电荷异构体分析

p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp 单克隆抗体药物(mAb)是通过基因工程生产的蛋白质药物，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、经济效益大等优势，是近年来生物医药产业的重要增长点。 br/ /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 治疗性单克隆抗体（mAbs）的开发和制造是一个高度管制的过程，ICH的指导原则指出了相关产品质量参数允许的异质性水平。电荷异构体是单克隆抗体（mAb）的关键质量参数（CQA）之一，在药品稳定性研究、申报及放行等环节都必须检测、评估。抗体的电荷异构体是由细胞内的酶促和非酶促过程分泌到培养基后形成，电荷异构体可能具有明显不同的生物活性，影响单抗药物的功能、安全性及稳定性。导致电荷异质性的最常见变异之一是C末端赖氨酸剪切，随着一个或两个带正电荷的赖氨酸残基丢失，可导致碱性变异体的形成；另外，在N-和O-连接的聚糖上脱酰胺、糖化和带负电荷的唾液酸的存在都会导致负电荷增加和酸性变异体的形成。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 电荷异构体的检测方法有很多种，如：聚丙烯酰胺凝胶电泳，虽然仪器设备相对便宜，但其分辨率低、操作繁琐，目前应用较少；毛细管等电点聚焦（cIEF）电泳可进行蛋白的等电点测定，现已开发出毛细管电泳与质谱联用的技术，该方法可从完整蛋白水平进行分析，暂未推广使用；离子交换色谱（IEX）在电荷异构体的分析中使用较多，有盐洗脱与pH梯度洗脱两种方式，后续收集各个成分进行质谱检测分析其分子量及翻译后修饰。现已有在线的LC-MS方法，此方法不使用传统的盐缓冲液，改为质谱可以耐受的有机盐缓冲液来进行电荷异构体的分离，但其质谱图谱质量及普适性还有待考量，且不能实现肽段水平翻译后修饰的解析。中国计量科学研究院研制了人源化IgG1 κ型单克隆抗体标准物质，与军事科学院军事医学研究院钱小红、应万涛课题组合作，建立了cIEF-WCID及SCX-HPLC两种方法分离检测了单克隆抗体标准物质中的电荷异构体。运用蛋白质组学技术，从完整的分子量分布、肽图分析、进一步延伸到糖肽分析，建立了逐步深入的分析方法来研究单克隆抗体电荷异构体形成的影响因素，此方法可推广应用于其他单抗类药物的电荷异质性分析与评价。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 272px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/f26eb0c0-ed43-47b2-9965-eb69024d8360.jpg" title=" 图片1.png" alt=" 图片1.png" width=" 600" height=" 272" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 2020年11月10-12日，中国计量科学研究院和国际计量局拟联合举办 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 第三届 “药物及诊断试剂研发与质控——测量与标准，质量与安全（TD-MSQS 2020）” /strong /span 国际研讨会，以期进一步促进该领域的学术交流和技术发展，提升企业的研发水平和产品质量。本次会议将在南京市政府的支持下，在江苏省南京市举行。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 本次会议可通过官方网站http://tdmsqs.ncrm.org.cn注册或扫描二维码注册，注册成功后请填写参会回执发送至会议邮箱pptd@nim.ac.cn。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/11c12ff4-263b-48c2-aff9-f4640b0a1850.jpg" title=" 图片3.png" alt=" 图片3.png" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center " strong span style=" text-indent: 0em " 欢迎各位专家、同仁报名参会！ /span /strong /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 更多信息请关注会议官方网站： a href=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" _src=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: right " 供稿：崔新玲 胡志上 span style=" text-indent: 2em " & nbsp /span /p

研究背景与成果生物分子的结构解析与相关生物学功能的关联研究已成为现今生命科学的前沿。生物分子存在多级结构，而其结构复杂度的一个重要因素为分子异构。不同的异构分子（Isomers and isoforms）具有相同的化学式和分子量，但化学结构不同。例如，单糖存在多种异构体，包括葡萄糖、果糖、半乳糖等；多糖由单糖两两通过糖苷键相互连接组成，导致出现更为复杂的构造异构（分子中原子或原子团互相连接次序不同，Structural or constitutional isomers）和立体异构现象（连 接 次 序 相 同 但 空 间 排 列 不 同，Spatial isomers or stereoisomers）。离子迁移（Ion mobility, IM）与质谱（Mass spectrometry, MS）联用（IM-MS）分析已经发展为生物分子特别是生物大分子结构解析的一种主要手段，并成为质谱仪器发展的主要方向。IM可以区分MS不能区分的异构体或同重素（Isobars），这一独到的特性对生物分子的结构解析研究十分关键，近年来被广泛用于糖结构、脂质结构、蛋白质结构和活性、蛋白质-分子相互作用等研究中。近年来，多种IM 分析方法被纷纷提出，例如迁移时间 DTIMS （Drift time ion mobility spectrometry）、囚禁式 TIMS（Trapped ion mobility spectrometry）、行波 TWIMS（Travelling wave ion mobility spectrometry） 以及非对称场 FAIMS（Field asymmetric ion mobility spectrometry）等。然而，这些技术均基于低E/N场原理（E/N 图2. 二糖异构体分析。（a）四种二糖异构体及其（b）离子云扫描谱图。乳糖和纤维二糖混合物的（c）离子云扫描谱图和（d）串级质谱分析谱图。（e）两种二糖标准品及（f）混合物的定量分析结果。离子云扫描技术对各类生物分子异构体具有普遍适用性。如图3所示，该技术同样可分辨脂质和多肽分子异构体。研究工作中，离子云扫描方法展现出多种优点，如分析部件结构简单、操作方便、具有强大的时间/空间串级质谱能力等，可以方便地与多类质量分析器联用，用于设计混合型串联分析质谱仪器，在生物分子复杂结构解析上展现出较好的应用前景。图3. 脂质与多肽异构体分析。（a）脂质异构方式示意图。各种脂质异构体的离子云扫描谱图：（b）sn异构、（c）碳碳双键位置异构和（d）双键顺反异构。（e）多肽的不同翻译后修饰类型及其异构方式示意图。不同翻译后修饰类型的多肽异构体离子云扫描谱图：（f）甲基化、（g）乙酰化和（h）磷酸化。本研究由国家自然科学基金项目和清华大学精准医学科研项目资助。论文第一作者为清华大学精仪系周晓煜副教授，通讯作者为欧阳证教授，其他作者还包括精仪系博士生王卓凡和范菁津，第一完成单位为清华大学精密仪器系精密测试技术与仪器国家重点实验室。这项研究也得到了清华大学化学系瑕瑜教授、精仪系马潇潇副教授与张文鹏助理教授的大力帮助。

生物分子的结构解析与相关生物学功能的关联研究已成为现今生命科学的前沿。生物分子存在多级结构，而其结构复杂度的一个重要因素为分子异构。不同的异构分子(Isomers and isoforms)具有相同的化学式和分子量，但化学结构不同。例如，单糖存在多种异构体，包括葡萄糖、果糖、半乳糖等 多糖由单糖两两通过糖苷键相互连接组成，导致出现更为复杂的构造异构(分子中原子或原子团互相连接次序不同，Structural or constitutional isomers)和立体异构现象(连 接 次 序 相 同 但 空 间 排 列 不 同，Spatial isomers or stereoisomers)。　　离子迁移(Ion mobility, IM)与质谱(Mass spectrometry, MS)联用(IM-MS)分析已经发展为生物分子特别是生物大分子结构解析的一种主要手段，并成为质谱仪器发展的主要方向。IM可以区分MS不能区分的异构体或同重素(Isobars)，这一独到的特性对生物分子的结构解析研究十分关键，近年来被广泛用于糖结构、脂质结构、蛋白质结构和活性、蛋白质-分子相互作用等研究中。近年来，多种IM分析方法被纷纷提出，例如迁移时间DTIMS(Drift time ion mobility spectrometry)、囚禁式TIMS(Trapped ion mobility spectrometry)、行波TWIMS(Travelling wave ion mobility spectrometry)以及非对称场FAIMS(Field asymmetric ion mobility spectrometry)等。然而，这些技术均基于低E/N场原理(E/N 　　图2. 二糖异构体分析。(a)四种二糖异构体及其(b)离子云扫描谱图。乳糖和纤维二糖混合物的(c)离子云扫描谱图和(d)串级质谱分析谱图。(e)两种二糖标准品及(f)混合物的定量分析结果　　图3.脂质与多肽异构体分析。(a)脂质异构方式示意图。各种脂质异构体的离子云扫描谱图：(b)sn异构、(c)碳碳双键位置异构和(d)双键顺反异构。(e)多肽的不同翻译后修饰类型及其异构方式示意图。不同翻译后修饰类型的多肽异构体离子云扫描谱图：(f)甲基化、(g)乙酰化和(h)磷酸化　　离子云扫描技术对各类生物分子异构体具有普遍适用性。如图3所示，该技术同样可分辨脂质和多肽分子异构体。研究工作中，离子云扫描方法展现出多种优点，如分析部件结构简单、操作方便、具有强大的时间/空间串级质谱能力等，可以方便地与多类质量分析器联用，用于设计混合型串联分析质谱仪器，在生物分子复杂结构解析上展现出较好的应用前景。　　该研究成果近日以“超高场离子云扫描技术实现高分辨生物分子异构体分析研究”(High-Resolution Separation of Bioisomers Using Ion Cloud Profiling)为题发表在《自然通讯》(Nature Communications)上。　　论文第一作者为清华大学精仪系周晓煜副教授，通讯作者为欧阳证教授，其他作者还包括精仪系2020级博士生王卓凡和范菁津，第一完成单位为清华大学精密仪器系精密测试技术与仪器国家重点实验室。研究得到了清华大学化学系瑕瑜教授、精仪系马潇潇副教授与张文鹏助理教授的大力帮助。该研究由国家自然科学基金项目和清华大学精准医学科研项目资助。　　论文链接：　　https://www.nature.com/articles/s41467-023-37281-7

☆ 导读 ☆对于多肽类药物而言，在药物的研发、生产、质量控制等环节，清楚地了解氨基酸的具体构型，把控氨基酸异构化现象，对于最终药物的质量与药效至关重要，也是多肽药物企业严格监控的重点之一。因此，氨基酸异构体的分离检测，在整个研发管线中必不可少。然而，D/L两种氨基酸成分分析经常遇到的难点有：分析难度大：各种各样的肽或氨基化合物的背景干扰较多分析时间长：传统的氨基酸异构体分析必需进行氨基酸的衍生化处理，通常分析时间超过10小时面对氨基酸异构体的分析难点，岛津公司推出LC/MS/MS DL氨基酸分析方法包（内含分析方法、报告模板和使用说明书）。结合LCMS-8045/8050/8060的高灵敏度分析能力，为DL氨基酸异构体分离提供准确、高效、简便的解决方案。 ☆ 什么是D/L氨基酸 ☆ 大部分氨基酸（除甘氨酸外）具有与羧基（COO-）相邻的手性碳原子，该手性中心存在彼此互为镜像的立体异构，分别称为D型氨基酸和L型氨基酸。L型氨基酸属于天然存在的氨基酸构型，可合成蛋白质，作为营养物质在人体内大量存在。D型氨基酸体内含量极低，多为人工合成，有研究发现，体内极微量的D型氨基酸，存在于肠腔或生物体肾脏。 ☆ 氨基酸名录 ☆☆ 方法包特点 ☆ l 同时分析42种D/L型氨基酸 可实现批处理分析，快速分析42种D/L氨基酸。l 快速分析检测（10min） 仅需10分钟即可完成高灵敏度的氨基酸分析。l 高灵敏度分析 结合LCMS-8045/8050/8060高灵敏度分析能力，可省去氨基酸衍生化实验流程。l D/L型氨基酸均可以实现柱上分离和定量分析 充分发挥手性分离优势，对于理化性质相近氨基酸（如谷氨酸和赖氨酸，苏氨酸，异亮氨酸和别异亮氨酸），本方法支持两种手性色谱柱同时分析，可以由两种数据结果共同确认组分，提供高准确性数据。☆ 典型应用 ☆ 利用岛津DL氨基酸分析方法包对某多肽药物水解样品进行检测分析，准确测定出L型氨基酸与极微量的D型氨基酸含量，并得出相关比例。 岛津独特的DL氨基酸构型分析方法结合三重四极杆质谱仪高精准的特点，可较完美解决D型与L型氨基酸异构体的分离难点，为多肽类或氨基酸类药物研发与质量控制、D-氨基酸机能研究及更具附加值的机能性食品或药物开发提供新型技术手段。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

近期，清华大学化学系瑕瑜教授课题组与清华大学药学院尹航教授课题组以及北京清华长庚医院王韫芳研究员团队合作在Angew. Chem. Int. Ed杂志上发表了题为 “sn-1 Specificity of Lysophosphatidylcholine Acyltransferase-1 Revealed by a Mass Spectrometry-based Assay” 的文章。第一作者为清华大学化学系博士生赵雪与梁家琦，通讯作者为瑕瑜教授。该工作首次揭示磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)在合成胆碱甘油磷脂 (PC)时对甘油骨架的sn-1位置具有选择性 该选择性与LPACT1在人肝细胞癌组织中的高表达直接导致了sn位置异构体PC 18:1/16: 0的显著升高。以上研究对于发展基于脂质异构体分析的新型疾病诊断与靶点发现具有启示意义。　　LPCAT1是细胞内PC的合成通路中脂质重塑过程关键的酶。已有相关研究表明，LPCAT1在多种癌症组织中表达上调并且对饱和或单不饱和的酰基辅酶具有选择性。然而LPCAT1对甘油骨架sn位置的选择性还尚不明确，这主要是由于sn位置异构体难以区分与定量。2019年瑕瑜教授课题组利用PC碳酸氢根加合物([PC+HCO3]-)在串级质谱中碎裂产生的“sn-1 frag.”实现了sn位置异构体的定性与定量(Zhao X, Xia Y, et al. Chemical Science, 2019, 10:10740)。基于此，本工作建立了测定LPCAT的sn位置选择性的LC-MS流程。作者以sn-1 LPC和sn-2 LPC的混合物为底物，LPCAT1过表达的HEK 293T细胞膜碎片作为酶源，加入酰基辅酶，37℃下进行孵育。酶反应产物通过反相液相色谱(RPLC)中分离及质谱检测 其与内标的色谱峰面积比对总的合成产物(sn位置异构体之和)进行定量。继而对酶反应产物的碳酸氢根加合物进行串级质谱分析，通过“sn-1 fragment”的百分比对sn位置异构体进行定量(分析流程如图1)。继而通过建立sn-1 LPC和sn-2 LPC的酶反应动力学曲线，比较动力学常数来确定sn位置选择性。　　图1. LC-MS/MS流程用于定量分析LPCAT催化所产生的PC sn位置异构体　　鉴于不同分子量的PC分子可以在RPLC中分离，该流程可以同时测定LPCAT1对多种酰基辅酶(如，17:0-CoA, 18:1-CoA和20:4-CoA)的选择性。结果显示LPCAT1对三种酰基辅酶均表现出活性，20:4-CoA的活性最低。当LPCAT1将三种酰基辅酶连接到甘油骨架上时，均选择性的加在了sn-1位置，即只合成了PC 17:0/16:0，PC 18:1/16:0和PC 20:4/16:0。因此，基于图1的LC-MS/MS分析流程，该研究首次明确了LPCAT1对甘油骨架的sn-1位置具有选择性。　　已有研究表明LPCAT1在肝细胞癌组织中表达上调。为了探究肝细胞癌中PCsn位置异构体的组成是否会受到LPCAT1对sn-1位置选择性的影响，该工作对人肝细胞癌组织和正常肝组织中PC的sn位置异构体进行LC-MS/MS分析。结果显示PC 18:1/16:0在肝细胞癌组织中显著上升。该工作进一步对常用的肝癌细胞系HepG2中的LPCAT1进行敲降，敲降后PC 18:1/16:0的含量显著下降。这表明肝细胞癌组织中PC 18:1/16:0的含量与LPCAT1对sn-1位置的选择性以及LPCAT1的表达上调直接相关。更重要的是，解吸电喷雾电离质谱(DESI)对PC 18:1/16:0的分布成像与人肝细胞癌组织连续切片的LPCAT1的免疫荧光成像以及H&E染色高度吻合(图2)。因此PC 18:1/16:0可能作为新型生物标志物，用于划分癌变区域和癌旁区域。　　图2. 人肝细胞癌组织连续切片H&E染色(a)组织中LPCAT1的免疫荧光成像(b)以及DESI MS2 对PC 16:0_18:1的sn位置异构体分布的成像(c, d)　　总的来说，该工作建立了用于测定LPCAT的sn位置选择性的快速、灵敏、高通量的LC-MS/MS分析流程。它深度剖析了组织中sn位置异构体的组成、分布与酶的功能、分布的关系 阐明了脂质异构体作为新型生物标志物用于疾病的诊断与治疗的巨大潜力。不过其他几种LPCAT在连接酰基辅酶时对sn位置选择性还有待进一步研究。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem.上的文章，Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry [1]。该文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授。组氨酸是人体蛋白质结构中的重要组成氨基酸，研究发现，组氨酸具有Nδ-H和Nε-H两种互变异构体，通过两种互变异构体的转换，可以在蛋白质中介导质子转移。目前常使用2D NMR技术进行区分，但操作相对繁复。共价标记质谱是一种研究蛋白质结构的有力方法，具有操作简单，灵敏度高，结构分辨率高等优点。在本文中，作者尝试以焦碳酸二乙酯（DEPC）为标记试剂，采用共价标记质谱区分组氨酸互变异构体。组氨酸侧链的咪唑上具有两个氮原子，其中一个氮上的孤电子对参与芳香环π键的组成，而另一个氮原子仍保留孤对电子，更容易与DEPC等亲电子试剂反应。而组氨酸的两个互变异构体中都只有一个保留孤对电子的氮原子，且该氮原子位置不同，Nδ-H互变异构体中的Nε2与DEPC反应，而Nε-H互变异构体中的为Nδ1。因此以DEPC标记组氨酸以区分两个互变异构体的方法是可行的（图1）。图1. DEPC 结构及其与两种不同组氨酸互变异构体的反应 为了测试DEPC 标记区分两种互变异构体的能力，作者以几种含组氨酸的肽，在确保DEPC仅标记组氨酸条件下进行实验。以Fmoc-DGHGG-NH2为例子，该肽在N端包括一个Fmoc基团以确保仅标记组氨酸。采用等度洗脱来最大限度地利用LC分离两种异构体，并确保流动相组成不影响肽段电离效率，从而可以更好地量化每个互变异构体的比率。结果发现，在11.4和13.6分钟洗脱的峰具有相同的m/z值（图2）。根据串联MS数据，发现这两个峰代表着组氨酸上成功标记DEPC的单一物质（图3）。并且，这些同量异位离子的串联质谱不同，表明这两种物质为带有不同组氨酸互变异构体的物质。作者将先洗脱出的物质命名为修饰物质1，后洗脱出的为修饰物质2。根据MS/MS数据，两者的主要区别为修饰物质2具有更加丰富的羧基化a3离子（a3*）。图2. 未标记（蓝色迹线）和 DEPC 标记（红色迹线）肽 Fmoc-DGHGG-NH 2的提取离子色谱图。DEPC浓度比肽浓度高10倍，反应1分钟图3. 两种修饰的His异构体的串联质谱。(a)来自图2中的色谱图的修饰物质 1 的串联质谱。(b)来自图2中的色谱图的修饰物质2的串联质谱。标有星号 (*) 的产物离子包含羧基化产物此外，在重复实验中，作者发现物质2与物质1的丰度比为3.9± 0.2。而研究发现，在中性pH条件下，游离氨基酸Nε-H 互变异构体与 Nδ-H 互变异构体的比接近于4:1。因此，两物质的峰面积比表明物质1可能为 Nδ-H 互变异构体，而物质2可能为 Nε-H 互变异构体。结合以上发现，并考虑肽解离途径等因素，作者对两物质质谱图谱差异做出推测。当物质2为Nε-H互变异构体侧链时，DEPC 标记在Nδ1上，有利于肽通过bx-yz途径解离，随后通过bx-ax途径损失CO，因此物质2富含a3*离子。当物质1为Nδ-H 互变异构体时，DEPC 标记在Nε2上，肽通过组氨酸途径解离，并形成了稳定五元环，因此优先形成更稳定的b3*离子（图4）。以上发现进一步证明了Fmoc-DGHGG-NH2中物质1为 Nδ-H 互变异构体，物质2为 Nε-H 互变异构体。根据丰度比以及肽解离途径不同，作者在其他模型肽标记实验中也成功区分两互变异构体。由于组氨酸的pKa在一定程度上会影响互变异构体的比例，因此两互变异构体的丰度比可能会略有变化。总之，以上结果表明，DEPC共价标记质谱可以识别两个组氨酸互变异构体。图4. DEPC 标记的含组氨酸肽 CID 过程中两种异构体的肽片段化途径。左侧通路为物质1（Nδ-H互变异构体），右侧通路为物质2（Nε-H互变异构体）之后，作者还进一步研究了不同DEPC浓度对实验的影响。结果发现，在 DEPC 浓度范围超过一个数量级时，Fmoc-DGHGG-NH2的两种修饰形式的比率基本在4左右保持恒定，其他模型肽的比率略有不同（图5），但随着 DEPC 浓度的增加，给定肽的标记比率保持不变。在质谱可以确认互变异构体结构的肽中，Nε-H互变异构体总是丰度相对更高，洗脱相对较晚。此外，作者发现当组氨酸不是位于N末端残基时，Nε-H 互变异构体的an */bn *比率总是比Nδ -H 互变异构体的更高。但是，若组氨酸残基位于肽的N末端时，在质谱中观察不到b1和a1离子，将对结果造成影响。图 5. 在 DEPC 浓度增加时选择肽的两种修饰形式的标记比率。(a) Fmoc-DGHGG-NH2；(b) Ac-IQVYSRHPAENGK(Ac)；(c) Ac-VEADIAGHGQEVLIR；(d) Ac-LFTGHPETLEK(Ac)。MS/MS 用于通过测量an /bn离子的比率来确认每个互变异构体总而言之，作者成功使用DEPC共价标记质谱区分肽与蛋白质中的组氨酸互变异构体，利用丰度比与洗脱时间，以及CID期间的肽解离模式，区分两种互变异构体。利用该方法，作者团队已经确定了几种蛋白质组氨酸互变异构体比率，并且相对于2D NMR方法，该方法更简单、更快、更精确，有利于探索蛋白质中组氨酸残基周围的局部结构，提供高分辨率的结构信息。[1]Pan X, Kirsch ZJ, Vachet RW. Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1003-1010.

