蛋白质细胞

1. “真”单细胞蛋白质组学引领者2019年8月12日，Nature Methods编辑Vivien Marx在Nature Methods上在线发表了题为“A dream of single-cell proteomics”的文章，蛋白质组学领域的领军人物之一苏黎世联邦理工学院Ruedi Aebersold教授在文章中评论到“It’s early days, but it’s not a distant dream to be able to tally the proteins in single cells” 。巧合的是，2019年也是基于timsTOF Pro的4D-蛋白质组学技术开始腾飞的一年。 2020年12月蛋白质组学领域两大领军科学家Matthias Mann团队（Max Planck Institute of Biochemistry)和Ruedi Aebersold团队（ETH Zurich）在Nature Methods发表题为“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition”的文章，其共同开发的基于4D平台的DIA技术——diaPASEF，能够全面提升蛋白质鉴定覆盖率、重现性和定量准确性。因此，4D-DIA技术大幅提升的可靠性，之前不太被大家认可的DIA（数据非依赖性采集）技术真正开始大步向前，也是从此刻开始，4D-蛋白质组学技术的发展一发不可收拾。2021年11月2日，在第69届ASMS会议上，布鲁克公司发布第一代单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP，“真”单细胞蛋白质组学方案横空出世，全球首台商品化timsTOF SCP落户于广州，表明在单细胞蛋白质组学领域中国研究者的前瞻性。在timsTOF SCP发布的第一年，单个HeLa细胞蛋白质鉴定已经接近2500种，即使在现在，这个单细胞鉴定深度也是其它质谱仪所不能企及的。这也让蛋白质组学领域领军科学家之一Matthias Mann教授发出了"I always said that single cell proteomics would not happen in my lifetime, but I'm happy to have been proven wrong。" 这样的感叹。2. “真”单细胞蛋白质组学质谱进化到第二代，可以上车了 2023年6月5日，在第71届ASMS会议上，布鲁克公司继续在“真”单细胞蛋白质组学上发力，重磅发布了timsTOF Ultra，“真”单细胞蛋白质组学质谱发展到第二代。timsTOF Ultra配备新型Captive Stray（CSI）Ultra离子源，第四代TIMS（捕集离子淌度）XR离子淌度和14位数模转换器，MSMS扫描速度提升到300Hz，继续占据MSMS扫描速度的头把交椅。 以HeLa细胞为例，人们一般认为单个细胞的蛋白质含量为200-250pg，于是有人将250 pg的进样量的蛋白鉴定数目等价于单细胞蛋白质组鉴定数目，但实际上系列稀释样本可以用来部分表现仪器灵敏度，无法代表真正单个细胞蛋白鉴定水平，“真”单细胞蛋白质组学的数据才是检验质谱灵敏度的唯一标准。布鲁克公司在第一代“真”单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP上积累的宝贵经验和技术，在第二代timsTOF Ultra上完全得到了释放，通过CellenOne对HeLa细胞分选，获取1个、5个和10个细胞，采用dia-PASEF方法进行数据采集，Spectronaut 18数据分析，单个细胞22min可以鉴定超过3700种蛋白质（每个样本3针重复），1个HeLa细胞两次重复所鉴定的蛋白质强度相关系数0.95，显示出低至1个细胞的进样量也能得到高重复性。 德国柏林马克斯德 尔布吕克分子医学中心空间蛋白质组学研究小组负责人Fabian Coscia博士采用第一代“真”单细胞蛋白质组学质谱timsTOF SCP进行FFPE组织的单细胞分析，单个肝细胞当量的组织可以定量1500-2000种蛋白质。timsTOF Ultra灵敏度的提升，必将在FFPE组织的单细胞分析中发挥更强大的威力。3. “真”单细胞蛋白质组学主打“成熟可复制”单细胞蛋白质组学研究是一项复杂而前沿的科研领域，涉及许多挑战和门槛，比如用什么技术进行单个细胞的分选、分选后对单个细胞操作时怎么尽可能将低样本损失、质谱的灵敏度能否达到单细胞蛋白质组学所需灵敏度，这些挑战和门槛让很多研究者对单细胞蛋白质组学望而却步。布鲁克推出的一套完整的“真”单细胞蛋白质组学方案，把单细胞蛋白质组学研究的这些挑战和门槛全部打破，主打一个“成熟可复制”，甚至没有蛋白质组学经验的人也可以快速上手，短时间内就可产生高质量单细胞蛋白质组学数据。小结得益于质谱技术的进步，单细胞蛋白质组学领域将很快迎来爆发，布鲁克timsTOF Ultra的发布，必将成为单细胞蛋白质组学领域爆发的强劲动力。timsTOF Ultra超越了传统的限制，为新的科学可能性打开了大门。无论是单细胞蛋白质组学、免疫肽组学或者血浆蛋白质组学，timsTOF Ultra提供了无与伦比的扫描速度和灵敏度，帮助研究人员打破工作的界限并取得突破性成果。参考文献1. Marx, V. A dream of single-cell proteomics. Nat Methods 16, 809–812 (2019). 2. Meier, F., Brunner, AD., Frank, M. et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods 17, 1229–1236 (2020). 3. Brunner, AD., Thielert, M., Vasilopoulou C. et al. Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation. Molecular Systems Biology (2022)18:e107984. Makhmut, A., Qin, D., Fritzsche, S., et al. A framework for ultra-low input spatial tissue proteomics. bioRxiv 2023.05.13.540426

近日，华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋、朱麟勇、陈显军团队在活细胞蛋白质标记与成像研究中取得重要进展，相关研究在《细胞发现》发表。 人造荧光蛋白及荧光探针。华东理工供图生物过程可视化一直吸引着科学家的好奇心。不同类型的荧光成像工具可以帮助科学家观察生命体中多种生物事件的发生过程，其中最著名的是荧光蛋白标记技术。荧光蛋白及其衍生技术经历了近30年的飞速发展，为生物学各个领域的研究作出了极大贡献，但伴随着显微镜技术的飞速发展，现有荧光蛋白的性质已经难以适应新型仪器的成像要求。相比之下，基于蛋白质标签和激活型荧光团的荧光标记工具凭借其理化性质成为新的研究热点。该团队针对自催化蛋白质标签SNAP-tag，设计开发了高信噪比的青色人造荧光蛋白SmFP485。SmFP485的荧光产生十分迅速，避免了荧光蛋白生色团成熟导致的延迟，因此可以用于实时监测蛋白质的合成过程。研究团队随后对SmFP485的结构进行了解析，探究了人造荧光蛋白的荧光激活原理。在此基础上，研究团队通过化学进化方法设计出一系列光谱覆盖绿色到近红外波段的人造荧光蛋白，它们均具有高亮度和高信噪比特点，特别是其在近红外波段的亮度已远超现有成像工具，能够对活细胞以及活体动物中的蛋白质表达、蛋白质降解、蛋白质组装、蛋白质相互作用以及蛋白质运输进行原位实时标记与成像。最后，研究团队在多色人造荧光蛋白的基础上，采用蛋白质与荧光团共进化的方法设计开发出一系列光谱涵盖青色到近红外波段的钙离子遗传编码荧光探针，实现了对哺乳动物细胞中钙离子震荡的实时监测，为荧光探针的构建提供了新的荧光载体。综上，研究团队开发了一系列高性能人造荧光蛋白，它们具有荧光产生迅速、亮度高、信噪比高、光谱范围广等优点，为活细胞以及活体动物中蛋白质的可视化提供了有力工具，同时也为荧光探针的构建提供了新的思路和策略。

p 　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。 /p p style=" text-align: center " img width=" 400" height=" 284" title=" 1.jpg" style=" width: 400px height: 284px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。 /p p 　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。 /p p 　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。” /p

蛋白质的快速降解使得细胞在受内源或者外源刺激时可以对蛋白质丰度进行快速调节。短半衰期蛋白质在细胞内很多生物学过程起重要作用，比如细胞周期的每一步都受短半衰期蛋白质的严密调控。稳定同位素瞬时标记结合质谱是测量蛋白质半衰期的常用手段。但受技术本身的一些限制（长标记时间，样品复杂度，tRNA重置，以及内源氨基酸重利用等），稳定同位素结合质谱法对短半衰期蛋白质的覆盖度非常低，更适合于中长半衰期蛋白质的研究。短半衰期蛋白质仍然是人类蛋白质组中缺失的一部分。2021年10月8日，哈佛大学医学院Steven P. Gygi研究组（李嘉铭博士为第一作者，Brian L. Harry为共同通讯作者）在Molecular Cell上在线发表文章Proteome-wide mapping of short-lived proteins in human cells，对人类细胞中翻译抑制条件下的短半衰期蛋白质进行了大规模鉴定。作者使用了广谱蛋白质翻译抑制剂Cycloheximide结合16通道串联质谱标签的方法，利用FAIMS结合实时搜库策略在人源HEK293T, U2OS, RPE1以及HCT116细胞系中对蛋白质半衰期进行了测量。串联质谱标签结合FAIMS以及实时搜库策略可以兼具蛋白质覆盖度以及半衰期测量的精确度，最终作者在每个细胞系中定量到约9000个蛋白质，每个细胞系中约400-500个蛋白质被鉴定为短半衰期蛋白质（半衰期小于8小时），其中约100个蛋白质的半衰期小于2小时。最终在4个细胞系中一共鉴定到1017个短半衰期蛋白质。系统性分析发现，和其它蛋白质相比，短半衰期蛋白质丰度较低，热不稳定，在进化上更年轻，具有更低的mRNA和蛋白质相关性，存在于较小的蛋白质复合体中。后续差异分析发现103个短半衰期蛋白质在细胞系之间存在显著不同的稳定性。其中，ATRX蛋白质和GMDS蛋白质被证实分别在U2OS细胞和HCT116细胞中以truncation形式存在，并且和全长蛋白质相比，truncation形式的ATRX蛋白质和GMDS蛋白质具有非常低的稳定性。由于广谱蛋白质翻译抑制剂可能引起应激，使得某些测得的半衰期和实际半衰期存在差别，作者将本文的结果和以往稳定同位素结合质谱法的结果进行了比较。首先，和预期相符，稳定同位素法结合质谱法对短半衰期蛋白质的覆盖度非常低；其次，在有限的被两种方法共同定量到的蛋白质中，本文的半衰期结果和稳定同位素法表现出了非常高程度的一致性。这说明本文定量到的短半衰期蛋白质的半衰期非常接近实际条件下的半衰期。每一个短半衰期蛋白质背后都代表着一个蛋白质快速降解的机制，本文提供了一个人类细胞中快速降解蛋白质的详细图谱，后续对降解机制的详细研究会为蛋白质降解作为治疗手段提供思路。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.09.015

人体细胞表达的蛋白质种类超过几万种，而不同的蛋白质在细胞的定位也不一样。蛋白质亚细胞定位还会涉及到细胞功能异常和疾病。而空间蛋白质组学正是研究蛋白质在亚细胞上的定位、表达及其在亚细胞水平上的动力学，属于蛋白质组学的研究范畴。目前研究空间蛋白质组学分析的方法主要有两种：基于细胞器分离的质谱法和基于成像的蛋白质定位方法。 近期上海同济大学的朱小立研究团队在国际期刊Science Advances 发表题为“Computer-aided design of reversible hybridization chain reaction(CAD-HCR) enables multiplexed single-cell spatial proteomics imaging”的研究文章，该研究报告了一种高灵敏度和多重成像的空间蛋白质组学技术。　　杂交链式反应（HCR）是一种公认的稳健的扩增系统，并已应用于各种生物标志物分子的扩增检测。本研究开发一种可逆HCR，将HCR与DNA交换技术相结合，并利用计算机辅助设计（CAD）技术，通过与免疫识别相结合，可逆的CAD-HCR有望用于空间蛋白质组学分析。 研究人员通过多种实验对CAD-HCR的应用进行验证。使用荧光染料修饰HCR的发夹结构以验证扩增效果，结果显示扩增效果比未扩增的情况下增强约65倍，并且与常规免疫荧光相近，有利于后续成像。目的蛋白表达改变时，可逆HCR的蛋白丰度与荧光强度呈正相关，表明可逆CHR可用于目标蛋白的半定量分析。　　文章还对可逆HCR循环成像能力进行研究。在10个循环内，成像结果几乎相同，说明在不影响细胞形态的情况下实现染色和脱色循环。循环期间信号稳定输出，证明一抗的抗原性和引发剂的杂交能力也未受影响。可逆HCR解决了传统免疫荧光技术无法实现的荧光光谱重叠的问题，提供样品重复使用性，具有重要价值。　　最后研究人员使用可逆HCR对分布在单个细胞内不同亚细胞位置的9种蛋白质进行多重成像分析。结果显示9种蛋白质的分布与其理论亚细胞定位一致，并且能够很好的共定位，说明可逆HCR在亚细胞上的空间定位具有高精度，可用于单细胞蛋白质组学成像。 总之，结合CAD技术，研究团队开发了一种可循环和可逆的HCR技术，这种创新的HCR系统成功地应用于单细胞水平的空间蛋白质组学的敏感成像分析，目标蛋白的半定量和亚细胞定位可通过常规的激光共聚焦显微镜实现，可广泛用于大多数实验室，在临床诊断和生物医学研究中具有更大的应用潜力。

细胞异质性作为细胞系统中一种普遍存在的现象，受到生物研究领域的日益关注。在传统的群体分析中，单个细胞的独特差异往往被整体的平均值所掩盖，而这些被忽略的细节恰恰构成了细胞分化过程中的关键线索。随着微阵列芯片、核酸测序、质谱等技术的进步，对单一细胞进行基因组、转录组、代谢组和蛋白组分析已不再遥不可及。特别是核酸扩增技术的进步极大地推动了基因组、转录组在单细胞层面的测序技术的应用。尽管取得了这些进步，但在单细胞层面对蛋白质和代谢物的分析仍然面临重大挑战，这主要是由于它们的量有限且缺少有效的扩增手段。本文提出了一种新的策略，通过一次性单细胞蛋白质组和代谢组分析（scPMA），可以在单次LC-MS/MS分析中同时获取单个细胞的蛋白质和代谢物信息。通过这种策略，研究人员能够整合单个细胞的多组学数据，以深入理解细胞内部相互作用的网络和调控细胞状态的复杂机制。scPMA策略共包括以下三个部分（图1）：单细胞捕获及分离、纳升级样品预处理、一次性LC注入和质谱检测。前两个环节都是基于课题组前期自制的机械装置操作完成的，最后一部分才是scPMA策略的亮点。在常规分析流程中，由于蛋白质组和代谢组在物理化学特性上的根本差异，它们通常需要匹配不同的质谱检测技术。因此，在传统的样本预处理阶段，蛋白质和代谢物会被分离，随后各自经历特定的处理流程，并最终分别进行LC-MS/MS检测。然而，这些额外的分离和处理步骤不仅增加了分析的复杂性，而且往往不可避免地会导致样本的损失，特别是在处理单细胞水平的微量样本时，这种损失尤为显著，可能对研究结果的准确性和可靠性造成影响。基于此，作者希望能够开发一种易于使用的方法来实现同一单细胞个体的蛋白质组和代谢组同步分析。图1 一次性单细胞蛋白质组和代谢组同步分析示意图实际上，代谢物和蛋白酶切后的肽段在C18反相色谱柱上的保留时间是存在差异的。如图2所示，在作者设置的45 min梯度下，大部分A549细胞酶切的肽段在9至17 min的范围内就已流出（图2a），而此时流动相中乙腈的最高含量仅为40%。而A549细胞产生的代谢物则主要分布在17 min之后，只有极少部分是在17 min以前流出（＜10）（图2b）。导致这些现象的根本原因是肽段与代谢物之间疏水性的差异，因此，该策略更适合蛋白组与有一定疏水性的代谢物分析。得益于C18的有效分离，可以在色谱梯度的不同时间段针对不同的样本成分（肽段/代谢物）设置不同的质谱检测参数（图2c）。有效的色谱分离加与之匹配的双区域质谱检测便可实现一次性单细胞蛋白质组和代谢组双重分析。与之前的单组学的结果相比，scPMA策略在定量深度上并无明显差异（图2d-f）。图2 单蛋白质组和代谢组分析与scPMA的性能比较 通过scPMA策略，研究者们能够对单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）进行双重组学分析，平均定量了816、578和293个蛋白质以及72、91和148个代谢物。并利用UMAP聚类和随机森林机器学习模型，基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息，实现了对细胞类型的初步分类（图3、4）。根据结果可得知，细胞在代谢组中的异质性要大于蛋白组。图3 scPMA策略分析单个肿瘤细胞（包括A549、HeLa和HepG2细胞）图4 基于单细胞的蛋白质组、代谢组和双重组学信息对细胞进行分类随后，作者还利用scPMA方法在单细胞水平上研究了多柔比星对肿瘤细胞的诱导作用（图5）。对比药物处理组的各个单细胞样本发现给药后不同的单细胞在蛋白质表达上存在着异质性，这也是在群体分析中无法观察到的现象。与未给药的细胞相比，给药组共鉴定出255个差异蛋白(图5b、c)，一些肺癌细胞中过表达的蛋白显著降低。大部分的差异蛋白涉及的通路与DNA、染色质、核小体的合成有关（图5g）。同样，给药组和未给药组中鉴定出的代谢物也被用于UMAP聚类(图5d)和差异分析。差异分析结果(图5e、f)显示，93种代谢物有差异表达。其中，多柔比星仅在给药组检测到。值得注意的是，在给药组的各个细胞中，多柔比星丰度有明显的离散分布，甚至有10倍的丰度差异。这一结果表明不同的细胞个体具有不同的药物吸收水平，从而表现出明显的细胞异质性，这可能为进一步深入探索提供启发。基于差异蛋白质组和代谢组信息，利用MetaboAnalyst 5.0进行联合通路分析，分别富集出62条和234条相关通路。其中有37条显著相关的通路涉及的差异蛋白和代谢物与核糖体、DNA复制等药物作用机制有关（图5i）。图7.氘代差异分析流程示意图这些结果展示了scPMA策略在单细胞分析中的潜力，尤其是在药物干预研究中的应用前景。同时，这项工作也证明了一次性获取单细胞蛋白质组和代谢组信息的可行性，为未来在细胞分化、衰老和肿瘤免疫等领域的研究提供了新的工具。本文2024年发表在Analytical Chemistry上，One-Shot Single-Cell Proteome and Metabolome Analysis Strategy for the Same Single Cell。该文章的通讯作者是来自浙江大学化学系微分析系统研究所的方群教授。

