蛋白质复合物

美国科学家主导的国际科研团队在最新一期《科学》杂志撰文指出，他们利用人工智能和进化分析，绘制出了真核生物的蛋白质之间相互作用的3D模型，首次确定了100多个可能的蛋白质复合物，并为700多个蛋白质复合物提供了结构模型，深入研究蛋白质相互作用有望催生新的药物。　　研究负责人之一、美国西南大学人类发育与发展中心助理教授丛前（音译）称，研究结果代表了结构生物学新时代的重大进步。　　丛前解释说，蛋白质通常成对或成组工作，形成复合物，以完成生物体存活所需的任务。虽然科学家已经对其中一些相互作用开展了深入研究，但许多仍是未解之谜。了解蛋白质之间所有的相互作用将揭示生物学的许多基本方面，并为新药研发提供参考。　　但半个世纪以来，鉴于许多蛋白质结构的不确定性，科学家们很难了解这些相互作用。2020年和2021年，深度思维公司和华盛顿大学戴维贝克实验室独立发布了两种人工智能技术“阿尔法折叠”和RoseTTAFold，它们使用不同的策略预测蛋白质结构。　　在最新研究中，丛前等人通过对许多酵母蛋白复合物建模，扩展了人工智能结构预测工具箱。为了找到可能相互作用的蛋白质，科学家们首先搜索相关真菌的基因组，寻找发生突变的基因，然后使用上述两种人工智能技术来确定这些蛋白质是否可以3D结构结合在一起。　　他们确定了1505种可能的蛋白质复合物，其中699个结构已被表征，验证了其方法的实用性；另外700个复合物目前获得的数据有限，剩下106个从未被研究过。为更好地理解这些很少被描述或未知的复合物，团队研究了类似的蛋白质，并根据新发现的蛋白质与此前已知蛋白质的相互作用，确定了新发现蛋白质的作用。

作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合物等形式行使其特定的生物学功能。近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华、研究员赵群等研制了一种基于糖苷键的质谱可碎裂型交联剂，显著地提高了交联信息的检索通量和鉴定准确度，同时具有良好的两亲性和生物兼容性，实现了活细胞内蛋白质复合物原位交联和规模化精准解析。相关成果发表在《德国应用化学》上。大连化物所供图　　细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合物结构和功能至关重要。而化学交联技术，尤其是原位化学交联质谱技术具有规模化分析蛋白复合物原位构象和相互作用界面的优势，已成为活细胞内蛋白质复合物解析的重要技术。但是，目前活细胞原位交联面临着细胞扰动大、交联肽段谱图复杂程度高等问题。因此，如何实现活细胞低扰动下的原位快速交联是蛋白质原位构象和相互作用精准解析的先决条件。　　本工作中，团队基于糖分子的高生物兼容性和糖苷键的质谱可碎裂特征，将糖苷键引入到功能交联剂的骨架设计中，筛选并获得了高生物兼容性的海藻糖作为骨架分子，研制了质谱可碎裂型交联剂——海藻糖二琥珀酰亚胺酯。该交联剂较目前已报道的可透膜型化学交联剂，展示了更加优异的细胞活性维持能力，可在低扰动状态下实现细胞内蛋白质复合物的高效交联。　　在此基础上，低能量的糖苷键—高能量的肽键的质谱选择性碎裂模式，可以将“工字形”的交联肽段数据分析降幂为常规交联剂片段修饰的线性肽段数据检索，极大地降低了交联肽段谱图分析的复杂性，显著地提高了交联肽段的鉴定效率与准确度。

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA,Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

蛋白质复合物是高度动态的实体，在组装、翻译后修饰和非共价相互作用方面表现出巨大的多样性，使它们能够在各种生物过程中发挥关键作用。天然状态下蛋白质复合物的异质性、动态性和低丰度给使用传统结构生物学技术进行研究带来了挑战。基于此，美国威斯康星大学麦迪逊分校葛瑛教授团队近期开发了一种天然纳米蛋白质组学策略，用于直接从人体心脏组织中富集内源性心肌钙蛋白 (cTn) 复合物并随后进行天然自上而下质谱分析。在非变性条件下，使用肽功能化的超顺磁性纳米粒子对 cTn 复合物进行富集和纯化，以实现 cTn 复合物的同位素解析，揭示其复杂的结构和组装。此外，nTDMS 阐明了 cTn 复合物的化学计量和组成，定位 Ca2+ 结合域，定义 cTn-Ca2+ 结合动力学，并提供蛋白质形态的高分辨率图谱。这种天然纳米蛋白质组学策略为内源天然蛋白质复合物的结构表征开辟了范例。（论文链接：）这一研究为深入了解心脏组织中内源性蛋白质复合物的神秘世界提供了一种前所未有的工具和方法。这不仅有助于揭示心脏疾病的分子机制，还为未来开发相关治疗方法提供了重要的基础。这项创新的纳米蛋白质组学技术将为生物医学研究开辟新的可能性，为科学家们提供了更深层次的洞察力，以探索蛋白质相互作用的微妙之处。

大家好，本周为大家分享一篇李惠琳课题组最近发表在Mass Spectrometry Reviews上的综述，Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes1。结构生物学的快速发展极大地促进了蛋白结构表征工具的开发。其中，基于质谱的分析方法凭借其快速、灵敏、高通量的优势从中脱颖而出。相比于原子水平的高分辨结构表征工具如X-射线晶体学、核磁共振（NMR）、冷冻电镜（Cryo-EM）等，基于质谱的分析方法能够有效地补充蛋白动力学结构变化的信息，并且不受蛋白纯度、分子量大小的限制。而相较于低分辨的蛋白表征工具如圆二色光谱、动态光散射等，基于质谱的分析方法能够提供更高的肽段或残基水平分辨率，获取额外的序列、翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）、局部空间结构等信息。常见的结构质谱包括：氢氘交换质谱（hydrogen‐deuterium exchange MS, HDX-MS）、交联质谱（cross‐linking MS, CX-MS）、表面标记质谱（covalent labeling MS, CL-MS）等。已有相当多的文献对这些方法进行了详细的介绍2,3，在此不再赘述。而此篇综述将重点介绍非变性至上而下质谱（native top‐down MS, nTDMS）在蛋白及其复合物结构表征中的应用。在过去的十年，非变性质谱（native MS, nMS）特别是nTDMS发展迅速。nMS作为一个桥梁将蛋白质组学与结构生物学相连，其保留非共价相互作用的特性使其广泛用于蛋白复合物四级结构表征，如推断亚基组成、化学计量比、亚基排布等。然而，对于一些深层次的结构信息，如氨基酸序列、PTMs、配体结合位点、亚基结合界面等，仅靠单一的nMS是无法获取的。与之对应的，变性条件下的自上而下质谱（TDMS）能够在完整蛋白水平下直接获得序列以及PTMs信息，虽然有助于PTM的准确定位以及蛋白、蛋白异质体（Proteoform）的鉴别，但却丢失了涉及非共价相互作用的高级结构信息。受限于质谱仪器的发展，在早期，nMS与TDMS通常在两个独立的实验中进行，随着质量分析器以及多种活化/碎裂方式的开发，nMS与TDMS的能够有效的结合，充分发挥各自的优势，在实现多层次结构信息获取的同时，也在不断挑战更加复杂的生物体系，如核糖体、膜蛋白、内源蛋白混合物等。实验设计nTDMS已成为表征蛋白质和复合物的初级到高级结构的重要工具。随着蛋白质样品的大小和复杂性的增加，用于nTDMS的仪器不仅需要符合某些特定标准，还需要不断提高其性能以满足这些增加的需求。nTDMS分析中几个关键的步骤包括：样品前处理、ESI离子化、二级碎裂、质量检测以及数据处理。样品前处理为了维持蛋白的自然状态，通常需要在生理环境中进行nMS分析。然而，缓冲液中的非挥发性盐会产生大量盐簇并与蛋白离子形成非特异性加合物，从而抑制离子信号、降低检测的准确度和灵敏度。因此，样品前处理过程中最重要的环节就是除盐。然而适当的离子强度有助于维持蛋白的三维结构，所以通常的步骤是对蛋白进行缓冲液置换，将蛋白置换至醋酸铵或碳酸氢铵等挥发性盐溶液中。目前已开发了多种在线或离线的除盐方法，详细内容的可在综述原文中查看，此处不再赘述。除了使用非挥发性缓冲盐，减小ESI喷针孔径大小也可以提高系统耐盐能力。碎裂/活化方式二级碎裂方式是实现nMS到nTDMS的关键。常见的活化方式按照原理可分为三类：基于碰撞（CID, SID）、基于电子（ECD, ETD, EID等）以及基于光子（UVPD, IRMPD）的活化/碎裂方式。值得注意的是，CID与IRMPD都属于慢加热的活化方式，能量累积的非常慢，以至于在发生碎裂之前已经进行了能量重排，一些较弱的或者不稳定的键会优先发生断裂，最终导致非共价相互作用在活化的过程中被破坏。而SID、ExD与UVPD则属于快加热的活化方式，碎裂发生在能量重排之前，非共价相互作用得以在这一过程保留下来，碎片化程度受到非共价相互作用的限制，因此可被用于表征蛋白的空间结构。此外，将多种活化方式的结合或与离子淌度技术串联也是获取多层次结构信息的关键。质量检测与变性条件下的质谱分析相比，蛋白复合物在天然环境下通过电喷雾电离产生的电荷数相对较少，因此需要具有较大m/z 范围的质量分析仪（高达m/z = 20,000 Da甚至更高）。最初，nMS分析高度依赖基于飞行时间（time of fight, TOF）质量分析器，因为TOF具有理论上无限的m/z范围。近年来，高分辨质量分析器如轨道阱（Orbitrap）和傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）为生物大分子的nTDMS分析带来了新的活力。在综述中，我们简要介绍了每种质量分析器的最新进展，并重点强调了FTICR和Orbitrap在nTDMS分析中的发展和应用。数据处理除了基本的硬件设施，配套的数据处理软件也十分重要。nTDMS数据处理流程通常包括以下4个步骤：同位素峰选取、去卷积、数据库搜索、验证和可视化。正文中，我们对每个步骤进行了简要描述，并重点介绍用于数据库搜索和异质体鉴别的软件。多层次结构信息的获取得益于多种活化/碎裂方式的开发，nTDMS分析可同时获得多层次的结构信息（图1）。主要有以下两种策略：第一种策略，完整蛋白复物（MS1）首先被CID或SID碎裂至亚基（MS2），亚基可进一步碎裂肽段（MS3），在MS1及MS2中可获蛋白复合物结合计量比、拓扑结构、蛋白异质性等信息，在MS3阶段则可获取蛋白序列、PTMs定位以及异质性来源等信息。第二种策略则是完整蛋白复合物（MS1）直接被UVPD或ExD碎裂成肽段（MS2），受益于UVPD以及ExD独特的碎裂方式，发生碎裂的区域主要位于蛋白复合物的表面可及区，而未发生碎裂的区域可能位于蛋白复合物的核心区域或参与亚基相互作用界面。不同的碎裂情况反映不同的空间结构，带有配体的肽段碎片可以用于配体结合位点的定位。综述中，我们详细阐述了如何利用nTDMS获得蛋白复合物的多层次结构信息以及如何将碎片信息与结构信息相关联。图1. nTDMS可提供的多维度结构信息复杂生物体系中的应用蛋白质的空间结构决定了其生物功能，而蛋白质-蛋白质/配体相互作用是大多数生物进程的基础。通过突变、翻译后修饰、或者与金属、小分子配体、蛋白质、DNA、RNA等分子发生共价或非共价的相互作用，蛋白质功能在活细胞中不断受到调节。随着MS仪器、方法的不断开发和数据处理软件的逐渐成熟，nTDMS已被广泛应用于各种生物系统，从小蛋白质、蛋白质-配体复合物到大分子组装体，如膜蛋白、蛋白酶体、核糖体、病毒衣壳，甚至是内源性蛋白混合物。它们中的许多都是极具挑战性的体系，即便是采用NMR、X-射线晶体学或Cryo-EM等生物物理方法分析也是非常困难的。因此，来自nTDMS的见解对于理解这些蛋白质和复合物至关重要。在这里，我们总结nTDMS在所有生物体系中的应用实例，旨在全面了解nTDMS在解决生物学问题方面的潜力。小蛋白的结构表征和区分最初，nTDMS主要用于50 kDa以下单体蛋白的结构表征，大部分的研究都是围绕蛋白质气相结构与溶液相结构对比展开的。根据nTDMS的碎裂情况，推断蛋白的气相空间结构，并与NRM获得的溶液结构进行对比。此外，如果在二级碎裂前增加离子预活化有助于蛋白分子的展开，以便研究蛋白气相展开路径以及获取蛋白质内部空间结构信息。得益于碎片离子对蛋白空间结构的高度敏感性，nTDMS还被用于区分不同蛋白亚型、蛋白突变体的结构差异。蛋白-小分子配体相互作用随后，nTDMS应用到了蛋白-配体复合物中，不同的配体类型适合不同的活化/碎裂方式，除了金属离子、RNA/DNA等以静电作用为主的蛋白配体能够在CID活化时存活，大部分复合物的碎裂都需要选择ECD或UVPD等方式。nTDMS可用于蛋白-配体结合计量比、亲和力、结合位点、作用机制、结构动力学/变构效应的研究。它是一种强大的结构表征工具，其在抑制剂筛选、酶催化监控、RNA-蛋白质互作机制的应用实例在正文中已有详细的介绍。蛋白-蛋白相互作用随着仪器设备的快速发展，nTDMS已应用到更大的体系如蛋白-蛋白复合物，通过组合不同的活化/碎片化技术，在一次实验中可以获得多层次的结构信息。nTDMS可以帮助区分不同的蛋白异质体，并在完整复合物、亚基、肽段三个水平上确定异质性的来源。蛋白的异质性与其生物学功能密切相关，通过调整蛋白的异质性可以实现蛋白功能的转变，具体的应用案例已在正文详细介绍。除此之外，nTDMS还可以用作蛋白-蛋白复合物结合界面、气相展开以及深层次结构探索。治疗性抗体和抗原-抗体复合物在过去的几十年中，治疗性抗体已成为最受欢迎的候选药物之一，它们的高特异性和低副作用促进了治疗性抗体的快速增长。在综述中，我们还详细地介绍了nTDMS在治疗性抗体和抗原-抗体复合物体系中的应用。nTDMS可用于抗体可变区的测序、具有不同药物计量比（DARs）的抗体耦联药物的结构表征、以及抗体-抗原复合物中互补决定区及抗原表位区的鉴别。膜蛋白无论是对于传统的结构表征工具如：X-射线晶体学、NMR还是nTDMS，膜蛋白的结构表征一直以来面临着诸多困难。膜蛋白具有低丰度以及低溶解性等特点，最常见的方法是利用与nMS兼容的膜模拟物如：去污剂胶束、纳米微盘等去溶解膜蛋白，在nTDMS分析时再将膜蛋白从胶束中释放出来，释放出的蛋白可在nTDMS中进一步碎裂获取结构信息。具体的实验流程和应用实例可在综述正文中查看。大分子组装体正文中，还介绍nTDMS在极具挑战性的大分子组装体如：核糖体、蛋白酶体、病毒衣壳中的应用实例，这些生物体系普遍存在的问题是分子量非常大（接近MDa），且具有较高的异质性。对这些大分子机器进行nTDMS分析要求仪器具有较高的质量范围以及分辨率。大分子机器的结构表征充分说明nTDMS方法无论在深度还是广度上都有极大的提升。Native top-down MS蛋白质组学值得注意的是，当质谱前端结合非变性分离技术，如native GELFrEE，尺寸排阻色谱，毛细管区带电泳，离子交换色谱等，nTDMS还可以在靶向模式或发现模式下用于复杂蛋白质组的高通量分析，如内源性蛋白混合物。nTDMS分析最大的优势在于它能区分不同的蛋白异质体，并对每种蛋白异质体进行结构表征，这是其他在肽段水平进行分析的结构质谱法如：HDX-MS, CL-MS所无法实现的。总结与展望总之，在这篇综述中我们重点介绍了nTDMS的最新进展和在不同生物体系中的应用，强调通过nMS与TDMS结合可以获得额外的多层次结构信息。新技术的出现以及仪器的进步使nTDMS能够应用于结构生物学中日益复杂的生物样本体系，包括蛋白质配体、多聚蛋白复合物、大分子组装体和内源性复合物。尽管这样，nTDMS分析仍面临着的挑战，包括但不限于前端的样品分离、离子化、去溶剂化、高质荷比分子传输、异质性样本的分析以及软件的开发。未来nTDMS将与其他的一些结构表征方法相结合以获取更加全面的结构信息。正文中对未来发展趋势进行了讨论并提到了其他一些令人兴奋的创新技术如：基于MALDI离子源的质谱成像技术用于蛋白原位分析、电荷检测质谱（CDMS）用于异质性样本分析，多重技术的结合将为蛋白质复合物的nTDMS研究开辟新的道路。我们希望这篇综述能让读者更好地理解nTDMS提供的独特结构信息，并推动该方法的广泛应用。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. 参考文献1.Liu RJ, Xia SJ, Li HL. Native top‐down mass spectrometry for higher‐order structural characterization of proteins and complexes. Mass Spec Rev. 2022 e21793. https://doi.org/10.1002/mas.217932.Britt HM, Cragnolini T, Thalassinos K. Integration of mass spectrometry data for structural biology. Chem Rev. 2022 122(8):7952-7986. 3.Liu XR, Zhang MM, Gross ML. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: fundamentals and applications. Chem Rev. 2020 120(10):4355-4454.