目的 使用沃特世(Waters® )ACQUITY UPC2&trade 系统成功开发非对映体超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography&trade ，UPC2&trade )方法，用于四种氯菊酯异构体的基线分离。 背景 公众对杀虫剂使用的关注日益增长。目前使用的杀虫剂有25%为手性化合物。在这些杀虫剂中，手性在药效、毒性、代谢特性和环境方面起着重要的作用。因此，对立体选择性分离技术和分析测定杀虫剂对映体纯度的需要正在不断增长。 氯菊酯是一种合成的化学品，广泛用作杀虫剂和驱虫剂。氯菊酯具有四种立体异构体(两对对映体)，由环丙烷环上的两个手性中心产生，如图1所示。因此，氯菊酯异构体的分离和定量测定颇具有挑战性。在分离氯菊酯方面，开发正相HPLC和反相HPLC的方法已经做出巨大的努力，但收效不尽如人意。我们在此展示，利用ACQUITY UPC2，在不足6分钟之内实现了四种氯菊酯基线分离。 与HPLC方法相比，UPC2&trade 实现了所有异构体的完全基线分离，运行时间大大缩短；对于杀虫剂的生产厂家而言，进行日常非对映体分析UPC2不愧为理想之选。 解决方案 人们已经对各种手性固定相(CSPs)进行了评估，以利用手性正相HPLC和反相HPLC进行分离。Lisseter和Hambling报道了Pirkle型手性固定相用于正相HPLC条件下分离氯菊酯。总的运行时间大于30min，使用的流动相为含有0.05%异丙醇的正己烷(Journal of Chromatography，539 1991 207-10)。但是，顺式和反式对映体拆分并不理想。Shishovska和Trajkovska使用了手性ß -环糊精手性固定相，用于在反相HPLC条件下拆分氯菊酯，以甲醇和水作为流动相(Chirality，22 2010 527-33)。总的运行时间大于50min，反式氯菊酯对映体的分离度小于1.5。另外，正相HPLC条件下，CHIRALCEL OJ色谱柱也用于氯菊酯的分离(Chromatographia，60 2004 523-26)，我们的实验在表1中所示的条件下进行，得到了3个分开的色谱峰，如图2所示，该结果与文献报道一致。 图3显示了利用ACQUITY UPC2系统对氯菊酯进行非对映体分离。所有四种异构体利用更短的OJ-H色谱柱在不足6分钟内实现了基线分离。实验结果总结于表2中。总的来说，与手性HPLC方法相比，当前的UPC2方法实现了更好的分离，且运行时间更短。 总结 利用沃特世ACQUITY UPC2系统成功分离氯菊酯得到了证明，在小于6分钟内实现了四种异构体的基线分离。与手性HPLC方法相比，UPC2方法具有更高的分离度和更短的运行时间。UPC2方法也杜绝了正相HPLC中有毒正己烷的使用。对于杀虫剂生产商而言，进行日常非对映体的分析，ACQUITY UPC2系统不愧为理想之选。

在疾病研究中二十烷担负着重要作用，本方案将二十烷以及其同分异构体及代谢物50种成分的MRM条件最优化，建立了由54个通道组成的同时检测法。使用LCMS-8040对多成分检测，定量限达到pg以下。 花生四烯酸串联是非常重要的代谢路径之一，作为其代谢产物的二十烷以及其同分异构体及代谢物的同时分析方法，在疾病研究中起到重要作用。LC/MS/MS的MRM测定具有高灵敏度与高选择性，广泛应用于二十烷的分析，但随着成分数的增多，从分离・ 离子化的观点来看，现在很难获得稳定的分析结果。本方案使用快速LC/MS/MS系统开发了全面地定量分析二十烷和其类似物的新方法。 本方案作为全面、快速、高灵敏度分析脂信号分子的方法行之有效。 了解详情，请点击&ldquo 基于超快速LC/MS/MS的二十烷以及其同分异构体的同时分析&rdquo 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有13个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳及成都5个分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

分离纯化贝达喹啉的四种异构体结核病(TB)是导致残疾和死亡的全球性流行病。据估计，世界上多达三分之一的人口感染了结核病，主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis)感染引起。由于患者停药或不正确的药物处方导致病原体突变，结核分枝杆菌对一线结核病治疗产生了多药耐药。2005 年，Andries 及其同事报告了第一种耐多药抗结核药物 TMC 207，现在被称为富马酸贝达喹啉(BDQ)，成为40年来首个抗结核特异性药物。Andries 等人进行了实验测试四种立体异构体对耐多药结核分枝杆菌菌株的活性。他们报告了每种异构体以及两种异构体的混合物对细菌生长产生 90% 抑制的浓度(IC90)。如图1所示，(R,S)和(S,R)的值分别为 0.03 和8.8μg/mL，组合后的值为 1.8μg/mL。(R,R)和(S,S)同分异构体的IC90值分别为 4.4 和 8.8μg/mL，而混合物的 IC90 值为 4.4μg/mL。这些结果表明，需要对(R,S)异构体进行优化分离，以专门治疗结核分枝杆菌。▲图1：贝达喹啉的四种异构体，及其抗结核分枝杆菌活性(IC90)本文介绍了一种利用 BUCHI Sepiatec SFC-50 仪器分离纯化 BDQ (R,S)异构体的方法。SFC 仪器与蒸发光散射检测器(ELSD)相连。为了提高生产效率，采用了堆叠注入模式。▲图2：BUCHI Sepiatec SFC-501实验条件设备 BUCHI Sepiatec SFC-50色谱柱 Chiralpak IA (4 x 100mm)流动相条件 93.7%二氧化碳、6%（50/50甲醇: 异丙醇）和 0.3%异丙胺，等度洗脱流速 5ml/min背压 150 bar柱温 40℃样品 (RS, SR)对映体BDQ进样量 285mg 叠层进样，每次 100uL检测波长 220nm2结果与讨论通过图3我们可以观察到 BDQ 的两种异构体（RS,SR）在 Sepiatec SFC-50 上能呈现有效的基线分离，并且分离时长控制在 10 分钟以内。▲图3：通过Sepiatec SFC-50以叠层进样的方式获取BDQ (R,S)异构体由于本次实验使用的色谱柱规格较小（4x100mm），不适用于大量样品（285mg）的纯化分离，因此我们采用叠层进样的方式，通过多次进样来高效获取大量目标化合物。

p 　　最新一期的Nautre Methods杂志对清华大学瑕瑜课题组和欧阳证课题组在脂类同分异构体及小型质谱技术研究中取得的进展进行了报道。长期以来，质谱小型化技术被国外研究机构所垄断，欧阳证课题组的研究为我国在质谱仪的研发与产业化领域争取到了“原创话语权”。脂类同分异构体中C=C双键位置的确定在全世界一直是难点，瑕瑜课题组利用Paternò –Bü chi反应找到了定位C=C双键的方法，为脂质组学开辟了一个全新的研究维度。 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/256c243d-6a9f-40d6-a0d8-13f84fb196f5.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体,楷体_GB2312, SimKai " Nautre & nbsp Methods杂志是Nature子刊，影响因子25.06，主要提供生命科学领域的新方法和基础研究技术重大进展的相关报道 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(79, 129, 189) " strong 根据C=C做脂质组学定性、定量分析 /strong /span /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" style=" width: 230px height: 295px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/ac5de0cd-a2ab-4b34-a39f-a9f38337697c.jpg" height=" 295" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 230" / /p p style=" text-align: center " strong 清华大学教授 瑕瑜 /strong /p p 　　瑕瑜长期从事生物质谱为基础的气相化学自由基研究，一个偶然的机会，瑕瑜课题组的马潇潇博士(现为清华大学精密仪器系助理教授)在进行光化学自由基反应时发现受激发的丙酮与脂质C=C反应的结果并没有形成断裂加成峰，而是整个丙酮加到脂质分子上去。查阅资料之后，发现这是一个已知反应Paternò -Bü chi(PB反应)。根据PB反应的机理就能够清晰地解析离子碎裂谱图从而确定C=C位置。“这个发现对确定脂质同分异构体C=C位置，以及进行脂质定量分析非常有帮助。”瑕瑜说。 /p p style=" text-indent: 2em " 从2014年发表第一篇文章起，他们将这一理论应用在了脂质组学研究中。 PB反应在鸟枪法策略中进行脂质同分异构体的定性与定量分析的研究已经取得了成功。目前，PB反应在液质联用策略中的脂质组学分析研究工作也已经完成。瑕瑜表示：“液质联用分析脂质组学能够得到更多的分子信息，应用面会更加广泛。将PB反应用在这个技术中，能够给脂质组学的发展提供更多机会。” /p p 　　 strong span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 小型质谱技术简化脂质分析工作流程 /span /strong /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" style=" width: 230px height: 295px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/e3ddfcc2-869d-4a4b-a052-469cdb80b27a.jpg" height=" 295" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 230" / /p p style=" text-align: center " strong 清华大学教授 欧阳证 /strong /p p 　　不同双键位置揭示的是不同的代谢通路，不同的发病机理，通过脂质同分异构体的定性与定量分析，可应用于临床诊断。现有的商业脂质解析数据库并不包括脂质C=C位置信息，并不能进行脂质同分异构体的定性与定量分析。目前，欧阳证与瑕瑜的研究团队正在进行基于小型质谱的包含C=C位置信息的脂质组学分析工作。“我们希望让更多做脂质组学研究的人知道这个技术，并通过建立数据库帮助到需要了解脂质C=C信息的研究。”欧阳证在谈到该数据库的建立时说，“事实上，我们将要建立的不止是一个数据库，而是包括前端液相方法、PB反应、质谱方法、数据库与软件分析在内的整体工作流程。” /p p style=" text-indent: 2em " 该工作已取得了一系列产业化成果，由欧阳证创立的清谱科技在10月份召开的BCEIA2017上推出了Mini β小型质谱仪、脂质组学双键定位系统Ω反应器以及MS Mate快速检测方案，结合了PB光化学反应的特异性、高效性以及质谱检测的特异性和灵敏度，可实现脂质中双键的快速定位、精准定量、全方位读取。此外，搭载的庞大的数据库可以实现数据检索、数据读取、报告生成一体化工作流程。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" style=" width: 400px height: 290px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/9b657d8e-0702-4f7b-a363-4b1a7a569ed6.jpg" height=" 290" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " strong Mini & nbsp β小型质谱仪 /strong /p p 　　Mini β小型质谱仪与液质联用分析脂质组学的方法相比，突破了实验室环境的束缚，其简化的工作流程，大大降低了对操作人员专业性及检测环境的要求，可在现场检测，更利于质谱脂质分析走向临床、基层。 /p p 　　更多详细内容： /p p style=" text-align: left text-indent: 2em " a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/news/20170616/222209.shtml" target=" _blank" span style=" color: rgb(79, 129, 189) " C=C位置探索思路或将发现脂质生物标志物——访清华大学瑕瑜教授、欧阳证教授 /span /a /p p style=" text-align: left text-indent: 2em " a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/news/20171013/230960.shtml" target=" _blank" span style=" color: rgb(79, 129, 189) " 十年一剑 & nbsp 欧阳证带领清谱科技推出Mini β小型质谱分析系统 /span /a /p

仪器信息网讯，2009年11月7日，由中国质谱学会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会联合举办的“2009年中国有机质谱年会”在北京成功召开，会议为期三天，出席会议人数达300人。仪器信息网作为特邀媒体也应邀参加。 　　此次质谱年会为与会代表准备了丰富的报告内容，内容涉及生命科学、医学、药学、环境科学、食品安全、毒物分析中的质谱应用研究以及质谱仪器研发的新技术、新进展等。仪器信息网将进行系列报道。 　　北京大学化学学院的袁谷教授以手性物质为研究对象，创新地选用质谱作为分析手段进行研究。 北京大学化学学院的袁谷教授 其主要做了以下几个方面工作：ESI质谱法鉴别环肽非对映异构体、环肽质谱碎裂机理研究、环肽识别乙肝病毒发卡型DNA研究、环肽识别HIV-1双链DNA研究。课题组利用ESI-MS测定了8个4对环肽非对映异构体特征离子的相对强度，成功区别了8个异构体，同时用MS鉴别了非对映异构体混合物并确定了相对含量，建立了鉴别环肽非对映异构体混合物的标准曲线和计算方法。 　　研究发现：MS/MS是鉴别异构体的有用方法 环肽分子对DNA具有识别功能 质谱是分析分子间相互作用力的好方法。

产品编号：CDGG-132647-05-1ml 名称：8种PCB异构体混标 EPA525 规格：500 mg/L于丙酮，1mL 组份信息 英文名 中文名 CAS 浓度 2-chlorobiphenyl (BZ# 1) 2-氯联苯 2051-60-7 500 +/- 25 mg/L 2,3-dichlorobiphenyl (BZ# 5) 2,3-二氯联苯 16605-91-7 500 +/- 25 mg/L 2,4,5-trichlorobiphenyl (BZ# 29) 2,4,5-三氯联苯 15862-07-4 500 +/- 25 mg/L 2,2&rsquo ,4,4&rsquo -tetrachlorobiphenyl (BZ# 47) 2,2&rsquo ,4,4&rsquo -四氯联苯 2437-79-8 500 +/- 25 mg/L 2,2&rsquo ,3&rsquo ,4,6-pentachlorobiphenyl (BZ# 98) 2,2&rsquo ,3&rsquo ,4,6-五氯联苯 60233-25-2 500 +/- 25 mg/L 2,2&rsquo ,4,4' ,5,6&rsquo -hexachlorobiphenyl (BZ# 154) 2,2&rsquo ,4,4' ,5,6&rsquo -六氯联苯 60145-22-4 500 +/- 25 mg/L 2,2' ,3,3' ,4,4' ,6-heptachlorobiphenyl (BZ# 171) 2,2' ,3,3' ,4,4' ,6-七氯联苯 52663-71-5 500 +/- 25 mg/L 2,2' ,3,3' ,4,5' ,6,6' -octachlorobiphenyl (BZ# 201) 2,2' ,3,3' ,4,5' ,6,6' -八氯联苯 40186-71-8 500 +/- 25 mg/L 现货供应 应用：EPA525 原价：2250.00元 优惠价：1575.00元 促销时间：2012-12-03至2012-12-31 上海安谱科学仪器有限公司 地址：上海市斜土路2897弄50号海文商务楼5层 [200030] 电话：86-21-54890099 传真：86-21-54248311 网址：www.anpel.com.cn 联系方式：shanpel@anpel.com.cn技术支持：techservice@anpel.com.cn