近日，大连化学物理研究所生物技术研究部生物分子高效分离与表征研究组(1810组)赵群研究员和张丽华研究员等人与中国科学院精密测量科学技术创新研究院龚洲副研究员合作，提出了利用原位化学交联—质谱技术(in vivo XL-MS)，解码细胞中蛋白质动态结构的策略。该策略将AlphaFold2的结构作为先验信息，结合in vivo XL-MS数据与多种结构计算方法评估结构与交联信息的匹配度，重构了细胞内多种蛋白质，尤其是多结构域蛋白质和固有无序蛋白质(intrinsically disordered protein，IDP)的原位动态结构。为深入研究蛋白质在细胞微环境中发挥功能的分子机制提供技术支撑。活细胞内蛋白质的原位动态结构对于揭示其生物学功能至关重要。随着深度学习算法助力蛋白质结构预测的发展迭代，AlphaFold2实现了对蛋白质结构的全面预测，然而该方法对柔性区域的结构预测仍面临挑战。近年来，in vivo XL-MS以高通量、高灵敏，且对蛋白质纯度要求低等优势，在解析活细胞内蛋白质的原位动态结构方面展示出重要潜力。张丽华团队一直致力于in vivo XL-MS新技术研究，实现了蛋白质原位构象和相互作用的规模化解析(Anal. Chem.，2020；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2022；Anal. Chem.，2023；Angew. Chem. Int. Ed.，2023；Nat. Commun.，2023)。 　　本工作中，针对多结构域蛋白质，研究团队提出了将结构域作为整体，利用结构域间的XL-MS数据对细胞内蛋白质动态结构建模，实现了三种多结构域蛋白质——钙调蛋白、hnRNP A1和hnRNP D0在细胞内的动态结构表征。此外，针对IDP，研究团队提出了两种互补的结构表征策略：一是将XL-MS信息直接转换为距离约束用于IDP的结构计算，二是首先使用全原子分子动力学模拟进行无偏采样，然后基于XL-MS数据对采样结构进行评估和筛选。利用这两种策略，研究团队解码了高迁移率组蛋白HMG-I/Y和HMG-17在细胞内的动态系综构象。 　　上述成果以“Decoding Protein Dynamics in Cells Using Chemical Cross-Linking and Hierarchical Analysis”为题，于近日发表在《德国应用化学》(Angewandte Chemie International Edition)。该工作的第一作者是1810组博士研究生张蓓蓉。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青促会等项目的资助。

基于单细胞层面的研究为生物系统中细胞间的同质性和异质性提供了更精准的信息，随着蛋白质组学技术的快速发展，检测技术和灵敏度的提升，使实现单个体细胞的蛋白质组学分析成为可能。 为推动单细胞蛋白质组学的发展，拓展单细胞研究的视野，布鲁克和景杰生物将于2021CNHUPO会议期间联合举办“单细胞蛋白质组学专题卫星会”，线上线下同步进行，诚邀您与会。会议时间：2021年10月14日12:30-13:35 现场参会地点：武汉 东湖宾馆 1楼 晴川厅 网络同步直播：请加微信报名 13370119923特 邀 嘉 宾会 议 日 程12:30 - 12:35 欢迎致辞及公司介绍 何磊 布鲁克道尔顿中国区经理12:35 - 12:50 timsTOF SCP 带您突破单细胞蛋白质组学研究极限 刘先明 布鲁克道尔顿中国区蛋白质组学及生物制药应用经理12:50 - 13:20 单细胞高维度蛋白检测技术及临床应用 丁显廷 教授 上海交通大学生物医学工程学院13:20 - 13:35 真于心，单于一，基于质谱的单细胞蛋白质组学 顾宏博 博士 杭州景杰生物科技股份有限公司线下注册参会：请加微信报名 13370119923* 本次卫星会将为现场参会人员提供午餐和礼品！抽奖活动在线上和线下同步进行！ 会议咨询：13370119923 期待您的参与！

近期，浙江大学化学系方群教授团队在国际权威期刊《Nature Communications》上发表了题为“Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell”的研究成果，创新性地提出了PiSPA（Pick-up Single-cell Proteomic Analysis）技术用于单细胞蛋白组分析。该工作流程利用纳升级微流控液滴操控机器人，可以实现单细胞精准捕获、样本前处理以及自动进样，利用布鲁克tims TOF Pro质谱仪在单个哺乳动物细胞内实现了超过3000种蛋白的定量深度。作者通过此项技术对三种不同的哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）进行单细胞蛋白质组学研究，以及研究了HeLa细胞在迁移过程中的细胞异质性，均展现了超高的定量分析深度。PiSPA平台的单细胞捕获过程是基于SODA（Sequential Operation Droplet Array）技术开发的微流控液体处理系统，可在“点取式”操作模式下实现自动化纳升级单细胞分选，并且能够基于细胞的明场形态特征或是标记的荧光信号灵活地选择单细胞，具有很高的捕获成功率和指向性。此外，研究人员将商品化的锥形底部内插管改造成阵列化的纳升级微反应器，兼容后续的液相色谱自动进样，可大大提高整个工作流程的可操作性、可靠性和成功率。PiSPA平台可自动完成单细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测等一系列操作，最大程度降低样品的损失。研究人员利用PiSPA工作流程，对多种哺乳动物单细胞实现了深度覆盖的定量分析。采用优化的胰蛋白酶/蛋白比例和色谱梯度，分别通过DDA和DIA扫描模式对A549、HeLa和U2OS三种细胞进行单细胞蛋白组分析，所有质谱数据均使用布鲁克4D蛋白质组学平台——timsTOF Pro进行采集。布鲁克独特的捕集离子淌度技术（TIMS）带了额外一维离子淌度信息，可大大降低样品分析复杂度，极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性，最新一代平行累积连续碎裂技术（PASEF® ）可以实现极高的二级扫描速度和灵敏度，只需要很少量样本就可以达到组学鉴定新深度。在本研究中，timsTOF Pro更是展示了探索单细胞蛋白质组学的能力，在DIA扫描模式下，利用DIA-NN（MBR算法）进行library-free数据检索，可在A549、HeLa和U2OS三种细胞的单细胞样本中，分别平均定量到3008、2926和2259种蛋白质，展现了PiSPA平台在单细胞蛋白组定量分析中的覆盖深度；此外，有2869、2772和1889种蛋白质在至少80%的A549、HeLa和U2OS单细胞样本中被重复定量到，说明了PiSPA平台有很高的重复性和可靠性。为了证明PiSPA平台的实际应用价值，研究人员分析了迁移过程中HeLa单细胞的蛋白质组表达情况。通过细胞划痕实验，选取有明显迁移（n=46）和未发生迁移（n=43）的HeLa单细胞进行定量分析。采用DIA扫描模式，分别平均鉴定到了2544和2893种蛋白质，后续生物信息学分析发现Cdc42、Rac1和RhoA等蛋白在发生迁移的HeLa细胞中发生显著上调，揭示了迁移过程中的焦点粘附和肌动蛋白骨架调节通路发生激活，说明了PiSPA可以作为细胞迁移研究和抗癌药物靶点研究的有效工具。PiSPA工作流程包含了高精度的液体操控、单细胞的精确前处理，结合布鲁克先进的液相色谱-捕集离子淌度谱-四极杆飞行时间质谱仪（LC-TIMS-QTOF MS）进行蛋白质组分析，突破了传统质谱分析在单细胞蛋白组研究领域的技术瓶颈，实现在单个哺乳动物细胞中定量超过3000种蛋白，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在疾病诊断和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。参考文献：1. Wang Y, Guan ZY, Shi SW, et al. Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammaliancell. Nat Commun. 2024 15(1):1279.2. Meier F, Brunner AD, Koch S, et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2018 17(12):2534-2545.3. Meier F, Brunner AD, Frank M, et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 17(12):1229-1236.

原创 飞飞 赛默飞色谱与质谱中国关注我们，更多干货和惊喜好礼齐英姿Literature sharing本次我们分享两篇文章，分别于2022年09月和2022年10月发表于bioRxiv [1-2]，文章内容为在单细胞蛋白质组学领域，使用基于PD3.0_CHIMERYS检索及质谱宽隔离窗口采集的方法，搭配全新的μPAC 色谱柱的赛默飞综合解决方案，提升单细胞蛋白质鉴定的性能。接下来我们分别进行具体的介绍。基于DDA采集模式与单细胞组学的低离子数目的特点，采用更大的隔离窗口，增加共隔离的离子数目，这是一种被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的采集方法，文献中将这个方法称之为宽隔离窗口采集（wide window acquisition ,WWA)策略(如图1所示)。图1：wide window acquisition (WWA)宽隔离窗口采集策略（点击查看大图）PD软件3.0版本自2022年年中发布以来，其对DDA蛋白质组学数据的性能提升有目共睹；如需CHIMERYS的介绍，可具体参考以下链接《好风凭借力：CHIMERYS实现蛋白质组学数据的性能飞跃》——赛默飞orbitrap组学俱乐部公众号点击图片可查看基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，可在一张二级谱图中解析出多个PSMs，擅长于解析WWA采集得到的更加复杂的二级谱图。作为 LC-MS/MS的重要组成部分的低流速液相色谱，对减少样品的复杂度、增加蛋白质组学的鉴定方面的贡献尤为重要，通常我们可以通过拉长色谱梯度等方法来实现更好的分离，而这也会引入包括峰展宽在内的灵敏度的降低及检测通量的降低等问题。而新发布的微柱蚀刻技术的μPAC系列色谱柱，具有高度有序的排列，有助于更加优异的峰宽表现且减小柱残留，低背压的设计也使其可以使用更大的流速，可以更快的上样、清洗及平衡色谱柱，从而增加检测通量(赛默飞提供的综合解决方案如图2所示)。图2：结合了低流速液相色谱、质谱及分析软件的完整综合解决方案（点击查看大图）► ► ► 不同的色谱柱性能比较在色谱柱的比较中，与传统的填充柱相比，作者对比了110cm的第二代μPAC色谱柱与其他两款填充型色谱柱(50cm及25cm)，如图3所示，上样量为12.5ng Hela肽段，30min有效梯度，采用1Th的采集窗口，第二代μPAC色谱柱可以得到蛋白水平66%和肽段水平140%的提升。而比较不同的μPAC色谱柱（5.5cm原型柱、50cm Neo柱和110cm二代柱），使用复杂样品(HeLa, yeast, 和 E. coli按照8:1:1混样)，10ng-400ng的上样区间，蛋白鉴定结果如图3所示。50cm的Neo色谱柱，在30min及60min梯度上具有优异的表现，特别是在低上样量的条件下。我们需要的样品的通量(梯度时间)及样品的复杂度则决定了WWA方法对单细胞样品的适用性，样品通量是单细胞蛋白组学领域的重要关注点，使用5.5cm色谱柱搭配高流速，可实现到~100spd的水平。图3：不同的色谱柱性能比较（点击查看大图）► ► ► 隔离窗口的优化在WWA方法中，若使用了＞4m/z的较宽的母离子隔离窗口，使得临近的母离子被共同碎裂，这时二级谱图会形成类似于DIA采集方法的混合谱，这种方法不仅能增加鉴定数，还能提高鉴定时对低丰度肽段的灵敏度；对不同大小的隔离窗口进行优化，在250pg到400ng的上样区间中，可以看到，更宽的隔离窗口更适合较小上样量的结果，如250pg和1ng的上样量下，隔离窗口12m/z和8m/z为最适效果。搭配于CHIMERYS的检索方法，更大的隔离窗口所提供的谱图复杂度，使得对低丰度肽段有更好的挖掘，拓宽了鉴定的丰度的动态范围。图4：不同上样量条件下隔离窗口的优化（点击查看大图）在质谱方法中，单细胞的样品由于离子数更少，往往需要更高的最大离子注入时间，比如几百个毫秒，这会导致二级谱图数的降低，从而显著的影响鉴定量。此时我们也可以配合使用更高的分辨率，可以识别更加复杂的离子，也就是说，我们可以使用更大的隔离窗口来提供更多的离子进行累积，并且通过高分辨率来识别这些离子，而后我们可以通过PD3.0 CHIMERYS引擎来对这些复杂的混合谱图进行检索。使用经典的窄隔离窗口采集方法，与传统的MS Amanda 2.0 引擎相比，CHIMERYS引擎可提升鉴定量2.6倍；而再加成上宽隔离窗口的WWA采集方法后，则可达到4.6倍的提升水平。图5：CHIMERYS搜索引擎提升蛋白质组学鉴定深度（点击查看大图）另一篇文献中，作者使用0.2ng Hela肽段，对不同的隔离窗口、最大离子注入时间、分辨率等参数进行优化，发现在MS2分辨率为45k和60k时，我们能够得到最多的PSMs鉴定数。在隔离窗口为8或者12Th时，会得到最好的结果。0.2ng Hela的上样量，WWA模式可达到2,396个蛋白鉴定，比普通DDA模式鉴定量增加39%。图5：采用0.2ngHela肽段及40min对WWA模式质谱采集参数进行优化（点击查看大图）在短梯度模式下，峰容量降低，使其谱图的复杂度更高。基于CHIMERYS的破解高度复杂的混合谱的能力，使得更快的色谱分析成为可能。在使用12Th的隔离窗口与60k MS2分辨率的组合条件下，可得到最好的鉴定能力。使用此参数组合，更快的20min的鉴定量仅比40min少了10%（3160 vs 3524）。这说明，在并未显著影响蛋白质组学鉴定量的条件下，WWA的采集方法适用于更快速的梯度分离。由于WWA采集方法被认为是类似于结合了传统的DDA与DIA的方式，故文章对不同的采集模式进行了比较；在单细胞水平的比较中（10个Hela细胞及7-10个K562细胞），使用相同的118ms和60K分辨率的二级参数，定性深度的比较中，WWA采集方法可得到最多的鉴定。图6：不同的采集模式（DIA, DDA 及 WWA）比较（点击查看大图）► ► ► 结语WWA采集方案的提出，为我们进行快速的、更高深度的单细胞蛋白质组学提供了新的思路：基于赛默飞综合解决方案，我们从全新的Vanquish neo低流速液相色谱、μPAC色谱柱、宽隔离窗口的质谱采集策略以及全新的基于AI算法的CHIMERYS搜索引擎，全方面提升单细胞蛋白质组学鉴定深度。如需合作转载本文，请文末留言。

据发表在最新一期《自然化学》杂志上的论文，德国达姆施塔特工业大学和瑞士弗里堡大学领导的国际研究团队在使用合成材料合成人造细胞方面实现突破。这些细胞通过一种被称为生物催化聚合诱导自组装（BioPISA）的过程制造，代表了合成生物学领域的重大进步。论文插图图片来源：《自然化学》（2023）人造细胞是模仿活细胞特性的微观结构。它们是促进化学反应和分子系统工程的重要微反应器，是合成生物学途径的宿主，也是研究生命起源的重要工具。该团队开发了一种酶促合成的聚合物微胶囊，并使用它们来包裹细菌细胞的可溶性内容物（即胞质溶胶），从而创造出能够在内部产生一系列蛋白质的人造细胞，包括荧光蛋白、制造细胞骨架样结构的肌动蛋白，以及人类骨骼中发现的生物矿化过程的碱性磷酸酶。蛋白质的表达不仅模仿了活细胞的基本特性，而且展示了这些人造细胞在从药物输送到组织工程等多种应用中的潜力。新研究弥补了合成生物学中的一个重要空白，即能够将合成材料与酶过程结合起来，创造出复杂的人造细胞，就像真正的细胞一样，这为创造结构和功能上与生物细胞相似的模拟物开辟了新途径。研究人员指出，酶促自由基聚合是制造这些人造细胞的关键。酶会将聚合过程中自组装的聚合物合成纳米和微米尺寸的聚合物胶囊。这是一种非常简单但有效的人造细胞制备方法。在未来的工作中，研究团队的目标是利用人造细胞中表达的蛋白质来催化进一步的聚合，从而模仿自然细胞的生长和复制。

p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 近日，浙江大学方群团队联合北京大学黄超兰团队在单细胞蛋白质组学分析研究领域取得了突破性进展。 /span 此项成果近日以全文形式在线发表于美国化学会的Analytical Chemistry杂志上(影响因子 6.32)，论文题目为“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/0d88aade-7372-4d68-b5da-4d57efa64b73.jpg" title=" 001.jpg" width=" 650" height=" 478" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 650px height: 478px " / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 图：纳升级油-气-液滴(OAD)芯片和自动定位(SAM)装置的结构示意图(a)和用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和上样的全流程图(b)。 /strong /span /p p 　　蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 单细胞内蛋白质含量极少，就典型体细胞而言仅为0.1- 0.2 ng，远远小于常规蛋白质组学样品前处理所需要的微克级蛋白量。 /span 并且细胞内的蛋白质通常需要在离心管内完成复杂多步的前处理操作，包括细胞裂解和蛋白质释放、蛋白质沉淀纯化、蛋白质还原和烷基化、酶切等，一个全细胞裂解蛋白质组的最后反应体积均是几十甚至过百微升，在这个蛋白质组学常规前处理的过程中，由于样品与离心管的接触、多步的样品转移和不完全上样等原因，在进入质谱之前不可避免地带来了蛋白质的损失。用此流程来处理单细胞，即使之后结合液相色谱仪器的自动进样阀可以以小于十微升的体积完成上样也无济于事，因为尚未等到分离蛋白质样品就有可能已经损失大半了。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/ce546442-97dc-4a87-a243-558d62afe43e.jpg" title=" 003.png" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 如果说单细胞蛋白质组学是在米粒上雕刻，那么两个团队就是造出了适合在米粒上雕刻的工具刀。 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究起自2014年，两个团队的研究人员协同合作将微流控液滴技术与蛋白质组分析技术相结合，发展了一种微型化的油-气-液“三明治”芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成少量细胞蛋白质组学分析所必需的多步样品前处理操作，并且实现了将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的液相色谱分离与质谱检测。 /span 通过采用优化后的芯片材料、裂解试剂、酶切比例和色谱质谱参数等实验条件，该芯片系统可以分别成功地从100、50、10和1个HeLa细胞内鉴定到1360、612、192和51个蛋白质。更重要的是，研究人员首次实现了以单个鼠卵母细胞为初始样本的蛋白质组学分析，一共鉴定到355种蛋白质，其中存在一系列与生殖发育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相关(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在该工作中，还采用两种常规的基于离心管的前处理方法进行了对照实验，实验结果明确证实了微流控液滴体系具有更低的样品吸附损失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白质鉴定能力等明显优势，更适用于微量蛋白质样品的蛋白质组学分析。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 此项研究带来三个突破 /span ：首先是成功发展了适合进行单细胞及类似微量样品的蛋白质组学分析样品前处理芯片和方法。芯片内550 纳升的液滴与芯片的接触面积仅为常规离心管模式下的十五分之一，显著减少了样品与反应器接触所带来的损失；二是发展了一种实现纳升级液滴的直接进样方法，利用3D打印加工的自动定位装置和高压气泵高效地(& gt 99%)将液滴样品注入到分析色谱柱内，完全避免了样品转移和经过液相仪器内复杂管路带来的损失；第三是为避免在常规微流控液滴系统中由于油相直接接触液滴而造成的缺陷，提出了一种采用气相来间隔液滴相和油相的新型液滴芯片结构，在成功防止液滴明显蒸发的同时，还避免了油相和液滴相直接接触带来的脂溶性样品的损失，也使系统能更方便地进行后续的分离柱进样、色谱分离和质谱检测。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究在基于质谱的单细胞及微量样品的蛋白质组学分析方面开启了全新的技术，其所具有的系统结构简单、容易搭建、操作方便、可靠性高等特点，使其有望被广泛应用到细胞间异质性的研究以及与临床相关的研究，包括稀有的循环肿瘤细胞分析、生殖细胞相关研究和疾病诊疗等方面，因此在未来具有巨大的持续开发和应用转化前景。 /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/91e71d83-0fde-4b69-8b5f-10de6af33876.jpg" title=" 未命名_meitu_0.jpg" width=" 400" height=" 400" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 400px height: 400px " / /span /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " （左上：浙江大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 方群、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右上： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 北京大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄超兰、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 左下： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 浙江大学博士生李紫艺、 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右下：前国家蛋白质科学中心· 上海高级工程师 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄敏 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " ） /span /strong /p p 　　该论文的第一作者为浙江大学博士生李紫艺，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授。工作得到了国家自然科学基金和中国科学院杰出技术人才项目的支持。黄超兰教授的部分工作在前单位中科院国家蛋白质科学中心· 上海完成，特此鸣谢! /p p style=" line-height: 16px " img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/b0d2802c-066e-4fdf-86c9-b683f1c317de.pdf" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis.pdf /span /a /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 文章链接： /span a href=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" _src=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661 /span /a /p