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4,G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

血红蛋白(Hb)是红细胞中的一种关键蛋白质，负责氧气的运输。它由α和β亚基组成，形成四聚体结构，通过氧合(relaxed)和脱氧(tense)状态之间的变构转变来实现氧气的运输。Hb作为一个重要的模型蛋白，广泛应用于蛋白质基础特性的研究以及包括质谱技术在内的分析化学方法的开发。研究中使用的Hb样品通常从化学公司购买(商业Hb)或从哺乳动物血液中新鲜提取(血液Hb)，尽管理论上商业Hb和血液Hb都应该反映血红蛋白的天然活性和三维构象，但先前的电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分析显示，这两种Hb来源的性质存在差异，这可能与商业Hb在制备过程中的变性有关。迄今为止，商业Hb和血液Hb之间的结构差异仅使用Native ESI-MS进行过研究。考虑到Native MS不同纯化方法(缓冲液置换、脱盐)对样品的影响，本文尝试使用氢/氘交换质谱(HDX-MS)对血液Hb和商业Hb中的血红蛋白复合物进行比较研究。与Native ESI-MS相比，HDX-MS对不挥发性盐的耐受性要高得多，这主要是由于肽段的脱溶剂效率高于完整蛋白质。在本研究中，作者直接对商业Hb和血液Hb进行了HDX-MS分析，得到的HDX-MS结果与Native ESI-MS数据非常吻合，证实商业Hb已广泛变性形成二聚体物质。对于Native ESI-MS，作者认为缓冲液置换方法对于检测结果具有一定的影响。图1和图2分别展示了血液Hb和商业Hb样品在经过不同次数的缓冲液置换后得到的Native ESI-MS谱图。由图1可见，血液Hb在经过1-5次缓冲液置换后，其质谱图谱从主峰为单体型信号逐渐转变为由二聚体和四聚体信号峰主导，表明缓冲液置换次数对样品结构的完整性有显著影响。图2表明商业Hb在0-4次缓冲液置换后，其质谱图谱从主峰为单体型信号逐渐转变为由二聚体信号主导，最终在四次置换后显示出二聚体为基峰，表明商业Hb在多次置换后更倾向于形成二聚体结构。图1.缓冲液置换(A)1、(B) 2、(C) 4和(D)5次后获得的血液Hb的ESI质谱图。红色符号αh, βa、D、Q分别代表单体全α亚基、单体apo-β亚基、二聚体αhβh和四聚体(αhβh)2离子。标有星号(*)的信号对应电流噪声。图2.缓冲液置换(A)0、(B) 1、(C) 2和(D)4次后获得的商业Hb的ESI质谱图。红色符号αh, βaox、D、D-h，(D-h)ox，Q代表单体全α亚基、氧化单体apo-β亚基、二聚体αhβh、二聚体αhβa、 氧化二聚体αhβaox和四聚体(αhβh)2离子。B和D的插图分别对应β的扩展峰βaox和(D-h)ox。单氧化、二氧化和三氧化物质表示为βaox/(D-h)ox+O, βaox/(D-h)ox+2O 和βaox/(D-h)ox+3O。标有星号(*)的信号对应电流噪声。由于Native ESI-MS分析的可靠性在很大程度上依赖于样品处理方法，因此有必要开发一种互补方法来分析高阶蛋白质复合物的完整性。作者采用HDX-MS来查看是否可以获得血液Hb和商业Hb样品的一致结构信息。图3展示了血液Hb和商业Hb的HDX-MS速率曲线。这些曲线显示了不同时间点上肽段的氘化水平，揭示了两种样品在结构上的显著差异。血液Hb的肽段氘化水平普遍低于商业Hb，特别是在α亚基的33-46及130-141段和β亚基的33-41及130-146段，这表明新鲜血红蛋白在这些区域的溶剂可及性较低，结构更稳定。相反，商业Hb在这些区域显示出更高的氘化水平，暗示其结构可能已经发生了部分解离，增加了溶剂可及性。 图3.血液Hb(绿色曲线)和商业Hb(红色曲线)酶切片段的HDX速率曲线。每个数据点报告三次试验的平均值，误差线表示三次试验的标准偏差。为了将HDX结果与Hb的三维结构相关联，将t = 180 min时两个Hb样品之间的氘代水平差异映射到天然氧合血红蛋白晶体结构(PDB：1LFQ)中，如图4所示。在 t = 180 min时，商业 Hb 的氘水平分别α 130-141和β 130-146比血液Hb高18.9%和26.6%。更高的氘吸收量意味着在这两个区域中商业Hb的溶剂可及性更高。α 130-141和β 130-146分别属于α 1α 2(图4A)和β1β2(图4B)界面。这两个链段中溶剂可及性的增加可能是因为天然四聚体(αhβh)2解离成二聚体αhβh亚复合物，这将导致α1α2和β1β2界面相互作用的破坏。这一推论与Native ESI-MS分析结果一致，即商业Hb的质谱基峰是二聚体信号(图2D)，而血液Hb的质谱基峰是四聚体信号(图1D)，进一步验证了商业Hb样品在制备和存储过程中可能经历了结构变化。图4.人氧合血红蛋白(PDB：1LFQ)的晶体结构，包括亚基(A)α1和α2，(B)β1和β2，(C)α1和β2，以及(D)α1和β1。根据t = 180 min时商业Hb和血液Hb之间氘代的百分比差异对结构进行着色。总的来说，本文通过Native ESI-MS和HDX-MS来表征商业Hb和血液Hb之间的差异。发现血液Hb主要保持四聚体结构，而商业Hb则主要表现为二聚体，且在商业Hb中观察到更多的氧化形式。这些发现强调了在进行生物医学研究前验证蛋白质高阶结构完整性的重要性，并展示了两种质谱技术在分析蛋白质结构变化中的互补性。

p strong 仪器信息网讯 /strong 　 第六届全国冷冻电子显微学与结构生物学专题研讨会在北京隆重召开，研讨会由中国生物物理学会冷冻电子显微学分会(以下简称：中国冷冻电镜分会)主办，北京大学承办，中国电子显微镜学会低温电镜专业委员会协办。18日上午，生物大分子复合物的高分辨率动态结构专题报告会作为大会三大专题之一，在中国科学技术大学蔡刚教授和国家蛋白质科学中心(上海)丛尧研究员联合主持下，顺利召开。上午的会议围绕“膜蛋白复合物”共安排了11个专题报告，吸引了来自海内外400多名代表与会。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/9ac8f2be-f797-4b8b-925c-19f6d71f8f94.jpg" title=" 会场.jpg" alt=" 会场.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　研讨会现场 /p p 　　抗生素耐药性已成为全球健康威胁，革兰氏阴性细菌是最难对付的病原体之一，主要是由于它们独特的“外膜”阻止了大多数抗生素进入细胞。脂多糖(LPS)是外膜的主要成分，在限制抗生素的进入中起着至关重要的作用。美国哈佛医学院廖茂富教授的《High-resolution views of lipopolysaccharide transport driven by bacterial ABC transporters》报告使用高分辨率单粒子Cryo-EM来揭示这些分子机器的机制。理解和靶向LPS生物合成对于开发新型抗生素以穿透外膜并杀死革兰氏阴性细菌至关重要。在组装到外膜之前，LPS必须穿过内膜、周质和外部构件，这个非凡的旅程由两个必需的ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白来提供动力：MsbA和LptB2FGC。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/3d990b6a-e671-45cc-b619-27fa72ad4d41.jpg" title=" 廖茂富.jpg" alt=" 廖茂富.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　廖茂富作《High-resolution views of lipopolysaccharide transport driven by bacterial ABC transporters》报告 /p p 　　在植物中，高渗性刺激能触发渗透通道的开放，导致细胞溶质钙浓度升高而引发快速的下游信号级联。拟南芥中OSCA家族的成员，被认为在高渗应激反应的初始阶段发挥关键作用。 在这里，中国科学技术大学孙林峰教授《Structure of the hyperosmolality-gated calcium permeable channel OSCA1.2》报告通过单粒子冷冻电子显微镜确定了拟南芥OSCA1.2的原子结构。 拟南芥OSCA1.2是含有11个跨膜螺旋并形成的同型二聚体，处于灭活状态下，被清楚地识别出孔隙里残留物 其胞质结构域包含RNA识别基序和两个独特的长螺旋，这两个螺旋之间的连接体在脂质双层中形成锚，并且可能是渗透传递所必需的。 研究显示，AtOSCA1.2的结构可作为研究渗透胁迫响应和机械传感潜在机制的平台。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/bbaafb19-ff20-4ad7-b76f-295737c6953c.jpg" title=" 孙林峰.jpg" alt=" 孙林峰.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　孙林峰作《Structure of the hyperosmolality-gated calcium permeable channel OSCA1.2》报告 /p p 　　北京大学李龙副教授作《Structure of a substrate engaged SecASecY protein translocation machine》报告。通过蛋白质传导通道SecY / Sec61的蛋白质易位是原核生物和真核生物的常见细胞过程。在原核生物中，SecY通道与ATP酶SecA合作，在蛋白质翻译后将分泌蛋白质移过膜。目前尚不清楚SecA-SecY复合物如何转移其高度多样化的蛋白质底物。李龙组装了由SecA，SecY和多肽底物组成的蛋白质易位中间体，并确定了其在脂质环境中的Cryo-EM结构。研究结果显示，多肽底物被捕获在复合物的中心 SecA的夹子紧紧地保持多肽，SecA的双螺旋指状物将多肽引导至SecY的中央通道。李龙认为，该结构定义了ATP水解驱动蛋白质易位的关键步骤。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/8ece8079-a629-4258-b296-571ef9db56a3.jpg" title=" 李龙.jpg" alt=" 李龙.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p 　　李龙作《Structure of a substrate engaged SecASecY protein translocation machine》报告 /p p 　　β-氧化是分解脂肪酸分子以产生能量的基本代谢途径。TFP在此过程中催化三种反应，并且TFP亚基中的突变会引起诸如TFP缺乏和妊娠急性脂肪肝的疾病。尽管TFP催化反应几乎在所有主要的生物化学教科书中都有详细记载，但人类TFP的结构尚不清楚。北京大学肖俊宇研究员作《Cryo-EM structure of human mitochondrial trifunctional protein》报告，研究中使用cryo-EM单粒子重建方法，确定了人类TFP的4.2Å 2四聚体结构。研究结果为TFP功能研究提供了结构基础，并对脂肪酸氧化相关疾病具有重要意义。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/aa32d868-23c6-449b-94c0-9ee6f4482019.jpg" title=" 肖俊宇.jpg" alt=" 肖俊宇.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　肖俊宇作《Cryo-EM structure of human mitochondrial trifunctional protein》报告 /p p 　　围绕会议主题，主办方还组织了其他7个专题报告，中国科学技术大学陈宇星教授作《Cryo-EM structure and transport mechanism of a wall teichoic acid ABC transporter》报告 浙江大学张岩教授作《Conformational dynamics and heterogeneity of GPCR signaling complexes》报告 美国哈佛医学院李宗利教授作《Cryo-EM structures of TRPC4/TRPC5 ion channels》报告 香港科技大学党尚宇作《Investigation of TMEM16 family proteins using single particle Cryo-EM》报告 美国国立卫生研究院吴雄武教授作《Cryo-EM and molecular simulation study of glutamate receptor activation mechanism》报告 西湖大学周强研究员作《Structure of the human LAT1-4F2hc heteromeric amino acid transporter complex》报告 南方科技大学龚欣副教授作《Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm》报告。 /p p br/ /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Struct.上的文章，Towards a structurally resolved human protein interaction network，该文章的通讯作者是瑞典斯德哥尔摩大学的Petras Kundrotas、Arne Elofsson和欧洲分子生物学实验室的Pedro Beltrao。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的表征对于理解形成功能单位的蛋白质组和细胞生物学研究的基础是至关重要的。同时，蛋白质复合物的结构表征是理解蛋白质的功能机制、研究突变的影响和研究细胞调控过程的关键步骤。最近，基于神经网络的方法已经被证明了准确预测单个蛋白质和蛋白质复合物的结构的能力；然而，其在大规模预测人类复杂结构中的应用尚未得到有效测试。在此，本文测试了应用AlphaFold2在预测人类蛋白质相互作用结构上的潜力和局限性，并通过实验提示了界面残基中潜在的调节机制。除此之外，本文还提供了使用预测的二元复合物来构建高阶组装的案例，以此拓展了对于人类细胞生物学的理解。人类蛋白质相互作用的结构预测本文基于AlphaFold2的FoldDock管道对65484对来源于HuRI与hu.MAP V.2.0数据库中实验测定的PPIs的结构进行预测。文章合并了一个pDockQ分数，该分数可以根据置信度对模型进行排序。结果显示，已知相互作用蛋白的pDockQ往往高于随机集；对于hu.MAP数据集显示出平均比HuRI数据集更高的可信度，这表明，高可信度模型集中在具有高亲和力和直接相互作用的蛋白质相互作用区域。实验表明，AlphaFold2可以预测大型复合物中直接相互作用的蛋白对的结构（图1）。图1 | AlphaFold2复合物预测在大规模人类PPIs数据集上的应用影响预测置信度的特征如图1a所示，相较于HuRI和hu. MAP数据库中的蛋白质对，出现在蛋白质数据库（PDB）中的蛋白质对更加富集于高分模型部分。为了更好地理解这种差异，本文首先研究了一个由大型（10链）异质蛋白复合物构建的额外数据集。通过实验，结果显示直接相互作用对与间接相互作用对之间pDockQ分数的差异是显著的，这表明与间接相互作用对相比，即使直接相互作用对是大型复合体的一部分，也往往能够被预测。除此之外，由于HuRI数据库中的许多蛋白质间相互作用很可能是短暂的，而AlphaFold2无法可靠地预测这种相互作用（图2）。图2 | 影响预测置信度的蛋白质和相互作用特征：不同数据集的分析预测的复合物结构在化学交联上的验证化学交联结合质谱分析是一种识别蛋白质对中邻近的活性残基的方法，可以用来帮助确定可能的蛋白质界面。为了确定预测的复合物结构是否满足这种正交空间约束，本文获取了528对具有预测模型的蛋白质对的残基对的交联集合。在此章节中，文章提供了多个案例证明了化学交联验证的有效性（图3）。图3 | 对于预测复合物模型的化学交联支持复合物界面上与疾病相关的错义突变与人类疾病相关的错义突变可以通过多种机制改变蛋白质的功能，包括破坏蛋白质的稳定性、变构调节酶活性和改变PPIs。为了确定预测结构的有效性，本文汇编了一组位于界面残基上的突变，这些突变之前曾被实验测试过对于相应相互作用的影响。文章使用FoldX预测突变时结合亲和力的变化，并观察到破坏相互作用的突变强烈影响了结合的稳定性；另外，本文就在一系列生物学功能中具有界面疾病突变的蛋白质网络簇进行了举例说明（图4）。图4 | 蛋白质复合物界面残基的疾病突变蛋白质复合物界面的磷酸化调节蛋白质磷酸化可以通过改变修饰残基的大小和电荷来调节结合亲和力来调节蛋白质的相互作用，将磷酸化位点定位到蛋白质界面可以为它们在控制蛋白质相互作用中的功能作用产生机制假说。本文使用了最近对人类磷酸化蛋白质组26的鉴定，在高置信度模型中鉴定出了界面残基上的4,145个独特的磷酸化位点。实验表明，某些界面可能受到特定激酶和条件的协调调控。虽然不是所有界面上的磷酸位点都可能调节结合亲和力，但这一分析为特定扰动后的相互作用的潜在协调调控提供了假设（图5）。图5 | 界面残基上磷酸化位点的协同调控来自二元蛋白质相互作用的高阶组装蛋白质既能够同时与多个伙伴相互作用组成更大的蛋白复合物，又能够在时间和空间上分离。这也反映在文章的结构特征网络中，即蛋白质可以在群体中被发现，如蛋白质相互作用全局网络视图所示（图6）。由于使用AlphaFold2预测更大的复合物组装可能受到计算需求的限制，文章测试了蛋白质对的结构是否可以迭代结构上对齐。文章在上述网络中覆盖的一组小的复合物上测试了这一过程，并将一个实验确定的结构与预测的模型进行对齐，展示了该过程的潜力和局限性。受测试例子的鼓励，本文定义了一个自动化过程，通过迭代对齐生成更大的模型。总之，文章发现可以迭代地对齐相互作用的蛋白质对的结构来构建更大的组装，但同时也发现了目前限制这一过程的问题。图6 | 对高阶组装的蛋白质复合物的预测结论本文通过一系列的实验评估了应用AlphaFold2预测已知人类PPIs的复杂结构的潜力与局限性。分析结果表明，由亲和纯化、共分馏和互补的方法组合支撑的蛋白质相互作用能够产生更高置信度的模型。文章证明，可以使用模型指标（如pDockQ评分）对高置信度模型进行排序，为大规模PPIs和稳定复合物的详细研究提供支持；而来自交联质谱实验的数据为进一步验证这些预测提供了理想的资源。除此之外，本文用疾病突变和磷酸化数据证明了蛋白质界面的结构模型对于理解分子机制以及突变和翻译后修饰的影响至关重要；最后，文章提出了从预测的二元配合物出发构建更大的组件结构模型的想法。后续仍需要更多的工作来确定确切的化学计量学，设计方法和评分系统来构建如此更大的复杂组件，以及预测具有弱和瞬态相互作用的蛋白质之间的相互作用。参考文献(1) Burke DF, Bryant P, Barrio-Hernandez I, et al. Towards a structurally resolved human protein interaction network [published online ahead of print, 2023 Jan 23]. Nat Struct Mol Biol. 2023 10.1038/s41594-022-00910-8. doi:10.1038/s41594-022-00910-8