唾液酸（SA）是酸性单糖的家族名称，包括 N-乙酰神经氨酸 (NeuAc) 和 N-羟乙酰神经氨酸 (NeuGc)，主要存在于聚糖的非还原末端。是一种天然存在的碳水化合物，最初由颌下腺粘蛋白分离出，因此而得名。唾液酸通常以低聚糖，糖脂，糖蛋白的形式存在。唾液酸可以以 α2,3- 或 α2,6- 键类型存在。这样的连接异构体在生物学上很重要，因为不同连锁类型可能与各种疾病有关，例如病毒感染和癌症。 近年来，质谱技术已被广泛应用于分析聚糖。然而，鉴定含有多个唾液酸残基的复杂聚糖的唾液酸键类型仍然具有挑战性。本研究工作通过使用“SialoCapper-ID 试剂盒”进行独特的衍生化，然后进行 MALDI-8020 MS分析，从而鉴定2-氨基吡啶（PA）标记的聚糖上的酸谱系类型。 SialoCapper-ID 试剂盒是一种用于聚糖预处理的新型试剂盒，可简化获得专利的唾液酸键特异性烷基酰胺化 (SALSA 方法）步骤。SALSA通过中和残留物来防止在聚糖预处理和 MS 分析过程中唾液酸残留物的损失。此外，它允许通过以特定键的方式衍生残基来基于 MS 区分唾液酸键异构体。 SALSA法的衍生方案 本实验中，N-连接聚糖通过肼解作用从51只大鼠102只耳蜗血管纹衍生的糖蛋白中释放出来的。N-聚糖的还原端用PA标记。然后根据唾液酸的数量通过 DEAE 阴离子交换 HPLC 对 PA 标记的聚糖进行分离，并在 ODS 柱上使用反相 (RP) HPLC 进一步分离。使用酰胺柱和 LC-MS 通过正相 (NP) HPLC 分析分级的 N-聚糖，并根据二维 (2-D) HPLC 分析 (RP/NP) 的结果确定 N-聚糖的结构 和 LC/MS 分析。最后，使用 SialoCapper-ID Kit 进行唾液酸键特异性衍生化，用于未确定唾液酸键类型的分离。 在用碳芯片对 14 份 PA 标记的聚糖进行脱盐后，使用 SialoCapper-ID 试剂盒在试管中以液相反应的形式进行唾液酸键特异性衍生化。除了通过 2-D HPLC 和 LC/MS 进行结构测定外，研究者另辟蹊径，使用MALDI-8020+ SialoCapper-ID 试剂盒根据唾液酸键特异性衍生化产生的质量变化来区分唾液酸键类型。相对于LC/MS，MALDI-MS有利于轻松快速鉴定唾液酸键类型，特别是在分析多个样品时。 A1-14 组分的质谱图和唾液酸键型鉴定结果A2-16 组分的质谱图和唾液酸键型鉴定结果 MALDI-8020+SialoCapper-ID 试剂盒唾液酸结合异构体鉴定优势1 无需与标准聚糖样品的分析结果进行比较，即可识别复杂聚糖的唾液酸键类型。2 SialoCapper-ID Kit可应用于标记糖链，无需改变常规分析流程即可进行唾液酸键联分析。3 无需 LC 分离， MALDI-MS 直接鉴定唾液酸键类型。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（55dB）● 可视化工作状态 参考文献：岛津应用新闻：Sialic Acid Linkage Isomer Discrimination of N-glycansderived from Rat Cochlea using SialoCapper-ID KitM. Inuzuka, T. Nishikaze 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

近日，中国科学院烟台海岸带研究所、海洋研究所研究人员等联合起草的国家标准《虾青素旋光异构体含量的测定 液相色谱法》颁布，并将于7月1日起实施。　　《虾青素旋光异构体含量的测定——液相色谱法》（GB/T 38478-2021）由中国标准化研究院提出并归口承担，标准起草工作组专家主要来自烟台海岸带所、海洋所、中国标准化研究院、山东省标准化研究院、中科院过程工程研究所等单位。该标准从起草制定到颁布，历经6年，起草任务列入国家标准化管理委员会计划项目课题，由烟台海岸带所研究员秦松团队承担。　　该标准主要包括八部分内容，对测定范围、原理、试剂材料、仪器设备、不同样品的提取方法和酶解与测定条件与步骤、计算方法、重复性、限量和标准图谱等进行了详细阐述与约定。标准的制定和颁布实施，将规范虾青素产品分析测定操作流程，可为国内虾青素生产企业实现标准化规模生产提供技术支撑。同时，也有利于企业与管理部门在产品质量控制管理的协调统一，使我国虾青素产品质量监督有标准可依。

随着改变生命的治疗方法的出现，生物制药的未来前景广阔，2018 年的诺贝尔奖更是授予了免疫检查点疗法，基于这一疗法的 PD-1 正在拯救更多癌症病人的生命，推动这些新型生物治疗药物安全地应用于临床需要可靠的生产和质量控制过程。生物治疗药物复杂的异质性需要借助准确而稳定的分析检测方法进行分析，并需要可靠的色谱分离。鉴定关键质量属性(CQA) 是实施质量源于设计 (QbD) 原则以开发和生产生物药物的过程中最困难的一步。定义各种产品属性极具挑战性，因此，产品质量的一致性变得更加重要。滴度测定、糖链分析、电荷异构体分析、氨基酸和培养基分析、肽谱分析、聚集体分析、完整蛋白和亚基分析都是关键质量属性重要的技术，然而想要成功地获取最佳的实验结果，需要操作者能切中要害，找到关键之处，让我们也一起来“划重点”说一下这些技术的难点以及关键所在。滴度测定技术应用滴度测定是对于单克隆抗体，最有效的滴度测定方法之一是亲和色谱法。选择 Protein A 或Protein G 色谱柱时，首先要考虑的是待纯化或分析的目标蛋白质，再选择合适的流动相和样品方法。实验痛点您可能并没有注意到洗脱液对基线噪音以及色谱柱寿命的影响，也并不清楚如何最大程度延长这些“有生命”的色谱柱寿命，然而这正是容易被您忽视的关键所在。快速有效的糖链分析技术应用翻译后修饰( PTM )可能形成许多不同类型的异构体。糖基化尤其高度可变，而糖基化对于许多蛋白质的功效具有重大影响。FDA 认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹谱提供了指导。实验痛点如何获取难分离糖链结构的最佳分离度？为此具体的方法条件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的选择？仪器的选用？柱温、流动相、 FLD、进样量等应如何选择和设置？不仅如此，如何能够快速的获取有效的实验结果是整个方法优化的痛点所在。电荷异构体分析技术应用离子交换色谱可以分离一些电荷异构体，特别是那些位于蛋白质表面（而不是隐藏在结构内）的电荷异构体。由于大多数蛋白质所含的碱性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多数电荷异构体分离需要采用阳离子交换。实验痛点从离子交换 ( IEX ) 色谱的使用、色谱柱选择，流动相的重要注意事项、到IEX 的一般使用经验规则都是电荷异构体分析能否成功的关键，不仅如此，在操作中还有若干仪器注意事项，所以此项分析需要注意的关键点会非常多，需要操作者根据电荷异构体的不同情况，具体问题具体分析。氨基酸和培养基分析技术应用氨基酸和培养基分析主要用于确定蛋白质的氨基酸组成与其他技术一起使用以确认正确的结构。氨基酸也是用于制备重组蛋白质的细胞培养基中的关键成分。氨基酸本身属于两性离子，并具有各种侧链，它们还缺少合适的UV 发色团，使得分离和检测氨基酸非常具有挑战性。实验痛点如何实现所有常见氨基酸的基线分离并确保符合欧洲药典的系统适用性，这是非常挑战实验员操作水平的。肽谱分析技术应用肽谱分析是一项强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构基团的精确位置。使用这种方法，蛋白质将被分解成单独的片段，然后将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰与分析软件预测的预期片段相关联。实验痛点要成功生成肽谱，需仔细检查完整的表征策略。其中样品前处理对于成功的肽谱分析至关重要，这可能是一个耗时的过程，可能需要针对待酶解的各种蛋白质优化多个步骤。然而打好基础熟练掌握肽谱分析流程的基本技术才是成功的第一步，此外，进行肽谱分离优化时需要注意诸如覆盖率等事项，才能尽可能获得最佳结果。聚集体分析技术应用体积排阻色谱是特别适合从高阶聚集体中分离单体峰的技术之一。随着技术发展，人们将目光投向了除单克隆抗体以外的蛋白质药物。抗体药物偶联物等更为复杂分子的聚集体表征可能更具挑战性，因为疏水性细胞毒性药物的存在可能导致许多体积排阻色谱柱无法发挥理想性能。使用可显著降低次级相互作用风险的新型固定相，将非常适合聚合物的快速分离和定量。实验痛点聚集体分析中，如何确保稳定可靠运行SEC分析，使用何种条件才能确保分析过程中蛋白质稳定，以及怎样维护这一易耗品，是该分析获取有效实验结果的关键。完整蛋白和亚基分析技术应用完整蛋白和亚基分析可以用来比较生物仿制药与原研药。在反相条件下，分子很可能发生变性。样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白和亚基分析的精确质量数。实验痛点如何考虑选择完整蛋白和亚基分析色谱柱的多个相互关联因素：样品分子量和最适合的填料孔径，色谱柱固定相，流动相条件，以及速度或通量要求等。这些都是完整蛋白和亚基分析的关键。如果您希望提高上述所有分析的分析效率、方法稳定性和分析结果的可靠性，安捷伦已经为您准备了最新最全版本的《安捷伦生物色谱住关键质量属性应用文集》，内容包括从样品前处理到获取最佳实验结果的全部操作流程和技术干货指导以及相关的仪器及耗材选择攻略。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

毛细管电泳技术在蛋白药物研发和质量控制中的发展 随着蛋白药物的开发热潮在全球兴起，毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）作为一种新兴的研发和质控的分析技术也越来越受到各大生物制药公司的青睐和法规机构的重视。全球大部分生物制药公司均已使用毛细管电泳系统用于蛋白药物的研发及质量控制分析。从培养基优化、克隆筛选、配方稳定性研究和纯化过程监测，到蛋白表征、相关杂质检测、蛋白结构鉴定和蛋白质药物产品的质量控制，蛋白药物的各个环节都需要使用到毛细管电泳。例如蛋白的纯度测定，已经从SDS-PAGE转变为十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（CE-SDS）方法；蛋白质的等电点测定，毛细管等电聚焦(CIEF)比传统胶条方法更为准确；糖蛋白药物的糖基异质性表征，毛细管电泳是高分辨率分析方法之一。在各国药典中，毛细管电泳技术用于蛋白药物的检测方法也不断丰富与发展。药典中最早出现其对蛋白药物检测方法是促红细胞生成素(EPO)的糖异构体测定。糖蛋白的异构体差异小，普通的分析方法很难将EPO中的多种异构体分离定量。欧洲药典和美国药典将毛细管电泳方法确定为EPO异构体分析的标准，解决EPO产品中各种糖基化异构体的分离和定量问题。此外，生长激素的相关杂质检测标准也采用了毛细管电泳的方法。对于单克隆抗体药物的分析，在2006年，由惠氏、安进、基因技术、礼来、辉瑞、强生及加拿大卫生署等十几个实验室对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了联合验证。他们对方法的稳定性、可靠性、准确性等多方面进行了研究和考察。研究结果表明CE-SDS方法比传统的SDS-PAGE更适合单抗药物的表征与质量控制，其结果的稳定可靠性要远远超过SDS-PAGE，建议各生物制药公司使用CE-SDS代替原有的SDS-PAGE作为研发与质量分析的平台。随后，上述生物制药公司及机构又针对“CIEF方法进行单抗药的等电点测定及电荷异质性分析”、“CZE方法快速分析单抗药的电荷异质性”，“毛细管电泳技术进行单抗药中的糖基分析”进行了多实验室联合验证，结果展现了CE技术用于单抗药质量控制的优势及可行性。美国药典于2013年发布了利妥昔和曲拓珠等单克隆抗体药物的纯度检测、等电点/电荷异质性分析和糖基分析采用毛细管电泳方法。在中国，中国食品药品检定研究院于2012年联合国内外生物制药机构对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了验证，确认了CE-SDS方法在分辨率、定量准确性及自动化程度等方面的优势，并指出CE可以对单抗非糖基化重链进行准确定量。基于以上工作以及毛细管电泳技术在单抗药分析中的强大优势，中国药典2015版的第三部中增加了CE技术，明确了CE是单克隆抗体药物大小变异体、电荷变异体、鉴别与一致性和糖基化修饰分析中的重要方法。随着CE技术在生物制药领域的快速发展，以及新的蛋白质药物的不断上市，将会有更多的CE方法出现在各国药典中。毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用（1）单克隆抗体药物的纯度及大小异质性分析SDS-PAGE方法对单抗药物进行纯度分析，在分辨率、定量准确性和自动化程度上，已经不能满足生物制药研发和质量控制的要求。CE-SDS方法基于蛋白分子量的差异分离，用于还原和非还原单抗药物的纯度分析，免去了复杂的人工操作、定量更加准确，具有更高的分辨率，在还原模式中可对非糖基化重链进行分离和准确定量。图1. CE-SDS对还原单克隆抗体药物的纯度分析[1]选用不同的毛细管长度，可以实现高分辨率模式和快速模式的纯度分析。高分辨模式的CE-SDS方法提供最高的分辨率，快速模式的CE-SDS方法提供更短的冲洗和分离时间，提高了分析的通量。CE-SDS结合激光诱导荧光检测器（CE-SDS-LIF），通过5-Tarma或FQ染料对蛋白进行标记，可以获得更高的灵敏度，可以检测到含量在0.01%的杂质碎片。此外，LIF检测器的使用，可以最小化基线波动，使积分和定量更加准确。（2）单克隆抗体药物等电点的测定和电荷异质性的分析单抗药物在结构上会发生糖基化、脱酰胺化、异构化、氧化等翻译后修饰，造成蛋白表面电荷的改变，引起单抗的电荷异质性。每个变异体具有不同的等电点。基于等电点分离的毛细管等电聚焦技术(cIEF)，可以对单抗药物的变异体进行高分辨率的分离和定量，可分离0.03个pI差异的变异体。方法使用等电点Marker制作校准曲线，对变异体的等电点进行准确的测定。是单抗药物等电点测定和电荷异质性分析的重要方法。图2. CIEF方法对单克隆抗体药物的等电点和电荷异质性分析[5]针对不同pI范围的蛋白样品，可以通过选用适当的两性电解质来实现高分辨率的分析。如对于大部分单抗，其pI值位于7-10之间，可使用pH 3-10范围的两性电解质；对于pI 在5-7范围内的蛋白样品，可使用pH 5-8的窄范围两性电解质；而对于pI 小于5的酸性蛋白，则可以使用反向聚焦和迁移模式，实现更好的分析。 （3）CZE方法对单克隆抗体药物电荷异质性的快速分析毛细管区带电泳（CZE）基于分析物电荷/体积的比进行分离，是毛细管电泳技术中最简单、快速的模式。由于单抗药物的各个变异体分子体积近乎相同，因此在CZE分离模式中，电荷变异体的分离取决于表面电荷的差异，与CIEF模式的变异体分离相一致。因此，CZE成为快速电荷异质性分析的平台方法被生物制药行业所使用。此外，由于CZE方法简单快速的特点，它也被用于单抗药的鉴别分析中。图3. 同一种CZE方法对23种单抗药物的电荷异质性分析[3]（4）单克隆抗体药物的糖基异质性分析单克隆抗体等糖蛋白药物中，糖基的种类和排列顺序会导致糖基异质性。单抗药物的糖基化修饰对其安全性和药效有着很大的影响。因此对糖基异质性的质量控制十分重要。毛细管电泳方法对糖基异质性分析的流程包括糖蛋白中糖基的释放、糖基的标记和毛细管电泳分离。磁珠辅助的糖基释放和标记，使得前处理可在1小时内完成，加快了前处理的时间。采用APTS作为荧光标记物，不仅可以通过增加电荷提高分离效率， 还通过LIF检测实现了高灵敏的糖基分析。毛细管电泳技术对糖基分析的优势在于分辨率高，速度快。不但可以区分出一个糖基的差别，相同分子量的糖基异构体也可以得到分离，整个分离过程可在5-20分钟内完成。图4. CE-LIF方法对单抗药糖基分析的电泳图毛细管电泳技术在重组蛋白类药物分析中的应用重组人促红细胞生成素（rhEPO）是高度糖基化的蛋白药物。糖基化的异质性导致了多种变异体的存在。采用CZE方法可对EPO的变异体进行分离和定量，该方法已经成为欧洲药典中EPO变异体分析的标准方法。此外，CIEF方法也可以实现对EPO中各个变异体的高分辨分离，不但可以获得与CZE方法相同的变异体数目和定量信息，还可以提供每个变异体的精确的等电点数值。在对不同来源的EPO产品与参考品的比较中，可使用等电点对变异体进行鉴定。图5. CZE方法对EPO变异体的分析重组人生长激素（rhGH）的纯度及异质性分析中，CZE方法分离度高、定量准确，也已为欧洲药典所采用。图6 CZE方法对rhGH的电荷异质性分析总结在蛋白药蓬勃发展的今天，毛细管电泳技术以其分辨率高、模式多等优势，在蛋白药研发和质控的过程中起到了不可或缺的作用，被越来越多的企业和监管机构所认可，用于蛋白药的纯度、等电点及电荷异质性、糖基等分析中。随着蛋白药物、细胞/基因治疗以及新型疫苗等生物制品的不断发展，毛细管电泳技术将会具有更大的应用空间，在蛋白、核酸及病毒颗粒等分析中，发挥它的优势，提高生物制品的质量控制标准。