内容简介放射性示踪技术在生命科学的发展中起着重要作用。虽然发展了许多替代技术，但是在许多特定的条件下，放射性示踪仍然是首选的高效、专一、可靠的实验方法。液闪计数分析，作为b射线检测的一种实验技术，在蛋白质的功能研究中起着重要的作用，尤其是上世纪70年代末为医药工业的高通量筛选建立的、近年来在基础研究的多个领域崭露头角的临近闪烁分析方法，对蛋白质功能研究提供了一些新思路，使得蛋白质功能的研究从分子到细胞成为可能。本期Webinar邀请到的主讲人张洪杰博士为中国科学院生物物理研究所科学平台的同位素实验技术主管。其负责的放射性同位素实验室面向所内、所外提供技术支撑服务。目前实验室有3H、14C、32P、33P、35S、51Cr、125I等7种核素，经过近几年的改造、建设，同位素示踪实验平台已经基本形成了放射实验场所（辐射）清洁、放射操作安全防护配套、放射试剂许可剂量充足、放射废弃物处理规范、放射样品的制样设备和检测仪器齐全的开放共享的实验场所。目前该平台已助力两个实验室在Cell，多个实验室在nature子刊等影响因子大于10的学术期刊上发表研究成果。本期讲座主要以在中科院生物物理所同位素实验室完成的实验结果为基础，结合一些其它实验室发表的文献数据，对酶、转运蛋白的活性分析，配体和受体的结合分析以及蛋白质的体内代谢分析，介绍相关测试过程中的样品制备、测试信号选择中的一些注意事项，帮助大家理解液闪分析中的一些关键步骤，提高实验的成功率。 讲座题目：液体闪烁技术在蛋白质功能研究中的应用:从分子到细胞讲座时间：2019年6月27日14：00-15:00主讲人：张洪杰 博士（中科院生物物理研究所）讲座形式：网络讲座，手机或PC即可参与（会议链接和如下报名链接相同） 主讲人简介张洪杰博士，放射性同位素实验技术主管， 高级工程师，复旦大学化学系理学学士，中科院生物物理研究所分子生物学博士，在生物物理学和分子生物学领域从事过多年的研究工作，2012年开始负责放射性同位素的运行管理和实验技术指导，有着较为丰富的经验。近几年已经有20余篇和同位素技术支撑相关的被致谢的文章。 关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

近日，科创中心生物与分子智造研究院分子智造研究所所长方群教授团队再出新成果！团队开发了“点取式”单细胞蛋白质组分析（PiSPA）工作流程和基于纳升级微流控液滴操控机器人，实现了单细胞的精准捕获、前处理以及自动进样，并首次在单个哺乳动物细胞中实现了高达3000种蛋白质的超高定量深度。目前，相关研究成果以“ Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell ”为题在国际权威期刊《自然通讯》上发表。这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在诊疗和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。团队自研的探针式微流控液滴操纵机器人系统更强大的单细胞蛋白质组分析工具：PiSPA工作流程单细胞蛋白质组学技术是近年来生命科学领域研究的热点。因单个细胞中的蛋白质含量极微（仅约0.2 ng）且无法扩增，单细胞蛋白质组分析极具挑战性。目前传统蛋白质组分析技术仅能在每个细胞中鉴定1000种左右的蛋白质，而这在单细胞分析领域显得有些“力不从心”。此外，传统的样本前处理操作大多在微升级反应器中进行，在样品处理和转移的过程中会出现明显的样品损失，这会限制单细胞蛋白质组学的鉴定深度，难以满足生命科学研究的迫切需求。“想要突破单细胞蛋白质组学鉴定深度的障碍，有两种策略。一是在足够小的微反应器中进行样品前处理，利用微尺度效应提高反应效率；二是将所有操作整合在一起，降低样品损失，但这两种策略对技术与设备的要求都很高”，本项成果第一完成人王宇博士解释道，“我们利用微流控技术将商品化的内插管改造为阵列化的纳升级微反应器，解决了纳升级样品反应与自动进样的问题。PiSPA平台可自动完成细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测、数据处理等操作，进一步降低了样品损失。”“点取式”单细胞蛋白质组分析流程示意图PiSPA工作流程使得高精度的液体操控、单细胞的精确处理以及先进的LC-TIMS-QTOF MS技术融为一体，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。“在研究中，我们将该平台应用于三种哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）的单细胞蛋白质组分析，以及HeLa细胞迁移过程中的细胞异质性研究中，均实现了超高深度定量分析”，王宇博士说。同时，迁移细胞的单细胞蛋白质组分析也证实了PiSPA平台具有识别细胞迁移关键分子以及有价值靶点的应用潜力。哺乳动物细胞的单细胞蛋白质组分析结果单细胞的定量深度：从3000+走向全蛋白质组测序PiSPA平台集成了基于序控液滴（SODA）技术的自动化液滴操纵机器人，能够在“点取式”操作模式下实现纳升级的细胞分选、多步样品前处理和自动进样操作。相比于其他单细胞分析方法，PiSPA平台的优势主要体现在与成像技术结合，能够灵活地选择任意单个细胞进行分析，目标细胞的捕获指向性强，具有很高的捕获准确性和成功率，并可保留目标细胞的表观和空间信息，显著增加了单细胞分析的信息维度。其次，PiSPA平台采用针对单细胞样品的“定制化”分析条件，实现了蛋白质鉴定深度的大幅提升，能够为生物医学研究提供更多有效的基础数据。这些优势对推动单细胞蛋白质组分析的实际推广应用具有重要意义。“目前的单细胞定量深度只是一个起点”，方群教授分享道，在该项研究中，可从单个哺乳动物细胞中可定量多达3000种蛋白质，约占人类基因编码蛋白质总数（约20,000种）的15%，其鉴定深度已经达到10年前单细胞转录组测序技术的相近水平。类比单细胞转录组测序技术的发展历史，可以预见当前已处于单细胞蛋白质组分析技术的爆发阶段，随着技术的快速革新，单细胞的定量鉴定深度还将得到史无前例的提升。“这意味着单细胞蛋白质组学技术已进入在广泛的生物医学研究领域中实际应用的阶段。”团队表示，未来，他们将进一步提高单细胞蛋白质组分析的鉴定深度和通量，以持续推进该技术实用化和应用拓展的水平。此外，在上述成果基础上，目前团队还在利用iChemFoundry平台的自动化机器人技术和机器视觉技术构建能够完成单细胞蛋白质组分析全部流程操作自动化的分析平台，很快会有新的成果发布，这些都将为人们了解生命活动中细胞异质性的变化带来更有力工具。

《自然》选出将在未来一年对科学产生巨大影响的工具和技术。从蛋白质测序到电子显微镜，从考古学到天文学，本文将讲述七项有可能会在未来一年震动科学界的技术。　　单分子蛋白质测序　　蛋白质组体现了细胞或生物体制造的一整套蛋白质，可以提供关于健康和疾病的深入信息，但对蛋白质组的表征仍然是一项挑战性的工作。　　相对于核酸来说，蛋白质是由更多的分子砌块(building blocks)组成的，约有20种天然存在的氨基酸(相比之下，组成DNA和信使RNA等分子的只有4种核苷酸) 因此，蛋白质具有更大的化学多样性。有些蛋白质在细胞中的含量较少 并且与核酸不同，蛋白质不能被扩增 ——这意味着蛋白质分析方法必须使用任何能用的材料。　　大多数蛋白质组学分析使用质谱法，这是一种根据蛋白质的质量和电荷来分析蛋白质混合物的技术。这些谱图可以同时量化数千种蛋白质，但检测到的分子并不总能明确识别，并且混合物中的低丰度蛋白质常常被忽视。现在，能对样本中的许多(甚至全部)蛋白质进行测序的单分子技术可能即将问世，其中许多技术类似于用于DNA的技术。　　德克萨斯大学奥斯汀分校的生物化学家Edward Marcotte正在研究一种这样的技术，称为荧光测序(fluorosequencing)[1]。Marcotte的技术报道于2018年，该技术基于一种逐步的化学过程，在此过程中，单个氨基酸被荧光标记，然后从表面偶联蛋白的末端逐个被剪切下来，此时摄像机会捕捉到所产生的荧光信号。Marcotte解释道：“我们可以用不同的荧光染料标记蛋白质，然后在切割时逐个分子地观察。”去年，位于康涅狄格州的生物技术公司Quantum Si的研究人员描述了一种荧光测序的替代方法，该方法使用荧光标记的“粘合剂”蛋白来识别蛋白质末端的特定氨基酸(或多肽)序列[2]。　　其他研究人员正在开发模仿基于纳米孔的DNA测序技术，根据多肽通过微小通道时引起的电流变化来分析多肽。荷兰代尔夫特理工大学的生物物理学家Cees Dekker及其同事于2021年展示了这样一种方法，他们利用蛋白质制成纳米孔，并能够区分通过纳米孔的多肽中的单个氨基酸[3]。在以色列理工学院，生物医学工程师Amit Meller的团队正在研究由硅基材料制成的固态纳米孔器件，该器件可以同时对许多不同的蛋白质分子进行高通量分析。他说：“你可能可以同时观察数万甚至数百万个纳米孔。”　　尽管目前单分子蛋白质测序只是概念上的验证，但其商业化正在迅速推进。例如，Quantum Si公司已宣布计划今年推出第一代仪器，并且Meller指出，2022年11月在代尔夫特举行的蛋白质测序会议上有一个专门针对该领域初创企业的讨论组。他说：“这让我想起了第二代DNA测序技术面世前的那些日子。”　　Marcotte是德克萨斯州奥斯汀市蛋白质测序公司Erisyon的联合创始人，他对此持乐观态度。他说：“这已经不是个行不行的问题，而是这项技术几时能送到人们手上。”　　詹姆斯韦勃太空望远镜　　天文学家们从去年开始就翘首以盼，兴奋不已。经过20多年的精心设计和建造，美国国家航空航天局(NASA)与欧洲航天局和加拿大航天局合作，于2021年12月25日成功将詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope，缩写JWST)送入轨道。因为仪器设备需要展开并确定第一轮观测的位置，全世界不得不等待了近七个月，JWST才开始正常工作。　　等待是值得的。马里兰州巴尔的摩市太空望远镜科学研究所天文学家、JWST的望远镜科学家Matt Mountain表示，最初传来的图像超出了他的最高预期。“实际上天空并不空旷——到处都是星系，”他说，“理论上我们知道这一点，但真正看到这一景象带来了别样的情感冲击。”　　詹姆斯韦布太空望远镜(James Webb Space Telescope)的6.5米主镜片(图中展示了18片镜片中的6片)可以探测数十亿光年外的物体。资料来源：NASA/MSFC/David Higginbotham　　JWST的设计是为了接替哈勃太空望远镜的工作。哈勃望远镜可以看到令人惊叹的宇宙景象，但也有盲点：它基本上无法看见在红外范围内具有光信号的古老恒星和星系。要弥补这一点，需要一台高灵敏度的仪器，其灵敏度要能够探测到数十亿光年外发出的极为微弱的红外信号。　　JWST的最终设计包括18个完全光滑的铍质镜片阵列，当其完全展开时，直径为6.5米。Mountain说，这些反射镜的设计非常精密，“要是把一块镜面等比放大到美国那么大，上面的隆起也不超过几英寸(高)。”这些反射镜配有最先进的近红外和中红外探测器。　　这一设计使JWST能够填补哈勃望远镜的空白，包括捕获来自一个有135亿年历史的星系发出的信号，该星系产生了宇宙中最早的一些氧和氖原子。JWST也带来了一些惊喜，例如，它能够测量某些类型的系外行星的大气组成。　　世界各地的研究人员都在排队等待观察时间。英国卡迪夫大学的天体物理学家Mikako Matsuura正在用JWST进行两项研究，调查宇宙尘埃的产生和破坏，这些尘埃可能会导致恒星和行星的形成。Matsuura说，与她所在小组过去使用的望远镜相比，“JWST拥有完全不同的灵敏度和清晰度等级”。她说：“我们看到了这些天体内部正在发生的完全不同的现象——这真令人叹为观止。”　　体积电子显微镜　　电子显微镜(Electron microscopy，EM)以其卓越的分辨率而闻名，但观察的主要是样本的表面。深入研究样本的内部需要将样本切成非常薄的切片，这对于生物学家来说往往不够。伦敦弗朗西斯克里克研究所(Francis Crick Institute)的电子显微镜学家Lucy Collinson解释说，仅覆盖单个细胞的体积就需要200个切片。她说：“如果你只有一个[切片]，你就是在玩统计把戏。”　　现在，研究人员正在将EM的分辨率应用于包含多个立方毫米体积的3D组织样本上。　　此前，从2D的EM图像重建这样体积的样本(例如，绘制大脑的神经连接图)需要经历艰苦的样本准备、成像和计算过程，才能将这些图像转换为多图像堆叠。现在，最新的“体积电子显微镜”技术大大简化了这一过程。　　这些技术有各种优点和局限性。连续切面成像(Serial block-face imaging)是一种相对快速的方法，它使用金刚石刀片在树脂包埋样品上切下一系列薄片，并进行成像，可以处理约1立方毫米大小的样品。然而，它的深度分辨率较差，这意味着生成的体积重建将相对模糊。聚焦离子束扫描电子显微镜(Focused ion beam scanning electron microscopy，FIB-SEM)能制备更薄的薄片样品，因此深度分辨率更高，但更适用于体积较小的样品。　　Collinson将体积电子显微镜的兴起描述为一场“安静的革命”，因为研究人员专注于用这种方法得到的结果，而不是生成这些结果的技术。但这正在改变。例如，2021年，弗吉尼亚州珍利亚研究园区(Janelia Research Campus)从事电子显微镜中细胞器分割(Cell Organelle Segmentation in Electron Microscopy，COSEM)计划的研究人员在《自然》上发表了两篇论文，聚焦了在绘制细胞内部结构方面取得的重大进展[4,5]。“这是一个绝佳的原理论证。”Collinson说。　　COSEM研究计划使用精密的定制FIB-SEM显微镜，在保持良好空间分辨率的同时，可将单个实验中可成像的体积增加约200倍。将这些仪器与深度学习算法结合使用，该团队能够在各种细胞类型的完整3D体积中定义各种细胞器和其他亚细胞结构。　　这种样品制备方法费力且难以掌握，并且由此产生的数据集非常庞大。但这一努力是值得的：Collinson已经看到了该技术在传染病研究和癌症生物学方面产生的见解。她现在正在与同事们合作，探索以高分辨率重建整个小鼠大脑的可行性。她预计这项工作将需要十多年的时间，花费数十亿美元，并产生5亿GB左右的数据。她说：“这可能与绘制第一个人类基因组工作的数据量在一个数量级。”　　CRISPR无限可能　　基因组编辑工具CRISPR–Cas9作为在整个基因组的目标位点引入特定变化的首选方法，在基因治疗、疾病建模和其他研究领域取得了突破，无可非议地享有盛誉。但它的用途多受限制。现在，研究人员正在寻找规避这些限制的方法。　　CRISPR编辑由短链向导RNA(short guide RNA，sgRNA)协调，sgRNA将相关的Cas核酸酶导向其目标基因组序列。但这种酶发挥作用还需要在靶点附近有一种叫做原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)的序列 如果没有PAM，基因编辑很可能会失败。　　在波士顿的马萨诸塞州总医院，基因组工程师Benjamin Kleinstover利用蛋白质工程技术，从化脓性链球菌中制造出常用Cas9酶的“近乎不受PAM序列限制的(near-PAMless)”Cas变体。一个Cas变体需要由三个连续核苷酸碱基组成的PAM，其中腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)核苷酸位于中间位置[6]。“这些酶现在几乎可以读取整个基因组，而传统的CRISPR酶只读取1%到10%的基因组。”Kleinstover说。　　这种对PAM序列不太严格的要求，增加了编辑“脱靶”的机会，但进一步的蛋白质工程设计可以提高其特异性。作为一种替代方法，Kleinstiver的团队正在设计和测试大量Cas9变体，每个变体对不同的PAM序列表现出高度的特异性。　　还有许多天然存在的Cas变体有待发现。自然条件下，CRISPR–Cas9系统是一种针对病毒感染的细菌防御机制，不同的微生物进化出了具有不同PAM序列偏好的各种酶。意大利特伦托大学的病毒学家Anna Cereseto和微生物组研究人员Nicola Segata梳理了100多万个微生物基因组，鉴定和表征了一组多样的Cas9变体，他们估计这些变体可能总共可以针对98%以上的已知人类致病突变[7]。　　然而，其中只有少数能在哺乳动物细胞中发挥作用。Cereseto说：“我们的想法是测试许多种酶，看看是什么决定因素使这些酶正常工作。”从这些天然酶库和高通量蛋白质工程工作中获得的见解来看，Kleinstiver说，“我认为我们最终会有一个相当完整的编辑工具箱，能让我们编辑任何我们想要的碱基。”　　高精度放射性碳测年　　去年，考古学家利用放射性碳测年技术的进步，对维京探险家首次抵达美洲的确切年份——甚至是季节——进行了研究。荷兰格罗宁根大学的同位素分析专家Michael Dee和他的博士后Margot Kuitems带领的一个团队在加拿大纽芬兰岛北岸的一个聚落中发现了一些被砍伐的木材，通过对这些木材的研究，确定这棵树很可能在1021年被砍伐，而且可能是在春天[8]。　　自20世纪40年代以来，科学家一直在利用有机人工制品的放射性碳测年法来缩小历史事件发生的时间范围。他们通过测量同位素碳-14的痕迹来做到这一点，碳-14是宇宙射线与地球大气相互作用的结果，在数千年中缓慢衰变。但这种技术的精确度通常仅为几十年左右。　　加拿大纽芬兰省兰塞奥兹牧草地(L'Anse aux Meadows)木材的精确放射性碳年代测定显示，维京人于1021年在此地砍倒了一棵树。图片来源：All Canada Photos/Alamy　　2012年，情况发生了变化，日本名古屋大学物理学家三宅芙沙(Fusa Miyake)领导的研究小组发现[9]，公元774到775年之间，日本雪松年轮中碳-14含量显著升高。随后的研究[10]不仅证实了这一时期世界各地的木材样本中都存在这种碳-14含量的显著升高，而且还发现历史上存在至少五次这样的碳-14含量上升，最早的一次可以追溯到公元前7176年。有研究人员将这些碳-14峰值与太阳风暴活动联系起来，但这一假设仍在探索中。　　无论其原因是什么，这些“三宅事件”的存在，能让研究人员通过检测一个特定的三宅事件，然后对此后形成的年轮进行计数，从而准确地确定木制文物的制造年份。Kuitems说，研究人员甚至可以根据最外圈年轮的厚度来确定树木被砍伐的季节。　　考古学家现在正在将这种方法应用于新石器时代聚落和火山爆发遗址的研究，Dee希望用它来研究中美洲的玛雅帝国。在接下来的十年左右，Dee乐观地认为，“我们将对这些古老文明中的许多历史事件有真正精确到年代的完全记录，我们将能够以相当精细的时间尺度谈论这些历史发展。”　　至于三宅，则还在继续寻找历史中的时间标尺。她说：“我们现在正在寻找过去一万年中与公元774到775年的事件相当的其他碳-14升高。”　　单细胞代谢组学　　代谢组学是研究驱动细胞的脂质、碳水化合物和其他小分子的科学，它最初是一套表征细胞或组织中代谢产物的方法，但现在正在转向单细胞水平。科学家们可以利用这些细胞水平的数据，理清大量看似相同的细胞的功能复杂性。但这一转变带来了艰巨的挑战。　　代谢组包含大量具有不同化学性质的分子。欧洲分子生物学实验室的代谢组学研究人员Theodore Alexandrov说，其中一些分子存在的时间非常短暂，代谢周转率为亚秒级别。它们可能很难检测：尽管单细胞RNA测序可以捕获细胞或生物体中产生的近一半的RNA分子(转录组)，但大多数代谢分析仅涵盖细胞代谢产物的一小部分。这些缺失的信息里可能包含了重要的生物学奥秘。　　“代谢组实际上是细胞的活性部分。”伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的分析化学家Jonathan Sweedler说，“在疾病状态下，如果你想知道细胞状态，你真的要研究代谢产物。”　　许多代谢组学实验室使用分离的细胞，这些细胞被捕获在毛细管中，使用质谱法单独分析。相比之下，“成像质谱”方法获取了样本中不同位置的细胞代谢产物发生变化的空间信息。例如，研究人员可以使用一种称为基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的技术，其中激光束扫过经特殊处理的组织切片，释放出代谢产物，用于随后的质谱分析。这种方法也能捕获样本中代谢物来源的空间坐标。　　Sweedler说，理论上，这两种方法都可以量化数千个细胞中的数百种化合物，但要实现这一目标通常需要顶级的定制硬件设备，成本在百万美元左右。　　现在，研究人员正在普及这项技术。2021年，Alexandrov团队报道了SpaceM，这是一种开源软件工具，它能用光学显微镜成像数据，使用标准商用质谱仪对培养的细胞进行空间代谢组学分析[11]。他说：“我们算是做了数据分析部分的体力活。”　　Alexandrov的团队使用SpaceM对数以万计人和小鼠细胞中的数百种代谢产物进行了分析，并转向标准的单细胞转录组学方法将这些细胞分类。Alexandrov表示，他尤为热情的是后一项工作，以及构建“代谢组学图谱”的想法——类似于为转录组学开发的图谱，以加速该领域的进展。他说：“这绝对是一个前沿领域，并将对科学起到巨大的推动作用。”　　体外胚胎模型　　研究人员现在可以在实验室中制造出人工合成胚胎(下图)，它与8天大的自然胚胎(上图)类似。来源：Magdalena Zernicka Goetz实验室　　科学家们已经在小鼠和人类的细胞水平上详细描绘了从受精卵到完全形成的胚胎这一过程。但驱动这一过程早期阶段的分子机制仍不清楚。现在，“胚状体”模型的一系列活动有助于填补这些知识空白，让研究人员更清楚地了解可以决定胎儿发育成败的重要早期事件。　　该领域一些最精细的模型，来自加州理工学院和英国剑桥大学的发育生物学家Magdalena Zernicka Goetz的实验室。2022年，她和她的团队证明，他们可以完全从胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)中产生植入期的小鼠胚胎[12,13]。　　与所有多能干细胞一样，ES细胞可以形成任何细胞或组织类型，但它们需要与两种类型的胚外细胞密切相互作用才能完成正常的胚胎发育。Zernicka-Goetz团队研究出了诱导ES细胞形成这些胚外细胞的方法，并表明这些细胞可以与ES细胞共培养，以产生胚胎模型，该模型的成熟度是以前的体外实验无法达到的。“它就如你能想象的胚胎模型那样。”Zernicka Goetz说，“我们的胚胎模型发育出一个头部和心脏——而且还在跳动。”她的团队能够利用这个模型来揭示个别基因的改变如何破坏正常的胚胎发育。　　经过工程设计用于模拟胚胎8细胞期的细胞构成的胚状体。来源：M.A Mazid et al./Nature　　在中国科学院广州生物医药与健康研究院，干细胞生物学家Miguel Esteban和同事们正在采取一种不同的策略：重新编程人类干细胞，以模拟最早的发育阶段。　　Esteban说：“我们最初的想法是，实际上甚至制造合子也是可能的。”该团队没能完全实现这一点，但他们的确发现了一种培养策略，能使这些干细胞回到类似于8细胞期人类胚胎的状态[14]。这是一个至关重要的发育期里程碑，与基因表达的巨大变化相关，最终产生不同的胚胎细胞和胚外细胞谱系。　　尽管还不完美，但Esteban的模型展示了自然状态下8细胞期胚胎中细胞的关键特征，并凸显了人类和小鼠胚胎如何启动向8细胞期阶段转变之间的重要差异。Esteban说：“我们发现，一种甚至在小鼠体内都没有表达的转录因子，调节着整个转化过程。”　　结合起来，这些模型可以帮助研究人员描绘出仅仅几个细胞是如何发育为高度复杂的脊椎动物躯体的。　　在许多国家，对人类胚胎的研究只能在发育14天以内进行，但在这些限制条件下，研究人员仍有许多工作可做。Esteban说，非人类灵长类动物模型提供了一种可能的替代方案，而Zernicka-Goetz说，她的小鼠胚胎策略也可以产生发育到第12天的人类胚胎。她说：“在这个我们能研究的胚胎阶段，仍有很多问题有待提出。”　　参考文献：　　1. Swaminathan, J. et al. Nature Biotechnol.36, 1076–1082 (2018).　　2. Reed, B. D. et al. Science 378, 186–192 (2022).　　3. Brinkerhoff, H., Kang, A. S. W., Liu, J., Aksimentiev, A. & Dekker, C. Science 374, 1509–1513 (2021).　　4. Heinrich, L. et al. Nature 599, 141–146 (2021).　　5. Xu, C. S. et al. Nature 599, 147–151 (2021).　　6. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N. & Kleinstiver, B. P. etal. Science 368, 290–296 (2020).　　7. Ciciani, M. et al. Nature Commun. 13, 6474 (2022).　　8. Kuitems, M. et al. Nature 601, 388–391 (2022).　　9. Miyake, F., Nagaya, K., Masuda, K. & Nakamura, T. Nature 486, 240–242 (2012).　　10. Brehm, N. et al. Nature Commun. 13, 1196 (2022).　　11. Rappez, L. et al. Nature Methods 18, 799–805 (2021).　　12. Amadei, G. et al. Nature 610, 143–153 (2022).　　13. Lau, K. Y. C. et al. Cell Stem Cell 29, 1445–1458 (2022).　　14. Mazid, M. A. et al. Nature 605, 315–324 (2022).　　原文以Seven technologies to watch in 2023为标题发表在2023年1月23日《自然》的技术特写版块上