引言准确预测蛋白质-配体(在本文的语境中，配体意指小分子有机化合物)的结合构象是计算生物学中的一项重要任务。一方面，它有助于人们理解蛋白质与内源小分子或药物分子的互作机制。另一方面，在药物设计或药物筛选(无论是单个蛋白-多个配体的正向筛选，还是单个配体-多个蛋白的逆向筛选)的过程中，也离不开对复合物构象的准确预测：这是准确计算蛋白质-配体结合稳定性(亲和力)的必要条件。对于给定蛋白和给定配体分子，依据是否已知结合口袋(也称配体结合位点)可以将复合物构象预测任务分为两类：口袋未知的盲对接(blind docking)任务和口袋已知的局部对接(local docking)任务。其中，盲对接任务是更普遍的、更富有挑战性的任务。在传统的对接流程中，这一任务又被划分为几个子任务：先借助口袋搜索算法确定可能的结合位点(即，转化为局部对接任务) 再利用构象生成(采样)方法生成大量可能的复合物构象，并依据打分函数评价各个构象(即，进一步确定配体的位置、朝向，以及各个键对应的扭转角) 挑选出打分值最优者作为最终结果。但是，对接过程面临着打分函数不够准确、构象搜索空间巨大导致计算耗时过长等挑战。比如，对于后者，文献[1]计算结果表明：对于单个配体复合物的盲对接任务而言，借助GNINA和Glide这两款传统的对接软件，生成百万量级的复合物构象并从中挑选最优者，平均耗时分别约为150 s和1500 s。在巨型分子库的(如ZINC 15数据库，含有约数十亿个化合物分子[2])虚拟筛选过程中，使用传统方法逐一对接每个分子在计算速度上是不可接受的。而数据驱动的机器学习方法为优化各个子任务的准确性和计算效率带来希望。此外，同样基于机器学习方法，部分研究者发展出“端到端”的、更为直接的对接流程：训练一个拟合自由能面(free energy landscape)的模型，无需将原有的对接任务划分为多个子任务，以蛋白质与配体的三维结构为输入，输出即为可能的复合物构象。参照Anfinsen提出的蛋白质折叠热力学假说，可以设想：如果存在一个能量函数，能够将复合物在三维空间下的所有状态映射到它对应的自由能，那么可以将复合物构象预测问题转化为该能量函数的最优化问题[3]。这是机器学习拟合自由能面的出发点。与传统的对接方法相比，这样的方法也同样可能在准确性和计算效率等指标上得到提升。本文将针对口袋搜索、构象生成、打分函数、自由能面建模这四个方向：整理相应的评价体系，包括常用的评价指标或测试集 挑选并简要介绍部分具有代表性的机器学习模型 结合模型评估实验讨论当前模型或评价体系存在的不足以及未来可能的发展方向。1.机器学习口袋搜索 1.1 评价体系目前存在两种描述蛋白质-配体结合口袋的方式。其中一种方法借助蛋白质表面的点云(surface points)来描述。这种方法被称作以配体为中心(ligand-centric)的方法。另一种方法则借助蛋白质上的原子来描述，那些蛋白质上的、与配体重原子距离小于一定阈值的重原子被定义为配体结合原子。这种方法被称作以蛋白质为中心(protein-centric)的方法。这两种描述方法相应地衍生出两类评价指标。对于前者，通常以配体原子中心距(预测的口袋中心与配体任意原子的距离，distance between the center of the predicted site to any atom of the ligand，DCA)、配体中心距(预测的口袋中心与配体中心的距离，distance between the center of the predicted site to the center of the ligand，DCC)、体素交并比(预测的口袋体积与配体所占据的空间体积的交并比，discretized volume overlap，DVO)等指标来衡量[4][5]。直观上，在这三个指标中：DCA最为宽松(只需大致判断配体位置)，DCC更为严格(额外考察了配体大小)，DVO最为严格(额外考察了配体构象)。但在多数文献中，常使用DCA和DCC这两个指标，并以4 Å作为预测成功与否的阈值[4]。对于后者，Yan等人以原子水平的交并比(Intersection over Union)来衡量[6]。具体地，计算预测的配体结合原子与标注的配体结合原子的交集与并集的比值。这也是机器学习目标检测任务中的常用指标。1.2 模型方法目前发展的大多数口袋搜索算法，都是以搜索蛋白质表面点云为目标。例如Krivák等人于2015年提出的P2Rank[7]：刻画蛋白质Connolly点云中各个点的物化特征，并使用随机森林模型对每个点进行可靶性预测，最后对点聚类得到口袋预测结果。以DCA为评价标准，P2Rank在多个数据集上表现优于传统方法Fpocket。Krivák等人后续还提供了P2Rank的网络服务[8]，并对多种方法口袋搜索方法进行了更加全面的总结和比较，其中包括Jiménez等人于2017年开发的、使用3D网格(体素)刻画结合位点的DeepSite[9]。值得一提的是，在Krivák等人的结果中(测试数据集为COACH420、HOLO4K，评价指标DCC)，DeepSite表现不及Fpocket 而在Jiménez等人的结果中(测试数据集CHEN251，评价指标DCC、DVO)，DeepSite表现显著优于Fpocket。最近，Yan等人另辟蹊径，以鉴定蛋白质上的配体结合原子为目标，发表了PointSite方法[6]，并声称其在多个数据集上(包括COACH420、HOLO4K、CHEN251等等，以原子水平的交并比为评价指标)取得了SOTA。Yan等人将口袋搜索问题转化为计算机视觉领域的点云分割问题 此处的点以蛋白质上的原子表示，以充分挖掘原子之间的键连特征。此外，作者还指出：将PointSite方法引入到其它口袋搜索方法如FPocket、P2Rank中(具体而言，使用点云分割的结果对后者的预测结果进行过滤)，可以进一步提升配体结合位点的鉴定效果。1.3 讨论从以上几种方法的评估实验中可看出，模型在不同测试数据集上的相对表现可能存在差异，因此需要建立一套统一的、合适的数据集进行测试。另外，在训练数据集的准备过程中，将未鉴定到配体结合的位点直接划分为负样本也值得考量。2.2在具体使用建议上，最近有研究将口袋搜索方法引入到完整的对接流程中[10][11]，相较于FPocket、P2Rank等方法，PointSite表现最优。　　2. 机器学习构象生成 2.1 评价指标对于构象生成模型而言，需要考察所生成构象的多样性和准确性，由此分别衍生出两类指标：覆盖率(COV，coverage)和匹配程度(MAT，matching metrics)。针对测试集中的每一个构象：查看是否能够在生成的构象集合里找到RMSD值小于给定阈值的构象(如果能，则表示该模型能够覆盖当前测试构象)，可以计算得到覆盖率 计算生成的构象集合与当前测试构象的最小RMSD值，取平均可以得到匹配程度的值。以上是从测试集的角度衡量模型表现(召回率) 相应地，将测试集构象与生成集构象在计算中对调，则可判断模型的准确率。目前常见的测试数据集包括GEOM-QM9和GEOM-Drugs[12]。2.2 模型方法构象生成模型沿着两个思路发展：直接生成各个原子的3D坐标 先生成原子对距离、二面角等中间参数，再将分子3D坐标还原。对于前者，技术难点在于保证模型对于输入分子的旋转-平移不变性(整体改变分子坐标，得到的构象是相同的，也即对齐过程)。对于后者，则可能生成不合法的中间参数(比如违反三角几何关系)，或者中间参数的误差在训练过程中不断累积，影响分子3D坐标重构，需要进行后续的力场优化 但这是目前大多数方法所选取的道路。此处简要介绍最近发展的GeoDiff模型[13]和DMCG模型(Direct Molecular Conformation Generation)[14]。Xu等人于2022年提出GeoDiff，使用扩散模型直接生成原子坐标。GeoDiff在GEOM-Drugs数据集上测试集覆盖率可达约89%、匹配程度约0.86 Å，并且经过力场优化之后可以进一步提升模型表现。作者指出：在逆向扩散过程中(生成过程)，如果某一时刻T的密度函数具有旋转-平移不变性，且逆向生成的条件概率函数具有旋转-平移不变性，则T时刻以前任意时刻的密度函数也具有旋转-平移不变性。同年， Zhu等人提出基于变分自编码器的DMCG模型，在GEOM-QM9和GEOM-Drugs数据集上均取得最优(对于后者，覆盖率约96%，匹配程度约0.70 Å)。作者指出：模型除了满足旋转-平移不变性外，对于对称结构还应当满足置换不变性(交换对称原子的坐标，得到的构象是相同的)。为此，计算任意旋转-平移操作以及对称原子置换操作下的两个结构的距离最小值，并将其引入损失函数中，以满足以上两种不变性。消融实验表明，如果不考虑这一项损失，则覆盖率将下降约20个百分点，匹配程度将提高约0.3 Å。2.3 讨论今年3月，Zhou等人[15]基于RDKit设计了一种简单的生成算法：使用RDKit分别采样二面角、采样几何片段、采样能量并生成相应的构象，随后按照能量大小进行聚类。在GEOM-QM9和GEOM-Drugs两个数据集上，与GeoDiff、DMCG等深度学习方法相比，该算法几乎在所有指标上取得SOTA。作者认为，目前的测试基准不足以覆盖实际应用中(如分子对接中)涉及的构象生成任务。　　事实上，生成足够的分子构象不会降低测试构象集上的匹配程度和覆盖率(召回率)，但可能降低生成构象集的相应指标(查准率)。而Zhou等人(包括Zhu等人的DMCG)并未在文中给出关于后者的模型评价，因此模型的实用性仍有待考察。另外，目前的构象生成方法均以单个配体的势能极小值作为优化目标，针对(已知口袋的)复合物中配体的构象生成模型仍有待开发。最后，GeoDiff模型与DMCG模型的发展也启示我们挖掘任务目标中蕴含的性质(对称性、不变性)，在模型训练中引入合适的归纳偏置。　　3. 机器学习打分函数3.1 评价指标Su等人[16]于2019年建立了一套打分函数的基准测试数据集CASF-2016。CASF-2016及其前身CASF-2013已被广泛用于评估打分函数的表现。同时，Su等人设计了四类指标分别考察打分函数的打分能力、排名能力、对接能力和筛选能力。打分能力通常以Pearson相关系数来衡量：考察天然蛋白复合物的计算打分值与实验结合常数的对数之间的线性相关性。排名能力通常以Spearman等级相关系数或Kendall等级相关系数来衡量：对于同一蛋白、不同配体的多个天然蛋白复合物结构，考察计算打分值给出的排名与实验结合常数给出的排名之间的匹配程度。对接能力以对接成功率衡量：对于单个复合物，在天然配体结合构象和一系列计算生成的诱饵分子构象(decoy)中，若计算打分最高者与真实结合构象的RMSD小于2 Å，则认为对接成功 对于多个复合物，进一步计算对接成功率。筛选能力以筛选成功率衡量：在天然配体和一系列其它配体分子中，计算打分前1%(5%、10%)结果里包含天然配体的比例。由此可见，打分能力直接以实验数据作为参考，是评估打分函数是否可靠的基本测试。排名能力是对打分能力的补充。打分能力越好，排名能力通常也越好 反之则未必成立(存在对实验结合常数进行非线性拟合的打分函数)。对接能力测试将计算生成的构象引入测试集中，因此更贴近实际对接操作、对于打分函数的选择更具参考意义。需要指出的是，对接能力测试给出的结果通常只能代表该打分函数的对接能力上限，在CASF-2016的测试中可能呈现分数虚高的情形(在测试中能够以90%的成功率在top-1中挑选出天然配体构象，但在实际应用中却不能达到这一表现)。这主要归结于实际应用中计算生成的构象不够充分。筛选能力涉及多种配体的对接，因此可视为对排名能力和对接能力的综合考察。3.2 模型方法针对打分函数的机器学习方法，前人已给出详尽的综述[17][18][19]。本文将展开介绍经典的ΔVinaRF20打分函数[20]，以及最近发展的DeepDock[21]和RTMScore[22]。ΔVinaRF20由Wang等人于2016年提出，在CASF-2013、CASF-2016测试集上的各指标中均排名靠前[16][20]。具体地，在CASF-2016测试集上，ΔVinaRF20在打分能力和排名能力两个指标上分别以0.82和0.75取得最优，在对接能力上以89.1%(top1)仅次于Autodock Vina(90.2%)，在正向筛选能力以42.1%(top1)取得最优、逆向筛选能力以15.1%(top1)位居第五(次于最优方法ChemPLP@GOLD约2.4%)。Wang等人指出：机器学习打分函数与经典的打分函数在这些指标中各有所长，前者长于打分，后者长于对接和筛选。因此作者拟结合二者优点：一方面对训练集进行数据增强，将计算生成的诱饵结构引入训练集中(同时计算估计亲和力作为标签)，以提高机器学习打分函数的对接和筛选能力 另一方面使用随机森林方法对AutoDock Vina中的打分函数进行参数化修正(使用Δ-machine learning方法，类似残差拟合)。Méndez-Lucio等人于2021年提出的DeepDock方法在CASF-2016的正向筛选和逆向筛选能力评估中分别以43.9%和23.9%取得SOTA，但DeepDock给出的打分值与实验结合常数的对数之间不存在相关性(在训练过程中未引入实验结合常数的相关信息)。DeepDock方法使用二维分子图刻画配体、多面体网格点刻画蛋白质口袋(参考了MaSIF的编码框架[23])，分别学习蛋白质口袋与配体原子的节点表示 随后两两组合配体和靶蛋白的节点形成节点对，使用混合密度函数拟合节点对的距离分布(概率密度函数)。作者指出：相较于通过最小化距离误差来学习节点对距离的平均值，混合密度函数能够学习训练集中节点对多个可能的距离，从而更好地刻画构象预测任务中的多值特性。在DeepDock的基础上，Shen等人从两方面进行改进得到RTMScore：一方面，使用无向图编码蛋白质口袋残基，在编码过程中满足对于输入复合物坐标的旋转不变性 另一方面使用Graph Transformer模型以学习更深层次的特征。作者声称RTMScore在CASF-2016测试集上的对接能力和筛选能力达到SOTA，相较DeepDock得到大幅提升：对接成功率达到98.6%，正向筛选成功率达73.7%，逆向筛选成功率达38.9%。3.3 讨论DeepDock等方法的发展展现了图模型在捕获蛋白质-配体互作的潜力，以及直接拟合蛋白残基-配体原子距离似然函数的有效性。事实上，距离似然函数不仅能作为打分函数评估当前构象，还能够作为某种“势能面曲线”指导构象优化。此外，这些新近提出的DeepDock等方法有待更广泛的测试验证。在其它论文的评估实验中[24]，RTMScore在对接能力中依旧表现最优。但考虑到缺少打分能力、排名能力等测试数据，后续仍需要更多的测试评估(尤其是将打分函数整合到完整的对接流程中)以验证这些方法的可靠性。　　4. 机器学习自由能面4.1 评价体系拟合自由能面的模型直接处理盲对接任务，生成复合物构象。其中存在两类评价指标。一类指标评估计算准确性。通常以预测复合物(如果模型给出多个可能的构象，则选取打分值top-1者)中配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例来衡量模型对接能力。一般以2 Å作为对接成功与否的判断阈值[10]。还有通过配体质心距离小于2 Å(或5 Å)所占的比例来考察模型是否能够找到正确的结合口袋。此外，为判断生成的配体构象在化学上是否合理，Corso等人额外考察了配体构象中存在位阻冲突(steric clash，配体内部重原子之间的距离是否小于0.4 Å)的比例。另一类指标评估计算效率 这在大型分子数据库的虚拟筛选过程中同样不可忽视。以对接一个分子所需的平均CPU(如果可能，使用并行加速)或GPU时间来衡量。4.2 模型方法拟合蛋白质-配体自由能面的机器学习方法最近得到逐步发展，代表性的方法包括EquiBind[1]、TANKBind[25]、DiffDock[10]。Stärk等人于2022年提出基于图几何深度学习的EquiBind方法，在机器学习方法直接预测蛋白质-配体结合构象这一问题中做出开创性贡献。该方法以随机的配体分子构象(比如使用RDKit生成的构象)作为输入，无需经过大规模的构象采样即可在约0.1 s的时间内给出复合物结构。由此给出的结构在寻找结合口袋的能力上与传统方法(如QuickVina-W)相当(配体质心距小于2 Å的比例均约40%)，但在配体结合构象的预测上却表现不佳(配体RMSD小于2 Å的比例约6%，不及QuickVina、GLIDE等方法所达到的约20%)。虽然可以在该结构的基础上结合传统方法进一步微调配体位置和构象，但将增加预测所需的时间成本至数十秒或数百秒。同年，Lu等人提出TANKBind。相较于EquiBind，在保留推理速度(约0.5秒)的同时，TANKBind在配体构象预测上取得和传统方法相当的结果(配体RMSD小于2 Å的比例约19%)，口袋预测能力则获得较大提升(配体质心距小于2 Å的比例约56%)。不同于EquiBind对整个蛋白质进行编码的方法，TANKBind采用P2Rank寻找口袋位置，随后针对该位置的蛋白质区块(由半径20 Å内的残基构成)，拟合蛋白质残基与配体原子的距离。此外，受AlphaFold2的启发，TANKBind将三角几何约束引入残基与配体原子的距离建模中。消融实验表明，三角几何约束可以显著提升模型表现：配体RMSD小于2 Å的比例提升约15%，配体质心距小于2 Å的比例提升约12%。同年十月， Corso、Stärk等人提出DiffDock模型。该模型在对接准确性上首次实现了对传统对接模型的大幅超越。在holo态的蛋白晶体对接结果中，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例可达到38.2%，约为传统方法的两倍。这一结果对应于40次采样，消耗计算时间约40秒。与DeepDock想法类似，DiffDock使用生成模型来学习构象的概率分布并建立了一套相应的“扩散”方法(构象采样方法)。4.3 讨论今年2月，Yu等人[11]重新设计实验，考察了DiffDock等机器学习模型在盲对接任务中的哪一阶段领先传统方法、领先到何种程度。作者将盲对接任务拆分为口袋搜索和局部对接两个子任务，设计了三组实验：完全使用DiffDock等模型完成盲对接 使用其它方法搜索口袋(如前文所述的PointSite、P2Rank)，使用Uni-dock[26](一种基于AutoDock Vina 1.2的GPU加速对接方法)局部对接 使用DiffDock搜索口袋，使用Uni-dock局部对接。结果表明：DiffDock方法在口袋搜索中效果更佳(相较于PointSite等方法而言，引入了配体分子的结构信息)，但与ground truth、即表中的GT pocket相比仍存在提升空间 口袋确定，传统对接手段得到的结果优于DiffDock等机器学习模型。作者进一步指出：给定口袋下预测蛋白质-配体构象的机器学习方法是后续发展的方向(正如机器学习构象生成中所讨论的) 对于端到端的模型比较实验中，需要更审慎地评估传统方法的表现。另外，随着蛋白质结构预测方法的发展，评估模型在apo态蛋白质上的对接表现是有必要的，也是更符合实际情形的。事实上，目前几种模型所使用的训练集均为holo态蛋白(缺乏足够数量的与holo态对应的apo态蛋白结构)。为泛化模型的对接能力至apo态蛋白结构，通常采取折中方案：假定apo态与holo态的主链变动不大，而在模型编码过程中只使用主链碳原子的信息。DiffDock论文中首次评估了各种方法在ESMFold给出的蛋白质结构上的对接能力。结果显示，各模型的对接表现均显著下降(对于DiffDock而言，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例从38.2%下降至20.3%)。机器学习方法建模对接过程中蛋白质的结构变化仍然道阻且长。将分子动力学模拟过程中产生的动态信息引入模型中也许是一种可能的突破方向[27]。最后，正如AlphaFold2可作为打分函数评估蛋白质结构是否合理[3]，DiffDock等拟合自由能面的模型，其在打分函数的各项评价指标中表现如何也值得进一步探究。　　参考文献　　[1] Equibind: Geometric deep learning for drug binding structure prediction　　[2] Artificial intelligence–enabled virtual screening of ultra-large chemical libraries with deep docking　　[3] State-of-the-Art Estimation of Protein Model Accuracy Using AlphaFold　　[4] A Critical Comparative Assessment of Predictions of Protein-Binding Sites for Biologically Relevant Organic Compounds　　[5] Improving detection of protein-ligand binding sites with 3D segmentation　　[6] PointSite: A Point Cloud Segmentation Tool for Identification of Protein Ligand Binding Atoms　　[7] P2RANK: Knowledge-Based Ligand Binding Site Prediction Using Aggregated Local Features　　[8] P2Rank: machine learning based tool for rapid and accurate prediction of ligand binding sites from protein structure　　[9] DeepSite: protein-binding site predictor using 3D-convolutional neural networks　　[10] DiffDock: Diffusion Steps, Twists, and Turns for Molecular Docking　　[11] Do Deep Learning Models Really Outperform Traditional Approaches in Molecular Docking?　　[12] GEOM, energy-annotated molecular conformations for property prediction and molecular generation　　[13] GeoDiff: a Geometric Diffusion Model for Molecular Conformation Generation　　[14] Direct Molecular Conformation Generation　　[15] Do Deep Learning Methods Really Perform Better in Molecular Conformation Generation?　　[16] Comparative Assessment of Scoring Functions: The CASF-2016 Update　　[17] Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking　　[18] Protein–Ligand Docking in the Machine-Learning Era　　[19] From machine learning to deep learning: Advances in scoring functions for protein–ligand docking　　[20] Improving scoring-docking-screening powers of protein–ligand scoring functions using random forest　　[21] A geometric deep learning approach to predict binding conformations of bioactive molecules　　[22] Boosting Protein–Ligand Binding Pose Prediction and Virtual Screening Based on Residue–Atom Distance Likelihood Potential and Graph Transformer　　[23] Deciphering interaction fingerprints from protein molecular surfaces using geometric deep learning　　[24]: A fully differentiable ligand pose optimization framework guided by deep learning and a traditional scoring function　　[25] TANKBind: Trigonometry-Aware Neural NetworKs for Drug-Protein Binding Structure Prediction　　[26] Uni-Dock: GPU-Accelerated Docking Enables Ultralarge Virtual Screening　　[27] Pre-Training of Equivariant Graph Matching Networks with Conformation Flexibility for Drug Binding　　本文作者：ZF责任编辑：WFZ