2018 年，关于肿瘤免疫的那些事儿6 月：国内首款 PD-1 单克隆抗体药物获批，中国跨入肿瘤免疫时代10 月：诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯艾利森 (James Allison) 与日本科学家本庶佑 (Tasuku Honjo) ，以表彰他们在癌症免疫治疗方面所做出的贡献12 月：国内首款国产 PD-1 单克隆抗体药物获批，开启肿瘤免疫治疗“亲民”时代肿瘤免疫治疗的火爆让单克隆抗体药物（下文简称单抗）的研究越来越受到关注，今天我们就来聊聊单抗的一大特性——电荷异质性。抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白，而单抗是由单一 B 细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。同其它蛋白一样，单抗常常存在广泛的翻译后修饰和降解，如糖基化、碳端赖氨酸丢失、脱酰胺化、二硫键错配、糖化和氧化等。几乎这些所有的翻译后修饰都会直接或间接的引起单抗表面电荷的变化，这就是单抗的电荷异质性。电荷异质性影响单抗的体外及体内的活性、安全性、可行性和质量，在新药研发和生物类似药的开发中都非常重要。电荷异质性的检测通常采用基于电荷分离的技术手段，如离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。与主峰 (Main peak) 相比，这些变异体峰通常被称为酸性峰 (Acidic variants) 和碱性峰 (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有碱性的等电点，因此，阳离子交换色谱通常被用于分离。在主峰前面的峰通常称为酸性峰，因为其带有的正电荷较少，洗脱较快；在主峰后面的峰称为碱性峰。酸碱峰的鉴定采用离线收集鉴定或多维液相-质谱联机在线鉴定。图 1. 阳离子交换色谱分离酸碱峰示例图毛细管等电聚焦（CIEF）是电荷异质性表征的主要手段，但采用 CIEF 分离时收集馏分用于鉴定非常困难，所以 CIEF 通常用于监控电荷异质性而不能用于表征。质谱检测虽然广泛应用于单抗的表征，但是将 CIEF 和 MS 联机一直是非常大的挑战。质谱在线检测的缺失也限制了 CIEF 在蛋白电荷异质性的表征上的应用。将 CIEF 分离的高分辨特性和质谱的表征能力结合起来是电荷异质性表征迫切需要的技术。Agilent 7100 CE-QTOF 联机的特点无与伦比的毛细管分离的分辨率：甘油改性剂降低非 CIEF 电泳迁移和区带展宽两性电解质：兼顾电泳分辨率和质谱灵敏度质谱友好的阳极液和阴极液优化的鞘流液组成：有效的聚焦、迁移和电喷雾离子化纳流级别的鞘流液流速：基于电渗流技术的纳流鞘流液最大限度提高检测灵敏度优化的 CIEF 运行参数：进样量、电场强度、压力灵敏度高、抗污染的质谱：Agilent 6200 系列 TOF，6500 系列 Q-TOF图 2. Agilent 7100 CE-QTOF 联机图CIEF-MS 的方法可行性及卓越表现采用等电点标记物（pI markers）进行验证，等电点和迁移时间之间具有良好的线性相关性 (R^2=0.99)。此外，CIEF-MS 方法采集的四种单抗的电荷变异体分离的轮廓图也通过成像毛细管等电聚焦紫外方法比对验证一致。pI markers 的绝对迁移时间的相对标准偏差小于 5%（n=4）。贝伐单抗三次进样的相对迁移时间 RSD 小于 1%，绝对迁移时间小于 2.3%，峰面积的 RSD 小于 7%。并且，单抗的电荷变异体可通过质谱直接测得其分子量。CIEF-MS 采集的电荷变异体轮廓分布和 iCIEF-UV 检测具有高度的一致性。iCIEF-UV 通过全柱成像检测去除了等电聚焦后分析物迁移到检测器端的步骤，CIEF-MS 和 iCIEF-UV 检测结果的高度一致性证明了在线 CIEF-MS 分析单抗电荷变异体史无前例的高分辨率。除了高分辨率之外，该方法具有非常好的重现性。CIEF-MS 电荷异质性分析的应用实例大集结贝伐珠单抗的分析CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸碱峰比例接近，分别为酸性峰: 主峰: 碱性峰= 23% : 72% : 5% 和 27% : 68% : 5%。除了 CE 的高分离度之外，质谱数据优异的原始谱图是实验分析制胜的关键，尤其是在鉴定跟主峰质量差别很小的变异体时，如在分析一个脱酰胺 (+1Da) 质量差时，一款性能优异的质谱是 CIEF-MS 分析的必备之选。贝伐珠单抗的主峰分子量为 149 202 Da，碱性峰 B1 和主峰之间的质量差为 +128 Da，和碳端赖氨酸 (+128 Da, +1K) 异质性匹配；碱性峰 B2 (?=-17Da) 和氮端焦谷氨酸环化修饰 (-17Da) 匹配；酸性峰 A1 (?= 1Da) 和脱酰胺修饰匹配。酸性峰 A1 和主峰只有 1 Da 的质量差别，虽然我们会担心质谱准确度因素带来的不确定性，但酸性峰的位置和正好 1 Da 的质量差让我们有理由相信酸性峰 A1 是脱酰胺的修饰峰。A2 峰的信号非常弱，可能是高糖基化修饰的峰。图 3. 贝伐珠单抗 CIEF-MS 分析结果图曲妥珠单抗的分析曲妥珠单抗和贝伐珠单抗的电荷异质性分布的差异较大。iCIEF-UV 测得的低含量碱峰在CIEF-MS上未检出，同时其对酸峰的分离效果也优于 CIEF-MS 分离。质谱检测结果清晰的展示了酸性峰中四种主要的糖型变异体。曲妥珠单抗的主峰分子量为148 224 Da，酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脱酰胺修饰匹配，并且和 2D CZE-MS 的结果一致。图 4. 曲妥珠单抗 CIEF-MS 分析结果图英夫利昔单抗的分析英夫利昔单抗的三个电荷变异体峰在 CIEF-MS 上有良好的分离。解卷积结果显示两个碱峰为碳端赖氨酸变异体，碱性峰 B1 (?m = +258 Da) 和两个赖氨酸匹配；碱性峰 B2 (?m = +129 Da) 和一个赖氨酸匹配；酸性峰 A (?m = +5Da) 小的质量偏差显示其可能为脱酰胺的修饰。图 5. 英夫利昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗的分析西妥昔单抗是人鼠嵌合的 IgG-1 单抗，具有高度的微观不均一性，该特性主要源于高度复杂的糖基化修饰。西妥昔单抗重链的 Fab 和 Fc 上各有一个糖基化位点，同时有碳端赖氨酸的不完全剪切，这些高度的异质性会造成分离上的困难。采用 CIEF-MS 实现了八个电荷变异体的良好分离，不仅和 iCIEF-UV 的结果一致，同时也和文献报道一致。但是由于西妥昔单抗复杂的糖基化修饰，通过质谱获得的分子量信息不足以反应修饰的情况。图 6. 西妥昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗亚基水平的分析针对西妥昔单抗这类具有复杂异质性的抗体，通过 IdeS 酶切和 DTT 还原降低其复杂程度，更利于质谱检测。通过高分辨质谱检测，IdeS 酶切后的八个变异体峰及 IdeS 酶切同时 DTT 还原后得到的 11 个变异体都得以检测。研究发现，西妥昔单抗的电荷异质性主要源于 Fc 区末端赖氨酸的异质性、Fd’ 区 N-羟乙酰神经氨酸和可能存在的脱酰胺修饰。轻链上未发现有电荷异质性。图 7. 亚基水平 CIEF-MS 分析流程图安捷伦 CE-QTOF 解决方案不仅兼顾了毛细管电泳的高效分离，离子源接口的高灵敏度和高分离度，也实现了质谱的高灵敏高分辨检测。在完整蛋白分析的层次上增加亚基水平的解决方案，即使是具有高度复杂异质性的抗体分析也能轻松应对。访问安捷伦药典系列文章，了解更多信息。参考文献：1. 安捷伦应用文献 5994-0672EN2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6 90(3):2246-22543. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations1，文章的通讯作者是来自印第安纳大学化学系的Jarrold, Martin F.教授。　　腺相关病毒(AAV)是一种小的(26纳米)、无包膜二十面体病毒。由于其低免疫原性和高组织亲和性，AAV已成为一种很有前途的基因治疗载体。AAV衣壳包含三种病毒蛋白质，VP1、VP2和VP3。对于来自HEK细胞的重组AAV (rAAV)，VP1-3的比例约为1:1:10。AAV包裹单链(ss)DNA基因组。野生型基因组的长度约为4.7 kB。基因组两侧有两个倒置末端重复序列(ITRs)，它们在复制和基因组包装中起着重要作用。目前，主要用于rAAV研究的生产平台是人HEK293细胞的瞬时转染，然而其HEK293细胞的制造限制其大规模地用于AAV载体的生产。杆状病毒感染的Sf9细胞系已被发现是一种可行的生产方法，但是研究发现在生产过程中出现的ITR丢失和基因组截断现象，似乎成为了Sf9细胞系必须关注的一个问题。因为包裹着不完整的基因组的载体，会使得治疗的有效性降低。　　在本研究中，作者提出了一种利用电荷检测质谱(CDMS)直接检测从AAV中提取的DNA的方法。CDMS可以使用静电线性离子阱(ELIT)同时检测单个粒子的电荷数和质荷比，从而直接获得粒子的质量。测量是在一个自制的仪器上进行的，简单地说，纳喷雾(Advion Triversa Nanomate)产生的离子通过金属毛细管进入仪器，然后通过几个不同真空区域。第一个区域包含FUNPET(an ion-funnel ion-carpet hybrid)，随后是射频六极杆和分段射频四极杆。FUNPET会破坏气体通过毛细管时形成的气体射流，样品离子随即在六极杆中被热化，最终的离子能量由六极杆上的直流电位决定。离子束在分段四极杆中的径向分布被压缩，经过四极杆的离子通过非对称艾泽尔透镜聚焦到双半球形偏转能量分析器中，并设置传输具有较窄动能分布的离子(以100 eV/z为中心)。传输的离子被聚焦到ELIT中，其中一些离子被捕获并通过位于ELIT端帽之间的检测圆筒来回振荡。振荡离子产生的信号被电荷敏感放大器接收。信号被放大和数字化，然后用快速傅里叶变换(FFTs)进行分析。短时间窗口FFT通过每个捕获事件的信号进行转换，以确定离子是否在整个事件中被捕获。没有在整个事件中存活的离子信号将被丢弃。振荡频率与m/z有关，振幅与电荷成正比。用这种方法测量了数千个离子，并将其分成直方图以给出质量分布。　　　　图1. 来自Sf9细胞的AAV8-CMV-GFP的CDMS测量。(a,b)未孵育样品的质量分布和电荷与质量散点图。电荷与质量散点图中的橙色线是球形离子瑞利电荷极限的预测。(c,d)在45°c孵育15分钟后测量的质量分布和散点图。(d)中的插图显示了基因组从衣壳挤出的示意图。(e,f) 80°C孵育15 min后的结果。绿色虚线表示释放的ssDNA GOI的序列质量，紫色虚线表示互补DNA链碱基对进入溶液后的序列质量。图1第一排的图片显示了用CDMS测量的Sf9细胞制备的AAV8-CMV-GFP的质量分布。在4.5MDa处的主峰是由于rAAV对GOI进行了包装，在5.2MDa处的峰值是由于异质DNA的包装达到了包装容量，在3.7处MDa的肩峰是由于空颗粒。对应的电荷-质量散点图如图1第二排所示。其中空颗粒和包装了DNA的颗粒在电荷上的数值比较接近是因为DNA被包裹到了衣壳的内部。图1c显示了AAV8-CMV-GFP在45°C孵育15min后测量的质量分布。rAAV已经开始分解，存在大量质量低于3 MDa的离子。在3.7 MDa处的空颗粒的数量也大幅增加，这表明基因组正在被释放。而在80℃孵育15min后可见AAV已经完全分解，对应峰也消失了，而剩下的峰与推测的互补DNA链的分子量相当。图2显示了培养后为提取GOI而测量的rAAV载体的CDMS质量分布和电荷-质量散射图。值得注意的是，AAV8-CMV-CRE和AAV8-CAG-GFP(来自Sf9细胞)的平均电荷约为400 e, AAV8-CMV-GFP(来自HEK细胞)的平均电荷约为900 e。平均电荷的差异可能反映了dsDNA的整体几何结构，电荷越高的GOIs具有更广泛的结构。　　　　图2. 在80°C孵育15分钟后记录的代表性质量分布和电荷与质量散点图。结果显示AAV8-CMV-CRE、AAV8-CAG-GFP和AAV8-EF1a-GFP来源于Sf9细胞，AAV8-CMV-GFP来源于HEK细胞。紫色虚线显示dsDNA GOI的序列质量。插图显示了dsDNA GOI的峰值的扩展视图。图3a显示了测量到的dsDNA GOI与AAV样本序列质量的偏差的柱状图，对于大多数AAV样本，测量的dsDNA GOI大于序列质量。这种偏差可以用反离子来解释。DNA在中性溶液中带负电荷，因为它的一些主链磷酸被电离，dsDNA GOI有2219−3443个碱基对，因此它们可能有多达4438−6886个反离子。最可能的反离子是NH4+因为样品是用醋酸铵溶液电喷涂的。如果所有的dsDNA GOI主链磷酸都被电离并且有NH4+反离子，则附加质量(超出完全电离序列质量)为80 ~ 124 kDa。而有些dsDNA的分子量低于预测的序列质量，这是因为序列发生了截断导致的，图3d显示了为该样品测量的DNA峰值的扩展视图。峰宽可以提供截断分布的信息。如果所有的DNA链都损失了425 nt，峰值就会很窄。另一方面，如果截短长度分布较宽，则会产生较宽的峰值。图3d中的峰值相对较窄，说明分布较窄。有一个高质量拖尾，这可能表明一些基因组被截断了小于425 nt。　　　　图3. 来自Sf9和HEK细胞的一系列GOIs的AAV8、AAV9和AAVDJ血清型的dsDNA质量测量总结。(a)测量质量与序列质量偏差的柱状图。(b)考虑反离子的测量质量与预期质量的偏差的柱状图。(c) AAV基因组结构示意图。(d)来自HEK细胞的AAV8-CMV-CRE的dsDNA GOI峰的扩展视图。最后，将CDMS测量的基因组截断与来自第三代测序方法的信息进行比较将具有指导意义。尽管CDMS测量可以判断基因组是否被截断以及缺失的数量，但它不能确定截断发生在哪里。关于截断发生位置的信息可以从第三代测序中获得，这些信息反过来可以深入了解其机制。因此，CDMS测量全基因组MW和第三代测序是互补的。CDMS测量可用于筛选截断的基因组，以便通过第三代测序进行后续深入分析。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Barnes, L. F. Draper, B. E. Kurian, J. Chen, Y. T. Shapkina, T. Powers, T. W. Jarrold, M. F., Analysis of AAV-Extracted DNA by Charge Detection Mass Spectrometry Reveals Genome Truncations. Analytical Chemistry, 4310-4316.