细胞是跨越了至少四个数量级的、复杂而精妙的模块化系统【1】。对细胞内模块化系统的刻画主要有两种方式，一是蛋白质荧光成像，一是蛋白质生物物理特性，这两种方面的技术可以产生大量的数据，但是这两种方式所产生的数据库具有不同的质量和分辨率，通常需要分别进行处理。那如何将两种方式的优点进行同时整合呢？近日，美国加州大学圣地亚哥分校Trey Ideker研究组（第一作者为博士生秦越）与瑞典皇家理工学院以及斯坦福大学Emma Lundberg研究组合作发文题为A multi-scale map of cell structure fusing protein images and interactions，将来自于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）【2】的免疫荧光图像与BioPlex数据库【3】中亲和纯化结果进行整合，构建了多维度细胞整合图谱MuSIC1.0（Multi-scale integrated cell），对人类细胞中的结构层次进行了统一化的分析，从而解析出69个亚细胞系统，为整合各种各样不同类型的数据来创建全蛋白细胞模型铺平了道路。真核细胞由多种大的组分组成，比如细胞器、凝聚体或者蛋白质复合体，从而形成一个多维度的结构。人类蛋白图谱系统性地对人类细胞中蛋白质在亚细胞结构中定位进行了全面解析，与此同时质谱与亲和纯化（Mass spectrometry combined with affinity purification， AP-MS）技术将临近标记引入蛋白质组学探究之中，从而能够快速检测蛋白和蛋白之间的相互作用。因此，如果能将蛋白质成像与生物物理之间的关联结合起来，便可以对细胞结果进行更进一步地解析。为此，作者们构建了一种机器学习方法，可以将蛋白质成像与生物物理特性进行关联和集成，从而构建一个亚细胞结构组成组分的统一图谱。图1 蛋白质成像与AP-MS数据库整合策略首先，作者们使用深度神经网络（Deep neural network，DNN）对蛋白质图像与相互作用数据进行整合，确定每个平台中蛋白质的坐标，对蛋白质之间的距离进行校准和组合，从而确认在不同维度下蛋白质复合体的组装方式（图1）。这两个全方位的数据库均来自HEK293细胞。作者们对蛋白质配对之间的相互作用距离进行检测，举例来说，来自蛋白质复合体中的蛋白之间相互作用距离少于20nm，而细胞器中的蛋白质之间距离可能会超过1μm。作者们分析了661个蛋白质之间的所有距离，以识别相互接近的蛋白质组分。随着距离的变化，能够产生一个蛋白质多维度结构层次图谱（图2）。由此，作者们发现所构建的MuSIC系统能够以很广的范围对生物系统内的蛋白质相互作用进行测量和捕捉。图2 结构层次图谱建立和检测的流程在建立起该整合图谱后，作者们希望对MuSIC系统进行一个全局性的评估。MuSIC图谱中有370个蛋白以前未在AP-MS实验中用于亲和标记进行相互作用因子的钓取。因此，作者们对134个猎物蛋白进行标记进行AP-MS实验，从而检测到339个相互作用配对，进而对该整合图谱的准确性进行了全面的验证。在MuSIC发现的全新的亚细胞系统中，有一个由七个蛋白质复合体组成的直径估计为81nm的系统，作者们将此系统命名为前体核糖体RNA加工组装复合体（Pre-ribosomal RNA processing assembly，PRRPA）。为了对PRRPA复合体在前体rRNA加工中的作用进行确认，作者们使用siRNA对每个蛋白进行了敲降，发现所有的敲降都会一定程度上破坏核糖体RNA的成熟。另外，作者们使用RNA免疫共沉淀定量qPCR对这些蛋白结合45S前体rRNA的能力进行检测，再次证明了这些蛋白质在前体rRNA加工过程中的作用。同时作者们发现所建立的MuSIC系统也可以对一些蛋白质的功能进行更为全面的认识，包括发现已知蛋白的全新功能和未知蛋白的潜在功能。总的来说，该工作通过汲取蛋白质荧光成像与蛋白质生物物理特性两方面之长构建了多尺度细胞整合图谱MuSIC 1.0，进一步地提高了现有蛋白质荧光图像中信息的分辨率，也为蛋白质相互作用提供了空间维度的信息，为人类细胞中蛋白质组研究提供了更为全面的认识。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04115-9

近日，南京农业大学发布2022年11月政府采购意向，计划以1200万元预算采购单细胞蛋白质组学质谱。详情如下：本次公开的采购意向是本单位政府采购工作的初步安排，具体采购项目情况以相关采购公告和采购文件为准。

iPSC简介2006年Takahashi和Yamanaka突破性发现使终末分化、谱系受限的成体细胞：如皮肤活检来源的成纤维细胞、外周血来源的T淋巴细胞、毛囊细胞等，通过转录因子OCT4、SOX2、KLF、c-MYC、NANOG和LIN28的强制异位表达直接将其重编程为多能状态的细胞，这些细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。iPSC与胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESC)有相似的基因表达、表观遗传谱和分化潜能，可产生任何类型的体细胞。并且避免了ESC基于使用胚胎来源细胞和可能导致异常发育的体外受精胚胎的伦理问题，因此iPSC在医疗领域里具有更好的应用和产业化发展前景。iPSC应用和挑战描述任何人类疾病和药物发现的病因学和病理生理学的主要关键组成部分是需要一个生理相关的疾病实验模型，无论是体外还是体内或两者，需要忠实地概括各自的病理生理学和临床表现。因此基于人类iPSC的疾病模型可以无限供应临床相关的表型细胞、以及它们具有的衍生潜力，可以加速阐明生物医学研究中疾病的病因机制，应用于新药发现、药物效价测试、预测药物安全性药理学/毒理学研究，以及基于iPSC的再生细胞疗法，有望治疗心脏病、帕金森、视网膜和角膜疾病、肝脏衰竭、糖尿病、脊髓损伤等疾病。然而将iPSC治疗方法真正有效转化为临床环境，保证患者安全，还需解决：临床级iPSC的衍生和通用细胞系的生物库建立；需要定义iPSC及其差异化治疗细胞产品可接受质量属性；致瘤性问题；免疫排斥反应；选择同种异体或自体 iPSC 以获得更有效的细胞治疗的难题；iPSC 谱系表型细胞和细胞系变异的异质性；基于iPSC的多基因、散发性和迟发性疾病的患病模型的挑战；需要大量的患者iPSC以实现更有效的病因学和临床转化；iPSC衍生的表型细胞缺乏成熟度；遗传的不稳定性等挑战。iPSC-CM研究和面临的问题心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)作为全球主要的死因之一，每年会导致约1790万人死亡，所以迫切需要可以延缓疾病进展并且可以改善心脏功能和预防衰竭的治疗方法。而目前的药物、介入或手术方法可能会改善临床结果，但由于无法促进心脏组织修复和再生，因此使这种治疗方法的成功率得不到提升。人类诱导多能干细胞(hiPSC)技术的出现以及随后在培养物中分化和建立心肌细胞（cardiomyocytes，CMs)的能力，为实现人类心脏再生疗法创造了可能性。作为分化CMs的连续和生物学相关来源，hiPSC-CM是心血管研究界的宝贵工具，不仅可用于治疗CVD，还可用于模拟人类心脏发育和疾病、研究潜在机制以及筛选具有疗效和心脏毒性的新药。由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，这些细胞亚群是异质的、未成熟的、表达胎儿基因表达谱，并且与成人心肌细胞相比收缩力减少，因此hiPSC-CM疾病模型的准确性和实用性仍然有限。此外，随着hiPSC-CMs的成熟和蛋白质表达动态的波动，大量样品分析的分辨率变得不足。由于其异质性导致心室样、心房样和节点样亚群，需要严格表征hiPSC-CM，并应对其成熟度、身份和功能进行筛选。为此，需要进行单细胞分析模式以了解这种异质性。细胞异质性研究方法虽然单细胞测序技术在分析单细胞转录组学和基因组信息的通量和规模方面取得了进步，但由于任何一个细胞中存在的蛋白质含量非常低，因此难以满足对定量、单细胞蛋白质组学技术的需求。此外，蛋白质组的复杂性和广泛的浓度范围（fM到高nM）带来了额外的挑战。为了在单细胞水平上进行生化蛋白质表征分析，高灵敏度工具是必不可少的。来自ProteinSimple的单细胞蛋白质分子技术：Milo是一种基于微流体的芯片电泳技术。可以克服单细胞蛋白质组学方法面临的障碍。Milo操作流程将细胞悬浮液加载到Milo芯片上，这样单个细胞就可以安放在芯片上的各个微孔中。然后Milo裂解细胞，产生单细胞裂解物，通过分子量电泳分离每个单细胞裂解物中的蛋白质，然后使用紫外线在Milo芯片中捕获蛋白质。然后，对目标蛋白进行一级抗体和荧光二级抗体进行免疫荧光捕获。通过使用开放格式的微阵列扫描仪对芯片进行成像，并使用Scout™ 软件对图像进行分析，以进行定量的自动数据分析。Milo追踪定量不同iPSC-CM亚型与免疫荧光和流式细胞术等其他单细胞分析系统不同，单细胞Western Blot技术Milo可以提供分子量大小信息，以及在单细胞水平测量蛋白质表达时的免疫结合信息，赋予额外的特异性。这种分子量分级步骤可以分辨不同物种的不同蛋白质亚型或区分脱靶抗体结合。为了表征CMs亚型标志物，通过Milo检测了肌球蛋白调节轻链2心房亚型（MLC2A或MYL7）及其心室亚型（MLC2V或MYL2）的蛋白质表达。可以观察到Milo鉴定了三个亚群，这些亚群由MLC2A或MLC2V的单一表达或共表达组成。Milo检测到hiPSC-CM亚型特异性心室和心房标记物MLC2V和MLC2A，在45秒的电泳运行时间内，迁移到总泳道长度的60%（图A）。使用Milo-Scout™ 软件通过找到典型峰形与源自原始荧光图像的一维强度图的卷积的局部最大值来识别峰中心。检测到的MLC2A、MLC2V和GAPDH峰的峰中心位置也由泳道指数显示（图B），显示出单个Milo芯片上所有孔的峰迁移的均匀性。为了评估芯片位置（图C）是否影响峰面积量化，比较了空间不同块之间计算的峰面积方差：每个块区域之间的差异小于2.5%（图D）。应用优化的Milo的检测方法研究hiPSC-CM随时间的异质性，观察整个分化时间线中蛋白质表达的变化。在第17、23和30天从培养物中提取hiPSC-CM细胞，检测MLC2A和MLC2V蛋白质表达。结果显示，共表达MLC2A和MLC2V阳性细胞的比例在整个分化过程中增加，而仅表达MLC2A(MYL7+)的细胞比例随时间减少。且三个亚群中每个亚群中的细胞百分比在所有芯片中一致重现。为了了解在整个分化过程中每个标记物的表达水平在hiPSC-CM亚群中的变化，在hiPSC-CM分化的第17、23和30天对MLC2V和MLC2A的表达进行了量化。随着分化的进行，MLC2A的总水平略有增加。然而，MLC2V表达在第23天和第30天之间增加了近三倍（图C）。为了了解驱动MLC2V表达增加的细胞亚群，三个亚群（MLC2A+、MLC2V+和共表达MLC2A+和MLC2V+）被进一步分层（图D）。MLC2V的水平在共表达MLC2A+和MLC2V+亚群中显着增加，以及在单独的MLC2V+亚群中增加。为了进一步了解导致hiPSC-CM分化过程中MLC2V表达显着增加的机制，对先前从三个iPSC系产生的hiPSC-CM进行了Milo分析，其中转录因子NR2F2 (NR2F2GE)、TBX5 (TBX5GE) 的外显子)和HEY2 (HEY2GE) 被CRISPR/Cas9编辑删除。利用这些品系来验证NR2F2、HEY2或TBX5缺陷在单细胞蛋白质水平上对MLC2V表达的影响。结果显示，TBX5GE和HEY2GE hiPSC-CM中MLC2V的单细胞表达显着降低（图E）。此外，MLC2V表达的显着下降归因于共表达MLC2A和MLC2V亚群（图F）。鉴于共表达MLC2A和MLC2V的亚群增加了MLC2V的表达，推测单独表达MLC2A的未成熟hiPSC-CM会随着时间的推移共同表达MLC2V，从而变得更像心室。同时使用预测调节MLC2V（HEY2或TBX5）的转录因子缺陷的两种细胞系时，我们仅观察到MLC2V在共表达MLC2A和MLC2V亚群中表达降低。这可能表明单独表达的MLC2V群体代表了一个独特的细胞亚群，并且该亚群中MLC2V的表达受替代转录因子的调节。结论：随着在基础和转化心脏研究中的应用，hiPSC-CM正被用于心血管疾病和心脏发育研究。然而，由于hiPSC-CM由不同的细胞亚群组成，并且hiPSC-CM蛋白表达动力学随着成熟而波动，一些蛋白分析方法可能因为分辨率不足而无法检测单细胞蛋白异质性，因此hiPSC-CM的单细胞蛋白质组学可能受到依赖抗体结合检测而无法评估脱靶结合技术的限制。单细胞蛋白质分析技术Milo，通过靶点分子量差异和抗体识别特异性蛋白标记物，避免了抗体脱靶结合的现象，同时能够跟踪单细胞亚群蛋白表达随时间的变化，从而能够识别并量化hiPSC-CM中不同的异质性亚群，应用于疾病建模和再生医学治疗研究。参考文献：1 Current Challenges of iPSC-Based Disease Modeling and Therapeutic Implications.2 Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes.3 Single-cell protein expression of hiPSC-derived cardiomyocytes using Single-Cell Westerns.