《蛋白质研究国家重大科学研究计划“十二五”专项规划》解读 　　问：《蛋白质研究国家重大科学研究计划“十二五”专项规划》(以下简称《专项规划》)是在什么样的背景下出台的? 　　答：蛋白质是最主要的生命活动载体和功能执行者。对蛋白质结构与功能、相互作用和动态变化的深入研究，将有助于揭示生命现象的本质，同时将催生一系列新的生物技术，带动医药、农业和绿色产业的发展，引领未来生物经济。因此《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》明确将蛋白质研究列为国家重大科学研究计划之一，从2006年起重点支持。为明确蛋白质研究重大科学研究计划“十二五”期间的总体思路和发展目标、重点任务，科技部组织有关部门和专家编制了《专项规划》。 　　问：蛋白质研究国家重大科学研究计划“十一五”期间有哪些主要进展? 　　答：“十一五”期间，蛋白质研究国家重大科学研究计划围绕蛋白质组学、蛋白质结构和功能、代谢组学和转录组学、蛋白质研究的新技术新方法等方面部署了37个项目，经费投入约6.1亿元。目前已取得了一系列重要的成果，包括解析了一批具有重要生物学功能的蛋白质及其复合物的空间结构，建立了国际上最大的人类正常肝组织、肝病和肝癌系列的蛋白质表达谱和相互作用网络图 发现200余种针对人类重大疾病的潜在药物靶标或诊断标志物 通过肿瘤靶向的新型纳米药物输送系统实现了药物在肿瘤细胞内的靶向富集，为临床肿瘤治疗提供了新的有效手段 发展了高丰度蛋白质去除和低丰度蛋白质富集的成套关键技术，为重大疾病靶标和诊断标志物的发现提供了高效可行的技术方案等。同时，通过蛋白质研究国家重大科学研究计划的实施，锻炼了创新队伍，培养了一批年富力强、创新能力突出的学术骨干，形成了我国蛋白质科学研究的人才梯队。国际蛋白质科学研究与交流取得了重大进展，牵头组织实施了国际人类肝脏蛋白质组计划，并与多个国际一流研究机构成立了联合实验室(中心)，促进了蛋白质研究领域的重大国际合作。 　　问：蛋白质研究国家重大科学研究计划“十二五”发展的总体思路是什么? 　　答：“十二五”发展的总体思路是：紧密围绕我国经济与社会发展的重大科技问题和重大科学前沿，以蛋白质结构与功能、相互作用和动态变化的研究为重点，以蛋白质研究技术与方法创新为支撑，加强新技术新方法在蛋白质研究中的推动力 在结构生物学、蛋白质组学、蛋白质研究新技术和新方法、蛋白质合成、降解与调控机制、蛋白质生物学功能、系统生物学、药物靶标和分子诊疗等7个方面强化部署 加强项目与国家蛋白质科学研究设施、相关国家重点实验室等基地的紧密结合 加强蛋白质研究国家重大科学研究计划与国际相关计划的合作。 　　问：蛋白质研究国家重大科学研究计划“十二五”发展目标是什么? 　　答：“十二五”发展目标是：揭示一批膜蛋白和重要蛋白质复合体的空间结构及其生物学作用机制，产出一批具有长远影响的标志性成果 系统解析人类重要组织器官、重要病原体以及模式生物的蛋白质组 进一步阐释在各种生理和病理过程中的蛋白质相互作用网络的构成和动态变化，继续保持我国在蛋白质组学的国际领先地位 发现与重大慢性病和传染性疾病进程密切相关的蛋白质群，提供300种左右诊断标志物和药物靶标的候选蛋白质 建立和完善蛋白质结构测定、规模化蛋白质修饰与定量研究的技术平台，形成一批原创性的蛋白质研究新方法和新技术 构建多种具有应用前景的国家级蛋白质、多肽和抗体的公共资源库 造就一支创新能力强的高水平复合型蛋白质研究队伍。 　　问：蛋白质研究国家重大科学研究计划“十二五”有哪些主要任务? 　　答：主要有七方面任务：一是结构生物学方面，对参与基因表达调控、能量转换和信号转导等重要生命活动的蛋白质及其复合物的结构以及作用机制进行研究。二是蛋白质组学方面，开展重要生物体蛋白质组全组分解析及蛋白质翻译后修饰、动态变化和相互作用网络的蛋白质组学研究 针对严重危害人类健康的重大疾病开展蛋白质组学研究 开展人类蛋白质组计划国际合作研究。三是针对蛋白质研究前沿中的技术瓶颈发展相关的新技术和新方法，并开展以重要生物学问题为牵引的关键技术和方法创新。四是蛋白质合成、降解与调控机制研究方面，研究基因转录、mRNA加工和蛋白质翻译、新生肽链折叠的分子调控机制 研究蛋白质折叠相关疾病发生的分子机理及防治策略。五是蛋白质生物学功能方面，研究免疫调节和细胞信号转导等重要生命活动相关的蛋白质的分子作用机制 研究重要的蛋白质复合体以及蛋白质相互作用网络的功能。六是系统生物学方面，以蛋白质研究为核心，将生物系统内基因、代谢小分子等其它构成要素整合进行研究 针对多细胞生物，实现从分子到细胞、到组织、到整体的多层次的整合研究 开展对生物系统的功能元件构成、相互作用网络和动态变化等方面的研究。七是开展蛋白质药物靶标的研究，开展基于蛋白质相互作用网络的分子诊疗技术研究。 　　问：为确保《专项规划》的顺利实施，有哪些保障措施? 　　答：主要四个方面：一是加强顶层设计与统筹协调，面向国家重大战略需求和世界科学前沿，进一步强化重大科学目标导向，完善项目首席科学家负责制及鼓励创新的评价机制，促进系统性、原创性重大成果的产出。二是继续加强蛋白质研究基地建设，充分发挥国家蛋白质科学基础设施、相关国家重点实验室等研究基地的科研平台作用，促进项目、基地与人才的紧密结合。三是加大创新人才培养和引进力度，充分利用好各类人才计划，建设国际一流水平的蛋白质研究团队。四是吸纳优秀外国科学家和海外优秀华人学者以多种方式参与蛋白质研究重大科学研究计划实施，支持我国科学家参与国际合作和在国际组织中任职，鼓励提出国际合作计划。加强国家重大科学研究计划的科学普及工作。

近日，中国科学院武汉物理与数学研究所研究员唐淳课题组利用基于973重大科学研究计划“蛋白质动态学研究的新技术新方法”建立的研究技术，协助华中农业大学教授殷平课题组首次解析了N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白复合体结构，该研究成果发表于《自然》杂志。　　该工作揭示了RNA N6腺嘌呤甲基化修饰过程中的结构基础，是表观遗传学领域的一项重大突破。唐淳、武汉物数所副研究员龚洲和博士后刘主参与该项目，利用课题组发展的新技术新方法，通过结合小角X光散射与计算机模拟的手段，为该蛋白复合体的结构解析提供了研究方法上的帮助。　　经过近3年的努力，唐淳课题组发展、建立了包括核磁共振波谱、小角X光散射、化学交联质谱分析、单分子荧光检测和成像等技术在内的多种生物物理化学手段，并开发相应的整合计算方法，用于蛋白质动态结构及其转换过程的研究。课题组除了完成自身的科研项目外，积极开展广泛的合作与交流，与国内外同行共享研究技术和方法。目前，得益于“蛋白质动态学研究的新技术新方法”项目的实施，课题组已助力多个重要蛋白质结构的解析，取得了一系列的研究成果，研究成果发表于《自然—化学生物学》、eLife 等国际一流杂志。

人类线粒体DNA编码了13种重要的多肽，这些多肽是连接氧化磷酸化（OXPHOS）复合物的多亚基复合物的组成部分，这些复合物主要存在于内陷的嵴膜上。内界膜（IBM）含有丰富的动态接触位点，用于从细胞膜导入蛋白质的移位酶。大多数OXPHOS亚单位采用核编码，因此必须通过外膜在与内界膜的接触位点处从胞浆中导入。由于大多数OXPHOS成分导入后需与mtDNA编码的成分整合组装，那么线粒体内翻译发生于何处？由于线粒体编码的成分也是这些复合物的组成部分，所以蛋白质合成发生于何处？题图：以STED显纳镜分辨率拍摄的人类线粒体网络截面。(更多细节见图1）。本论文采用了基于点击化学的方法，并结合受激发射损耗显纳镜（STED）来解决以上问题。报告显示，在培养的人类细胞中，大部分线粒体蛋白质的合成是在嵴膜上检测到的，且在空间上与RNA加工和成熟的位点相分离。图1：图片显示了人类线粒体网络截面，以共聚焦显微镜和STED显纳镜的分辨率拍摄，用775nmSTED激光器损耗AF594，用660nmSTED激光器损耗AF532。这些图片是显示新合成蛋白质的亚线粒体位置的关键图像。绿色的荧光信号代表新合成的线粒体蛋白，品红色是线粒体内界膜中发现的线粒体蛋白（TIM23）的免疫荧光抗体。阅读完整文章：Zorkau M., Albus C., Berlinguer-Palmini R., Chrzanowska-Lightowlers Z. & Lightowlers R.Zorkau M., Albus C., Berlinguer-Palmini R., Chrzanowska-Lightowlers Z. & Lightowlers R.High-resolution imaging revealscompartmentalization of mitochondrial protein synthesis in cultured human cellsPNAS February 9, 2021 118 (6) e2008778118 https://doi.org/10.1073/pnas.2008778118了解更多：徕卡显微