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 随着改变生命的治疗方法的出现，生物制药的未来前景广阔，2018 年的诺贝尔奖更是授予了免疫检查点疗法，基于这一疗法的 PD-1 正在拯救更多癌症病人的生命，推动这些新型生物治疗药物安全地应用于临床需要可靠的生产和质量控制过程。生物治疗药物复杂的异质性需要借助准确而稳定的分析检测方法进行分析，并需要可靠的色谱分离。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/6d173e0c-2823-4042-81c7-8cb61da8ed57.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 442" height=" 312" style=" width: 442px height: 312px " / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 鉴定关键质量属性(CQA)& nbsp 是实施质量源于设计& nbsp (QbD)& nbsp 原则以开发和生产生物药物的过程中最困难的一步。定义各种产品属性极具挑战性，因此，产品质量的一致性变得更加重要。滴度测定、糖链分析、电荷异构体分析、氨基酸和培养基分析、肽谱分析、聚集体分析、完整蛋白和亚基分析都是关键质量属性重要的技术，然而想要成功地获取最佳的实验结果，需要操作者能切中要害，找到关键之处，让我们也一起来“划重点”说一下这些技术的难点以及关键所在。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 滴度测定 /strong /span /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 滴度测定是对于单克隆抗体，最有效的滴度测定方法之一是亲和色谱法。选择 Protein A 或Protein G 色谱柱时，首先要考虑的是待纯化或分析的目标蛋白质，再选择合适的流动相和样品方法。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 您可能并没有注意到洗脱液对基线噪音以及色谱柱寿命的影响，也并不清楚如何最大程度延长这些“有生命”的色谱柱寿命，然而这正是容易被您忽视的关键所在。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 快速有效的糖链分析 /span /strong /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 翻译后修饰( PTM )可能形成许多不同类型的异构体。糖基化尤其高度可变，而糖基化对于许多蛋白质的功效具有重大影响。FDA 认为这是一项重大挑战，并就如何确定糖指纹谱提供了指导。 br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 如何获取难分离糖链结构的最佳分离度？为此具体的方法条件都包含什么？例如，A 柱和 B 柱的选择？仪器的选用？柱温、流动相、 FLD、进样量等应如何选择和设置？不仅如此，如何能够快速的获取有效的实验结果是整个方法优化的痛点所在。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 电荷异构体分析 /span /strong /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 离子交换色谱可以分离一些电荷异构体，特别是那些位于蛋白质表面（而不是隐藏在结构内）的电荷异构体。由于大多数蛋白质所含的碱性氨基酸多于酸性氨基酸，因此大多数电荷异构体分离需要采用阳离子交换。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从离子交换 ( IEX ) 色谱的使用、色谱柱选择，流动相的重要注意事项、到IEX 的一般使用经验规则都是电荷异构体分析能否成功的关键，不仅如此，在操作中还有若干仪器注意事项，所以此项分析需要注意的关键点会非常多，需要操作者根据电荷异构体的不同情况，具体问题具体分析。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 氨基酸和培养基分析 /span /strong /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 氨基酸和培养基分析主要用于确定蛋白质的氨基酸组成与其他技术一起使用以确认正确的结构。氨基酸也是用于制备重组蛋白质的细胞培养基中的关键成分。氨基酸本身属于两性离子，并具有各种侧链，它们还缺少合适的UV 发色团，使得分离和检测氨基酸非常具有挑战性。 br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 如何实现所有常见氨基酸的基线分离并确保符合欧洲药典的系统适用性，这是非常挑战实验员操作水平的。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 肽谱分析 /span /strong /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 肽谱分析是一项强大的技术，可用于全面鉴定蛋白质的一级结构，还能够区分蛋白质内异构基团的精确位置。使用这种方法，蛋白质将被分解成单独的片段，然后将这些物质分离成经典的“指纹”色谱图。将分离与质谱检测相结合，能够将肽谱分析色谱图中观察到的实际的峰与分析软件预测的预期片段相关联。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要成功生成肽谱，需仔细检查完整的表征策略。其中样品前处理对于成功的肽谱分析至关重要，这可能是一个耗时的过程，可能需要针对待酶解的各种蛋白质优化多个步骤。然而打好基础熟练掌握肽谱分析流程的基本技术才是成功的第一步，此外，进行肽谱分离优化时需要注意诸如覆盖率等事项，才能尽可能获得最佳结果。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 聚集体分析 /strong /span /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 体积排阻色谱是特别适合从高阶聚集体中分离单体峰的技术之一。随着技术发展，人们将目光投向了除单克隆抗体以外的蛋白质药物。抗体药物偶联物等更为复杂分子的聚集体表征可能更具挑战性，因为疏水性细胞毒性药物的存在可能导致许多体积排阻色谱柱无法发挥理想性能。使用可显著降低次级相互作用风险的新型固定相，将非常适合聚合物的快速分离和定量。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 实验痛点 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 聚集体分析中，如何确保稳定可靠运行SEC分析，使用何种条件才能确保分析过程中蛋白质稳定，以及怎样维护这一易耗品，是该分析获取有效实验结果的关键。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 完整蛋白和亚基分析 /strong /span /p p /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 技术应用 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 完整蛋白和亚基分析可以用来比较生物仿制药与原研药。在反相条件下，分子很可能发生变性。样品保留在色谱柱上得到浓缩，且适用于质谱分析。因此，该技术适用于测定完整蛋白和亚基分析的精确质量数。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 实验痛点 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 如何考虑选择完整蛋白和亚基分析色谱柱的多个相互关联因素：样品分子量和最适合的填料孔径，色谱柱固定相，流动相条件，以及速度或通量要求等。这些都是完整蛋白和亚基分析的关键。 /p

蛋白新药的设计得益于重组DNA技术的发展。融合蛋白是指通过基因融合两个或更多蛋白质结构域来创造一个具有新功能的嵌合蛋白。每个融合体的功能通常分为一个载体结构域和一个效应结构域，前者有助于提高稳定性和药代动力学，后者具有从细胞毒性到识别和结合等不同的功能。截至2019年，已有11种Fc融合蛋白疗法被FDA批准。 生物制药的电荷变异体（电荷异质性）来自翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和脱酰胺化，须在整个生产过程中密切监测，因为它可能影响产品的安全性和有效性。全柱成像毛细管等电聚焦（icIEF）已被证明有诸多良好检测性能特征，如高分辨率、自动化、定量准确、重现性好和易用性。凭借这些优势，它已成为生物制品，特别是单克隆抗体电荷变异体表征的主流技术。 与单克隆抗体等传统生物药相比，融合蛋白的电荷异质性差异更大，这使得表征融合蛋白成为一个挑战。建立一种适用于分析多种融合蛋白的平台方法可以方便方法开发并且简化生产流程。2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术的双通道（紫外&自发荧光）表征9种融合蛋白药物的电荷异质性，其中6种蛋白为商业化蛋白。紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料。 结果表明，icIEF方法可用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析。该方法快速、准确、重复性好，为保障融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种可靠的平台分析方法。9种融合蛋白9种融合蛋白治疗剂（在本研究中被命名为样品1-9），其中6种已商业化，包括：样品1：安进公司的依那西普；样品2：百时美施贵宝公司的阿巴泰普；样品3：再生元公司的阿夫利贝特；样品5：重组人肿瘤坏死因子-α受体II：海正药业的IgGFc融合蛋白；样品6：嘉宏药业的康柏西肽；样品7：百时美施贵宝的贝拉塔塞普；三个样品正处于不同临床试验阶段，包括VEGFR-Fc融合蛋白样品4，血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白样品8和胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白样品9。结果通用稳定剂SimpleSol 大多数融合蛋白在传统电聚焦凝胶电泳（IEF）分析过程中会聚集或沉淀，需要添加剂来保持稳定性。尿素已被证明可以减少蛋白质聚集，并提高IEF分析的重复性。因为本研究的目的是开发一个平台方法，所以需要确定一种能在多种融合蛋白中发挥作用的稳定剂。为此，研究人员比较了尿素和商业稳定剂SimpleSol（来自ProteinSimple）对三种不同的融合蛋白治疗剂（样品1-3）的影响。 在没有稳定剂的情况下，样品1在电泳分析过程中发生聚集，形成不可重复的峰型（图1）。在加入2M尿素的情况下，样品1的峰型重复性得到提升。然而，在有尿素的情况下，峰高明显降低，约为无尿素情况的25%。相比之下，当样品1在含50%的SimpleSol的体系下进行分析时，峰型变得可重复，而且峰高和分辨率都保持不变（图1）。因此，对于样品1，SimpleSol比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。图1 对于样品2，在没有添加稳定剂的情况下也观察到了聚集现象，导致了峰型的不可重复（图2）。与样品1不同，加入2M尿素并没有改善峰型的分离。只有当加入4M尿素时，峰型才变得可重现。然而，在这两种条件下，峰高和分辨率也都明显降低。在SimpleSol的存在下，峰高和分辨率都得到了保持（图2），再次证明SimpleSol在稳定样品方面优于尿素。对于样品2，SimpleSol同样比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。数据表明，SimpleSol可以作为一种通用的蛋白质稳定剂用于融合蛋白的icIEF分析方法。图2紫外吸收和自发荧光双通道检测 在紫外吸收检测模式下研究人员分析样品1，样品峰从嘈杂的基线中区分不明显（图3）。为了克服这一挑战，研究人员同时利用自发荧光通道检测。与紫外吸收检测相比，荧光检测的每个峰组都显示出更高的信号，并且荧光检测的基线噪音更小。图3与传统IEF方法对比 icIEF方法与平板凝胶IEF方法产生了相似的峰型（图4）。然而，icIEF方法的每个峰的分辨率均得到了改善。此外，icIEF方法的灵敏度明显高于IEF方法；在获得凝胶IEF结果时，每个泳道要上样大约20μg的蛋白质，而利用icIEF分析时，最终样品溶液进样浓度为0.225μg/μL至0.45μg/μL。每次进样量约为5μL。相当于2.25μg-4.5μg的蛋白质，极大节约了样品。图4. icIEF方法与平板IEF方法检测融合蛋白对比图总结 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术建立并证明了用于融合蛋白电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点： 使用了通用的蛋白质稳定剂SimpleSol，可以有效避免融合蛋白发生聚集或沉淀。对于一些样品，无需任何添加剂就能获得可重复峰型，与没有稳定剂的相同蛋白质的峰型相比，添加这种稳定剂对蛋白质的峰型的不利影响很小。使得该方法可以广泛用于分析多种融合蛋白，而不需要根据不同的样品更换稳定剂。同时可通过紫外和自发荧光双通道来检测蛋白质。自发荧光检测模式利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现且无需染料，可以提高灵敏度，减少由载体两性电解质引起的背景噪音。通过icIEF分离得到的每个峰组分的峰面积百分比和表观pI值，重复性好。总共对9种融合蛋白药物进行表征，每个组分的峰面积百分比和表观PI值的定量分析都有极佳的重复性。扫描下方二维码，获取ProteinSimple融合蛋白表征解决方案参考文献：1. Wu, Gang et al. “A platform method for charge heterogeneity characterization of fusion proteins by icIEF.” Analytical biochemistry vol. 638 (2022): 114505.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

东莞市三力星造纸助剂有限公司是三力星集团旗下工厂，拥有数套造纸助剂生产线，是生产造纸助剂的专业厂家。公司主要生产Cr200D阳离子分散松香胶，P100D阴离子分散松香胶，Akd100D中/碱性AKD施胶剂，Akd200D中/碱性施胶剂，Pae100D造纸湿强剂等多种造纸助剂产品。 造纸行业中，浆料滤液和白水中胶体溶解电荷是造纸湿部化学反应的度量，因此胶体溶解电荷检测对造纸行业有着重要的意义。三力星研发质检部门在日常检测中，进行胶体电荷密度滴定实验时，由于指示剂颜色变化不容易判定，容易造成误差。鉴于该情况，我司技术部门通过与三力星工程师进行多次的技术交流探讨及现场实验验证，最后提出了采用光度滴定法作为胶体溶解电荷的测试方法。并通过实验验证了该方法的可行性。 目前，三力星采购自雷迪美特公司的TIM845自动电位滴定仪（配合专用光度电极套装）已顺利完成安装调试，并取得良好的实验结果。 更详细信息，请咨询雷迪美特中国有限公司:cherry_radiometer@126.com 020-32486709, 87683635。

原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国关注我们，更多干货和惊喜好礼张晓夕 郭傲玮iCIEF成像毛细管等电聚焦电泳(Imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF）作为一种能够将蛋白质按照其等电点（isoelectric point, pI）分离的技术手段，被广泛应用于生物制药行业从研发至质控放行的各个阶段。近年来，随着各种分析手段的不断发展，越来越多科学家尝试将iCIEF与高分辨质谱在线直连使用，以发挥高分辨质谱在蛋白质定性定量分析中的优势。在本期的webinar视频中，来自Advanced Electrophoresis Solutions Ltd.(AES)公司的Matthew Courtney博士介绍了CEInfinite iCIEF 系统与Thermo Orbitrap 高分辨质谱联用，用于生物治疗型产品分析的最新应用进展。在Courtney博士的演讲中，引用了中检院单抗室去年发表在分析化学杂志上的iCIEF-MS在线直连测定九种不同单克隆抗体各自电荷变异体分子量的工作，同时也展示了最新设计的纳升级直连质谱喷针，可进一步提高分析的灵敏度。图1 最新设计的纳升级直连质谱喷针Courtney博士同时也分享了国内外最新的客户名单以及文献发表情况，有兴趣的老师可以观看视频，或参考我们之前发布过的公众号文献分享链接温习~图2 国内外客户名单图3 发表文献情况赛默飞世尔科技（中国）有限公司（赛默飞）与Advanced Electrophoresis Solutions Ltd.(AES)开展了深度的战略合作。AES的iCIEF结合赛默飞如Vanquish系列液相色谱仪， Orbitrap高分辨质谱仪等分析检测相关设备和技术，为广大的生物制药老师们带来了更加全面的整体解决方案。iCIEF/Orbitrap解决方案（点击查看大图）iCIEF-Orbitrap高分辨质谱直联示意图（点击查看大图）如老师对iCIEF或iCIEF-Orbitrap感兴趣，可以扫描下方二维码填写信息或直接联系当地赛默飞销售，将会为您及时的提供解决方案。相关文章● 文献分享：成像等电毛细管聚焦电泳（iCIEF）及离子交换色谱（IEX）与HRMS直联表征9种单克隆抗体电荷异构体► 点击阅读● 文献分享：iCIEF-HRMS在线直连技术用于蛋白质药物电荷异质性分析► 点击阅读● 文献分享：基于尖端的全柱成像等电毛细管电泳-高分辨质谱联用技术表征单克隆抗体电荷异质体► 点击阅读● 全柱成像等电毛细管电泳技术与高分辨质谱联用，助力复杂蛋白治疗产品深入表征► 点击阅读如需合作转载本文，请文末留言。

2015年5月21日，北京慧德易科技有限公司联手东曹(上海)生物科技有限公司和深圳市华创精科生物技术有限公司在天津日航酒店共同举办了&ldquo 液相色谱分离分析及中低压层析纯化技术应用研讨会&rdquo ，来自全国各地的共约100余名色谱界专家和学者参加了此次会议。会议主要从&ldquo 用于抗体纯化的层析填料新产品&rdquo 、&ldquo 针对抗体/ADC药物分析的应用&ldquo 以及&rdquo 反相/正相色谱柱在原料药和中草药方面的应用&ldquo 等几个方面向到场嘉宾介绍了东曹(上海)生物科技有限公司最新研发的TSKgel UP-SW系列色谱柱，并与到场嘉宾做了细致的交流。同时，在此次会议上还邀请到了日本山口大学研究生院的山本修一教授就色谱法中的生物识别和移动现象以及规模放大、规模缩小的开发做了精彩报告。会议在热烈的讨论中落下了帷幕。 会议现场 来自东曹(上海)生物科技有限公司的史俊霞工程师向到场嘉宾做了&ldquo 针对抗体/ADC药物分析的最新应用以及最新2umUHPLC色谱柱介绍&ldquo 报告，报告首先对抗体&mdash 药物偶联物(ADC)做了简要介绍，ADC即将单克隆抗体和高效细胞毒素完美地结合到一起，充分利用前者靶向，选择性强以及后者活性高的优点，同时又消除了前者疗效低和后者副作用大的缺陷。ADC常用的HPLC分析方法包括HIC、HIC/LC-MS、SEC和IEC等，接着史俊霞就分别对用TSKgelButy-NPR、TSKgel G3000SWXL、TSKgel SP-STAT分析曲妥珠单抗偶联药物的偶联比、曲妥珠单抗和曲妥珠单抗偶联药物的聚体以及抗体偶联药物的电荷异构体等做了分析，结果发现用TSKgelButy-NPR(4.6mmX10cm)曲妥珠单抗偶联药物的偶联比时，在流动相中添加20%异丙醇各组分的分离度较好 用TSKgel G3000SWXL(7.8mmX30cm)分析曲妥珠单抗和曲妥珠单抗偶联物的单体与二聚体时，添加10%的IPA在流动相中，单体与二聚体的分离度超过了1.5，各组分峰型良好。用TSKgel SP-STAT(4.6mmX10cm)在PH梯度条件下可以得到更多的ADC电荷异构体信息。最后史俊霞介绍了东曹(上海)生物科技有限公司最新研发的TSKgel UP-SW3000色谱柱，该色谱柱是一款主要针对生物大分子开发的SEC色谱柱，采用2um的硅胶作为基质，并用二醇基进行表面修饰，它可以同时兼容于UHPLC和HPLC系统。同时将TSKgel UP-SW3000色谱柱与竞争产品色谱柱在分离单抗的效果上做了对比。 东曹(上海)生物科技有限公司工程师 史俊霞 报告提目：《针对抗体/ADC药物分析的最新应用案例分享》 　　来自东曹(上海)生物科技有限公司的张琳博士向到场嘉宾介绍了TSKgel反相/正相色谱柱的介绍及在原料药和中草药方面的应用以及TSKgel色谱柱的常见问题和解决方法。张琳首先介绍了TSK品牌的由来，即源于东曹公司以前的名字&ldquo Toyo Soda Kogyo&ldquo ,其最有名的产品是用于蛋白分析的TSKgel G3000SWXL系列色谱柱，接着张琳向在场嘉宾介绍了使用TSKgel ODS系列反相色谱柱按照2010年版《中国药典》的要求考察了实验参数对于结果的影响情况。最后张琳还对色谱柱在化药-抗生素分析中的应用做了简要介绍。同时还介绍了TSKgel色谱柱的常见问题和解决方法。 东曹(上海)生物科技有限公司技术部主任 张琳 报告题目：《TSKgel反相/正相色谱柱在原料药和中草药方面的应用及TSKgel色谱柱使用中的常见问题解答》 　　来自于深圳市华创精科生物技术有限公司的栗云天经理向到场嘉宾介绍了公司最新开发的新一代全自动层析柱及层析系统。深圳市华创精科生物技术有限公司其产品主要包括分析液相、中压和高压制备液相、工业层析操作系统和层析柱，产品种类涵盖反相聚合物、反相硅胶、手性制备、离子交等不同类型的填料及预装柱，以及从分析到半制备、到工业生产不同规格的层析柱和操作系统。 深圳市华创精科生物技术有限公司经理 栗云天 报告题目：《新一代全自动层析柱及层析系统介绍》 日本山口大学研究生院教授 山本修一 报告题目：《用于生物大分子的新一代下游工艺的介绍》 东曹株式会社研究员 田中亨 报告题目：《根据FcR的糖链结构来进行抗体分离纯化》 东曹株式会社 桥本佳巳 报告题目：《新型磺酸基阳离子交换填料的介绍》