将小分子、核酸、蛋白质和药物导入细胞是监测和了解细胞行为以及生物功能的重要途径。然而，质膜是阻止外源分子进入细胞的生物屏障。因此，如何在保持细胞活力的同时高效地将外源分子递送到细胞中是细胞生物学领域的一个重要课题。为了克服现有大规模细胞内递送方法的弱点，例如细胞活性和递送效率不一致，主要基于膜破坏介导机制的微技术已成为一种有前景的解决方案。利用化学质膜穿孔进行单细胞递送的尚未得到广泛研究。2024年4月26日，清华大学化学系林金明教授团队在《ACS Applied Materials & Interfaces》杂志在线发表了题为“Chemical Plasma Membrane Perforation Generated by a Microfluidic Probe for Single-Cell Intracellular Protein Delivery”的工作。该研究使用微流控探针将含有毛地黄皂苷和货物的溶液精确地作用到单细胞上。毛地黄皂苷与质膜中的胆固醇结合诱导质膜穿孔，货物通过孔进入细胞。碘化丙啶 (0.67 kDa) 和 FITC-葡聚糖 (10、40 和 150 kDa) 可以在3分钟内成功引入单细胞，同时保持细胞活力。两种蛋白质（细胞色素C和亲环素A）被递送进入细胞，并观察到它们在细胞中得生理功能。图1. 微流控探针诱导单细胞化学质膜穿孔首先，利用Comsol Multiphysics软件对微流控探针形成的微区域进行数值模拟。使用荧光素（扩散系数=500 μm2 /s）来指示溶质扩散。结果表明，注入的溶液可以被完全吸出，并且溶质被限制在液滴状微区域内而不会扩散。微区内溶质浓度分布均匀。计算了基质上的剪切应力，低剪切应力不会对细胞造成额外的机械损伤。实验在与模拟相同的条件下进行，使用荧光素显示微流控探针产生的微区域，与浓度分布模拟结果一致。溶液的连续流动使微区中毛地黄皂苷和货物的浓度几乎恒定，有利于维持递送过程的连续性和稳定性。图2. 流体的数值模拟通过微流控探针进行碘化丙啶（PI）的细胞内递送来验证该方法的可行性以及优化递送条件。尝试使用 20-100 μg/mL 毛地黄皂苷将 PI 递送至U87细胞。随着毛地黄皂苷浓度的增加，ts（PI开始进入时间）和tm（PI进入速度最大时间）逐渐减少，表明细胞穿孔加速。当毛地黄皂苷浓度为60 μg/mL时，ts约为20 s，1 min内即可观察到清晰的荧光。此外，还尝试了不同的PI浓度进行细胞内递送，较高的PI浓度也使得PI能够更快地进入细胞。还测试了流速对递送结果的影响。注入流量保持2 μL/min，抽出流量在6~14 μL/min之间调整。当抽吸流速大于8 μL/min时，进入细胞的PI量随着流速的增长而显着增加。图3. 毛地黄皂苷浓度、PI浓度和流速对细胞内递送的影响为了证明该方法的效率和通用性，使用该方法将PI递送至U87、HUVEC和A549细胞。当递送时间为20秒时，三种类型的细胞几乎不发出荧光。随着递送时间逐渐增加，细胞的相对荧光强度显着增加，递送处理50 s后观察到强烈的红色荧光。由于洋地黄皂苷的作用，质膜逐渐透化，PI通过质膜上形成的孔继续进入细胞。还检查了该方法递送大分子的能力，使用不同分子量（10、40和150 kDa）的 FITC-葡聚糖作为货物。FITC-葡聚糖可以在3min内进入细胞，并且FITC-葡聚糖进入的量随着递送时间的增加而增加。图4. PI和FITC-葡聚糖递送的结果在验证了这种方法用于单细胞胞内递送的可行性后，作者尝试了细胞内蛋白质递送。Cyt C ( Mw = 13 kDa) 是线粒体中的一种蛋白质，可将电子转移到呼吸链以维持ATP的产生。当cyt C释放到细胞质中时，它会引发细胞凋亡。由于外源cyt C在正常情况下不能进入细胞，利用微流控探针将cyt C递送至A549中作为抗肿瘤药物以诱导细胞凋亡。对照组和仅用毛地黄皂苷或cyt C处理的细胞之间未观察到caspase-3水平和Hoechst 33342染色结果的显着差异。毛地黄皂苷诱导的质膜穿孔不会引起细胞凋亡。仅用cyt C处理的细胞中caspase-3的水平也没有增加，表明正常情况下cyt C不能穿过质膜进入细胞激活凋亡途径。然而，在进行毛地黄皂苷介导的cyt C递送的细胞中，caspase-3水平显著增加，蓝色荧光显著增强。细胞形态发生明显变化，细胞体积缩小，并形成凋亡小体。这些结果表明，递送的cyt C成功诱导细胞凋亡，并且外源蛋白可以通过微流控探针有效地引入细胞内并发挥作用。图5. Cyt C被递送至A549以诱导细胞凋亡为了进一步探索这种方法在细胞研究中的潜力，作者利用它来研究肿瘤耐药性。CypA (M w = 18 kDa) 是一种广泛存在的细胞内蛋白质，可充当抗氧化剂。最近有报道称CypA通过重塑细胞氧化状态介导结直肠癌耐药。BCNU是一种常用的抗肿瘤药物，其诱导细胞毒性的机制之一是谷胱甘肽还原酶的抑制导致ROS的积累。利用微流控探针将CypA递送到U87中，研究CypA对胶质瘤耐药性的影响。与对照组相比，未经CypA递送的细胞经BCNU处理1小时后ROS水平显着升高，并且细胞形态发生改变。对于递送CypA的细胞，ROS含量显着低于未递送细胞，并且细胞保持正常形态。结果表明，递送的CypA在细胞中具有抗氧化作用，这可能增强U87对BCNU的耐药性。抑制CypA表达可能是治疗神经胶质瘤的潜在方法。图6. CypA对胶质瘤耐药性的影响总结作者开发了一种基于开放式微流控探针的方法，以方便高效地实现单细胞递送。该方法通过使用化学试剂对单个细胞进行质膜穿孔，将最大分子量为150 kDa 的外源货物递送到细胞中。与载体介导或场辅助递送方法相比，该方法不需要对货物进行额外处理，无需物理场辅助的温和递送条件也避免了对货物和细胞的额外损伤。作者展示了使用微流控探针进行cyt C和CypA的细胞内递送，证明了该方法能够研究外源蛋白质对细胞生命活动的影响。未来，各种货物（肽、蛋白质、mRNA、DNA、质粒、细胞器等）可以通过这种方法导入细胞内，调节细胞的生理功能和命运。而且该方法不需要昂贵的设备，操作简单，有望成为单细胞递送的一种理想方法。清华大学化学系林金明教授为该论文的通讯作者，清华大学化学系2022级博士生宋扬为本论文的第一作者。该研究受到国家重点研发计划（No.2022YFC3400700）和国家自然科学基金（No.22034005）的支持。关于林金明教授工学博士，分析化学专业。1984年福州大学毕业，1992年在日本昭和大学国际交流基金的资助下前往该大学药学部从事访问研究。1994年获得日本政府奖学金转入东京都立大学攻读博士学位，1997年3月获得工学博士学位，同年留校任教，2000年入选中国科学院“百人计划”，受聘中科院生态环境研究中心研究员、博士生导师；2001年获得国家杰出青年科学基金，2002年3月底回国工作，2004年入选清华大学“百名人才引进计划”，受聘清华大学化学系教授、博士生导师。2008年受聘教育部长江学者特聘教授,2014年入选英国皇家化学会会士。目前主要从事微流控芯片质谱联用细胞分析、化学发光/荧光免疫分析、复杂样品前处理分析、空气负离子检测与健康评估等研究。已培养博士研究生43名（含联合培养，其中留学生2名）、硕士研究生28名、博士后11名（其中留学生3名）、访问学者10名（其中外国访问学者1名）。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

项目概况北京师范大学分析仪器采购项目 招标项目的潜在投标人应在网上报名获取招标文件，并于2021年12月23日 09点30分（北京时间）前递交投标文件。一、项目基本情况项目编号：CFTC-BJ01-2111069项目名称：北京师范大学分析仪器采购项目预算金额：1380.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：1380.0000000 万元（人民币）采购需求：项目名称预算金额（万元）简要技术参数要求数量是否允许进口用途北京师范大学分析仪器采购项目1380128通道信号采集分析系统、脑片膜片钳、电化学成像系统、单细胞记录分析系统、非接触式亚微米分辨红外拉曼同步测量系统、纳米粒度和电位分析仪、多功能微孔板检测仪、流式细胞仪、蛋白质纯化系统，详见招标文件第四章。各1台是科研合同履行期限：详见招标文件本项目( 不接受 )联合体投标。二、申请人的资格要求：1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定；2.落实政府采购政策需满足的资格要求：无3.本项目的特定资格要求：1）投标人不得被列入失信被执行人、重大税收违法案件当事人名单、政府采购严重违法失信行为记录名单。2）单位负责人为同一人或者存在直接控股、管理关系的不同供应商，不得同时参加本项目同一分包的政府采购活动。3）为本项目提供整体设计、规范编制或者项目管理、监理、检测等服务的供应商，不得参加本次政府采购活动。三、获取招标文件时间：2021年12月02日 至 2021年12月09日，每天上午9:00至12:00，下午12:00至17:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：网上报名方式：疫情防控期间为避免人员聚集，欢迎各投标人无接触报名。拟报名投标人，须将以下报名资料以PDF格式发送至指定邮箱：guojinzhaobiao2020@163.com（发送邮件后须致电采购代理机构项目联系人：边璐010-56215050），邮件内容需注明项目名称、投标人名称、通讯地址、授权代表姓名、联系方式、电子邮箱。 （1）法定代表人报名：针对本项目出具的法定代表人身份证明书原件加盖公章（须体现法人姓名、身份证号）及法定代表人身份证复印件加盖公章的扫描件； （2）法人授权代表报名：针对本项目出具的法人授权委托书原件加盖公章及授权代表身份证复印件加盖公章的扫描件。 上述资料经采购代理机构查验合格后，将以邮件形式确认回复，并向其发送《获取招标文件登记表》。供应商需及时查看邮件信息，打印《获取招标文件登记表》填写完整，并将标书款电汇或转账至采购代理机构指定账户，将《获取招标文件登记表》及标书款转账凭证扫描件发回邮箱：guojinzhaobiao2020@163.com。如资料有误，采购代理机构将在资料发送后1个工作日反馈至投标人，投标人需在报名截止前修正或补充完整。 采购代理机构将于《获取招标文件登记表》查验合格并确认标书款到账后，将招标文件电子版发送至投标人邮箱。售价：￥200.0 元，本公告包含的招标文件售价总和四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点提交投标文件截止时间：2021年12月23日 09点30分（北京时间）开标时间：2021年12月23日 09点30分（北京时间）地点：北京市朝阳区东三环南路甲52号顺迈金钻国际商务中心9层9C会议室五、公告期限自本公告发布之日起5个工作日。六、其他补充事宜评分方法和标准：综合评分法。本项目非专门面向中小企业。政府采购政策：节能产品强制采购；节能产品、环境标志产品优先采购；政府采购促进中小企业发展；政府采购支持监狱企业发展；政府采购促进残疾人就业；政府采购信用担保；进口产品管理七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：北京师范大学　　　　　地址：北京市新街口外大街19号　　　　　　　　联系方式：滕老师zfcg@bnu.edu.cn 　　　　　　2.采购代理机构信息名 称：国金招标有限公司　　　　　　　　　　　　地　址：北京市朝阳区东三环南路甲52号顺迈金钻国际商务中心9层9C　　　　　　　　　　　　联系方式：边璐、王珊珊、杨振豪、宋梦夏010-56215050　　　　　　　　　　　　3.项目联系方式项目联系人：边璐、王珊珊、杨振豪、宋梦夏电　话：　　010-56215050

p style=" margin: 0px 0px 14px background: white text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 仪器信息网讯 /strong & nbsp span style=" text-indent: 2em " 近日，北京大学白玉副教授团队在常压质谱免疫分析平台工作的基础上，设计并拓展质谱探针，利用基于狄恩流的微流控芯片实现单细胞排列，结合纳升电喷雾-高分辨质谱（nanoESI-HRMS），搭建了多维度有机质谱流式细胞分析平台。 /span /p p style=" margin: 0px 0px 14px background: white text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 331px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/e034a7c1-bb38-4c40-8a79-225f9e1d02e2.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 600" height=" 331" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 多维度有机质谱流式分析平台 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该平台能够高通量地对单细胞水平的蛋白质和代谢物等多维度信息进行同时获取。相关成果2020年10月21日在& nbsp Angewandte Chemie International Edition& nbsp 在线发表（Multi-Dimensional Organic Mass Cytometry: Simultaneous Analysis of Proteins and Metabolites on Single Cells，Angew. Chem. Int. Ed.,& nbsp 2020, DOI: 10.1002/anie.202009682）。 strong style=" text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " ( /span span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " a href=" https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202009682" target=" _blank" 点击链接了解论文详情 /a ) /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 单细胞中内容物体积少、含量低、种类多、分析窗口有限，使得高灵敏、高信息覆盖度、快速、高通量的单细胞分析面临重大挑战。通过单次测量实现多维度、多参数的单细胞定量信息获取，对于细胞分型、鉴定以及单细胞水平的疾病相关分子机制研究具有重要意义。单细胞测序技术方兴未艾，但针对单细胞中蛋白质和代谢物的分析技术仍非常有限，尤其是大量蛋白质和代谢物的同时分析尚未见报道。荧光流式细胞术可对单细胞中多种蛋白质进行分析，然而光谱带宽重叠问题限制了其同时测定的通道数。以CyTOF为代表的质谱流式细胞仪可实现单细胞中40余种蛋白质的同时定量分析，但其依赖于ICP-MS仪器，且ICP-MS无法提供细胞内源物质结构信息，极大地限制了方法的检测对象；有机质谱的结构鉴定能力强、质量分辨率高，可实现单细胞中小分子代谢物的分析。基于有机质谱建立流式细胞分析新方法，从而获取单细胞中蛋白组、代谢组等多组学信息，在单细胞异质性相关研究具有不可替代的分析优势。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该工作中设计并合成了一系列基于罗丹明质量标签的质谱探针，对单细胞表面的CA125、CEA、EpCAM、CD24、CD44和CD133等重要的蛋白标志物进行标记；标记的细胞利用基于迪恩流的微芯片实现单细胞排列，并利用nanoESI-HRMS实现单细胞检测。离子化过程中可实现质量标签的高效解离和细胞内容物的有效释放，从而确保了单细胞中蛋白质和代谢物信息的同时获取。该质谱流式分析平台成功实现了单细胞水平6种目标蛋白质及84种代谢物的同时检测，证实了蛋白质和代谢物在细胞个体间的显著差异性。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 753px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/834f3be8-504e-4692-8549-7d4e4e92ea8e.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" width=" 600" height=" 753" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em text-indent: 2em " A2780细胞质谱流式分析结果 /p p style=" line-height: 1.75em text-align: justify text-indent: 2em " 基于该多维度有机质谱流式细胞分析平台所获取的信息，工作首次同时利用蛋白质及代谢物信息作为细胞分型依据，在5种肿瘤细胞的PCA分析中获得了更好的鉴定和分型结果。在利用Ward’s法得到的聚类结果中，相比于利用单一的蛋白质或代谢物信息，使用蛋白质和代谢物的综合信息能够获得更高的分型灵敏度和特异性。单细胞分析方法在干细胞研究、细胞耐药性研究以及癌症治疗等方面具有重要意义，该流式平台还成功实现了肿瘤细胞耐药异质性分析，其结果有望为分子水平的耐药性细胞研究或癌症干细胞研究提供分析依据。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 590px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/6dfdd07e-01d8-40ed-aed8-bd47e0c1d11b.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 590" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 细胞分型和肿瘤耐药差异性结果图 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该论文第一作者为15级博士研究生徐姝婷。工作得到国家自然科学基金委和科技部国家重点研发计划和北京市自然科学基金重点项目的资助。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 研究学者： /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 250px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/38d36728-c2e0-4fc5-8087-cbb4d275ac50.jpg" title=" 白玉.jpg" alt=" 白玉.jpg" width=" 200" height=" 250" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 北京大学副教授 白玉 /p p style=" line-height: 1.75em " 研究领域与研究兴趣： /p p style=" line-height: 1.75em " 　　1.超灵敏质谱分析新方法研究； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　2.单细胞质谱分析； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　3.新型纳米分离介质在复杂体系分离分析中的应用； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　4.常压敞开式质谱离子化技术及其仪器研发； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　5.疾病相关的代谢组学研究。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 点击了解白玉课题组网页： /strong a href=" https://www.chem.pku.edu.cn/PAAL/" target=" _blank" https://www.chem.pku.edu.cn/PAAL/ /a /p p br/ /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