测定蛋白质浓度的方法有很多，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等 ，今天小编以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。UV法这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。（1）简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算 通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D，其中d为测定OD值比色杯的厚度，D为溶液的稀释倍数BCA法原理：BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。BCA 蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）提供一个简单，快捷，兼容去污剂的方法，准确定量总蛋白。成分试剂 A100 mL试剂 B2 mL标准蛋白（BSA）1 mL×2，1 mg/mL保存条件 运输温度：室温（标准蛋白 4～8 ℃ 运输）保存温度：室温（标准蛋白 -20 ℃ 保存）有效日期：12 个月使用方法方法一：96 孔板1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充分混匀。2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。6. 制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。方法二：试管法1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。4. 将样品与标准品在 562 nm波长下测定吸光度。考马斯亮蓝法实验原理：考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。考马斯亮蓝 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸) 和芳香族氨基酸残基相结合。突出优点（1）灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其最di蛋白质检测量可达 1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那样费时和需要严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 (SDS) 等。试剂与器材1、试剂 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸馏水稀释至 1000 mL。2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。（2）待测蛋白质溶液。 人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀释 200 倍。3、器材 试管 1.5×15 cm（×6），试管架，移液管管 0.5 mL（×2） 1 mL（×2） 5 mL（×1）；恒温水浴；分光光度计。操作方法 一、制作标准曲线 取 7 支试管，按下表平行操作。摇匀，1 h 内以 0 号管为空白对照，在 595 nm 处比色。绘制标准曲线：以 A595 nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。二、未知样品蛋白质浓度测定 测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的 A595 nm 值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。注意事项（1）在试剂加入后的 5-20 min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最we定的。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。

2020年初，一场突如其来的疫情打乱了大家的生活节奏。面对来势汹涌的疫情，全国上下正在积聚力量，全力战胜新型高致病性冠状病毒（2019-nCoV）。医护人员、解放军战士、志愿者们纷纷奔赴武汉，与疫魔竞速，守卫着国民的生命安全，致敬最美逆行者！同时疫情研究者一样没有停下自己的脚步，特别是在分子水平，我们调研了基于Orbitrap超高分辨的蛋白质组学和结构组学技术在病毒学研究中的应用，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。Orbitrap技术促进病毒机理研究病毒与宿主共同进化，获得捕获和操纵宿主细胞过程进行复制的机制传播。同样，宿主细胞会通过部署防御机制或通过适应感染环境。在整个感染过程中，细胞严重依赖于时空调控的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用的形成。 蛋白质组学方法与病毒学的结合促进了对病毒复制、抗病毒宿主反应和病毒对宿主防御的颠覆机制的深入研究。而Orbitrap技术依靠其高灵敏度、高精度，高通量等特性在该方面表现出色。案例一：Orbitrap技术深度挖掘病毒-宿主蛋白质相互作用2019年Viruses杂志上发表了基于组学技术研究宿主变化的综述，质谱技术中基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行MS分析（AP-MS）的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒-宿主多蛋白复合物，可识别间接和直接的蛋白质相互作用，提供相互作用事件的瞬时信息，或跟踪单个病毒基因产物的过表达，以深入了解单个蛋白质的功能；表达蛋白质组学技术（定量蛋白质组学和翻译后修饰组学）可以研究病毒蛋白的组成，宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化。（Viruses 2019, 11, 878 doi:10.3390/v11090878）迄今为止，基于蛋白质组学方法的进展已经为识别数量惊人的病毒-宿主蛋白关联铺平了道路，科学家基于这些数据构建了包含了5000多种病毒成分和宿主细胞之间的非冗余蛋白相互作用数据库。这些有价值的信息库包括相互作用蛋白数据库、VirHostNet(http://virhostnet.prabi.fr/)、VirusMentha(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D588–D592)、IntAct-MINT(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D583–D587)和Uniprot。 案例二：Orbitrap技术揭示新型塞卡病毒宿主因子Pietro,Scaturro, Alexey, et al. Nature, 2018 寨卡病毒(ZIKV)最近成为全球健康问题，由于它的广泛传播和与严重的联系新生儿神经症状和小头症。然而,与致病性相关的分子机制关于ZIKV的大部分仍然未知。 技术路线：利用赛默飞 LTQ-Orbitrap和Orbitrap Q Exactive HF质谱进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学（实验路线见下图a），研究对象为神经细胞系SK-N-BE2和NPC细胞，表征细胞对病毒的反应，在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化，利用亲和蛋白组学方法鉴定ZIKV蛋白的细胞靶点。使用这种方法，找到了386个与zikv相互作用的蛋白质，导致宿主在神经发育受损，视网膜缺陷和不孕。此外，确定了寨卡病毒感染后1216个磷酸化位点存在上调或下调，来自AKT, MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路中，为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。在功能上，系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动，并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证（下图热图），补充这一空白。技术路线图案例三：Orbitrap技术深入探寻寨卡病毒病毒与宿主的相互作用Etienne Coyaud, et al. Molecular & Cellular Proteomics，2018,技术路线技术路线：本文利用生物素识别以及IPMS亲和纯化结合MS 方法，研究寨卡病毒侵染后病毒与宿主细胞蛋白质的相互作用（技术路线见上图），实验结果揭示了1224个蛋白3033多肽形成的相互作用网络（见下图a）。相互作用包括多肽加工和质量控制、囊泡方面的作用运输，RNA处理和脂质代谢。40%的 作用都是以新报道的相互作用。通过数据挖掘分析，揭示过氧化物酶体在ZIKV感染中的关键作用。病毒宿主蛋白相互作用网络图 温馨提示：积极防护 保护自己 戴口罩 勤洗手

仪器信息网讯 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究进入了后基因组时代，蛋白质组学随之成为重大热点研究领域之一。在应用研究上，蛋白质组学已成为发现新型生物标志物、新药物靶标的重要途径，已成为生物医药产业及其相关产业发展的新生长点，此外，蛋白质组学通过研究疾病不同阶段相关蛋白质变化、对疾病诊断和治疗领域具有应用价值和指导意义。而蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台对于蛋白质组学研究至关重要。质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具潜力的技术。　　为帮助从事相关研究的用户学习蛋白质组学研究技术及方法，仪器信息网将于2021年3月18日举办“蛋白质组学技术与应用进展”主题网络研讨会，会议将邀请多位业内专家做精彩报告，为广大用户搭建一个即时、高效的交流和学习的平台。报名链接：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/PROTEOMIC2021/　　会议日程:　　报告嘉宾一览：北京蛋白质组研究中心主任/研究员 秦钧　　秦钧博士，男，1965年2月出生。国家特聘专家，北京市特聘专家。秦钧教授是世界上少数几位将质谱仪设计、蛋白质组学方法开发、生物信息学、生物学及临床应用纳入同一个研究项目的学者之一。在蛋白质复合体研究方面，建立了国际领先的蛋白质复合体纯化和鉴定方法 在蛋白质网络研究方面，建立了世界上最大的内源性人蛋白质复合体数据集 在DNA损伤修复开展了大量卓有成效的研究工作 成功建立了国际上最高效的蛋白质组扫描平台 利用转录因子可与其特异性DNA序列结合的特点，设计研发catTFRE用来富集细胞/组织中内源性转录因子和转录调控复合物 主持开发建设了国际上第一个一站式蛋白质组学数据分析云平台 绘制了首个弥漫型胃癌的蛋白质组地形图，并将弥漫型胃癌分为与生存预后和化疗敏感性密切相关的三个分子亚型 绘制了首个解剖区域分辨率的健康人胃黏膜蛋白质组参考图谱，并建立了胃粘膜在生理条件下的蛋白质组的定量参考范围。以责任作者身份在Cell、Nature Biotechnology、Nature Communications、Molecular Cell、Genes & Developments和PNAS等期刊发表系列文章。西湖大学特聘研究员 郭天南　　2006年毕业于华中科技大学同济医学院临床医学七年制，同时获得武汉大学生物科学双学位。2012年获得新加坡南洋理工大学博士学位。2012-2017年在瑞士苏黎世联邦理工大学Ruedi Aebersold教授实验室从事博士后研究。2017年初在澳大利亚悉尼大学儿童医学研究所ProCan任Scientific Director，肿瘤蛋白质组Group Leader，悉尼大学医学院兼聘高级讲师。2017年8月加入西湖高等研究院任特聘研究员。长期从事蛋白质组学相关研究，并将其应用于大量的临床样本(包括甲状腺癌、前列腺癌等)，结合人工智能探索生物标志物。中山大学教授 李惠琳　　中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用，侧重于(1)开发整合结构质谱技术(包括native top-down MS, HDX-MS, CX-MS等)，用于药物作用分子机制及蛋白复合物结构研究 (2)Middle-down/top-down蛋白质组学新技术的开发及应用。共发表SCI收录论文40篇，其中第一作者或通讯作者15篇，主要发表在Nat. Chem.、Anal. Chem.等期刊 2014年获得American Society of Mass Spectrometry Postdoctoral Career Development Award 2019年入选“珠江人才计划”青年拔尖人才 主持国家自然科学基金项目3项。南方科技大学终身教授 田瑞军　　南方科技大学终身教授，加拿大渥太华大学及深圳市人民医院兼职教授，中国蛋白质组组织CNHUPO常务理事、中国化学会色谱专业委员会理事、中国质谱学会理事和中国分子系统生物学学会理事，科技部“国家重点研发计划”子课题负责人。2008年在中国科学院大连化学物理研究所获得分析化学博士学位，师从邹汉法研究员，并获得中国科学院院长优秀奖和中国科学院优秀毕业生奖励。在加拿大先后师从Daniel Figeys教授和Tony Pawson院士完成博士后研究，并获得加拿大国立卫生研究院(CIHR)博士后基金资助。2014年起受聘南方科技大学化学系，致力于蛋白质组学的方法学和技术研究，并强调其在细胞信号转导和肿瘤微环境等生物医学研究方向的应用。已在国际主流学术期刊上发表论文70余篇，其中以通讯作者在Nature、PNAS、Anal. Chem.等上发表文章近30篇。曾荣获由国际蛋白质结构分析和蛋白质组学协会(IAPSAP)颁发的2012 Young Investigator Award、深圳市鹏城学者特聘教授和广东杰出青年基金等。曾担任第五届中加系统生物学研讨会等国内外会议共同主席。目前担任色谱杂志青年编委和Frontiers in Endocrinology编委。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

蛋白质（protein）是组成人体一切细胞、组织的重要成分，是生命的物质基础，分子结构由α—氨基酸按一定顺序组合和排列形成氨基酸顺序不同的多肽链，这些多肽链进一步通过交联构成。蛋白质的复杂结构是其功能多样性的前提和基础，对其分子结构及发挥生物活性的机制进行研究具有重要意义。蛋白质空间结构（图片来源：网络）与其他有机或无机化合物晶体结构一样，蛋白质晶体结构是由相同的蛋白质分子或蛋白质分子复合物在空间中有序排列,从而构成的规则的3D阵列。根据蛋白质晶体结构排列的对称性，晶体中的所有分子相对于晶格具有有限数量的独特取向。蛋白分子通过在晶格中的有序排列，将单个分子的衍射值叠加，最终获得足以测量的衍射强度，其中晶格起到放大器的作用。结晶研究作为探究生物大分子结构及功能的重要手段，有力的推动了蛋白质分子结构的研究进程。 蛋白质晶体结构（图片来源：网络）时至今日，蛋白结晶还存在许多问题，制约着蛋白结构测定的速度。工欲善其事必先利其器，蛋白晶体成像仪作为高通量筛选蛋白质结晶的重要工具，可进行蛋白晶体研究的自动化成像和分析，为下一步进行蛋白质晶体衍射、确定结构奠定基础，最终应用于制药和生命科学领域的研究。蛋白晶体成像仪通过精确的温度控制提供稳定的蛋白质晶体培育环境，在甄别分析中，通过可见光、偏振光、紫外三种模式辨别晶体是否为蛋白晶体并观察晶体成长过程，可对晶体快速定位、自动化拍摄高质量影像。相比传统显微镜，它在蛋白晶体观察捕获的敏感度、成像质量、样本的自动定位等方面都有了很大提升，重要参数指标包括物镜倍数、附镜倍数、数值孔径、景深(mm)、视场(mm)、像素尺寸(μm)、光学分辨率(μm)等。目前市场的蛋白质晶体成像仪主流厂商有赛默飞、腾泉生物、安捷伦、Formulatrix等，不同品牌产品也各具特色。以Formulatrix的产品为例来介绍蛋白质晶体成像仪，蛋白晶体成像仪同时具备可见光和紫外荧光功能，可创造蛋白晶体的培养、成长环境，精确恒定温度和振动隔离。除此之外，仪器提供最多970个结晶板的存储和培养空间，能实现准确实验样本自动定位、智能影像捕捉拍摄等功能。在观察晶体成长过程的同时，可进行数据库数据对比和搜索，以确定蛋白晶体的存在和成长，对蛋白质晶体进行跟踪研究。蛋白液滴定局部成像（图片来源：Formulatrix）蛋白质晶体可见光及紫外成像（图片来源：Formulatrix）更多信息，点击进入仪器信息网相关仪器专场：https://www.instrument.com.cn/zc/2582.html

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录 　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成 　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。 　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。 　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。 　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。 　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。 　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。 　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。