HPLC肽图分析是蛋白质一级结构研究中极为重要的手段之一，不但可以比较重组与天然蛋白质结果之间的同一性，确认基因工程上游和下游处理过程中是否发生差错、重组产物中是否存在翻译后修饰及未预期氨基酸的变异等，而且不同批次产品的肽谱比较可验证工艺过程的稳定性。因此，肽图分析在生物技术药物质控中尤为重要。 目前肽图分析常用方法主要是胰蛋白酶切RP-HPLC方法。蛋白样品经酶解后进入HPLC，进行色谱分离，保留时间不同的肽段依次进入紫外检测器进行检测。 岛津的相关液相产品，例如Nexera-i系列、LC-40以及生物惰性兼容液相Nexera Bio均可实现蛋白类药物的HPLC肽图分析。 蛋白类药物肽图分析电荷异构体的存在将会影响到蛋白质药物的活性、结合能力、药代动力学、免疫原性及结构稳定性，从而影响药物有效性、安全性及保质期。同时，电荷异质性的控制程度也反映了重组蛋白类药物生产工艺的一致性。因此，在生物类似药的研发及与原研药的一致性评价研究中，电荷异质性是工艺质量控制的重要因素。 为了最大限度地降低蛋白质与固定相填料的离子相互作用及二者之间可能存在的吸附作用，电荷异质性分析通常使用高离子强度的流动相，并且采用碱性或酸性分析条件。但是，高离子强度流动相和碱性/酸性分析条件给液相色谱仪的耐腐蚀性和系统稳定性带来严峻的挑战。 ATP分析 糖基化是蛋白质的一种重要翻译后修饰，糖基分析主要包含唾液酸含量测定、单糖组成分析、糖基化位点测定、糖链结构测定等。 唾液酸含量的测定是先将唾液酸从糖链上解离成游离状态，再进行化学反应实现衍生化，通过测定衍生化产物从而测定唾液酸含量，常用的方法有间苯二酚显色法和HPLC法。间苯二酚显色法是利用间苯二酚将游离的唾液酸进行衍生生成有色化合物，再用紫外分光光度法测定其含量；HPLC法是利用邻苯二胺（OPD）对唾液酸进行衍生，然后用带紫外检测器的HPLC或者LC-MS/MS进行定量。 蛋白类生物药糖型分析 蛋白质药物在其生产、贮藏、运输、销售以及用药过程中由于外力因素的作用可能会产生聚集。蛋白质聚集现象会导致蛋白药活性和其在药品中的浓度降低，并可能产生有害的毒理学作用和免疫应答，甚至发生危及生命的药物反应。FDA关于聚集体的指导原则中就指出蛋白聚集体在人体内极易产生免疫原性。 对于常见的蛋白质低聚体（二聚~四聚体），非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）需要在变性条件下进行，一般会影响多聚体的检测。而体积排阻色谱法（SEC）条件温和，不会对蛋白的形态产生较大的影响。因此，SEC法能较准确地检测蛋白质中的低聚体，是蛋白质药物开发、质量控制和稳定性研究中常用的聚集体分析方法。 大小变异体，聚体分析 应用案例：单抗药物聚集体分析，推荐生物惰性液相 作为细胞生长的环境和营养来源，培养基的性能很大程度上决定了细胞密度和表达产物的产量和质量，因此培养基是工艺开发最重要的环节之一。其中，在生产工艺优化和确认过程中，以及QC过程中，细胞上清液中氨基酸含量的监测对细胞培养有着重大的意义。但是，离线衍生后使用HPLC分析，以及HPLC柱后衍生法检测氨基酸等方法，不仅耗时耗力，并且对结果准确度影响较大。因此，开发操作简单、高效稳定的分析方法，对氨基酸组成分析非常有意义。 24种氨基酸标准溶液色谱图（双波长同时检测）

中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员朱正江课题组在《自然-通讯》（Nature Communications）上，在线发表了题为A mass spectrum-oriented computational method for ion mobility-resolved untargeted metabolomics的研究论文。该工作针对基于离子淌度质谱的四维代谢组学技术开发了一种端到端的精准数据分析技术Met4DX，用于四维代谢组学数据的四维峰检测、峰对齐和峰定量，并结合四维数据库实现代谢物的四维精准匹配和鉴定（图1）。 　　离子淌度质谱相较于传统质谱增加了根据离子尺寸、形状以及电荷分离的离子淌度，有效提升了质谱的分离能力，特别是代谢物同分异构体的分辨能力，其跟液相色谱联用形成多维分离分析技术，可进一步提高复杂生物样本分析的分离度和峰容量。一次四维代谢组学分析能够同时对代谢物离子进行四个维度的表征，包括精确质量数（MS1）、二级质谱图(MS/MS)、色谱保留时间（RT）和离子淌度碰撞截面积（CCS），能有效提升对复杂生物样品中代谢物定性和定量分析的覆盖度和准确度。然而，四维代谢组数据的高度复杂性对数据的高效精准分析提出了挑战，尤其是四维质谱峰的检测仍是难点。因此，四维代谢组数据分析技术和工具相对有限。目前，少量工具如MS-DIAL与MZmine等均采用自上而下压缩数据的降维策略进行峰检测。该降维策略可以降低数据的维数和复杂性，但降维过程也不可避免低引入了信号掩蔽及干扰，显著降低了四维峰检测的灵敏度。 　　液相色谱-离子淌度-质谱依次从液相、离子淌度以及质谱维度对代谢物实现多维分离，所需要的时间也逐级减小。受到该分离方式的启发，本研究开发了从一张质谱图出发的自下而上峰组装算法（mass spectrum oriented bottom-up assembly algorithm）用于四维代谢组学数据中四维峰的检测（图2）。该技术的特点是将每一张质谱图作为四维数据中的最小数据单元，采用逆向工程的策略依次构建其在离子淌度和液相色谱上的峰形。具体地，对于每一张质谱图，该算法会依次进行其前体离子的搜索、离子淌度流出峰的组装与检测、离子淌度流出峰的拓展、色谱流出峰的组装与检测和四维峰积分等五个步骤实现四维代谢峰检测与峰定量。本工作开发的自下而上的峰组装算法避免了数据压缩与降维，有效地提高了四维峰检测的覆盖度与灵敏度。以上述算法为核心，科研人员进一步开发了适用于四维代谢组学的端到端的精准数据分析技术Met4DX，通过二级谱图去冗余模块、自下而上的峰组装模块、四维峰对齐以及分组模块、代谢物的多维匹配与鉴定模块等实现了的四维复杂代谢组的精准定性和精确定量分析。 　　Met4DX技术能够实现高覆盖的四维质谱峰检测，定量精密度高。与同类技术相比（如MS-DIAL和MetaboScape），Met4DX能够提升四维峰检测的覆盖度2-3倍，提升准确定量代谢物的数目2-5倍。Met4DX在代谢物同分异构体识别上具有优异的性能。以在小鼠肝脏代谢组为例，Met4DX精准识别代谢物同分异构体数目高达3033对，比同类技术显著提升3.6倍，且可准确识别出CCS差异为1%的共流出同分异构体。同时，该研究还收集了HMDB和KEGG中的超过13万个代谢物，建立了目前最全面的四维代谢物数据库用于代谢物的多维匹配与鉴定。 　　目前，Met4DX支持包括布鲁克timsTOF和安捷伦DTIM-MS等仪器平台采集的四维代谢组学数据。为了方便相关领域研究应用该工具，课题组提供了docker供学术界用户免费使用Met4DX（https://hub.docker.com/r/zhulab/met）。该工作开发的四维代谢组学精准分析技术M4dx-ret4DX已申请国家发明专利和国家软件著作权。研究工作得到国家自然科学基金、科技部、中科院和上海市科学技术委员会等的支持。 图1.四维代谢组学精准数据分析技术Met4DX 图2.自下而上的峰组装算法和Met4DX数据分析流程（图片修改自《自然-通讯》）

近期，Analytical Chemistry杂志上发表的一篇文章提出了一项创新性的用于抗体药物电荷异质性表征的分析技术——icIEF-MS。icIEF-MS联用技术平台与传统的SCX-MS对蛋白异质性进行交叉验证，而且更高的灵敏度、更出色的重复性和更低的样品残留，这将为蛋白药物电荷异质性表征提供一种新的策略。 原文见：Anal. Chem. 2023, 95, 4, 2548–2560 蛋白质的电荷异质性是由多种复杂机制所共同作用形成，包括细胞过程、化学降解和制造过程中的生产条件。这些因素中的许多修饰会引起蛋白质等电点 (pI) 值的变化，例如翻译后修饰（PTMs) 的发生，包括 c 端赖氨酸缺失、焦谷氨酸形成、脱酰胺化、唾液酸化和糖基化等，都会导致电荷变异体的形成，从而对药物的稳定性和溶解度产生重要影响。因此，对电荷异质性的可靠表征是评估关键质量属性 (CQA) 的重要步骤，也是确保治疗性mAbs在整个临床和商业开发期间保持一致质量的关键所在。 目前，全柱成像毛细管等电聚焦 (icIEF) 和离子交换色谱 (IEX) 是治疗性mAbs在研发和质量控制中进行电荷异质性分析的两种常用技术。然而，传统的cIEF-MS联用技术在研究蛋白质电荷变异体方面还存在着许多缺陷，如重复性差、操作复杂以及与MS离子源不兼容等问题。 CEInfinite icIEF分析兼制备型全柱成像毛细管电泳系统 基于一体化的icIEF-MS技术平台，使用加拿大品牌艾易尔斯生物科技（AES）开发的分析与制备一体的CEInfinte系统，可实现快速的icIEF分离，并配合使用高分辨率的Thermo Q-Exactive Plus质谱平台对蛋白质的电荷变异体进行鉴定。icIEF分离部分采用了与MS兼容的两性电解质，无需使用甲基纤维素和尿素作为添加的的涂层毛细管柱。通过创新的纳流ESI接口，检测蛋白质药物电荷变异的灵敏度和重复性得到了极大提高，整个icIEF-HRMS分析可在25分钟内完成，比传统cIEF-MS所需的60分钟更加迅速。此外，该平台还可以灵活切换到icIEF馏分收集模式，对蛋白质的电荷变异体组分进行组分收集，并进行深入表征，包括LC-MS肽图分析、IEX-MS 完整蛋白分析、生物相互作用等研究。整合icIEF-MS和基于icIEF的馏分收集将在mAb电荷异质性表征的全新MS策略。图1 icIEF-MS的原理图 利用该icIEF-MS系统对9种不同的治疗性mAb的电荷变异体进行表征，并对icIEF-MS的方法进行了系统验证。同时，我们还使用SCX-MS分析了所研究mAb的电荷异质性。两种手段的分析结果表明，icIEF在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和精确分子量测量精度等方面都具有明显优势。我们相信，结合传统的IEC-MS技术平，台icIEF-MS将成为电荷异质性表征领域中的一项重要技术，为研究人员提供更加快速、准确、灵敏和高效的分析手段。 表1 九种单抗的等电点信息和使用的icIEF试剂● icIEF和SCX分离9种单克隆抗体的性能比较 ●在最优化条件下，通过icIEF-UV和SCX-UV分别分离了9种单克隆抗体，并进行了性能比较。两种分离工具均在10分钟内完成了高通量分离，所研究的单克隆抗体获得了相同的峰序列。在icIEF分离中，首先洗脱的是酸性最强的异质体，其次是主峰和碱性异质体，这与SCX分离的顺序相同。然而，对于大多数异质性mAb混合物，icIEF的分离效率显著高于SCX，这是因为iCIEF基于pI差异进行分离，微小pI差异的蛋白质异质体就可以得到高分离度的分离。在某些情况下，如英夫利西单抗，通过icIEF可以实现4种电荷变异体和一个主成分的基线分离，但使用SCX的分离效率却不佳。类似地，对于帕博利珠单抗、阿替利珠单抗和地诺单抗，使用icIEF可以很好地检测出所有电荷变异体；然而，在使用SCX时，一些电荷变体却丢失了。尽管icIEF由于不同的分离机制而比SCX具有更宽的峰宽，但由于其pI的微小差异，icIEF表现出了更好的分离性能。图2 九种mAb的icIEF-UV图谱和SCX-UV谱图● icIEF和SCX串联MS的比较 ●如图3所示，icIEF-S和SCX-MS都可以用于鉴定阿替利珠单抗的电荷变异体。在SCX分离中，MS检测到的酸碱峰顺序与UV一致。而在icIEF分离中，碱性峰首先被纳流泵推向ESI源，因此MS检测中的酸碱峰顺序与UV检测的顺序相反。另一个显著的区别是，由于SCX-MS使用更高的流速，从UV到MS检测，柱外的峰展宽程度都较轻，这意味着UV峰形状与MS峰形状更一致。相比之下，icIEF-MS的较低迁移流速意味着柱外效应对icIEF分离的影响更大，从UV检测到MS检测，峰呈现更为明显的展宽，尤其是主峰，强度更高，并与稍低pI的酸性峰部分重叠。为了进一步提高icIEF-MS的分离度以克服峰展宽造成的分辨率损失，可以使用窄pH的两性电解质、新型的涂层分离毛细管柱和纳流ESI源。图3 以阿替利珠单抗为研究对象，比较icIEF-MS 和 SCX-MS分离效果：UV谱图(左)和MS-TIC谱图(右)。 在分析单克隆抗体时，icIEF-MS的信号响应比SCX-MS高。虽然icIEF-MS的样品载量只有SCX-MS的十分之一，但如图3所示。icIEF-QE Plus MS的TIC强度与SCX-Orbitrap Exploris 240相同（Orbitrap Exploris 240比QE Plus MS具有更高的检测灵敏度）。icIEF-MS比SCX-MS灵敏度高的原因有两个：首先，icIEF-MS的纳流流速（小于5μL/min）远低于SCX-MS的流速（300 μL/min），这导致icIEF-MS的去溶剂化效率和离子化效率较高，从而极大的提高了MS灵敏度和动态范围，即使样品量低至1 ng。此外，在icIEF-MS中，补偿液采用含0.5% FA的50%乙腈，流速为5 μL/min，纳流泵速为50-100 nL/min。在此比例下，进入MS的最终流动相处于酸性条件，而文章中用于SCX-MS的洗脱流动相的pH接近mAb的pI点 (pH 7~10)，洗脱是在中性碱性条件下进行的，而在中性/碱性条件下，蛋白质与质子结合的能力比酸性条件下弱得多。因此，与SCX-MS相比，icIEF-MS在较低的电荷状态下具有更多的电荷数量，从而增加了电离和质谱效率。 总之，icIEF和SCX是两种有效的单克隆抗体分离工具，在高通量条件下分离效率都很高。然而，在icIEF-MS中，由于低迁移流速和酸性流动相的使用，其灵敏度比SCX-MS更高。这些结果表明，icIEF-MS是一种具有优越性能的单克隆抗体分离和表征方法，可以应用于生物制药的研究发现和质量控制。(A)(D) 图4 阿替利珠单抗的高灵敏度icIEF-MS表征分析:不同浓度(0.0 5 ~ 2 mg/mL ) 阿替利珠单抗(A) 的UV谱图，TIC (B) 和 MS(C )谱均为0.05 mg/mL；电荷变异体的浓度与MS响应强度的关系如图(D)所示。 图4展示了icIEF-QE Plus MS 在不同浓度阿替利珠单抗的结果，见图4。从酸性变异体和碱性变异体的 TIC和MS谱图得出，即使在 0.05 mg/ mL的最低浓度 (3倍S/N的UV信号)下，MS仍然检测到所有电荷变异体的明显信号。而SCX-QE Plus MS不能达到0.05 mg/ml的检出限。而在已报道的传统cIEF-MS研究中，典型的蛋白质分析浓度为 0.1~ 2 mg/mL。● icIEF-MS和SCX-MS的质量准确度比较 ●icIEF-MS 不仅在灵敏度上表现更优，而且在质量准确度方面也优于 SCX-MS。质量准确度是 MS 检测的一个关键指标，这取决于 MS 的分辨率。可达到的质量分辨率不仅取决于仪器的质量分辨率极限，还受电离过程的影响。加合物会使离子信号变宽，因为它们不仅来自于多重质子化的分析物，还来自于携带加合物的分析物。因此，更多的加合物会导致较差的分辨率和较大的质量误差（即较差的精度）。虽然源内碰撞诱导裂解（CID）可以减少加合物的形成，但并不是所有加合物都可以被去除。如表2所示，尽管使用了110 V 的源内CID值，但SCX-MS 获得的质谱峰仍然比 icIEF-MS 获得的质谱峰宽，导致SCX-MS 主成分的 MW 偏差（5.4 ppm）大于 icIEF-MS（2.7 ppm）。另一个例子是贝伐珠单抗，在没有脱盐预处理的情况下，SCX-MS 对贝伐珠单抗的 MW 偏差高达33.9 ppm。脱盐后进行分析，贝伐珠单抗的偏差降低到12.8 ppm。而 icIEF-MS，由于加合离子形成较少，即使不脱盐，获得的贝伐珠单抗的偏差也仅为9.6 ppm。表2 阿替利珠单抗的电荷变异体的icIEF-MS和SCX-MS分析结果比较● icIEF-MS和SCX-MS的残留效应 ●相比 SCX-MS，icIEF-MS 的残留效应要小得多。在对阿替利珠单抗分析后，icEF-MS 使用含有4% HR 8.5&minus 9.5 两性电解质的水溶液作为空白样本，而 SCX-MS 使用水作为空白样本。在 icIEF-UV 检测中未观察到明显信号，而 SCX-UV 在阿替利珠单抗峰值处检测到了信号残留。SCX-TIC 和 icIEF-TIC 中有信号峰相对明显，保留时间分别为6.82和21.5 min，。从这两个信号峰提取的 MS 数据通过去卷积得出，SCX-TIC检测到的残余信号是阿替利珠单抗，而 icIEF-TIC 检测到的信号只是两性电解质，这意味着 icIEF-MS 中没有检测到残余分析信号。低残留率使得 icIEF-MS 对微量蛋白电荷变异体的检测更加准确和可靠，避免了假阳性结果。图5 icIEF-MS和SCX-MS的残留效应的比较：SCX-MS (A-C)显示残留阿替利珠单抗信号，而icIEF (D-F)没有残留分析物信号。如图4和图5所示，观察到1500~2500 m/z 的背景信号，MS信息证实它们不是蛋白质，而是来自两性电解质和溶剂背景，背景离子不干扰mAb电荷变异体的鉴定。 ● icIEF-MS鉴定蛋白质的可重复性 ● 针对阿替利珠单抗电荷变异体进行的重复性考察表明，icIEF-MS 平台对其测定表现出良好的重复性。通过 icIEF-MS 对批间蛋白质样品进行鉴定，所有批间检测到的相同电荷变异的质量偏差都很小（表3列出了所有9种mAb的电荷变异体的修饰鉴定结果。酸性变异体的表征比碱性变异体更具挑战性，因为酸性变异体具有更复杂的修饰。虽然这种酸性修饰通常可以通过 pI 来区分，但它们在分子质量上的差异相当小。icIEF在线串联高分辨率质谱可以通过结合完整的蛋白质分子量和测量的pI值来阐明蛋白质的结构信息，为解决酸性电荷变异体的难题提供一个有用的icIEF-MS联用平台。表3 九种单克隆抗体的电荷变异体的iCIEF-MS表征结果在对一系列不同的治疗性单克隆抗体进行电荷变异体表征时，icIEF-MS 和 SCX-MS 可以获得类似的结果。然而，icIEF-MS 在分离分辨率、灵敏度、低残留效应和 MW 测量准确度方面比 SCX-MS 展现出更多的优势。因此，将 icIEF-HRMS 分析与更常见的 SCX-MS 相结合，通过正交的验证，可以为分离和鉴别蛋白电荷变异体提供更加全面的分析策略。 如需进一步了解相关信息，可联系我们获取更多文献。艾易尔斯生物科技（AES）致力于全柱成像毛细管等电聚焦技术（icIEF）技术与质谱的联用、馏分制备以及高分辨分离等领域。