蛋白质是细胞功能的执行者，是一切生命的物质基础。然而人们对蛋白质和蛋白质组的了解还远远不够，蛋白质分析被认为是一项复杂而艰巨的任务。2015年是蛋白质领域的关键一年，有可能决定着蛋白质分析的未来走向。 　　1.人类蛋白互作图谱取得更大的成果。最近Cell杂志上发表了一项大规模的蛋白质研究，科学家们鉴定了一万四千个蛋白相互作用，获得了迄今为止最大规模的人类蛋白互作图谱。他们计划将在未来六年中逐步完成人类基因组的全部互作图谱。这种图谱可以帮助人们更全面的了解人类互作组，进一步理解疾病的发生和发展。对新发现的蛋白互作进行研究，能够揭示基因型和表型之间的真实关系。我们期待在2015年看到这类研究结出更多硕果。 　　2.人造环境为蛋白质分析提供便利。今年八月Roy Bar-Ziv及其同事在Science杂志上发表文章，展示了以微流体DNA隔室为基础的人造细胞。这些二维的人造细胞可以实现预编程的蛋白合成、代谢和通讯，是一种非常灵活的蛋白合成系统。研究显示，人造细胞能够更好的模拟蛋白表达的动态模式，维持蛋白信号的梯度。人们可以利用这一系统来评估蛋白质的活性和相互作用，这种方法将对蛋白质功能研究产生重要的影响。 　　3. 一个时代的终结&mdash &mdash 蛋白质结构计划PSI收官。PSI项目在运行了十五年后，正逐步走向自己的终点。PSI项目已经确定了六千三百多个蛋白结构，为蛋白质分析做出了重要的贡献。那些为PSI而建的高通量蛋白生产中心可能会继续维持下去，给其他结构生物学实验室使用。结构生物学家们也可能启动与数据处理有关的中、大型项目，作为PSI的延续。 　　不管怎样，对于蛋白质领域来说明年都是特别的一年，研究者们需要决定PSI之后的前进方向。我们希望未来能有更多类似人类互作组图谱的大型项目，增进我们对蛋白质结构和功能的理解。

俗话说：文无第一，如果非要整出个蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，显然并不是一件容易的事，也注定是一件有争议的事。作为一个半路出家的准业内人，我就本着无知者无畏的革命精神，说一下我自己心目中的第一牛人：Ruedi Aebersold。 　　考虑到科学网的大多数网友对蛋白质组学并不了解，先简单科普一下，根据百度百科的定义：“蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。” 1995年(也有1994，1996年之说)Marc Wikins首次提出蛋白质组(Proteome)的概念1，1997年, Peter James(就职于有欧洲MIT之称的瑞士联邦工学院(ETH))又在此基础上率先提出蛋白质组学的概念2。基因组学和蛋白质组学的概念又进一步催生了N多的各种各样的组学(omics)，两者的诞生的发展，也使系统生物学成为可能，本文的主人公Ruedi Aebersold与Leroy Hood一起于2000年在美国西雅图创办了系统生物学研究所(ISB),该所的建立不但标志着系统生物学作为一门独立的学科的诞生(此句话貌似不靠谱，参见文后14楼的评论)，也带动了包括蛋白质组学在内的多种组学的发展，当然各种组学的发展也同时促进了系统生物学的发展。尽管日本也于2000年在东京建立了系统生物学研究所，但是同为第一个吃螃蟹的，东京的这个所，无论是学术水平还是世界影响都无法和西雅图的那个系统生物学领域的麦加相提并论。闲话少叙，我之所以认为Ruedi Aebersold是蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，是基于如下原因： 　　Ruedi Aebersold对蛋白质组学的最大贡献可谓是同位素代码标记技术(ICAT)，现在这一蛋白组定量技术自从1999年在Nature上发表以来，该技术已世界广泛应用，该论文迄今(截至2013年1月11日)已被引用了近3000次。Web of Science的检索结果显示，蛋白组学领域迄今已经至少有超过10万篇论文发表，按照被引用次数排名，该论文位居第三位。有意思的是，被引用次数排第四位的是Ruedi Aebersold和另外一位牛人Mathias Mann(下面会介绍)于2003年发表在Nature上的有关蛋白质质谱与蛋白质组学的综述论文，迄今也已被引用近2800次。而引用次数排第一和第二的两篇论文的通讯作者并算不上是蛋白质质谱与蛋白质组学领域的，蛋白质组学仅仅是他们使用的工具，他们的影响也在这个领域之外。蛋白质组学领域，最重要的专业协会应该算是HUPO (国际人类蛋白质组组织), 最重要的专业会议也当属HUPO世界大会，Ruedi Aebersold曾获HUPO含金量最高的成就奖，他本人也经常是HUPO世界大会的分会主席或大会特邀报告人。当然Aebersold还获得了包括美国质谱协会(ASMS)大奖在内的许多专业大奖。可能有人会列出另外的自己心中的第一牛人(如上述的Mathias Mann)，但Ruedi Aebersold无疑至少是领域内公认的前几位的世界级牛人。另外，顺便说一下德国马普所的Mathias Mann(其在丹麦首都也有实验室)，Mann和Aebersold可谓是蛋白质组学领域的双子星座，都是该领域的顶级牛人，Mann发表的论文有多篇都在蛋白质组学领域被引用次数前10位，不少被引用次数都上千次。上述的Mann和Aebersold两人能在Nature发表综述论文也说明了他们的江湖地位。Aebersold和Mann所发表的论文总被引次数分别超过了5万和3万次，这个数字在世界所有领域都是惊人的。另外，Mathias Mann在蛋白质组学最大的贡献可以说是发明了蛋白质组体内标记技术SILAC3,这种技术与Ruedi Aebersold发明的ICAT已及另外一种标记iTRAQ是公认的应用最为广泛的蛋白质组学定量标记技术。 　　今年年近花甲的Ruedi Aebersold是世界蛋白质组学的开拓者之一，现在在上述的ETH的工作，和最早提出蛋白质组学Peter James在同一个大学。作为土生土长的瑞士人，Ruedi Aebersold是在2004年底、2005年初才开始在ETH全职工作的，可谓是瑞士的大海龟。Ruedi Aebersold此前在西雅图的ISB和华盛顿大学工作，作为ISB的元老和共同创办人，Ruedi Aebersold现在还是ISB的兼职教授，发表论文时也还署ISB地址。Mann和Aebersold都是欧洲人，现在又都致力于将蛋白质质谱与蛋白质组学应用到临床，尽管蛋白质组学已有十多年发展历史，现在最大的一个瓶颈可以说在基本无法应用到临床，现有的技术，对于临床应用而言，时间和经济成本都太高(无法高通量、检测成本太贵)。这一块硬骨头显然不是一般人能够啃得动的，需要从临床样品制备、质谱技术到数据分析都要有突破甚至革命性的创新，我很期待，也相信Mann和Aebersold有能力最终使蛋白质组学(尤其是基于此的生物标志物鉴定技术)应用到临床。 　　我国在蛋白质质谱与蛋白质组学领域在世界上最出名的无疑非贺福初莫属，贺福初的名字在国内搞蛋白质组学应该都知道他的名字，他的头衔很多(如将军、院士)，我就不一一列举了，新年伊始他又多了一个牛头衔：万人计划中的科技领军人才。贺的工作和学术水平，我不熟悉，不敢评头论足。他的文章被引用次数最高的是发表在Cancer Research一篇论文，迄今已有126次，但并非是蛋白质组学领域。在蛋白质组学领域，他的被引次数(含自引)最高的论文是2007年发表在蛋白质组学顶级期刊MCP的文章4，迄今已有105次引用。蛋白质质谱领域，我国在世界上最出名的学者估计要数复旦大学的杨芃原了，他的被引用次数最高的一篇论文，是2005年发表在化学顶级期刊德国应用化学的文章5，迄今已被引用70次，杨芃原为该论文的共同通讯作者。我国在蛋白质组学目前被引用次数最高的是南开大学王磊(澳大利亚海归、长江学者)2007年发表在美国科学院院刊(PNAS)的论文6，迄今被引次数已经超过500次。 　　蛋白质质谱仪主要生产商Thermo Fisher(即原来的Finnegan), 最近新出了本挂历，这本特别的挂历上列了13位在蛋白质质谱与蛋白质组学领域的牛人，上述的Ruedi Aebersold和Mathias Mann都在之列，其余11位简单介绍、列表如下。 姓 名 工作单位 主要贡献 Richard D. Smith 美国太平洋西北国家实验室 1990年首次用三重四级杆质谱Top-down（自上而下）分析完整蛋白 John Yates III 美国Scripps研究所 SEQUEST MS/MS数据库搜索程序 Joshua Coon 美国威斯康星大学麦迪逊分校 发明了电子转移解离技术(ETD) Neil Kelleher 美国西北大学 Top-down蛋白质组学 Kathryn Lilley 英国剑桥大学 蛋白质组学定量技术 Pierre Thibault 加拿大蒙特利尔大学 应用生物质谱和蛋白质组学到细胞生物学 Michael MacCoss 美国华盛顿大学（西雅图） 稳定同位素标记技术 Albert Heck 荷兰Utrecht大学 基于质谱的结构生物学 Catherine Costello 美国波士顿大学 HUPO前任主席，质谱技术发展及应用 Alexander Makarov 德国Thermo Fisher Scientific 生物质谱全球研发总监 领导研发Orbitrap质谱仪 Donald Hunt 美国弗吉尼亚大学 FT-MS and ETD 　　简单的说，上述13位世界级牛人都来自欧美，没有一位来自亚洲，也没有一位华人。我不知道以Ruedi Aebersold代表的上述牛人是如何炼成的，但可以肯定的是：他们不是欧美版的“百人”计划，也不是“千人”计划，更不是“万人”计划而“计划”出来的。网上的公开信息表明：Ruedi Aebersold除了在国际专业协会和期刊有学术兼职外，没有任何行政职务，就是一普通教授，但是这不妨碍他成为蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人。

2017年5月23日，全球生物技术领先企业珀金埃尔默（PerkinElmer,Inc.）公司与国家蛋白质科学中心 北京（凤凰中心）共同举办了“蛋白质功能技术研讨会”，凤凰中心坐落于中关村生命科学园内，配备了国际顶尖的硬件设备和软件工具，包括来自珀金埃尔默的多模式检测、高内涵细胞成像分析系统、小动物活体成像系统，同时也为园区内其他企业提供了开放性的专业研究平台。此次研讨会旨在服务现有客户，辐射园区客户，拓展应用范围、推动新技术交流。 技术研讨会主要以从元素、分子、细胞到动物的蛋白质研究整体解决方案为主线，由珀金埃尔默应用技术专家姚继军博士、刘治东分别对细胞中的金属元素检测新技术以及分子与蛋白相互作用的应用解决方案进行了介绍。应用技术专家王瑜与石晓月针对高内涵和小动物活体成像中的肿瘤、肝病、传染性疾病等方向做了应用案例分享。 整个研讨会互动热烈，参会的听众对新技术及新应用很感兴趣，既提出了不少实验中遇到的具体的问题，也讨论了进一步实验设计的前瞻性问题。 通过此次技术研讨会，加强了珀金埃尔默公司与广大用户的沟通与交流，现有用户对于珀金埃尔默公司的整体解决方案有了更加深刻和系统的了解。

2003年12月15日，由中国科学院院士贺福初牵头的“人类肝脏蛋白质计划”（HLPP）启动，这是我国领导的第一项重大国际合作计划，也是第一个人类组织/器官的蛋白质组计划。 北京蛋白质组研究中心主任、蛋白质组学国家重点实验室副主任秦钧告诉《中国科学报》记者，十余年来，HLPP经历了三代更迭，从第一代版本的肝脏总蛋白质组，到第二代的肝脏细胞器蛋白质组，以及到刚刚完成的第三代肝脏不同细胞亚群的蛋白质组解析。HLPP的肝脏蛋白质组研究正在并将继续作为“中国人类蛋白质组计划”（CNHPP）的先导，为CNHPP的发展探明道路。 事实上，通过HLPP研究十余年的努力，中国蛋白质组研究团队已向世界交上了一份漂亮的答卷。 据记者了解，中国科学家成功构建了迄今国际上质量最高、规模最大的人类第一个器官蛋白质组的表达谱、修饰谱、连锁图及其综合数据库；首次实现人类组织与器官转录组和蛋白质组的全面对接；在炎症诱发肿瘤等方面，发现一批针对肝脏疾病、恶性肿瘤等重大疾病的潜在药靶、蛋白质药物和生物标志物。 2008年，张学敏课题组首次发现炎症和免疫的新型调控分子CUEDC2，可作为肿瘤耐药的新标志物，从而为克服癌细胞耐药提供了原创性的药物新靶点和治疗新思路。2010年，周钢桥课题组“逮到”肝癌的易感基因，为肝癌的风险预测和早期预警提供了重要理论依据和生物标记̷̷上述几项成果均发表于国际顶级的《科学》《自然》系列杂志。 秦钧认为，蛋白质组学研究是我国生命科学中几个能够始终跻身世界前沿的科学领域之一。 而现在，世界蛋白质组学领域内的新一轮科技竞赛已开始。中国科学院院士、中国科学院大连化学物理研究所研究员张玉奎表示，虽然中国在蛋白质组学领域走在了世界前列，但国外有些团队如今正快马加鞭，中国科学家必须加快步伐，不能丧失已经取得的优势。 这也是我国开展CNHPP研究的一个重要原因。“这是真正的原始创新，是中国能够引领世界科技发展的重要领域之一。”贺福初说。