【科技日报】探秘蛋白质的&ldquo 前世今生&rdquo &mdash &mdash 国家蛋白质科学中心· 上海(筹)印象 图为蛋白质科学研究(上海)设施核磁共振分析系统。 　　生活中的乌云总是不期而至。一位正值花季的美国女孩，突然被告知患上了一种非常难治的癌症。基因检测结果显示，她所患癌症的亚型发生率极低。 　　在患同一大类癌症的人群中，只有2%的人所患亚型和她一样。幸运的是，针对这一亚型恰好有一种特效药。经过不到3个月的治疗，她痊愈了。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)主任雷鸣用这个真实的案例，向科技日报记者生动阐释了精准医疗的未来图景。但并非所有的癌症患者都和那位女孩一样幸运。在人类通往精准医疗的道路上，蛋白质科学研究将扮演什么角色?身为国家大科学工程之一的蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称&ldquo 上海设施&rdquo )对推进蛋白质科学研究将起到怎样的作用? 　　为回答这些问题，科技日报记者近日走进国家蛋白质科学中心· 上海(筹)一探究竟。 　　不容小觑的&ldquo 仪器集群&rdquo 　　和以往走进的国家大科学工程相比，上海设施没能在视觉上给人造成强大冲击。 　　&ldquo 我们这里主要是一些体量相对较小的生命科学研究的仪器集群，以至于在立项之初，是否将上海设施列入大科学工程都存在争议。&rdquo 雷鸣说道。 　　可别小瞧这里的&ldquo 仪器集群&rdquo 。上海设施自2014年5月试运行以来，前来参观的10多位诺贝尔奖得主和其他国际知名专家对设备的先进性纷纷&ldquo 点赞&rdquo 。 　　雷鸣回忆道，十多年前，我国在蛋白质科学研究领域虽然已取得一批达到国际一流水平的研究成果，但整体上仍落后于国际先进水平。科研基础设施建设滞后，是制约蛋白质科学发展的关键因素。 　　在科学家们的不懈努力下，蛋白质科学研究设施国家重大科技基础设施项目于2008年被批准立项，成为我国生命科学领域第一个大科学工程项目。蛋白质科学研究设施分为上海和北京两部分，上海设施以建设蛋白质结构解析能力为主。 　　围绕从生物体的空间尺度和生命过程的时间尺度来研究蛋白质，上海设施构建了由规模化蛋白质制备系统、蛋白质晶体结构分析系统、核磁分析系统、集成化电镜分析系统、蛋白质动态分析系统、质谱分析系统、复合激光显微成像系统、分子影像系统和数据库与计算分析系统组成的9大技术系统，具备规模化蛋白质制备、多尺度结构分析、多层次动态研究、修饰与相互作用分析以及数据库与计算分析5大能力。 　　史蒂夫· 哈里森是雷鸣在哈佛大学读博士时的导师。参观上海设施后，史蒂夫感觉非常震撼，对雷鸣很年轻就有机会参与如此重大的项目表示赞赏和羡慕。收获羡慕之余，雷鸣多次被问道：&ldquo 在如此先进的科研平台上，你们能做出哪些世界一流的工作来?&rdquo 　　独一无二的蛋白质&ldquo 智能工厂&rdquo 　　每一个蛋白质就像一个人一样，有自己的脾气秉性。要把它研究透彻，需要时间。 　　上世纪六七十年代有句话叫&ldquo one protein，one career&rdquo ，意为一个教授一辈子只能研究透一个蛋白质。&ldquo 我主要研究端粒，从评上教授到现在，也只解析了数十个蛋白质的结构。&rdquo 雷鸣说道。 　　要摸清蛋白质的&ldquo 脾气&rdquo ，首先是要获取高纯度的蛋白质样品。想见到蛋白质的&ldquo 真身&rdquo ，就必须打破细胞。而细胞一旦被打破，里面90%的蛋白质就同时被破坏掉了，踪迹难觅。 　　找到目标蛋白质后，保存也是个难题。相对于&ldquo 皮实&rdquo 的基因，蛋白质要&ldquo 娇气&rdquo 得多。记载遗传信息的基因就像是张可以随意摆放的卡片，没有变性的担忧。蛋白质则不同，一旦温度、湿度、光线等环境因素发生变化，就会有变质的风险。 　　在传统的生物学实验室里，穿着白大褂的科研人员手持移液枪，往装有不同液体的瓶瓶罐罐里添加试剂是常见的场景。在上海设施的规模化蛋白质制备系统里，这一幕正在被自动化的机器操作所取代。 　　高通量克隆构建实验室的中心区域是一个用玻璃超净间封闭起来的自动化机械操作平台。操作台外有一台集成软件的计算机负责&ldquo 发号施令&rdquo 。科研人员启动预设程序后，白色的机械臂在平台的各个自动化仪器间来回挪动，轻巧地把一个个96孔板放置到指定的板位上。各个自动化仪器的板位分别可执行加液、振荡、离心、清洗等生物实验操作。 　　传统手工操作，一个人每天最多克隆十几个基因。眼前的这套自动化系统，一天可以克隆960个基因，生产效率相当于一个数百人规模的基因克隆企业。&ldquo 我们希望把自动化概念引入科研中，重复劳动让机器来做，科研人员可以有更多的时间去探索和思考真正的科学问题。&rdquo 规模化蛋白质制备系统主管邓玮告诉记者。 　　上海设施自主设计和研发应用流程的这套系统，如同&ldquo 智能工厂&rdquo 一般，能独立完成一整套从分子生物学到细胞生物学的全部实验操作。 　　&ldquo 集成化程度越高的自动化设备，出错的几率就越高。针对完全陌生的样品，我们这套系统的可靠性能达到70%，这已经是一个非常不错的结果了。&rdquo 雷鸣表示。 　　五线六站 透视蛋白质内部结构 　　蛋白质并不是由松散的氨基酸随机排列组合而成，每一种天然蛋白质都有自己特定的空间结构。结构决定着蛋白质的功能。 　　肌红蛋白是哺乳动物心肌和骨骼肌中贮存和分配氧的胞内蛋白质。1960年，英国科学家肯德鲁(John Kendrew)首次用X射线衍射法测定了来自抹香鲸的肌红蛋白的三级结构。这一发现，使他成为1962年诺贝尔化学奖的获得者之一。 　　大多数人都有医院照X光的体验，X射线衍射法相当于是给结晶后的蛋白质拍X光，拍出的是一幅蛋白质晶体原子尺度的三维结构图。 　　在建筑外观呈鹦鹉螺形状的上海光源里，有5条光束线和6个专用实验站(五线六站)用于蛋白质科学研究。五线六站包括4个X射线实验站和两个红外光谱实验站，它们构成了上海设施的蛋白质晶体结构分析系统和动态分析系统。 　　记者来到五线六站时，上海光源处在停光检修期，复合物晶体线站负责人秦文明正在进行设备调试，为第二天的复工做好准备。排成一长溜的设备间和操作间由厚重的屏蔽门把守，机器的轰鸣声给人置身工厂车间的感觉。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)副主任张荣光，是五线六站的负责人。2009年回国之前，他在美国阿贡国家实验室工作近20年。阿贡的APS(先进光子源)是世界上最先进的同步辐射中心之一，采用X射线衍射法在半小时内测定蛋白质晶体结构曾是阿贡的骄傲。在五线六站，这一时间被缩短为几分钟。 　　&ldquo 我们安装了先进的衍射仪和探测器，收集全套数据最快只需36秒，接着使用自建的软件系统，不到5分钟就能完成对数据的处理和分析，给出蛋白质的三维结构。&rdquo 张荣光表示，五线六站不仅配备了世界一流的硬件设施，在实验方法和自动化上也有了很大程度的改进和提升。 　　过去，科研人员带着蛋白质晶体样品来到线站做实验非常忙碌。因为不能确定收到的数据是否有用，针对同一个晶体样品，要反复不停收集多套数据，带回去做进一步分析。 　　&ldquo 现在很快就能看到结果，一次可以带上一批样品来线站做实验，节省了大量的时间和人力。我们的目标是，用户带到线站上来的是晶体，带回去的是蛋白质的结构。&rdquo 张荣光说道。 　　核磁共振拼搭蛋白质结构&ldquo 积木&rdquo 　　不是所有的蛋白质在纯化后都能顺利结晶。结晶了的蛋白质也可能由于晶体质量等原因，难以被X射线&ldquo 看清&rdquo 。此外，同步辐射产生的X射线能量很高，小一点的晶体在被它探测时有&ldquo 粉身碎骨&rdquo 的风险。 　　在晶体学力所不及的领域，同样借助X射线设立的生物小角线站能弥补一二。事实上，溶液状态下的蛋白质表现得更为&ldquo 动态&rdquo 和&ldquo 真实&rdquo 。小角线站负责人李娜介绍，小角散射技术能快速捕捉到溶液状态下蛋白质的瞬时结构。只需要秒量级，甚至毫秒量级的时间，就能看见两个分子是否形成复合物。 　　分辨率不高是小角散射的不足之处。张荣光进一步解释说，就像从远处看两个人的位置关系一样，能看清他们是靠在一起，但具体是手牵手，还是脚靠脚，就不得而知了。要在溶液状态下看清原子尺度的细节和运动，就要靠核磁系统了。 　　离开五线六站，记者来到了上海设施的核磁共振实验室。蓝色塑胶地板上，分布着5台白色圆柱状的&ldquo 大家伙&rdquo 。其中，体型最大的900兆核磁共振谱仪是目前国内在使用的最高场强的超导磁体设备之一。为了方便把样品放入仪器顶部，还专门搭建了高约四五米的扶梯。 　　和光束线站、电镜等设施的直接成像相比，核磁共振扫描得到的是&ldquo 间接&rdquo 信息&mdash &mdash 蛋白质分子里每2个氢原子之间的相对距离，据此勾勒出蛋白质的三维结构。对此，核磁系统技术主管刘志军打了个形象的比方：一个坐着的人，如果能测算出他的头、手、脚等部位两端的距离，就能画出他的大致轮廓。 　　&ldquo 也可以理解为，核磁共振扫描得到的是一盒子拼插积木，接下来的事情就是把积木一块块地搭建起来，难点就在于不知道这些积木分属于哪个部位，是头还是脚，需要先指认，再通过计算来还原成三维结构。&rdquo 刘志军说。 　　为了&ldquo 指认&rdquo 方便，刘志军和他的同事们正在构建一个大的数据库。理想状态是，核磁共振扫描溶液状态下的蛋白质后得到的实验信息，可以去数据库中进行对比，如果有类似的&ldquo 片段&rdquo ，就可判断出这块&ldquo 积木&rdquo 属于哪个部位，再进一步去还原。&ldquo 搭积木的效率高低，取决于已知信息的多少，还原蛋白质三维结构也是如此&rdquo 。 　　蛋白质研究为药物研发铺路 　　蛋白质(protein)的概念最早由瑞典化学家永斯· 雅各布· 贝采利乌斯在1838年提出。&ldquo protein&rdquo 源自希腊文&ldquo protos&rdquo ，意为&ldquo 第一的，首要的&rdquo 。其时，人们对于蛋白质在机体中的核心作用并不了解。 　　一直到上个世纪40年代，在美国的教科书里，蛋白质被认为都长着一副橄榄球的模样，为细胞提供黏稠度是它主要甚至唯一的功能。随着DNA(脱氧核糖核酸)双螺旋结构的提出和首个原子尺度的蛋白分子三维结构图的精准呈现，分子生物学时代的大幕开启，人们开始逐渐摸清蛋白质的&ldquo 长相&rdquo 和&ldquo 秉性&rdquo 。 　　细胞是生命体的基本单位。在构建细胞结构、生物催化、物质传输等方面，蛋白质发挥着重要的作用。生物体新陈代谢几乎离不开的催化剂&mdash &mdash 酶，绝大多数都是蛋白质。 　　然而，和DNA测序、基因组研究的耳熟能详相比，蛋白质研究似乎略显低调。事实上，蛋白质研究可视作基因研究的姊妹篇。雷鸣以肺癌为例说道，过去肺癌病人都用一种药物治疗，现在看来并不科学。尽管结果都表现为肺癌，但从分子尺度分析，发病机理千差万别。 　　上游致病的基因多种多样，不同基因组会产生数百种或数千种蛋白质组合，形成不同特质的癌细胞。每一种组合背后的原因也不尽相同，因为基因的表达方式错综复杂，同一个基因在不同条件、时期可能会起到完全不同的作用。如何找到精准的治疗靶点成为棘手的难题。 　　&ldquo 通过测序能知道多少种基因有病变，分析出主要矛盾是哪个，但基因检测只能用于诊断，给不了治疗的药物，下一步需要借助于蛋白质科学研究，为生物制药提供对症的&lsquo 靶点&rsquo 。在未来，精准医疗有望给每一种不同亚型的癌症患者提供有针对性的药物。&rdquo 雷鸣表示。

图为蛋白质科学研究(上海)设施核磁共振分析系统。 　　走近中国大科学工程 　　生活中的乌云总是不期而至。一位正值花季的美国女孩，突然被告知患上了一种非常难治的癌症。基因检测结果显示，她所患癌症的亚型发生率极低。 　　在患同一大类癌症的人群中，只有2%的人所患亚型和她一样。幸运的是，针对这一亚型恰好有一种特效药。经过不到3个月的治疗，她痊愈了。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)主任雷鸣用这个真实的案例，向科技日报记者生动阐释了精准医疗的未来图景。但并非所有的癌症患者都和那位女孩一样幸运。在人类通往精准医疗的道路上，蛋白质科学研究将扮演什么角色?身为国家大科学工程之一的蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称&ldquo 上海设施&rdquo )对推进蛋白质科学研究将起到怎样的作用? 　　为回答这些问题，科技日报记者近日走进国家蛋白质科学中心· 上海(筹)一探究竟。 　　不容小觑的&ldquo 仪器集群&rdquo 　　和以往走进的国家大科学工程相比，上海设施没能在视觉上给人造成强大冲击。 　　&ldquo 我们这里主要是一些体量相对较小的生命科学研究的仪器集群，以至于在立项之初，是否将上海设施列入大科学工程都存在争议。&rdquo 雷鸣说道。 　　可别小瞧这里的&ldquo 仪器集群&rdquo 。上海设施自2014年5月试运行以来，前来参观的10多位诺贝尔奖得主和其他国际知名专家对设备的先进性纷纷&ldquo 点赞&rdquo 。 　　雷鸣回忆道，十多年前，我国在蛋白质科学研究领域虽然已取得一批达到国际一流水平的研究成果，但整体上仍落后于国际先进水平。科研基础设施建设滞后，是制约蛋白质科学发展的关键因素。 　　在科学家们的不懈努力下，蛋白质科学研究设施国家重大科技基础设施项目于2008年被批准立项，成为我国生命科学领域第一个大科学工程项目。蛋白质科学研究设施分为上海和北京两部分，上海设施以建设蛋白质结构解析能力为主。 　　围绕从生物体的空间尺度和生命过程的时间尺度来研究蛋白质，上海设施构建了由规模化蛋白质制备系统、蛋白质晶体结构分析系统、核磁分析系统、集成化电镜分析系统、蛋白质动态分析系统、质谱分析系统、复合激光显微成像系统、分子影像系统和数据库与计算分析系统组成的9大技术系统，具备规模化蛋白质制备、多尺度结构分析、多层次动态研究、修饰与相互作用分析以及数据库与计算分析5大能力。 　　史蒂夫· 哈里森是雷鸣在哈佛大学读博士时的导师。参观上海设施后，史蒂夫感觉非常震撼，对雷鸣很年轻就有机会参与如此重大的项目表示赞赏和羡慕。收获羡慕之余，雷鸣多次被问道：&ldquo 在如此先进的科研平台上，你们能做出哪些世界一流的工作来?&rdquo 　　独一无二的蛋白质&ldquo 智能工厂&rdquo 　　每一个蛋白质就像一个人一样，有自己的脾气秉性。要把它研究透彻，需要时间。 　　上世纪六七十年代有句话叫&ldquo one protein，one career&rdquo ，意为一个教授一辈子只能研究透一个蛋白质。&ldquo 我主要研究端粒，从评上教授到现在，也只解析了数十个蛋白质的结构。&rdquo 雷鸣说道。 　　要摸清蛋白质的&ldquo 脾气&rdquo ，首先是要获取高纯度的蛋白质样品。想见到蛋白质的&ldquo 真身&rdquo ，就必须打破细胞。而细胞一旦被打破，里面90%的蛋白质就同时被破坏掉了，踪迹难觅。 　　找到目标蛋白质后，保存也是个难题。相对于&ldquo 皮实&rdquo 的基因，蛋白质要&ldquo 娇气&rdquo 得多。记载遗传信息的基因就像是张可以随意摆放的卡片，没有变性的担忧。蛋白质则不同，一旦温度、湿度、光线等环境因素发生变化，就会有变质的风险。 　　在传统的生物学实验室里，穿着白大褂的科研人员手持移液枪，往装有不同液体的瓶瓶罐罐里添加试剂是常见的场景。在上海设施的规模化蛋白质制备系统里，这一幕正在被自动化的机器操作所取代。 　　高通量克隆构建实验室的中心区域是一个用玻璃超净间封闭起来的自动化机械操作平台。操作台外有一台集成软件的计算机负责&ldquo 发号施令&rdquo 。科研人员启动预设程序后，白色的机械臂在平台的各个自动化仪器间来回挪动，轻巧地把一个个96孔板放置到指定的板位上。各个自动化仪器的板位分别可执行加液、振荡、离心、清洗等生物实验操作。 　　传统手工操作，一个人每天最多克隆十几个基因。眼前的这套自动化系统，一天可以克隆960个基因，生产效率相当于一个数百人规模的基因克隆企业。&ldquo 我们希望把自动化概念引入科研中，重复劳动让机器来做，科研人员可以有更多的时间去探索和思考真正的科学问题。&rdquo 规模化蛋白质制备系统主管邓玮告诉记者。 　　上海设施自主设计和研发应用流程的这套系统，如同&ldquo 智能工厂&rdquo 一般，能独立完成一整套从分子生物学到细胞生物学的全部实验操作。 　　&ldquo 集成化程度越高的自动化设备，出错的几率就越高。针对完全陌生的样品，我们这套系统的可靠性能达到70%，这已经是一个非常不错的结果了。&rdquo 雷鸣表示。 　　五线六站 透视蛋白质内部结构 　　蛋白质并不是由松散的氨基酸随机排列组合而成，每一种天然蛋白质都有自己特定的空间结构。结构决定着蛋白质的功能。 　　肌红蛋白是哺乳动物心肌和骨骼肌中贮存和分配氧的胞内蛋白质。1960年，英国科学家肯德鲁(John Kendrew)首次用X射线衍射法测定了来自抹香鲸的肌红蛋白的三级结构。这一发现，使他成为1962年诺贝尔化学奖的获得者之一。 　　大多数人都有医院照X光的体验，X射线衍射法相当于是给结晶后的蛋白质拍X光，拍出的是一幅蛋白质晶体原子尺度的三维结构图。 　　在建筑外观呈鹦鹉螺形状的上海光源里，有5条光束线和6个专用实验站(五线六站)用于蛋白质科学研究。五线六站包括4个X射线实验站和两个红外光谱实验站，它们构成了上海设施的蛋白质晶体结构分析系统和动态分析系统。 　　记者来到五线六站时，上海光源处在停光检修期，复合物晶体线站负责人秦文明正在进行设备调试，为第二天的复工做好准备。排成一长溜的设备间和操作间由厚重的屏蔽门把守，机器的轰鸣声给人置身工厂车间的感觉。 　　国家蛋白质科学中心· 上海(筹)副主任张荣光，是五线六站的负责人。2009年回国之前，他在美国阿贡国家实验室工作近20年。阿贡的APS(先进光子源)是世界上最先进的同步辐射中心之一，采用X射线衍射法在半小时内测定蛋白质晶体结构曾是阿贡的骄傲。在五线六站，这一时间被缩短为几分钟。 　　&ldquo 我们安装了先进的衍射仪和探测器，收集全套数据最快只需36秒，接着使用自建的软件系统，不到5分钟就能完成对数据的处理和分析，给出蛋白质的三维结构。&rdquo 张荣光表示，五线六站不仅配备了世界一流的硬件设施，在实验方法和自动化上也有了很大程度的改进和提升。 　　过去，科研人员带着蛋白质晶体样品来到线站做实验非常忙碌。因为不能确定收到的数据是否有用，针对同一个晶体样品，要反复不停收集多套数据，带回去做进一步分析。 　　&ldquo 现在很快就能看到结果，一次可以带上一批样品来线站做实验，节省了大量的时间和人力。我们的目标是，用户带到线站上来的是晶体，带回去的是蛋白质的结构。&rdquo 张荣光说道。 　　核磁共振拼搭蛋白质结构&ldquo 积木&rdquo 　　不是所有的蛋白质在纯化后都能顺利结晶。结晶了的蛋白质也可能由于晶体质量等原因，难以被X射线&ldquo 看清&rdquo 。此外，同步辐射产生的X射线能量很高，小一点的晶体在被它探测时有&ldquo 粉身碎骨&rdquo 的风险。 　　在晶体学力所不及的领域，同样借助X射线设立的生物小角线站能弥补一二。事实上，溶液状态下的蛋白质表现得更为&ldquo 动态&rdquo 和&ldquo 真实&rdquo 。小角线站负责人李娜介绍，小角散射技术能快速捕捉到溶液状态下蛋白质的瞬时结构。只需要秒量级，甚至毫秒量级的时间，就能看见两个分子是否形成复合物。 　　分辨率不高是小角散射的不足之处。张荣光进一步解释说，就像从远处看两个人的位置关系一样，能看清他们是靠在一起，但具体是手牵手，还是脚靠脚，就不得而知了。要在溶液状态下看清原子尺度的细节和运动，就要靠核磁系统了。 　　离开五线六站，记者来到了上海设施的核磁共振实验室。蓝色塑胶地板上，分布着5台白色圆柱状的&ldquo 大家伙&rdquo 。其中，体型最大的900兆核磁共振谱仪是目前国内在使用的最高场强的超导磁体设备之一。为了方便把样品放入仪器顶部，还专门搭建了高约四五米的扶梯。 　　和光束线站、电镜等设施的直接成像相比，核磁共振扫描得到的是&ldquo 间接&rdquo 信息&mdash &mdash 蛋白质分子里每2个氢原子之间的相对距离，据此勾勒出蛋白质的三维结构。对此，核磁系统技术主管刘志军打了个形象的比方：一个坐着的人，如果能测算出他的头、手、脚等部位两端的距离，就能画出他的大致轮廓。 　　&ldquo 也可以理解为，核磁共振扫描得到的是一盒子拼插积木，接下来的事情就是把积木一块块地搭建起来，难点就在于不知道这些积木分属于哪个部位，是头还是脚，需要先指认，再通过计算来还原成三维结构。&rdquo 刘志军说。 　　为了&ldquo 指认&rdquo 方便，刘志军和他的同事们正在构建一个大的数据库。理想状态是，核磁共振扫描溶液状态下的蛋白质后得到的实验信息，可以去数据库中进行对比，如果有类似的&ldquo 片段&rdquo ，就可判断出这块&ldquo 积木&rdquo 属于哪个部位，再进一步去还原。&ldquo 搭积木的效率高低，取决于已知信息的多少，还原蛋白质三维结构也是如此&rdquo 。 　　蛋白质研究为药物研发铺路 　　蛋白质(protein)的概念最早由瑞典化学家永斯· 雅各布· 贝采利乌斯在1838年提出。&ldquo protein&rdquo 源自希腊文&ldquo protos&rdquo ，意为&ldquo 第一的，首要的&rdquo 。其时，人们对于蛋白质在机体中的核心作用并不了解。 　　一直到上个世纪40年代，在美国的教科书里，蛋白质被认为都长着一副橄榄球的模样，为细胞提供黏稠度是它主要甚至唯一的功能。随着DNA(脱氧核糖核酸)双螺旋结构的提出和首个原子尺度的蛋白分子三维结构图的精准呈现，分子生物学时代的大幕开启，人们开始逐渐摸清蛋白质的&ldquo 长相&rdquo 和&ldquo 秉性&rdquo 。 　　细胞是生命体的基本单位。在构建细胞结构、生物催化、物质传输等方面，蛋白质发挥着重要的作用。生物体新陈代谢几乎离不开的催化剂&mdash &mdash 酶，绝大多数都是蛋白质。 　　然而，和DNA测序、基因组研究的耳熟能详相比，蛋白质研究似乎略显低调。事实上，蛋白质研究可视作基因研究的姊妹篇。雷鸣以肺癌为例说道，过去肺癌病人都用一种药物治疗，现在看来并不科学。尽管结果都表现为肺癌，但从分子尺度分析，发病机理千差万别。 　　上游致病的基因多种多样，不同基因组会产生数百种或数千种蛋白质组合，形成不同特质的癌细胞。每一种组合背后的原因也不尽相同，因为基因的表达方式错综复杂，同一个基因在不同条件、时期可能会起到完全不同的作用。如何找到精准的治疗靶点成为棘手的难题。 　　&ldquo 通过测序能知道多少种基因有病变，分析出主要矛盾是哪个，但基因检测只能用于诊断，给不了治疗的药物，下一步需要借助于蛋白质科学研究，为生物制药提供对症的&lsquo 靶点&rsquo 。在未来，精准医疗有望给每一种不同亚型的癌症患者提供有针对性的药物。&rdquo 雷鸣表示。(原标题：探秘蛋白质的&ldquo 前世今生&rdquo &mdash &mdash 国家蛋白质科学中心· 上海(筹)印象)