电荷检测质谱法是通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而算得离子质量m的单粒子统计方法，在测定超大分子离子的质量分布方面有独特的优势。现有质谱仪在超大分子量测量方面面临的挑战在质谱仪中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来，因此形成质谱。所以，目前的质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。经过一个多世纪的发展，质谱仪从原先只能分析无机元素和小分子，逐步发展到能够分析有机物分子、生物大分子直至具备生命体特征的病毒颗粒。2002年诺贝尔化学奖之一授予了用电喷雾电离（ESI）进行蛋白质质谱分析的创始人John Fenn。在电喷雾质谱对蛋白质进行分析时，溶液中的蛋白质样品被传送到加有高压的毛细管尖端，强电场促使样品溶液喷雾，喷雾中的液滴通过蒸发，库仑爆炸等过程，形成带有多个电荷的蛋白质离子，被引入处于真空中的质谱分析器。每个离子所带的电荷数的多少，取决于分子的大小、分子在溶液中的几何构象（折叠或打开）以及电喷雾尖端处的电压和气流等参数。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...),人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以用电脑程序退卷积得到m分布。对于分析较小（分子量在5万以下）、较简单纯净的蛋白样品，退卷积还是很有效的。然而，在实际应用中对蛋白和蛋白组的分析，特别是对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化（heterogeneity），很宽的质量m分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。图1中，用高分辨质谱仪对二种病毒壳体的质量进行测定，由于各种价态的质谱峰群连城一片，根本无法辨别谱峰，得到样品分子的质量。同时，实际样品也可能因处理不善或自然裂解，使谱图混杂着不同大小的分子离子，它们各自的价态z分布可能导致它们的峰群在m/z轴上交叠在一起。目前对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用退卷积软件来获得分子量的分布信息。事实说明，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。图1 ESI质谱对大型病毒壳体质量测定的困难。(a,b）晶体结构效果图 (c,d) 的“高分辨”质谱分析图。（摘自：Kafader, J. O.， Nature methods, 17(4), 391-394）糖蛋白是生物制品中比例最大的一类药物，其糖修饰对其功能非常关键，准确解析此类药物的糖修饰是药物研发、报批和质量监控的关键内容。但它们在ESI-MS的质谱中，看到的好像是一堆杂草，无法辨别有什么蛋白组分。将一个糖蛋白药物中的各组分进行高分辨检测，是当前生物质谱面临的巨大挑战。电荷检测质谱仪的提出与技术发展早在上世纪90年代，美国西北太平洋国家实验室R.D.Smith组的 Bruce, J. E等就提出可以在傅里叶变换质谱仪中同时测量单个离子的电荷和质荷比，从而算出离子的质量m。随后，美国劳伦斯伯克利国家实验室W. H. Benner 发明了一种线形的静电离子阱，并用其测量单个高价离子的电荷数和质荷比，进而得到单个事件中的离子质量m。只要连续不断地进行大量的单个离子测量，就可以把总离子事件统计出来，形成按质量分布的直方图，而这就是一张电荷检测质谱。图2，Benner小组采用的直线形静电离子阱进行CDMS测量的原理图CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。测量中，离子在静电离子阱内进行周期性运动并在电极上感应出“镜像电荷”信号。通过对信号的傅里叶变换，得到离子信号的频率从而决定离子的质荷比，而由频谱峰的强度得到离子所带的电荷数。虽然单个离子的镜像电荷频谱的峰强度与离子的电荷数成正比，它也同时与离子在阱内的轨道形状、离子存活时间有关，而这些参量都存在不定性；并且由于镜像电荷信号强度极弱，回路中的电子噪声对精确测量镜像电荷产生很大的影响，因此早期的电荷测量的RMS误差达2.2e以上,由此计算出的质量精度只比凝胶电泳好一点。近年来随着人们对天然、复杂蛋白分析的需求日益显现，CDMS技术也进一步得到了发展。美国印第安纳大学Jarrold小组通过对线形静电离子阱分析器的不断改进，特别是采用了低温前级信号放大器等优化设计后，实现了最小RMS 0.2 e的电荷测量误差，测量的样品包括2 MDa以上的蛋白复合体（protein complex）和20 MDa以上的病毒外壳。在这个RMS误差下，通过电荷数取整可以大概率获得精准的电荷值，从而得到精准的质谱分布。图3给出了用普通ToF质谱仪和CDMS测量天然态丙酮酸激酶（PKn）多聚体的效果比较。当3个以上四聚体组装在一起时，ToF质谱完全无法辨别其质量分布，而CDMS可以看到近10个四聚体组合的质量峰。图3.用常规ToF质谱（左）和用CDMS测量的丙酮酸激酶（PK）多聚体，使用相同样品和相同电喷雾条件。（摘自D. Keifer: Analyst, 2017,142,1654)目前，虽然用线形静电阱结合傅里叶变换可以得到较好的电荷测量精度，但该方法每次只能测一个离子，否则库伦相互作用会影响测量。在实际测试中，每次引入的离子数是随机分布的，需要用软件鉴别超过一个离子注入的事件，也要发现因为和残余气体碰撞而半路夭折的事件，并把这些“不良”记录剔除。考虑单次分析时间大约需要1s，得到一张良好统计的CDMS谱图需要几个小时甚至一天的数据积累。加利福尼亚大学E. Williams团队对线形静电离子阱分析器的设计和的数据处理方法进行了创新，能让宽能量范围的离子同时进入离子阱进行分析，避免了离子之间的空间电荷作用，可以在一个测量周期内测量10-20个离子，进而有望提高了检测效率。与此同时，其他尝试使用商业傅立叶FT质谱仪进行CDMS的研究团体也逐步浮现。美国西北大学Kelleher团队、荷兰乌得勒支大学的A.R.Heck团队先后使用热电公司的静电场轨道阱(Orbitrap) 系统，通过更新数据处理软件，对CDMS进行了应用研究。除了Orbitrap是成熟的商业化仪器这一优点外，轨道静电离子阱内的离子由于其轨道运动，导致电荷分布在中心电极周围，因此其空间电荷相互作用较小。Kelleher 在Nature Method上的论文声称，基于Orbitrap的CDMS可以同时分析100个离子。不过，在电荷测量精度上，Orbitrap-CDMS目前只达到RMS 1 e左右，较Jarrold的线形静电阱还有一定的差距，但Orbitrap对m/z的测量精度、分辨率远远超过ELIT，一定程度上帮助消除在多离子同时分析时可能出现的m/z相近离子的信号干涉效应。笔者在岛津公司的欧洲研发团队去年也在JASMS发表了用CDMS测量糖蛋白的尝试。该工作采用了一种盘状平面静电离子阱分析器，如图4，而这种分析器也能像Orbitrap那样获得超高分辨质谱。通过对测量硬件和软件进行改进，实现了CDMS实验。该报道给出了一种全新的CDMS数据处理方法，能够克服离子在分析过程中因碰撞夭折造成测量不准的问题，同时实验验证了该方法的有效性，还对多个离子同时分析时的信号干涉等问题提出分析和研判，为深入研究CDMS技术，消除造成电荷测量误差的障碍打下了基础。图4，用于CDMS 实验的平面静电离子阱系统 （A. Rusinov, L. Ding, JASMS, 32, 5, 2021)CDMS技术的应用现状目前，电荷检测质谱技术还处于早期发展阶段，还没有现成的商品仪器出售，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS（含Orbitrap）软件的专家才能进行这样的实验。 今年初美国沃特世公司宣布成功收购专攻电荷检测质谱技术（CDMS）及服务的初创企业Megadalton Solutions Inc. Megadalton Solutions是由美国印第安纳大学的Martin Jarrold和David Clemmer两位教授于2018年创立，他们目前是研发的CDMS仪器最长久的团队并拥有最成熟的技术。沃特世曾于2021年将Megadalton的CDMS技术引进到了沃特世Immerse Cambridge创新和研究实验室，并应用于各项先进检测及研发工作。沃特世公司首席执行官Udit Batra博士表示要进一步开发Megadalton的CDMS技术并将其商业化。在国内，CDMS无论是仪器技术开发还是应用都属空白。虽然国内在复杂生物大分子结构与功能的研究、病毒载体空壳率监测方面对CDMS已经产生需求，但我们在高端质谱仪器研制方面远远落后于西方。CDMS在技术上是基于FTMS分析原理而演化产生的，但国内目前对FT类型的质谱仪器研究，除了少量理论分析与离子光学仿真工作外，还没有实质性的进展，也没有企业能够提供FTMS类商品仪器。针对这些需求，笔者打算在前期研究工作的基础上，研究开发静电离子阱分析器，并进一步结合开发CDMS特定的数据处理软件，建成一套拥有自主知识产权的新型质谱仪器。同时建立国内的研发应用合作机制，解决目前国内超大分子蛋白质生物药剂质量分析的问题。预测CDMS技术未来的市场空间如前所述，目前对复杂蛋白等大型生物分子进行质谱分析时，由于其分子量的差异性（heterogeneity), 存在着严重的多价态峰群重叠问题，导致无法通过质谱仪获得这些大分子在样品中的质量分布。而用电荷检测质谱仪，无需对电荷态退卷积，可以直接得到蛋白质、蛋白复合体、各种转译后修饰造成的特定质量分布图。因此，该仪器的发展在天然蛋白质、糖蛋白、病毒颗粒的成分和结构研究，抗原-抗体作用机理研究和疫苗研发方面有很大的未来市场空间，具体可以列举以下几个方面：（1）新型电荷检测质谱仪可实现复杂样品的蛋白离子精确分析，可时提供复杂样品中各蛋白分子的结构，密度分布等。（2）可直接测定糖蛋白及其它各种转译后修饰造成的特定质量分布图，为解释蛋白大分子及其转译后修饰分子量或结构表征变化信息等之间的关系，从而对糖蛋白相关的疾病诊断具有重要意义。（3）通过研究DNA等生物大分子离子的电荷分布，以及质量与电荷的关联，可以推断这些大分子的结构，比如它的聚合程度、纤维股数等。（4）在病毒研究中，可以用来确定病毒衣壳的蛋白复合体结构及其组装反应的过程，这将在抗病毒药物的研究中发挥作用。（5）在基因疗法研究和产品质控中，本项目研制的电荷检测质谱仪可以用来测定腺病毒载体的空壳率，检查载体内的基因完整度。推动现代临床医学的发展；（6）电荷检测质谱仪还可以用来测定纳米聚合物分子的聚合度和分散指数，推动材料科学的发展。值得关注的是新冠疫情给质谱分析带来了全新机遇，除了对新冠病毒本身的蛋白进行分析研究以外，也可以在灭活疫苗、病毒载体疫苗以及核酸疫苗产品的质量控制、效果评价、免疫机制研究以及载体类疫苗的体外模拟产物的评价等方面发挥优势。关于笔者：宁波大学材料科学与化学工程学院/质谱技术研究院 丁力1990年于复旦大学物理系获理学博士学位。先后工作于复旦大学材料科学系，以色列魏兹曼科学研究所，英国贝尔法斯特女王大学纯粹与应用物理系。1998年加入岛津欧洲研究所。2007年至2011年任岛津分析技术研发(上海)有限公司总经理。2011-2020年任岛津欧洲研究所高级研究员，研发二部经理。主要领导了多项质谱仪器的研发，是国际上数字离子阱质谱技术的创始人，在离子源，四极场离子阱，静电离子阱，飞行时间等分析器技术及其联用技术方面有很多创新和突破。发表论文、报告、专著一百余篇，有三十余项发明专利。领域：QIT、ToF、Quadrupole、MALDI、APMALDI、ESI、Digital Ion Trap、Linear Ion Trap、Electrostatic Ion Trap，FTMS、 CDMS、MSMS、ECD、Ambient Pressure Ion Sources 等。目前丁力在宁波大学组建团队，继续静电离子阱的设计和优化工作，已提出了静电“和谐阱”的设计概念，充分利用其高次谐波来提高质谱分析器的分辨本领。同时也在探索在国内实现这种精密分析器的加工和组装工艺，为下一步实现超高分辨质谱仪国产化做准备，也为在国内研制电荷检测质谱仪打好基础。