人类和老鼠的外貌可说是天渊之别，但实际上他们却有着近99%相同的基因组。何以&ldquo 失之毫厘差之千里&rdquo ？正是蛋白质放大了他们基因上的细微差别。 日前，中国人类蛋白质组计划全面启动。&ldquo 基因组学中微小的差异，在蛋白质组学中可以被千倍甚至几近万倍地放大。&rdquo 亚太蛋白质组组织主席、中国科学院院士贺福 初表示，这一计划的实施将对基因组序列图进行&ldquo 解码&rdquo ，进而全景式揭示生命奥秘，为提高重大疾病防诊治水平提供有效手段。 解码生命的&ldquo 密钥&rdquo 提起蛋白质，大家并不陌生。它是生物体内一种极为重要的高分子有机物，约占人体干重的54%。 不过，&ldquo 蛋白质组&rdquo 一词却鲜有人了解。其实，蝴蝶由卵变虫、成蛹、再破茧成蝶，幕后&ldquo 操盘者&rdquo 并非基因组，而是蛋白质组。&ldquo 1994年澳大利亚科学家率先提出蛋白质组这个概念，指某个时刻、某个组织、器官或个体中所有蛋白质的集合。&rdquo 贺福初说。 科学家们之所以对蛋白质组产生浓厚兴趣，还要从人类基因组计划说起。2003年4月，耗资27亿美元、经由6国科学家历时13年奋战的人类基因组计划，以人类基因组序列图的绘制完成为标志，画上了句号。 没想到，更大的挑战还在后头&mdash &mdash &ldquo 科学界曾经认为，只要绘制出了人类基因组序列图，就能了解疾病的根源，但是错了&rdquo 。国际蛋白质组组织启动计划主席萨姆· 哈纳什说，事实上，我们此时只了解10%的基因的功能，剩下的90%仍是未知的。 &ldquo 人类基因组计划并不像事前所预期的那样，能够逾越蛋白质这一生物功能的执行体层次，揭示人类生、老、病、死的全部秘密。基因组序列只是提供了一维遗传信息，而更复杂的多维信息发生在蛋白质组层面。&rdquo 贺福初表示。 就 人体而言，各个器官的基因组是一样的，而它们之所以形态、功能各异，正是其结构与功能的物质基础&mdash &mdash 不同的蛋白质组在&ldquo 操盘&rdquo 。&ldquo 就像蛹化蝶，无论形态如 何变化，基因组是不变的。&rdquo 军事医学科学院放射与辐射医学研究所研究员钱小红说，人的每一种生命形态，都是特定蛋白质组在不同时间、空间出现并发挥功能的 结果。比如，某些蛋白质表达量偏离常态，就能够表征人体可能处于某种疾病状态。 &ldquo 无论是正常的生理过程还是病理过程，最直接的体现是蛋白质以及它们的集合体&mdash &mdash 蛋白质组。&rdquo 上述专家们表示。&ldquo 生，源于基因组；命，却一定由蛋白质组决定。只有蛋白质组才能根本阐释生命。&rdquo 贺福初说。 独辟蹊径的&ldquo 中国画卷&rdquo 事实上，早在上世纪90年代人类基因组计划成形之际，已有科学家提出解读人类蛋白质组的想法。其目标是，将人体所有蛋白质归类，并描绘出它们的特性、在细胞中所处的位置以及蛋白质之间的相互作用等。 《科学》杂志在2001年，也将蛋白质组学列为六大科学研究热点之一，其&ldquo 热度&rdquo 仅次于干细胞研究，名列第二。 不过，严峻的现实挑战，让这一想法迟迟停留在&ldquo 纸上谈兵&rdquo 阶段。&ldquo 生物蛋白质数的差别大概是基因数差别的三个数量级左右，人类基因总数大概2万多个，人体内的蛋白质及其变异、修饰体却是百万级的数量。&rdquo 贺福初表示。 不仅如此，人类基因组图谱只有一张，而蛋白质组图谱每个器官、每个器官的每一种细胞都有一张，且在生理过程和疾病状态时还会发生相应改变。工程的艰巨性可想而知。 但困难并未阻挡住科学家们对其探索的脚步。1995年，首先倡导&ldquo 蛋白质组&rdquo 的两家澳大利亚实验室分别挂牌成立蛋白质组研究中心。随后欧美日韩等国均有行动。 1998年初，从事基因组研究的贺福初敏锐地嗅到这朵夜幕后悄然盛开的&ldquo 莲花&rdquo ，逐渐将精力投入到这个新兴领域。 2001年，&ldquo 基因组会战&rdquo 尚未鸣金，《自然》、《科学》杂志即发出&ldquo 蛋白质组盟约&rdquo 。同年秋，&ldquo 人类蛋白质组计划&rdquo 开始孕育。 2002 年4月，贺福初在华盛顿会议上阐述&ldquo 人类肝脏蛋白质组计划&rdquo 。同年11月，&ldquo 人类血浆蛋白质组计划&rdquo &ldquo 人类肝脏蛋白质组计划&rdquo 正式启动，贺福初担任&ldquo 人类 肝脏蛋白质组计划&rdquo 主席。其后两年间，德国牵头的&ldquo 人类脑蛋白组计划&rdquo 、瑞士牵头的&ldquo 大规模抗体计划&rdquo 、英国牵头的&ldquo 蛋白质组标准计划&rdquo 及加拿大牵头的 &ldquo 模式动物蛋白质组计划&rdquo 相继启动。 然而，很少有人知道，这种以生物系统为单元的研究策略酝酿之初饱受诟病。贺福初回忆，在华盛顿，中国人提出蛋白质组计划必须按生物系统（如器官、组织、细胞）进行一种战略分工和任务分割，一石激起千层浪，争议四起。 &ldquo 要想通过分工合作来完成全景式分析人类蛋白质组的宏大目标，必须以人体的生物系统作为研究单元和分工的规则。这个策略，10年来合者渐众，不过目前仍存争议，中国的先见之明可能得在下个10年成为不可阻挡的潮流。&rdquo 贺福初坦陈。 定位疾病的&ldquo GPS&rdquo 历经10余年的努力，以贺福初为代表的中国蛋白质组研究团队，在该领域向世界交了一份漂亮答卷： 成功构建迄今国际上质量最高、规模最大的人类第一个器官（肝脏）蛋白质组的表达谱、修饰谱、连锁图及其综合数据库； 首次实现人类组织与器官转录组和蛋白质组的全面对接； 在 炎症诱发肿瘤等方面，发现一批针对肝脏疾病、恶性肿瘤等重大疾病的潜在药靶、蛋白质药物和生物标志物。如，2008年，张学敏课题组首次发现炎症和免疫的 新型调控分子CUEDC2，可作为肿瘤耐药的新标志物，从而为克服癌细胞耐药提供了原创性的药物新靶点和治疗新思路。2010年，周钢桥课题组&ldquo 逮到&rdquo 肝 癌的易感基因，为肝癌的风险预测和早期预警提供了重要理论依据和生物标记。2012年，张令强课题组研制出世界上首个能特异性靶向成骨细胞的核酸递送系 统，提供了一种基于促进骨形成的全新骨质疏松症治疗途径，向解决骨丢失无法补回这一医学难题迈出了坚实的一步。2014年，张令强课题组首次在国际上揭示 泛素连接酶Smurf1是促进结直肠癌发生发展，并且导致病人预后差的一个重要因子&hellip &hellip 上述几项成果均发表于国际顶级的《科学》、《自然》系列杂志。 还没来得及分享这一喜悦，激烈的角逐又让他们绷紧了神经。日前，英国《自然》杂志公布美国、印度和德国等合作完成的人类蛋白质组草图。研究人员表示，这一成果有助于了解各个组织中存在何种蛋白质，这些蛋白质与哪些基因表达有关等，从而进一步揭开人体的奥秘。 &ldquo 尽 管还有许多不完善的地方，但确实是蛋白质组学领域乃至整个生命科学领域，具有里程碑意义的科学贡献。&rdquo 中国科学院院士饶子和直陈。中国科学院院士张玉奎指 出，虽然中国在蛋白质组的一些领域走在了世界前列，但国外有些团队正快马加鞭，我们不得不警醒，否则很快将被甩出第一阵营。 6 月10日，中国人类蛋白质组计划全面启动实施。&ldquo 蛋白质组，可以揭示疾病的发病机制和病理过程，发现新型诊断标志物、治疗和创新药物，可以全面提高疾病防 诊治水平。这个项目完成后，将揭示人体器官蛋白质组的构成，一旦哪一部位出现异常即可实现&lsquo GPS定位&rsquo ，进而找到针对性的诊断措施、干预措施和预防措 施。&rdquo 记者了解到，中国人类蛋白质组计划第一阶段，将全面揭示肝癌、肺癌、白血病、肾病等十大疾病所涉及的主要组织器官的蛋白质组，了解疾病发生的主要异常，进而研制诊断试剂以及筛选药物。这将在2017年左右完成。 &ldquo 这是真正的原始创新，也是中国能够引领世界科技发展的重要领域之一。&rdquo 贺福初强调说。

记第四届中国计算蛋白质组学研讨会（CNCP-2016）新技术　　仪器信息网讯 2016年8月10日-11日，第四届中国计算蛋白质组学研讨会(CNCP-2016)在中国科学院大连化学物理研究所盛大召开。(相关新闻：第四届中国计算蛋白质组学研讨会(CNCP-2016)在大连开幕)。本届研讨会邀请了26个大会报告，报告嘉宾是来自国内外的计算蛋白组学领域专家和奋战在第一线的青年科研工作者，嘉宾中的绝大多数是首次登上CNCP讲坛。报名参加本届会议的人员首次超过了200人。CNCP2016C参会代表合影张丽华研究员为研讨会致开幕辞　　本届会议的开幕式只有简短的5分钟，没有领导讲话，没有任何仪式，充分体现了会议的简洁办会特色。开幕式由中国科学院大连化学物理研究所的张丽华研究员致欢迎词，她提到：“中国计算蛋白质组学研讨会在业界享有很高盛誉。每次会议的演讲嘉宾都是由会议发起者和主办方——中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员、北京蛋白质组研究中心徐平研究员、北京生命科学研究所董梦秋研究员等资深学者以及往届会议报告人鼎力推荐的。本次研讨会的26个报告将由来自国内外相关领域的顶级专家和奋战在科研第一线的青年才俊精彩呈现。相信在这两天的会议中，大家不仅能够收获知识，也能收获友谊。”研讨现场　　CNCP-2016会议邀请的26个报告多数都是最近一两年的研究成果，部分还没有发表，新技术频繁现身，特别是在交联质谱技术与蛋白质复合体，蛋白质相互作用、翻译后修饰技术、蛋白质鉴定数据处理、定量蛋白质组技术等领域报告较多，下面对这26个报告的内容逐一进行简介总结。　　UCI(美国加利福尼亚大学尔湾分校)黄岚博士 报告题目《Developing Cross-Linking Mass Spectrometry (XL-MS) Strategies to Define Interaction and Structural Dynamics of Protein Complexes》　　了解蛋白质复合物的相互作用和结构动力学对于揭示病理的分子学细节非常有帮助。交联质谱(XL-MS) 是目前研究大量多亚基蛋白复合物PPIs的重要技术，而精确的肽段鉴别是XL-MS分析一直以来面临的挑战。为了促进这方面的研究，黄岚博士研究组研发了DSSO 及一系列含亚砜(sulfoxide-containing)可分裂质谱交联剂以揭示蛋白质复合物表面相互作用机理。研究者通过这些(MS-cleavable reagents)质谱可分裂试剂在多级串联质谱上建立了实用的XL-MS工作流，快速、准确的鉴别交联肽段去研究体内和体外的PPIs。同时，研究者也研发了新的定量XL-MS途径，用以分析多种生理条件下蛋白质间的相互作用和蛋白质复合体的结构动态变化。据介绍，该课题组最近研发了新的羧基交联剂DHSO主要用来与酸性氨基酸反应，反应中需要DMTMM共同作用。 这样可以得到更广的蛋白相互作用信息。北京生命科学研究所 谭丹博士 报告题目《Trifunctional Cross-Linker for Mapping Protein-Protein Interaction Networks and Comparing Protein Conformational States》　　该研究组最近有一项研究工作围绕一种含生物素标签的赖氨酸富集交剂Leiker，谭丹博士在报告中详细展示了课题组的相关研究，研究表明Leiker能够有效改进蛋白质化学交联质谱技术(CXMS)。研究组将以Leiker为交联剂的CXMS用于E.coli全细胞裂解液的分析，发现了3656种相互作用，是之前已有研究方法的10倍。Leiker CXMS比BS3得到的信息要立体很多，能得到更全面的蛋白质相互作用网络。研究者还将Leiker为基础的CXMS用于RNA结合位点鉴定与定量，该方法能够深入揭示蛋白质构象变化。在将Leiker CXMS用于大肠杆菌和秀丽线虫裂解液中的研究中，分别鉴定出3130和893个互补赖氨酸对，并各自发现了677和121种PPIs。Utrecht University (荷兰乌德勒支大学) 刘凡博士 报告题目《Charting the Cellular Interactome by Proteome-Wide Cross-Linking Mass Spectrometry》　　据刘凡博士介绍，针对交联数据分析的n-square和交联肽段低效裂解这两大难题，该研究组建立了一种新XL-MS工作流-质谱可分裂交联剂法。该法是一种混合MS2-MS3裂解途径与专用的交联搜索数据库结合的方法。研究者将质谱裂解交联剂DSSO应用于测定每个交联肽段的前体质量，解决了n-square问题。交联裂解前体离子可通过质量差异确定数据的MS3采集方向，这些工作都可以在Oribitrap Fusion 和 Lumos Tribrid质谱上完成。这种采集途径提高了MS3实验的成功率，能够解决低效裂解问题和显著改善数据质量。与先前方法相比，报告中介绍的新方法包含以下三个优势。1)能够完成整体蛋白组数据库的交联鉴别 2)包括多种翻译后修饰的交联鉴别 3)在MS2和 MS3水平都有高质量范围。该研究组将此新XL-MS方法用于多种复杂样本，包括大肠杆菌裂解物、HeLa裂解物、排阻色谱分馏的HeLa细胞核提取物与细胞器。采用这种方法能够从每种样本得到成千上万个交联点。中国科学院计算技术研究所 刘超博士 报告题目《Development of the Cross-Linked Peptides Identificationin Large Scales》　　由于检索空间过于庞大，蛋白组范围内交联肽段(双肽)的鉴定一直都是一项挑战。刘超博士和其团队考察了用于大范围交联肽段鉴定的普通搜索工具的应用效果，并开发了一种新的计算软件技术pLink 2.0。此技术比先前技术有三方面的改进：1)提高了双肽中单同位素鉴定的精度 2)由肽段索引升级为离子索引 3)引入机器学习(SVM在线训练)。该团队研究表明，通过使用离子索引pLink2.0检索人类数据库，在一小时以内可以完成5000张谱图的检索。干湿结合方法在人库检索1万张二级谱图仅用时不到2分钟。将pLink 2.0与美国西雅图研究人员研发的Kojak相比较，pLink2.0的分析速度约为Kojak的6倍，在精度方面也有一定优势。pLink2.0支持可碎裂交联，可减少可搜索空间和减少谱图数目。华中师范大学 万翠红博士 报告题目《Mapping Conserved Metazoan Protein Complexes with Biochemical Fractionationand LC/MS/MS》　　对多蛋白复合物的了解对于生理进程探索非常重要。然而，对多蛋白复合物种类的分布特别是大规模网状图的发现比较困难。万翠红博士研究组通过高分辨生化分离与定量质谱直接分析了可溶性多蛋白复合物的组成，分析C.elegans、D.melanogaster、M.musculus、S.purpuratus和人类的可溶性细胞提取物。研究组采用以人类为中心的综合计算分析，鉴别出2153种蛋白，并新鉴定出7699种成对相互作用和981种共复合作用。这些相互作用能够反映后生动物生理过程相关的核心生理基础。重建的生理作用网有助于深入了解特殊的分子生物机理以及动物细胞的进化。国家蛋白质科学中心 郑勇博士 报告题目《Scaffold Protein-Mediated Dynamic Assembly of Protein Complexes in Normal and Cancer Cells》　　很多细胞表面受体通过催化多组分蛋白复合物的形成开始信号传导过程。这个过程通过与受体结合的scaffold蛋白来传导。然而，目前这种scaffold的生物学基本原理仍不明晰。针对这个问题，郑勇博士研究组通过以IP-MRM为基础的方法，根据Shc1复合信号跟踪其空间和实时变化。研究人员进一步将这种方法与生化和基因技术结合，研究组发现Shc1以特殊的方式对EGF有即时的反应，包括明显的磷酸化和蛋白质相互作用。研究人员成功发现Shc1与一种抑制蛋白产生相互作用，是一种快速绑定蛋白基团能够激活促有丝分裂/存活通路，蛋白复合物围绕Shc1的装配变化在细胞间非常显著。对EGFR/Shc1复合物蛋白组分析能为以pTyr为基础的致肿瘤信号导致的乳腺癌提供诊断依据。暨南大学 张弓博士 报告题目《High-Throughput De Novo Proteome Identification Aided by Translatome Sequencing》　　De novo肽段序列鉴定能够避免依赖数据库的检索法的缺点，但由于由于没有背景库，无法评估FDR，且极易受到干扰信号误导，因此长期以来无法应用于复杂样品的大规模鉴定。张弓教授介绍了研究团队研发的利用翻译组测序数据作为蛋白质de novo鉴定质量控制新方法，使肽段de novo鉴定能首次应用在蛋白质组复杂样品的实用化鉴定。研究人员在HCD质谱上应用此方法检测三种肝癌细胞(Hep3B, MHCC97H, MHCCLM3)，单次实验鉴定出12000-13000种蛋白质，其灵敏度几乎达到了翻译组测序的水平 而用6种搜库软件鉴定到的真阳性蛋白并集也才7000-8000种。只能用新策略鉴定的4000余蛋白中随机挑选几十个进行MRM验证，几乎都能验证成功。这证明翻译组指导的de novo鉴定效能很高，能鉴定到大量搜索库法无法鉴定到的肽段和蛋白。De novo鉴定的大规模化可引致一系列新的蛋白质组应用。上海生命科学院　李辰博士 报告题目《De Novo Identification and Quantification of Single Amino-Acid Variants in Human Hepatocellular Carcinoma Tissues》　　肿瘤蛋白质组-基因组学研究非常关注变异的发现。单核苷酸的多变性(SNPs) 数据库能够给单个氨基酸变体(SAVs)的检测提供依据。李辰博士在报告中介绍了一种在蛋白组水平发现SAVs的新方法。该法基于de novo算法，肽段的可能候选者可被鉴别并与理论蛋白数据库比较。在人类肝癌(HCC)组织中，研究者成功的应用此方法鉴别和定量已知和新的突变蛋白。在肝组织当中，在细胞核内的突变比较低，突变在内质网和线粒体的富集比例较高。这种新方法为病人提供了高通量的定制检测途径，可能为潜在临床生物标志物发现和机理研究提供帮助。中山大学 肖传乐博士 报告题目《Improving Peptide Identification for Tandem Mass Spectrometry by Incorporating Translatomics Informatio》　　目前很多数据库检索方法是利用谱学数据而忽略能用于肽段鉴定的生物系统的其他信息。最近，转录物组RNA-seq的界面信息能提高肽段鉴别的灵敏度已经证实。与转录物组信息相比，翻译物组体现出与蛋白质的关系更为紧密，所以其可能对肽段鉴别更有效。在此报告中，肖传乐博士介绍了该研究组设计的高灵敏度肽段鉴定手段IPomics，其以翻译组学信息为主要蛋白鉴定参考。方法得到的推荐蛋白质优先性整合进了新的评分功能。与Mascot和pFind相比，IPomics方法蛋白质鉴定准确度更高，并能够增加整体肽段的鉴定率、谱学信息利用率，并已经利用LC-MS/MS数据集在人类和小鼠蛋白鉴定取得了显著效果。华大基因(BGI-Shenzhen) 闻博 报告题目《Protein Identification and Quantification based on Multiple Search Engines》　　闻博在报告中介绍了团队有关以多搜索引擎为基础的蛋白鉴定和定量软件的研究进展。目前，串联质谱技术产生的质谱数据解析率往往不高，不同蛋白质鉴定软件由于谱图预处理、打分算法不同等原因导致对同一个数据的解析结果往往存在一定的互补性。虽然有一些开源的软件可以通过精巧的运算将多个鉴定引擎的鉴定结果整合起来取得与单引擎相比更好的鉴定效果，但由于操作往往较为复杂、下游软件比较缺乏等原因，故没有在蛋白鉴定与定量中推广开来。为了促进多引擎整合方法在蛋白鉴定和定量中的应用，该研究组研发了一种多引擎综合鉴定的开源软件IPeak和同重同位素(如iTRAQ、TMT)标记定量软件IQuant，并将IQuant升级到IQuant2。IQuant2采用精妙的算法和mzIdentML标准，整合多引擎搜索结果进行蛋白质定量。在分析水稻蛋白样品(用Q-Exactive分析)和人细胞系蛋白(用TripleTOF 5600分析)样本时，与单个引擎定量结果相比，IQuant2定量的蛋白能提高28.8%，检测的差异蛋白数量能提高多大40%。多引擎搜索不但能够提高蛋白鉴定效果，也能提高蛋白定量效果。中国科学院水生生物研究所 葛峰博士 报告题目《GAPP: a Proteogenomic Software for Genome Annotation and Global Profiling of Posttranslational Modifications in Prokaryotes》　　葛峰博士在前期蓝细菌的蛋白基因组学研究工作的基础上，开发了一种用于原核生物的基因组注释和翻译后修饰全局发现的蛋白基因组分析软件GAPP。该软件最大的特点就是简单高效，具备初步生物信息学知识的研究者就能应用该软件进行原核生物的蛋白基因组数据的深度分析，利用该软件可以高效完成原核生物的全蛋白质组解析和翻译后修饰的全局发现的工作，该软件的开发和应用将有助于原核生物的基因组的精准鉴定，并有望成为原核生物基因组注释的一项标准流程。今后研究组还将根据用户的要求和体验继续对该软件进一步升级。复旦大学 周峰博士 报告题目《Genome-Wide Quantitative Proteomic and Transcriptomic Analysis Reveals Post-Transcriptional Regulation of Mitochondrial Biogenesis in Human Hematopoiesis》　　蛋白质组学样品分析需要高分辨分离平台，周峰博士研究组搭建了一种长色谱柱三维蛋白组学定量分析平台(GWPQ), 整套系统完全在线和实现操作自动化。研究者将在此平台建立的蛋白质组学方法与Ribosome profiling相比较，水平相当，在分析模型样品时有80%的重叠。研究者还用此方法开展了人体造血相关细胞的研究，二代测序与应用该平台的蛋白质组方法重叠率达到92%。研究团队利用此方法比较了人体最重要的造血干细胞和红细胞发育中14502个基因蛋白表达变化和17127个基因mRNA表达变化。mTORC1信号极大的促进了红细胞进化中线粒体蛋白的翻译，线粒体和mTORC1的遗传和药理学干扰削弱了体内和体外的红细胞生成。该研究支持了线粒体理论机理，可能与线粒体疾病和老化相关的血液缺陷有关。研究者用模式生物小鼠实验验证了线粒体在血红细胞发育中起到关键作用，找到了全新控制血红细胞发育的通路。Johns Hopkins University(美国约翰霍普金斯大学) 张会博士 报告题目《Comprehensive Analyses of Glycoproteins》　　已有不少实验证明，糖蛋白的变化与很多疾病相关。张会博士介绍了糖蛋白的生物合成、结构和功能以及分析糖蛋白的最新方法。糖蛋白的分析是蛋白质分析中最复杂的一种。研究者常把糖和蛋白分开分析，如已有的SPEG(固相提取糖基位点肽)法。该研究组建立了N-糖蛋白数据库，该库可用于检索已鉴定蛋白、通过精确质量数检索候选肽段、鉴定糖蛋白源等。该研究组最近还建立了分析N-linked糖链，糖基化位点，糖基化位点特异糖链，及O-linked糖链分析方法和软件，并探索了用糖基化酶推测多糖的方法。中国科学院大连化学物理研究所 于龙博士 报告题目《Isolation and Structural Analysisof N-Linked Glycansby Using Two-dimensional Chromatography, Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy》　　糖蛋白糖链的纯化合物对糖链的结构分析、精准检测以及功能研究都具有十分重要的意义。然而，目前糖链纯化合物仍处于严重匮乏的状态。来自大连化物所的于龙博士介绍了该团队根据自身优势，采用纯化制备方法来获取N-糖链纯化合物并对其结构进行解析的相关研究进展。研究者首先介绍了糖链的结构特点并对其分离分析中存在的难点问题进行了阐述。针对这些难点问题，研究者结合课题组的材料优势，构建了以二维亲水作用色谱分离体系为核心的糖链纯化制备流程，该流程包括糖蛋白糖链的释放、富集、二维分离、质谱表征以及核磁结构分析等技术单元。在二维色谱分离体系中，第一维度主要根据糖链的羟基数量而实现不同聚合度糖链的分离，第二维度主要用于同分异构体的分离。由于串联质谱技术并不能得到糖链准确的结构信息，因此，研究者目前正在探索核磁共振技术进行准确结构的分析。以现有的糖链纯化合物为基础，研究者接下来将分别在功能、结构和定量三方面开展相关研究以拓展糖链样品库的应用。青岛大学 李磊博士 报告题目《Ultra-Deep Tyrosine Phosphoproteomics Enabled by a Phosphotyrosine Superbinder》　　酪氨酸磷酸化网络应用在蛋白组学中不容忽视，如何找到pY尤为重要,但之前方法需要大量抗体才能富集pY。为解决业内这一问题，李磊博士研究组做了不少相关研究，团队研发的Superbinder(超亲体)易于制备，能够有效减轻实验室经济负担。研究者合成了pTyr1和pTyr2两个肽段，比较了SH2 superbinder法与其他几种方法的效果，又增加了Ti4+IMAX的去噪功能，证明其能有效富集pY。与抗体相比，src和grb2超亲体都能有效发现更多pTyr位点。研究者还应用superbinder富集方法进行了Tyr 磷酸化蛋白组学研究。如探索人细胞磷酸化蛋白不同功能分类和Tyrosine kinase (TK)的生物活性等。该项研究是与中科院大连化学物理研究所邹汉法团队、加拿大西安大略大学李顺成团队多方合作完成的。University of Minnesota (美国明尼苏达大学) 陈悦博士 报告题目《Discovery and Characterization of Short-chain Lysine Acylations with Mass Spectrometry and Quantitative Proteomics》　　赖氨酸是细胞内蛋白质翻译后修饰的重要靶点。最近，除了赖氨酸乙酰化以外还有一些短链酰基化修饰逐渐被发现。在陈悦博士的早期研究工作中，他从细致的质谱分析中发现了组蛋白赖氨酸丙酰化和丁酰化，两种新的短链酰基化修饰。进一步的研究表明，这两类短链酰基化修饰都是广泛存在的，并可以被特定的酶所调控。最近最新的研究表明赖氨酸丁酰化在Bromo domain识别和精子发育过程中起到重要的调控作用。为了进一步探索质谱信息中隐藏的其他新的修饰，研究者设计了PTMap软件,用来分析非限定性搜索，得到了一些可靠的新蛋白质修饰鉴定，包括琥珀酰化，巴豆酰化，羟基丁酰化等。在定量研究方面，该团队比较关心蛋白质修饰丰度，因为普遍使用的相对定量的分析方法对解释蛋白质修饰的生物学意义有一定的局限性，但是质谱分析得到的离子峰强度并不能直接比较来计算蛋白质修饰的丰度。研究者针对此问题开发了稳定同位素标记为主的新的蛋白质修饰丰度定量方法，可以直接比较离子峰强度，通缩计算得到每个位点上赖氨酸位点丰度，准确性和重现性都很好。中国科学院昆明动物研究所 赖仞博士 报告题目《Mite Allergen Diversity Identification by Proteomics Coupling with Pharmacological Testing》　　螨虫、马蜂、牛虻和蟑螂等带有很多种过敏原，一些过敏甚至会导致死亡。过敏的标准治疗方式就是利用过敏原进行脱敏治疗，现在很多机构希望把过敏原纯化出来进行过敏治疗，因此对过敏原发现和提取纯化都有更多要求。屋尘螨(HDM) 是最常见的室内过敏原。赖仞博士希望结合蛋白质组学、药理和病理学手段来进行过敏原的多样性研究。过敏原蛋白组学研究一般是将分离提取出的过敏原与病人血清进行IgE反应。赖仞研究组将蛋白组学技术和二维免疫印迹法结合，从粉尘螨提取物中鉴定出分属于12个组群的17种过敏原，由Edman降解、质谱分析和cDNA克隆等技术鉴定出其一级结构。通过酶联免疫吸附试验抑制测试、免疫印迹、粒细胞活化试验、皮肤点刺试验测定，该研究组发现了8种新的尘螨过敏原。中国医学科学院基础医学研究所 邵晨博士 报告题目《Opportunities and Challenges for Urinary Biomarker Discovery Using Proteomic Approaches》　　邵晨博士对业内目前围绕尿蛋白质组生物标志物的发现研究进展进行了综述。据介绍，现在很多科研和医疗开始倾向于做尿液，因其具有易得性和稳定性，且含有丰富蛋白信息。邵晨博士研究组曾通过二维液相与串联质谱鉴定做了一些尿中蛋白质组的研究，尿液蛋白质组可以包括其他体液70%的蛋白质。研究组也通过3DLC-MS/MS鉴定出尿液中的6400多种蛋白，并发现与尿蛋白重合率最高的是脑组织中的高表达蛋白。尿蛋白能够反映很多远端的变化，如帕金森症和脑肿瘤等脑部疾病。在肾脏病中，肾小球损伤病人的肾小球会失去过滤功能而造成尿蛋白显著上升。目前很多研究发现尿蛋白中的生物标记物与一些疾病相关，主要集中在泌尿系统疾病的发现，如膀胱癌和急性肾损伤的标志物已获FDA批准，也有在消化系统疾病、肿瘤等疾病中的相关发现。其中，肺癌的研究比较成熟且已进入临床阶段。