p style=" text-indent: 2em " 6月18日，仪器信息网主办的“蛋白质组学研究技术与方法进展”主题网络研讨会成功召开，会议为期半天，共吸引近700人报名参会。会议现场，网友纷纷积极提问，与在线专家形成良好的互动氛围。 br/ /p p style=" text-indent: 2em " 为方便更多从事蛋白质组学研究的科研人员学习相关技术，现特将会议内容剪辑整理，点击 strong 报告题目 /strong 或 strong 报告图片 /strong 即可进入视频页面。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112929.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/13b79024-5ab6-46a9-ba61-aa729fa12726.jpg" title=" 1.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 1.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：邓海腾(清华大学 ) /p p style=" text-align: center " 报告题目：《 a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112929.html" target=" _blank" 功能蛋白质组学技术的进展和挑战》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 随着质谱技术的发展，高通量地检测细胞、体液和组织中的蛋白表达谱已经成为常规分析，蛋白质组学的研究重心开始从揭示蛋白的表达水平转移到蛋白的生物学功能研究上。在本次讲座中，我将和大家一起探讨常用的功能蛋白质组学方法和在分子生物学研究中的应用，以及功能蛋白质组学分析面临的挑战。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112930.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/e6517efa-7c9c-4df5-8b90-784a1ff0e53d.jpg" title=" 2.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 2.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：申华莉(复旦大学 )& nbsp & nbsp & nbsp /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112930.html" target=" _blank" 《拟靶向质谱定量技术用于大规模生物标志物筛选》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 血液包含了人体各器官实时的生理病理状态信息，是最理想的检测目标样本。目前的血清标志物研究方法通量小、效率低，导致血清标志物发现少，向临床转化效率低。我们利用MRM技术的特点实现血清中标志物的高灵敏、高精确定量，并通过时间窗口的设置大幅度提高MRM检测的通量。这一策略可以实现高灵敏、高通量的血清标志物筛选。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112932.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/3ecece59-eff5-4527-b974-047f2710ee1a.jpg" title=" 3.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 3.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：田瑞军(南方科技大学 ) /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112932.html" target=" _blank" 《基于生物质谱技术的动态蛋白质复合物分析及生物医学应用》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 蛋白质复合物是介导细胞微环境信号转导网络的关键分子机制，一般都经历一个由细胞间、细胞膜、细胞质到细胞核的“链条式”激活和动态组装的过程。目前针对细胞信号转导的蛋白质组学研究大多集中于对蛋白质表达量及其翻译后修饰的分析，仅能阐述通路节点的变化，无法诠释信号蛋白的动态组装和信号传递过程。本团队致力于开发基于生物质谱技术的蛋白质组学新方法和新技术，并专注于其在动态蛋白质复合物及肿瘤微环境信号转导研究方面的应用。最近，我们设计合成出一种具有酪氨酸磷酸化识别蛋白结构域SH2、光交联基团和富集基团的化学生物三功能亲和探针，实现了对疏水性动态受体膜蛋白复合物及相关药物靶点蛋白的高效富集和质谱精准鉴定；发展了样品前处理新技术SISPROT，实现了微纳克级别亲和富集样品前处理的集成化和通量化操作，并实现了受体膜蛋白相关复合物分钟级别动态变化规律的高准确度定量表征；发展了通用的受体膜蛋白复合物多维度协同富集和蛋白质组学分析方法，并成功地用于胰腺癌肿瘤微环境受体膜蛋白复合物的规模化发现。上述研究发现并验证了胰腺癌的新药靶点和疾病标志物白血病抑制因子LIF，并促成了首个针对胰腺癌的anti-LIF抗体药物的美国一期临床试验。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112935.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/79709921-762a-47fe-b158-b7195b607ca9.jpg" title=" 4.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 4.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：陆豪杰(复旦大学 )& nbsp & nbsp & nbsp /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112935.html" target=" _blank" 《定量蛋白质翻译后修饰组学》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 对蛋白质翻译后修饰的定量分析可以帮助我们了解和调控生命过程。蛋白质翻译后修饰使蛋白功能多样以满足复杂的生命过程，同时使得蛋白质的结构复杂。基于生物质谱的组学技术，极大推动翻译后修饰的规模化定量分析。我们发展了一系列方法用于蛋白质后修饰组的定量研究，包括蛋白质的糖基化、泛素化、棕榈酰化、4-羟基壬烯醛（HNE）修饰以及蛋白质的N/C末端。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112933.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/b27ac34d-5153-4f1c-9d16-8a679f98d718.jpg" title=" 6.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 6.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：隋欣煜(安捷伦) /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112933.html" target=" _blank" 《安捷伦蛋白组学样品前处理自动化解决方案》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " AssayMAP Bravo生物样品前处理工作站，由96通道的注射器式移液头、微量色谱小柱、功能全面的工作站台面和为生物制药专家量身定制的操作软件组成，利用自动化操作来减少人为实验操作带来的误差，提升实验结果的稳定性，减少污染的可能性，同时利用自动化精准的时间控制和操作，来优化实验流程，提高实验室运行效率，同时适应未来趋势，节省时间和体力让实验人员从事更加有深度的分析和探索职能。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " ●AssayMAP Bravo仪器功能介绍； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " ●AssayMAP Bravo实验的稳定结果； /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " ●AssayMAP Bravo在蛋白组学前处理的应用和文献解读； /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112931.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/9d190992-caea-4b22-afb1-1f04a98f1095.jpg" title=" 5.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 5.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：陈宁(布鲁克· 道尔顿) /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112931.html" target=" _blank" 《布鲁克4D-Proteomics& #8482 研究方案及dia-PASEF@、prm-PASEF@最新技术进展》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 随着分析技术的不断发展，高分辨率质谱已成为蛋白质组学研究的核心仪器。由于生物样本的高复杂性和宽动态范围，蛋白质组学的深度研究仍面临极大挑战。捕集型离子淌度的引入，带领着传统蛋白质组学进入了4D新时代，带来了鉴定深度、定量准确性、扫描速度、仪器稳定性等性能的全面提升。本次报告将主要介绍4D-ProteomicsTM研究方案，以及dia-PASEF& reg 、prm-PASEF& reg 技术进展。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112934.html" target=" _blank" img style=" width: 550px height: 413px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/074d05d3-7121-4343-adc9-0205390abdb5.jpg" title=" 7.jpg" width=" 550" height=" 413" border=" 0" vspace=" 0" alt=" 7.jpg" / /a /p p style=" text-align: center " 报告嘉宾：周岳(赛默飞 ) /p p style=" text-align: center " 报告题目： a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_112934.html" target=" _blank" 《突破蛋白质组学分析的极限——赛默飞蛋白质组学技术最新进展》 /a /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em text-indent: 2em " 赛默飞近几年在蛋白质组学领域开发了多种新技术来突破蛋白质组分析的极限。FAIMS Pro离子淌度可以接在Orbitrap质谱的前端选择特定的离子进入质谱，提高了蛋白质组学的覆盖度和定量准确性，同时也提高了质谱的稳定性。Orbitrap Eclipse独有的实时检索算法（RTS）使TMT定量的覆盖度和准确度可以兼得，加上TMT 16plex标记试剂的推出，使得TMT定量具有更高的通量。靶标定量一直是蛋白质组学的最后一环也是最关键的一环，基于Orbitrap质谱的独有SureQuant定量方法可以在很短的梯度内绝对定量500多个蛋白，同时不需要太多方法优化，该方法可以很快地在实验室间进行方法转移。 /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 点击链接，观看全部“蛋白质组学研究技术与方法进展”网络会议视频：& nbsp a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/Video/Video/Collection/10572" target=" _blank" https://www.instrument.com.cn/webinar/Video/Video/Collection/10572 /a /p

我国生命科学领域第一个综合性的国家级重大科技基础设施&mdash &mdash 蛋白质科学研究(上海)设施日前通过工艺测试，进入开放试运行阶段，预计于今年年底正式面向多用户、多领域开放。25日，记者走进基本建成的国家蛋白质研究中心，见识了国际一流的研究设施和紧锣密鼓开展科研的研究团队: 　　高通量自动化克隆构建系统，中心自主设计了五套大型自动化装置，将软件控制、硬件设备和生物应用结合在一起，实现了整个大规模蛋白表达过程的自动化(包括克隆、蛋白表达和纯化)，达到全球生物自动化一流水平，从传统手工一人次一天10个基因克隆提升到一天1000个基因克隆，极大地提高了生物实验效率。 　　自主研发高精度激光双光镊系统，光镊采用激光辐射压对微米级粒子进行捕获，并通过高精度的测量技术实现压纳米级位移和压皮牛级力的测量。这些技术有望在蛋白质折叠、RNA聚合酶合等研究领域提供单分子层次的信息。在仪器研发方面，为拓展仪器性能，还将结合单分子荧光技术和高精度激光光镊，有望提升蛋白质科学领域的仪器自主研发能力。 　　尽管仍处于紧张建设筹备中，科研活动早已紧锣密鼓地开展。截至2013年底，中心科研项目共计31项，年度新增13项，其中包括国家重大科学研究计划项目2项、中科院科研装备研制项目1项以及国家自然科学基金多项。中心成立伊始，许琛琦研究组即在阐明人体免疫机制方面取得突破性进展，首次证明钙离子能够改变脂分子功能来帮助T淋巴细胞活化，提高T淋巴细胞对外来抗原的敏感性，从而帮助机体清除病原体。周界文研究组在研究重要离子通道蛋白p7的精细空间结构以及p7与抑制剂金刚烷胺类药物相互作用的分子机理方面也取得重大突破，相关研究成果将大大推动新一代抗丙型肝炎病毒治疗手段的研发。周兆才研究组研究发现原癌蛋白质YAP的一个天然拮抗剂蛋白&mdash &mdash VGLL4，并在蛋白质晶体结构解析的基础上发展出一个针对YAP的多肽类抑制剂，为以胃癌为代表的肿瘤治疗提供了新的策略和途径。雷鸣、张荣光研究组的研究论文首次在原子水平上解析了端粒酶的结构，第一次从原子层面对脊椎动物端粒酶复合物中蛋白质-RNA的相互作用进行了描述。 　　国家蛋白质科学中心上海(筹)在保障上海设施高效运行的同时，定位于蛋白质科学研究，研究内容涵盖染色质结构与功能的调控、跨膜分子信息传递、非编码RNA以及结构生物学新技术和方法研究等学科领域，着重开展蛋白质多尺度结构分析、蛋白质动态结构研究、蛋白质修饰与相互作用研究、设备自主创新与集成研究和生物信息学与计算生物学等五大领域的研究。在未来的科学研究中，国家蛋白质科学中心/上海(筹)/蛋白质科学研究(上海)设施将围绕蛋白质科学研究的前沿领域和我国生物医药、农业等产业发展需求，保障国家中长期科技规划纲要部署的蛋白质重大研究计划的实施，建设高通量、高精度、规模化的蛋白质制取与纯化、结构分析、功能研究等大型装置，实现技术与设备的集成化、通量化和信息化，提供全面和完整的技术与条件保障，打造开放、协作、创新的国际一流蛋白质科学研究平台，为我国的蛋白质科学基础研究提供强有力的支撑。 　　背景介绍 　　蛋白质科学研究(上海)设施于2010年12月破土动工，总投资约7亿元，总建筑面积3.3万平方米，由中科院上海生科院承建，并依托上海设施同步筹建&ldquo 国家蛋白质科学中心· 上海&rdquo 。迄今，已有逾10位诺贝尔奖得主到访，对蛋白质中心表现出浓厚兴趣。

