稀释，可能改变分散状态。