几种不同折叠模式的蛋白质模型(图片来源Protein Data Bank Japan ) 　　上个世纪初，科学家们认为蛋白质是生命体的遗传物质，而具有独特的作用。随着这个理论被证伪，真正的遗传物质DNA的结构被给予了很大关注。然而，蛋白质作为生命体的重要大分子，其重要性也从未被忽视，而且在1950年代开始，科学家一直在探寻DNA序列和蛋白质序列的相关性。与此同时，蛋白质测序和结构解析蛋白质结构的努力开始慢慢获得回报。更多的生化研究揭示了蛋白质的功能重要性，因此蛋白质的三维结构的解析对于深入理解蛋白质功能和生理现象起着决定性作用。 　　本文简要回顾了蛋白质结构解析的重大历史事件，并总结了蛋白质结构解析的常用方法和结构分析方向。通过了解蛋白质结构，能够让我们更好地理解生物体的蛋白的理化特性，以及其相关联的化学反应途径及其机制，对于我们认识生物世界和研发治疗方法和药物都起着关键作用。在即将召开的2015高分辨率成像与生物医学应用研讨会上，各位专家学者将会进一步讨论相关议题。 　　蛋白质结构解析六十年来大事件 　　在1958年，英国科学家John Kendrew和Max Perutz首先发表了用X射线衍射得到的高分辨率的肌红蛋白Myoglobin的三维结构，然后是更加复杂的血红蛋白Hemoglobin。因此，这两个科学家分享了1962年的诺贝尔化学奖。事实上，这项工作在早在1937年就开始了。 　　然后在1960年代，蛋白质结构解析方法不断进步，获得了更高的解析精度。这个时期，蛋白质序列和DNA序列间关系也被发现，中心法则被Francis Crick提出，然后科学界见证了分子生物学的崛起。分子生物学(Molecular Biology)的名称在1962年开始被广泛接受和使用，并逐渐演变出一些支派，如结构生物学。然后在1964年，Aaron Klug提出了一种基于X射线衍射原理发展而来的全新的方法电子晶体学显微镜(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白质或者蛋白质核酸复合体结构。因为这项研究，他获得了1982诺贝尔化学奖。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射来确定大分子中固定位置的氢原子坐标。 　　进入1970年代，很多新的方法开始发展。存储蛋白质三维结构的Protein Data Bank(1971年) 开始出现，这对于规范化和积累蛋白质数据有着重要意义。1975年新的一种仪器叫做多丝区域检测器，让X-ray的检测和数据收集更加快速高效。次年，Robert Langride将X-ray衍射数据可视化，并在加州大学圣地亚哥分校成立了一个计算机图形实验室。同年，KeithHodgson和同事首次证明了可以使用同步加速器获得的X射线并对单个晶体进行照射，并取得了很好的实验效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白质结构的解析 同年首个高精度病毒(西红柿丛矮病毒)衣壳蛋白结构被解析。 　　在1980年代，更多蛋白质结构被解析，蛋白质三维结构的描述越来越成熟，而且蛋白质结构解析也被公认成为药物研发的关键步骤。在1983年，冷冻蚀刻的烟草花叶病毒结构在电子显微镜结构下得到描述。两年后德国科学家John Deisenhofer等解析出了细菌光合反应中心，因此他们共享了1988年的诺贝尔化学奖。次年，两个课题组解析了HIV与复制相关的蛋白酶结构，对针对HIV的药物研发提供了理论基础。 　　下一个十年，因为大量同步加速器辅助的X射线衍射的使用，数千个蛋白质结构得到解析，迎来了蛋白质结构组的曙光。1990年多波长反常散射方法(MAD)方法用于X射线衍射晶体成像，与同步辐射加速器一起，成为了近二十多年来的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年发表了第一个高精度的钾离子通道蛋白结构，对加深神经科学的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的诺贝尔化学奖。Ada Yonath等领导的课题组在1999年首次解析了核糖体结构(一种巨大的RNA蛋白质复合体)。　　进入新千年，更多的技术细节被加入到蛋白质解析研究领域。2001年，Roger Kornberg和同事们描述了第一个高精度的RNA聚合酶三维结构，正因此五年后他们共享了诺贝尔化学奖。2007年，首个G蛋白偶联受体结构的解析更是对药物研究带了新的希望。近些年来，越来越多的大的蛋白质结构得到解析。Cryo-EM超低温电子显微镜成像用于超大蛋白质结构成像的研究日益成熟，并开始广泛用于蛋白质结构的解析。 　　蛋白质结构解析的常用实验方法 　　1.X-ray衍射晶体学成像 　　X射线衍射晶体学是最早用于结构解析的实验方法之一。X射线是一种高能短波长的电磁波(本质上属于光子束)，被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此析获得粒子的位置信息。利用这种特点，布拉格父子研制出了X射线分光计并测定了一些盐晶体的结构和金刚石结构。首个DNA结构的解析便是利用X射线衍射晶体学获得的。 　　后来，获得X射线来源的技术得到了改进，如今更多地使用同步辐射的X射线源。来自同步辐射的X射线源可以调节射线的波长和很高的亮度，结合多波长反常散射技术，可以获得更高精度的晶体结构数据，也成为了当今主流的X射线晶体成像学方法。由X射线衍射晶体学解析的结构在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。 　　X射线衍射成像虽然得到了长足的发展，仍然有着一定的缺点。X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且，X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。 　　上海同步辐射加速器外景(图片来源 上海同步辐射光源网站) 　　2.NMR核磁共振成像 　　核磁共振成像NMR全称Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年诺贝尔奖)描述，在上世纪的后半叶得到了长足发展。其基本理论是，带有孤对电子的原子核(自选量子数为1)在外界磁场影响下，会导致原子核的能级发生塞曼分裂，吸收并释放电磁辐射，即产生共振频谱。这种共振电磁辐射的频率与所处磁场强度成一定比例。利用这种特性，通过分析特定原子释放的电磁辐射结合外加磁场分别，可以用于生物大分子的成像或者其他领域的成像。有些时候，NMR也可以结合其他的实验方法，比如液相色谱或者质谱等。 　　RCSB Protein Data Bank数据库中存在大约11000个用NMR解析的生物大分子结构，占到总数大约10%的结构。NMR结构解析多是在溶液状态下的蛋白质结构，一般认为比起晶体结构能够描述生物大分子在细胞内真实结构。而且，NMR结构解析能够获得氢原子的结构位置。然而，NMR也并非万能，有时候也会因为蛋白质在溶液中结构不稳定能难得获取稳定的信号，因此，往往借助计算机建模或者其他方法完善结构解析流程。 　　使用NMR解析的血红蛋白结构建模(图片来源RCSB PDB) 　　3.Cryo-EM超低温电子显微镜成像 　　电子显微镜最早出现在1931年，从设计之初就是为了试图获得高分辨率的病毒图像。通过电子束打击样本获得电子的反射而获取样本的图像。而图像的分辨率与电子束的速度和入射角度相关。通过加速的电子束照射特殊处理过的样品表明，电子束反射，并被探测器接收，并成像从而获得图像信息。具体做法是，将样品迅速至于超低温(液氮环境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于样品池，在电子显微镜下成像。图像获得后，通过分析图像中数量众多的同一种蛋白质在不同角度的形状，进行多次的计算机建模从而可以获得近原子级别的精度(最低可以到2.0埃)。 　　Cyro-EM解析TRPV1离子通道蛋白(图片来源Structure of the TRPV1 ion channel ) 　　将电子显微镜和计算机建模成像结合在一起的大量实践还是在新世纪之后开始流行的。随着捕捉电子的探测器技术(CCD技术，以及后来的高精度电子捕捉、电子计数electron counting设备)的提升，更多的信息和更低的噪音保证了高分辨率的图像。 　　近些年来，Cryo-EM被用来解析很多结构非常大(无法用X-ray解析)的蛋白质(或者蛋白质复合体)，取得了非常好的结果。同时，单电子捕捉技术取代之前的光电转换成像的CCD摄像设备，减少了图像中的噪音和信号衰减，同时并增强了信号。计算机成像技术的成熟和进步，也赋予了Cryo-EM更多的进步空间。然而，Cyro-EM与X-ray不同，该方法不需要蛋白质成为晶体，相同的是都需要低温环境来减少粒子束对样品的损害。 　　除去介绍的这三种方法以外，计算机建模技术也越来越多地被用在了蛋白质结构解析中。而且新解析的结构也会提高计算机建模的精确度。未来，我们或许能够用计算机构建原子级别的细胞模型，构建在芯片上的细胞。 　　蛋白质结构对了解生命体的生化反应、有针对性的药物研发有着重要意义。从1958到如今已经接近60年，蛋白质结构解析得到了较快的发展。然而，在如今DNA测序如此高效廉价的时代，蛋白质和DNA结构解析并没有进入真正高速发展阶段，这也导致了在如此多的DNA序列数据非常的今天，结构数据却相对少的可怜。大数据时代的基因组、蛋白质组、代谢组、脂类组等飞速发展的时候，蛋白质结构组也得到了更加广泛的重视。发展高精度、高效的结构解析技术也一直都有着重要意义。未来，蛋白质结构解析，对针对蛋白质的药物筛选，和计算机辅助的药物研究研究不应被低估。未来说不定在蛋白质结构领域有着更多惊喜，让我们拭目以待。 第一届电镜网络会议部分视频回放