使用ACQUITY UPC2 系统对环金属铱（III）配合物进行同分异构分离 Rui Chen 和John P. McCauley 沃特世公司（美国马萨诸塞州米尔福德） 应用效益 ■ 快速分离均配铱络合物中的同分异构体，实现对物质纯化的实时监控。 ■ 在一次色谱运行操作中同时分离均配铱络合物中的同分异构体和光学异构体，实现对纯度的准确评估，而这在其他系统中需要多次色谱分离操作来完成。 ■ 可简单地从 UPC2TM 转换至半制备型超临界流体色谱（SFC），纯化目标异构体，并可以在缓和的条件下轻松地回收收集的组分，减少同分异构体的生成，从而获得有机发光二极体（OLED）设备制造所需的高纯材料。 沃特世解决方案 ACQUITY UPC2TM 系统 Investigator SFC系统 Empower&trade 3软件 ChromScope&trade 软件 ACQUITY UPC2BEH和BEH 2-EP色谱柱 关键词 铱配合物，OLED，同分异构体，面式，经式，对映体，合相色谱，UPC2 引言 有机发光二极体（OLED）应用中环金属铱（III）配合物的合成与表征引起了人们的浓厚兴趣，因为这些配合物具有很高的发光量子产率，并且能够通过简单的合成方法对配体进行系统修饰，从而对颜色进行调整。根据包围在中心铱原子的配体的类型，这些有机金属配合物可能分为均配物和杂配物。均配物和杂配物均可能存在同分异构体，这些异构体被称为经式异构体（meridional，mer）和面式（facial，fac）异构体。同分异构体具有不同的光物理和化学特性1-3，这些特性可影响OLED设备的性能和寿命以及稳定性。此外，杂配物具有光学异构性。富含对映体的配合物发出圆形的偏振光，可用于三维电子显示4。 多种异构形式为这些材料纯度评估以及理解发光设备故障机理所需的异构体的分离提出了特殊的挑战。这种挑战因为目前流行的针对这些材料的纯化方法（即升华）而变得更加复杂5-6。升华过程中，可能会发生分子内的热力学异构化。纯化过程通常生成异构混合物，而不是用于设备生产的预期单一异构体，导致性能降低。显然，开发出在温和条件下的纯化技术对减少异构化具有重大意义。 由于大部分环金属铱配合物溶解性低，目前环金属铱配合物的色谱分析方法一般采用正相液相色谱法（NPLC）。超临界流体色谱（SFC）以及更先进的超高效合相色谱（UPC2）提供了引人关注的正相色谱替代方法，从而可提高分辨率、缩短分析时间，降低有机溶剂的消耗量。在本应用纪要中，我们对三［2（2,4-二氟苯基）吡啶]铱（III）（Ir（Fppy）3）和双（4,6-二氟苯基）吡啶C2，N］甲酰合铱（III）（Flrpic）的结构采用沃特世（Waters® ） ACQUITY UPC2 进行了分离，如图1所示。将SFC用于纯化Flrpic的可行性也说明了使用Waters Investigator SFC系统的可行性。 实验 仪器：所有分析实验均在由Empower 3软件控制的ACQUITY UPC2 上进行。制备实验在由ChromScope软件控制的Investigator SFC系统上进行。 色谱柱：沃特世公司的ACQUITY UPC2 BEH和2-Ethyl Pyridine 3.0 x 100 mm，1.7&mu m色谱柱。CHIRALPAK AS-H 4.6 x 150 mm，5 &mu m，购自Chiral Tec hnologies公司（宾夕法尼亚州西切斯特）。 样品描述 样品购自Sigma Aldrich和1-Material公司。为了形成异构体，将样品置于控温箱内进行热应激，引发异构化反应。冷却至室温后，将样品溶于氯仿中，用于随后的分析操作。 结果与讨论 图2是未经处理以及经过热应激的Ir（Fppy）3 的UPC2/UV色谱图。色谱峰1与色谱峰2的质谱（未显示）相同，但紫外光谱（插图）明显不同，说明它们最有可能是面式异构体和经式异构体。标有&ldquo desfluoro&rdquo 的峰出现的原因是Ir（Fppy）3 中的一个F原子丢失。但是，两张图谱的主要差异在于峰1与峰2之间的相对比例。加热时，1/2的峰比将会增大。其可能是由热异构化过程引起的，在异构化过程中，稳定性较差的经式异构体（峰2）转化成稳定性较高的面式异构体（峰1）。图2清楚地表明，Ir（Fppy）3 的同分异构体可轻易地通过使用ACQUITY UPC2 进行分离。 图2 使用ACQUIT Y UPC2 2-EP3x100mm，1.7&mu m色谱柱得到的Ir（Fppy ）3 UPC2/UV色谱图。（A）在280℃ 下处理24 小时的样品；（B）在25℃下未经处理的样品。流速为1.5mL /min；背压为2175 psi；30%异丙醇辅助溶液等度洗脱；温度为40℃。峰标记后面的数据表示以峰面积表示的每个峰的相对百分比。 图3是使用非手性固定相和手性固定相得到的Flrpic UPC2/UV色谱图。在手性柱中，Flrpic裂分为两个峰，如图3B所示。图3B中的两个峰具有相同的质荷比（未示出）和紫外光谱（插图），说明这两个峰最有可能来源于同一对对映体。与均配物Ir（Fppy）3 不同的是，杂配物Flrpic由两种不同的配体构成。这种分子对称性反过来产生了光学异构。在实际应用中，例如三维显示，具有高度的发光不对称性是很有利的。因此，UPC2 提供了一种简单的测定手性荧光化合物对映比的方法，这对于使化学结构与发光对称性相互关联是很重要的。 图3 标准级Flrpic的UPC2/U V 色谱图。（A）使用一根ACQUITY UPC2 BEH 3x100mm，1.7&mu m色谱柱；流 速为1.5mL/min，背压为1740psi，35%异丙醇等度洗脱，温度为40℃。（B）使用两根CHIRALPAKAS-H 4.6x150mm色谱柱（每根均为5&mu m）。流速为3mL/min，背压为2175psi，23%异丙醇共溶液等度洗脱；温度为50℃。 图4是在ACQUITY UPC2BEH色谱柱上得到的未经处理和经热应激的Flrpic UPC2/UV色谱图。对于经热应激的样品，会观察到一个多出的峰，如图4B所示。两个峰的质谱完全相同（结果未示出）。对紫外光谱更仔细地观察发现（如图5所示），图4B中的各个峰的紫外光谱并不相同。与图3B中所示的对映体不同，这些对映体的紫外光谱是相同的。图4B中的小峰的最大吸收波长&lambda max为245 nm，而主峰的最大吸收波长&lambda max为251nm。这些结果说明，经热应激的样品已经发生了异构化，生成了另一种同分异构体，这类似于升华过程中所观察到的一样5,6。因为总分析时间短于5分钟，UPC2 能够实现在升华后对材料纯度的快速测定，并可作为设备制造之前的质量控制方法。 图4 在ACQUITY UPC2 BEH3x100mm，1.7&mu m色谱柱上、等度洗脱（35%辅助溶剂）条件下得到的：（A）未经处理的Flrpic和（B）经热应激的Flrpic的UPC2/UV色谱图。流速为1.5 mL/min；背压为2175psi；35%异丙醇辅助溶液等度洗脱； 温度为40℃。 图5 一对Flrpic同分异构体的紫外光谱。 理论上讲，每个同分异构体均包含一对对映体。因此，我们尝试同时分离经热应激的Flrpic的四个异构体，如图4B所示。得到的紫外光谱图如图6所示。E1/E1' 和E2/E2' 是两对对映体，而E1/E2和E1' /E2' 是两对同分异构体。 图6 使用两根CHIRALPAK AS-H4.6x150mm色谱柱（每根均为5&mu m）得到的：（A）未经处理的Flrpic和（B）经热应激的Flrpic的UPC2/UV色谱图。流速为3mL/min，背压为2175psi，23%异丙醇共溶液等度洗脱；温度为50℃。 图6中的异构体分离结果超过了简单分析的结果。作为发光设备中所用的环金属铱配合物的主要纯化方法，升华会引起不利的分子内热异构化，如图2、4、6及其他图所示5-6。因此，用在设备中的是异构体混合物而不是纯物质，通常导致性能下降，寿命缩短。图6所示分离说明了超临界色谱有望替代升华成为这些材料的纯化方法。 图7是使用半制备超临界色谱得到的经热应激的Flrpic的SFC/UV色谱图。可以得到所有四种异构体的基线分离度。在50℃下，使用异丙醇作为共溶液，纯异构体可在温和的条件下进行回收，从而降低了异构体形成的可能性。应当指出的是，虽然图6B和图7都是在相同的色谱条件下获得的，但是图6B中的分离度远高于图7中的分离度。分离度的提高很大程度是由于UPC2统体积最小化，因而引起峰分散度降低。 图7 在沃特世InvestigatorSFC系统上使用CHIRALPAK AS-H4.6x150mm色谱柱（每根均为0.5&mu m）得到的经热应激的Flrpic的SFC/UV色谱图。流速为3mL /min ，背压为2175p si ，23%异丙醇辅助溶液等度洗脱；温度为50℃。阴影区域表示收集的组分。 结论 在本应用中，我们论述了使用超高效合相色谱对铱均配物Ir（Fppy）3 和铱杂配物Flrpic异构体进行的分离。对于Ir（Fppy）3 ，面式和经式同分异构体可以轻易地在5分钟以内得以分离。对于Flrpic，四种异构体，无论是同分异构还是光学异构，均要在一次分离操作中实现同时分离。 本文提出的分离方法可提升用于纯化评估的传统分析技术的水平。而纯化评估是合成、工艺和OLED设备和相关材料生产的一个分析难题之一。此外，其中的超临界流体技术也能够把UPC2 方法转换到半制备型超临界色谱仪器的制备方法，从而对目标物质进行分离。 参考文献 1. Kappaun S, Slugovc C, List EJW. Phosphorescent organic light-emitting devices: Working principle and iridium based emitter materials. Int J Mol Sci. 2008 9: 1527-47. 2. Tamayo B, Alleyne BD, Djurovich PI, Lamansky S, Tsyba I, Ho NN,Bau R, T hompson ME. Synthesis and characterization of facial and meridional tris-cyclometalated iridium(III) complexes. J Am Chem Soc. 2003 125(24): 7377-87. 3. McDonald AR, Lutz M, von Chrzanowski LS, van Klink GPM, Spek AL, van Koten G. Probing the mer- to fac-isomerization of triscyclometallated homo- and heteroleptic (C,N)3 iridium(III) complexes.Inorg Chem. 2008 47: 6681-91. 4. Coughlin FJ, Westrol MS, Oyler KD, Byrne N, Kraml C, Zysman-Colman E, Lowry MS, Bernhard S. Synthesis, separation, and circularly polarized luminescence studies of enantiomers of iridium (III) luminop. Inorg Chem. 2008 47: 2039-48. 5. Baranoff E, Saurez S, Bugnon P, Barola C, Buscaino R, Scopeletti R,Zuperoll L, Graetzel M, Nazeeruddin MK. Sublimation not an innocent technique: A case of bis-cyclometalated iridium emitter for OLED.Inorg Chem. 2008 47: 6575-77. 6. Baranoff E, Bolink HJ, De Angelis F, Fantacci S, Di Censo D, Djellab K,Gratzel M, Nazeeruddin MK. An inconvenient influence of iridium (III)isomer on OLED efficiency. Dalton Trans. 2010 39: 8914&ndash 18. 7. Sivasubramaniam V, Brodkord F, Haning S, Loebl HP, van ElsbergenV, Boerner H, Scherf U, Kreyenschmidt M. Investigation of FIrpic in PhOLEDs via LC/MS technique. Cent Eur J Chem. 2009 7(4): 836&ndash 845.

~遵循电荷异构体检测法规 引领精准检测技术新趋势~近年来，蛋白类生物药受到越来越多的关注和重视，2023年美国FDA批准的新药和生物制品名单中有24种蛋白药物[1]。抗体类蛋白药物在生产、储存和运输过程中发生的潜在变化，可能会导致产品中发生分子量、氨基酸残基的修饰、糖型等非均一性从而导致产生对应的电荷异构体。根据ICH Q6B的规定，生物制药需要对电荷异构体这种产品相关物质和产品相关杂质进行质量控制，以确保产品的安全性、有效性和一致性，满足各国药品监管机构的要求。在电荷异构体的分析检测中，全柱成像毛细管等电聚焦（icIEF）是一种不可或缺的分析手段，也是目前产品放行的法定方法。在2020版中国药典《人用重组单克隆抗体制品总论》和2025版中国药典公示稿《3129 单抗电荷变异体测定法》通则中都收录了icIEF作为电荷异构体检测的药典标准方法。AES(艾易尔斯生物)作为行业内唯一能够提供从载体两性电解质、卡柱、pI 标记物到分析型、制备型和质谱在线联机的icIEF全方面解决方案的供应商，与赛默飞强强联手共同推出icIEF-Orbitrap的联用分析解决方案，并与国内外生物制药客户合作发表系列研究成果，引领行业的发展[2-11]。CEInfinite全柱成像毛细管等电聚焦电泳与Orbitrap Exploris系列超高分辨液质联用仪~应对电荷异构体分析三大难题 提升生物制药质控需求~随着监管要求的提高，药物研发阶段和某些生产控制阶段需要制备毫克级电荷异构体，以便用于肽图分析、修饰位点确定和效力测定。然而，现有的icIEF技术在制备效率低、难以获得毫克级电荷异构体和制备重现性不佳方面存在行业难题。针对这些痛点，赛默飞与AES合作带来了创新解决方案。● 应对挑战一：攻克毫克级电荷异构体制备挑战，引领制备技术新突破AES的CEInfinite平台的制备型icIEF功能，能够在无人值守的情况下实现高效且可重现的馏分收集。每次运行可自动完成足量的馏分收集，满足肽图谱分所需且能够准确定义每个馏分的间隔，实现每天20-30次的高通量操作，能够快速提供大量可重现的样品用于后续在Orbitrap高分辨质谱上完成肽图测试，为新药的快速上市和生产流程的优化提供强有力的支持。▲ 高重复性：在迁移过程中可以保持峰形，从而确保高重现性▲ 高分辨率和高纯度：pI差异0.1 的峰即可分馏制备，纯度可以做到100%▲ 高产量：制备量高达 8 μg/次，250 μg/天，4天即可获得 1 mg▲ 减少劳动力：自动化、温控，并尽量减少用户干预图1: CEInfinite采用压力推动的制备模式，可以实现液相色谱级别的稳定性和重现性图2: 离线制备 Pembrolizumab 电荷异构体[5]图3: 制备获得的Pembrolizumab 电荷异构体的纯度确认[5]图4: Pembrolizumab 电荷异构体中氧化修饰的信息汇总[6]● 应对挑战二：提升电荷异构体分析的分辨率和灵敏度除了肽图分析以外，CEInfinite icIEF 与Orbitrap 超高分辨质谱仪联用的优势，包括采用 Denative MS 和Native MS 模式，实现 icIEF-Native MS 以进行各种蛋白药物进行有效分析，这种集成解决方案不仅提升了蛋白质电荷异构体分析的分辨率和灵敏度，还确保了操作的高效性和数据的合规性，为生物制药行业提供了一个先进、可靠的分析平台[10]。▲ 高分辨率、高灵敏度的质谱分析：Orbitrap具有极高的分辨率和灵敏度，使得蛋白质电荷异构体的分离和识别更加精准，能够检测到低丰度的电荷异构体，确保在复杂样品中获得可靠的数据，有助于发现和分析低浓度的蛋白质变体，提升分析的全面性。▲ Native MS 模式：独一无二的icIEF-Native MS 的模式，能够在保持样品天然状态的情况下进行质谱分析。这对于 ADC药物的电荷异构体表征尤其重要，能够准确地分析复杂生物药物的电荷异构体，为药物开发和质量控制提供了强有力的工具。▲ 统一管控满足合规要求：变色龙软件可以统一管理 CEInfinite icIEF 和 Orbitrap 的操作，提供强大的数据处理和管理功能，能够有效存储和分析数据，并提供数据审计跟踪，可自动生成合规性文档和记录，满足行业标准和法规要求。图5: 变色龙同时控制CEInfinite icIEF 和 Orbitrap Exploris 240[10]图6: 变色龙支持CEInfinite icIEF 的数据采集和数据处理[10]图7: CEInfinite icIEF与Orbitrap联用在线检测NIST mAb[2]● 应对挑战三：药物结构复杂性带来的电荷异构体分离挑战随着蛋白药物从最初单抗已经发展出了抗体偶联药物、小分子偶联药物、多肽偶联药物、抗体寡核苷酸偶联物等各种新颖的药物，这些药物结构的复杂性也给icIEF的分离带来了挑战，而只有得到很好的分离才能进入下一步的制备工作，这里面最核心就是载体两性电解液。利用AESlyte® 的载体两性电解质能够显著提高icIEF方法的分辨率，与传统载体两性电解质相比，AESlyte系列不仅具有更严格的批次间质量控制，还能够在复杂样品中实现更高的基线分辨率。另外通过优化不同的AESlyte组合以及定制化载体两性电解质，CEInfinite平台可以精确分离每个电荷异构体，从而为后续的肽图分析和质量属性研究奠定坚实基础。▲ 30 个两性电解质覆盖pH 2.5-12.0和40 个pI标记物从2.85 到 11.20。▲ 定制的两性电解质可根据要求匹配之前使用其他两性电解质的历史icIEF分析图谱。▲ 针对复杂蛋白如 ADC、双特异性抗体、融合蛋白、AAV和脂质纳米颗粒进行优化，确保结果可靠且可重复，保证长期稳定的供应。图8: 现有的载体两性电解质产线图图9: AESlyte载体两性电解液用于NISTmAb和Etanercept图10: 现有的 pI 标记物产线~提升质控需求，助力应对出海挑战~电荷异构体分析中，icIEF分析方法能满足国内外法规要求，icIEF-Orbitrap联用技术能进一步提升对生物制药的质控水平，生物制药头部跨国企业多家均配备了该套方案，以用于对生物制药中电荷异构体杂质的管控，该方案能进一步引领分析技术水平的提升，帮助国内生物制药企业应对新药出海的挑战，增强竞争力！参考文献：1. http://www.phirda.com/artilce_34778.html?cId=1&module=trackingCodeGenerator2. T. Kwok, et al. Imaged capillary isoelectric focusing tandem high-resolution mass spectrometry using nano electrospray ionization (ESI) for protein heterogeneity characterization. Analytical Biochemistry 2023, 680, 115312. doi: 10.1016/ j.ab.2023.1153123. W. Fan, et al. Integrating ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and imaged capillary isoelectric focusing for in-depth characterization of complex fusion proteins. Rapid Communicationsin Mass Spectrometry. 2023, 37, e9484. doi: 10.1002/rcm.94844. T. Kwok, et al. Fractionation and online mass spectrometry based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) for characterizing charge heterogeneity of therapeutic antibody. Analytical Methods.2023, 15, 411-418. doi: 10.1039/D2AY01670B5. Zhang, et al. Imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) tandem high resolution mass spectrometry for charged heterogeneity of protein drugs in biopharmaceutical discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023 224:115178. doi: 10.1016/j.jpba.2022.115178.6. X. Zhang, et al. In Depth Characterization of mAb Charge Variants with icIEFFractionation Followed by Peptide Mapping Analysis. ASMS poster,2021, PO66105.7. G. Wu, et al. Mass Spectrometry-Based Charge Heterogeneity Characterization of Therapeutic mAbs with Imaged Capillary Isoelectric Focusing and Ion-Exchange Chromatography as Separation Techniques. Analytical Chemistry 2023, 95, 2548–2560. doi: 10.1021/acs.analchem.2c050718. X. Zhang, et al. Cutting-edge mass spectrometry strategy based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) technology for characterizing charge heterogeneity of monoclonal antibody. Analytical Biochemistry, 2023, 660, 114961. doi: 10.1016/j.ab.2022.1149619. Gang Wu, et al. Mass spectrometry study on SARS-CoV-2 recombinant vaccine with comprehensive separation techniques to characterize complex heterogeneity. Analytica Chimica Acta, 2024, 1297, 342348. doi: 10.1016/j.aca.2024.342349.10. X. Zhang, et al. Imaged capillary isoelectric focusing – Mass Spectrometry (icIEF- MS) online coupling for polatuzumab vedotin charge heterogeneity analysis using native MS. ASMS poster ,2024, PO25811. 艾易尔斯生物科技公众号文章：文章分享丨为您更新：icIEF领域全新进展

近日，清华大学化学系瑕瑜教授课题组采用Waters Cyclic IMS高分辨质谱仪，开发了一种基于离子淌度-质谱、Paternò-Büchi反应-MS/MS的鸟枪法分析流程，实现了对皮脂组超过900种脂质C=C异构体的快速及灵敏分析。 极致淌度分辨率和多种且可灵活组合的碎裂模式 实现对皮脂组在精细结构层级上的定性定量 首先，利用Cyclic IMS可灵活组合的三个CID碎裂池的多种碎裂模式，使用电荷标签PB试剂和光催化剂对脂质C=C的PB反应进行评估。以单不饱和蜡酯WE 18:0/18:1(Δ9)（见图1）为例，其经电荷标签PB反应后，离子化效率可提升约1,000倍。PB产物的MS2 CID产生了指向n-端C=C位置的诊断离子，进一步的pseudo-MS3 CID分析能够识别出Δ-端位置，从而实现WE中FA链上C=C位置的特异性鉴定。研究者们还对WE 18:1(Δ9)/18:0进行了PB-MS/MS分析。无论C=C双键是位于FA链还是FOH链，PB-MS/MS均能实现链特异性的C=C位置鉴定。此外，研究者还对SQ的C=C进行了PB-MS1和PB-MS2 CID分析，成功鉴定了SQ中各个C=C双键的位置。 图1. 蜡酯WE 18:0/18:1(Δ9)的PB-MS/MS分析。 在鸟枪法分析皮脂时，采用高分辨率环形离子淌度谱（Cyclic IMS）出色的离子淌度分辨率，对来自含多一个不饱和度脂质的同位素峰（[M+2Da]）进行分离（见图2）。研究表明，经过10圈Cyclic IMS分离（分辨率约260），WE 36:2/WE 36:1 (5:1)的PB产物中，[M+2Da]干扰由60%显著降至4%。此方法相较于反相色谱法（干扰6%），干扰更少，分离速度也更快（ 图3. 皮脂的分析工作流程。 论文作者 论文第一作者是清华大学博士研究生施恒学，通讯作者是清华大学化学系瑕瑜教授。点击此处查看文献原文。 图4.清华大学博士研究生施恒学。 Waters Cyclic IMS助力深度前沿科学研究 环形离子淌度质谱，自横空出世以来，就吸引着各领域研究者们的目光。经过近两三年的孵化测试，环形离子淌度质谱仪SELECT SERIES Cyclic IMS，已被成功应用于生物、医疗、化工、制药、食品及环境等前沿科学研究领域，特别是在蛋白结构、糖结构、金属配合物、中药天然产物、未知物化合物或结构类似物表征方面，都有着非常强大的用途。 更多Cyclic IMS已发表文献，请点击此处下载。