蛋白质是生命的物质基础，通过与不同生物分子间的相互作用在生物体内执行着各项重要工作，其功能与结构直接相关。因此，解析蛋白质及其复合物高阶结构对于深入理解蛋白质功能、生理现象及药物研发具有重要意义。过去的60余年，随着X-射线晶体衍射(X-ray)、核磁共振(NMR)以及冷冻电镜(cryoEM)等技术的出现和不断发展，蛋白质结构解析取得了长足发展。然而，如何在分析蛋白质时使其保持近似自然生理环境的非变性状态，对其动态、异质性、相互作用等属性的研究是结构生物学领域的热点和难点。　　质谱技术的不断发展使其在蛋白质结构表征领域发挥了越来越重要的作用。非变性质谱(native MS)兴起于20世纪90年代，是一种可以分析蛋白高阶结构的生物质谱方法。与传统的破坏蛋白质立体结构和弱相互作用力的方法不同，非变性质谱采用质谱兼容的近生理pH值的溶液体系(主要为醋酸铵)和更温和的电离方式，使生物大分子在气相中能够最大程度地保持自然折叠状态、非共价相互作用和相关的生物学功能。因此，非变性质谱可以提供分子质量、寡聚态、构象(折叠vs 去折叠)、异质性、配体结合、靶蛋白-小分子亲和力以及复合物中蛋白亚基的相互作用网络关系等更具生物学意义的重要信息，为蛋白质“序列-结构-功能”关系提供分子基础，已成为结构生物学不可或缺的互补工具,在生物制药、蛋白一配体、蛋白一蛋白复合物结构分析等诸多领域具有广泛应用。　　近年来,蛋白质结构研究领域经历着剧烈的技术迭代。2021年人工智能(AI) AlphaFol2横空出世,将蛋白质3D结构预测的精度从60%提升到90%以上,在给传统结构解析技术带来冲击的同时,也为结构质谱的发展提供了契机。　　未来,非变性质谱技术的发展需要简化样品处理,提升仪器的灵敏度、分析通量和鲁棒性,实现内源性蛋白复合物样本的直接或原位分析,推动其在生物医药表征、蛋白多聚态等领域的更广泛应用。非变性质谱技术与离子消度(MS)、自上而下串联解离(top-down)、电荷检测质谱(CDMsS)等创新联用技术和方法的不断开发及完善,将极大地提升结构信息的广度、丰富度及精确度,补充生物物理学方法缺失的结构信息。同时,非变性质谱与cryoEM1、氢完交换质谱(HDX-MS)、交联质谱等技术联用将更加常态化,这些实验数据与AI结构预测算法的进一步整合将有效解决蛋白及蛋白复合物结构预测存在的精度问题,推动结构生物学发展,助力新药研发。　　此外,非变性质谱技术的应用发展将更加关注:1)蛋白复合物结构一功能关系的研究,通过与计算机模拟(MD)、HDX-Ms、cryoEM等技术联用,揭示标志物蛋白在人类疾病发展过程中的作用,推动靶向药物设计和精淮医疗 2)通过研究小分子与靶蛋白的相互作用获取二者结合的亲和力信息,加速靶向药物筛选 3)翻译后修饰(PTMS)、突变等因素导致的蛋白高度异质性及其对蛋白或亚基折叠动力学、构象及构象变化、结合计量比等造成的结构和功能影响 4)蛋白与其他生物分子(配体、DNAA/RNA、金属离子等)之间的相互作用。　　李惠琳，中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物大分子质谱新技术的开发及应用，其研究主要侧重于1)开发整合结构质谱技术，并对蛋白质机器结构、功能和动态变化及靶向药物作用分子机制进行深入研究2)开发middle-down/top-down蛋白质组学技术，探索蛋白翻译后修饰在生命过程中的调控机制。承担国家自然科学基金项目3项，荣获美国质谱学会颁发的Postdoctoral Career Development Award (2014) ，入选珠江人才计划(青年拔尖人才，2019)，其研究成果发表在Nature Chemistry, Analytical Chemistry, J. Am.Soc.Mass Spectrom.等杂志。　　"非变性质谱技术研究与应用"专栏共收录7篇论文,既介绍了非变性质谱技术的样品制备、离子源、质量分析器、联用技术等基础内容,也涵括了样品提取、样品引入、离子化及电荷操控等方式,以及在蛋白结构及构象解析、蛋白・蛋白相互作用等领域的应用,代表了国内非变性质谱技术的发展现状。希望本专栏能成为《质谱学报》广大读者颇有价值的科技文献,同时也希望更多的学者加入到非变性质谱研究领域,推动我国结构质谱技术的创新发展。

从中国科学院大连物理研究所官网了解到，近日，中国科学院大连化学物理研究所研究员王方军团队在蛋白质复合物形成和干预机制分析新方法研究方面取得进展，通过溶液状态蛋白质赖氨酸两步稳定同位素标记和定量蛋白质组学分析，实现对蛋白—蛋白识别关键位点区域的精确探测，并可评估小分子对蛋白质复合物的构象识别干预情况。蛋白质的结构和相互作用决定了其生物学功能，目前对溶液状态蛋白—蛋白识别和结构动态变化研究仍然缺乏高灵敏度的分析方法。此前，研究团队发现蛋白质上赖氨酸的原位标记反应性与其所处微观结构中的氢键、静电相互作用强度密切相关；提出以蛋白质上所有赖氨酸位点为内源性反应探针，通过定量赖氨酸在蛋白—蛋白，蛋白—小分子结合前后的标记反应性变化，精确探测蛋白质识别过程中的关键区域。为进一步提高赖氨酸反应性定量分析的通量和灵敏度，该团队进一步发展了溶液状态蛋白质“活性—变性”赖氨酸两步稳定同位素标记定量策略（TILLRP），系统研究了重组SARS-CoV-2 S1蛋白质和人体ACE2受体之间的相互作用情况；发现S1蛋白质RBD Lys386-Lys462区域的赖氨酸位点在S1-ACE2复合物形成前后标记反应性发生了显著改变；提出可以利用该区域赖氨酸的标记反应性调控水平评估小分子活性物质对S1-ACE2识别的干预情况，可能有助于相关治疗药物分子的研发。该研究结果发表在《化学科学》（Chemical Science）上。上述研究工作得到国家自然科学基金、大连化物所创新基金等项目的资助。王方军简介：中国科学院大连化学物理研究所分析化学博士，师从邹汉法研究员，博士生导师，主要研究方向为复杂生物样品高效分离表征：激光-质谱高灵敏度分析、生物分子高校标记与功能解析、翻译后修饰蛋白组学分析。担任中国蛋白质组学专业委员会理事、中国分析测试协会青年学术委员会委员。

蛋白质印迹实验具体操作步骤 蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 偶联抗免疫球蛋白抗体 结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。 【蛋白质印迹实验所需试剂】 1.IgG 标准品 2.羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体 3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。 4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5,然后补加三蒸水至1000ml. 5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul. 6.封闭液：5%脱脂奶粉。 7.抗体buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS. 8.显色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10 &mu l（临用时现配）。 9.脱色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸馏 水至1000ml. 10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸 过滤。 【蛋白质印迹实验操作步骤】 一、样品的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。 二、转移印迹 1.转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏 水中 10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min . 2.凝胶平衡：将电泳后的SDS -PAGE胶板置于转移buffer 中平衡 30-60min. 3.按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4.开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流 0.8mA/cm,室温下转移1h,转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脱色检测转移效果。 三、免疫染色 1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2.TBS洗膜1-2次，10min/次。 3.加HRP标记的抗体，室温1h . 4.TBS 洗3次，10min/次。 5.NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。

蛋白质是生命的物质基础，每个蛋白质的氨基酸链扭曲、折叠、缠绕成复杂的结构，想要破解这种结构通常需要花很长的时间，甚至难以完成。截至目前，约有10万个蛋白质的结构已经用实验方法得到了解析，但这在已经测序的数10亿计的蛋白质中只占了很小一部分。　　但“看清”蛋白的结构和人类的很多疾病机理、药物研发等等息息相关。在蛋白质结构解析的几十年历史中，X射线晶体学、核磁共振波谱学(NMR)、冷冻电镜(Cryo-SEM)技术纷纷发挥了巨大的贡献，但这些技术在科学界看来，都有着劳心劳力又价格高昂的缺点。　　如何简单地通过蛋白质的氨基酸序列来预测其形状?如何能解答这一问题，了解生命运作方式的将打开截然不同的一扇窗。这种设想提出的50多年后，谷歌旗下人工智能公司DeepMind在去年12月的国际蛋白质结构预测竞赛CASP上投下重磅，他们开发的基于神经网络的新模型AlphaFold2击败了其他选手，在预测准确性方面达到接近人类实验结果，让整个结构生物学界震惊。北京时间7月15日，DeepMind团队在顶级学术期刊《自然》(Nature)以“加快评审文章”(Accelerated Article Preview)形式在线发表了一篇题为“Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold”的论文，全面详述了半年前造成轰动的这一模型，并首次对外分享开源代码。该论文于今年5月11日提交，7月12日被接收。　　DeepMind团队提供了一份声明，公司创始人兼首席执行官Demis Hassabis在声明中表示，去年在CASP14大会上我们揭晓了一个可以将蛋白质3D结构预测精确到原子水平的全新AlphaFold系统，此后我们承诺会分享我们的方法，并为科学共同体提供广泛、免费的获取途径。　　“今天我们迈出了承诺的第一步，在《自然》期刊上分享AlphaFold的开源代码，并发表了系统的完整方法论，详尽细致说明AlphaFold是如何做到精确预测蛋白质3D结构的。作为一家致力于推动科学进步的公司，我们期待看到我们的方法将为科学界启发出什么其他新的研究方法，也期待很快能和大家分享更多我们的新进展。”Hassabis表示。值得一提的是，就在同一天，另一顶级期刊《科学》(Science)也在线发表了另一预测蛋白质结构的研究文章，题为“Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network”。　　来自华盛顿大学、哈佛大学、德克萨斯大学西南医学中心等团队的研究人员开发了新的深度学习工具RoseTTAFold，其拥有媲美AlphaFold2的蛋白质结构预测超高准确度，而且更快、所需计算机处理能力更低。同样，研究团队也对外分享了开源代码。该论文提交于6月7日，7月7日被接收。　　清华大学生命科学学院院长、高精尖中心执行主任王宏伟表示，“高质量结构预测的源代码开放对整个科学界尤其是结构生物学领域的促进作用必然是巨大的。”他评价道，对于DeepMind这样一家商业公司来说，“团队愿意向公众分享代码，是一个新型科研范式的突破，将整体上有利于人类更好地探索未知。”　　预测蛋白质结构，接近实验室测量　　50多年前，科学家们就设想用计算机预测蛋白质结构。近年来，共同演化、接触图预测、深度机器学习等技术的引入，一些实验室的算法精度有了很大程度的提高。　　曾经开发出Alphago、战胜人类顶尖棋手的DeepMind团队是其中的佼佼者，其团队的强大和资源雄厚是一般实验室无法企及的。2020年12月1日，他们在生物领域展现出实力，在两年一度的权威蛋白质结构预测评估竞赛(CASP)中用AlphaFold2击败其他参赛团队。　　CASP是由马里兰大学John Moult教授等人于1994年组织。竞赛使用的是最新解决且尚未在蛋白质数据库(PDB)中存放或公开披露的结构，结构生物学家们利用X射线晶体学、核磁共振波谱学、冷冻电镜的方法，把这些蛋白质的结构解析出来。做蛋白质结构预测的团队则利用计算机程序来预测它们的结构。最后由独立的科学家团队则把计算机预测的模型和实验室的结构对照，分析不同计算机算法的预测结果。这是一种“双盲”测试，长期以来一直是评价结构预测准确性的金标准。　　去年的CASP14共有84个常规题目，其中有14题因为生物实验没给出确定结构等原因被取消或延缓，其他70个题目的单体和复合物蛋白质所含有的氨基酸个数从73到2180不等。　　19个国家的215个小组参加了CASP14。DeepMind公司的AlphaFold2预测的大部分结构达到了空前的准确度，不仅与实验方法不相上下，还远超解析新蛋白质结构的其他方法。将实验方法得到的蛋白质结构叠加在AlphaFold2的结构上，组成蛋白质主链骨架的叠加原子之间的距离中位数(95%的覆盖率)为0.96埃(0.096纳米)。成绩排第二的方法只能达到2.8埃的准确度。　　AlphaFold2的神经网络能在几分钟内预测出一个典型蛋白质的结构，还能预测较大蛋白质(比如一个含有2180个氨基酸、无同源结构的蛋白质)的结构。该模型能根据每个氨基酸对其预测可靠性进行精确预估，方便研究人员使用其预测结果。　　AlphaFold2最终被Moult评价道，“在某种意义上，问题已经解决了”。　　值得一提的是，在最新发布的论文中，DeepMind还简化了AlphaFold2。AlphaFold的首席研究员John Jumper说，“这个网络需要几天的计算时间来生成CASP的一些蛋白质的结构，而开源版本的速度要快16倍。根据蛋白质的大小，它可以在几分钟到几小时内生成结构。”　　受AlphaFold2的启发，华盛顿大学医学院生物化学家、蛋白质设计研究所所长David Baker等人开发了RoseTTaFold。华盛顿大学医学院官网对该研究的介绍称，在高精度的蛋白质结构预测方面，Baker等人“在很大程度上重现了DeepMind团队的表现。”　　相较于AlphaFold2只解决了单个蛋白质的结构，RoseTTaFold不仅适用于简单的蛋白质，也适用于蛋白质复合物。据介绍，RoseTTaFold利用深度学习技术，根据有限信息准确、快速地预测蛋白质结构。从结构上来看，RoseTTAFold 是一个三轨(three-track)神经网络，它可以兼顾蛋白质序列的模式、氨基酸如何相互作用以及蛋白质可能的三维结构。在这种结构中，一维、二维、三维信息来回流动，使得网络能够集中推理蛋白质的化学部分与它的折叠结构。巴塞尔大学的计算结构生物学家Torsten Schwede对《科学》杂志说，许多生物功能依赖于蛋白质之间的相互作用。“直接从序列信息中处理蛋白质-蛋白质复合物的能力使其对生物医学研究中的许多问题极具吸引力。”　　Baker同时坦言，AlphaFold2的结构更加准确。但是根特大学的结构生物学家Savvas Savvides说，Bake实验室的方法更好地捕捉到了“蛋白质结构的本质和特性”，比如识别从蛋白质侧面伸出的原子串，这些特征是蛋白质之间相互作用的关键。　　纽约大学医学院的细胞和结构生物学家Gira Bhabha说，两种方法都很有效。她表示，“DeepMind和Baker实验室的进展都是惊人的，将改变我们利用蛋白质结构预测推进生物学的方式。”　　开源代码，如何促进整个科学界?　　相比于去年年底带来的震撼，这次外界更感兴趣的是上述两支团队开源代码这一动作。　　此前的6月中旬，在Baker实验室发布RoseTTAFold预印本三天之后，DeepMind的Hassabis在推特上表示，AlphaFold2的细节正在接受一份出版物的审查，公司将“为科学界提供广泛的免费访问”。　　而从6月1日开始，Baker等人已经开始挑战他们的方法，让研究人员发送来他们最令人困惑的蛋白质序列。加州大学旧金山分校的结构生物物理学家David Agard的研究小组发送了一组没有已知类似蛋白质的氨基酸序列，几个小时内，他的团队就得到了一个蛋白质模型，“这可能为我们节省了一年的工作。”Agard说。　　除了免费提供RoseTTaFold的代码外，Baker团队还建立了一个服务器，研究人员可以插入蛋白质序列并得到预测的结构。贝克说，自从上个月推出以来，该服务器已经预测了大约500人提交的5000多种蛋白质的结构。　　不过，上述两支团队的源代码都是免费的，但也有观点认为，对于没有技术专长的研究人员来说，它可能还不是特别有用。不过，DeepMind的科学人工智能负责人Pushmeet Kohli表示，DeepMind已经与一些选定的研究人员和组织合作，以预测特定的目标，其中包括总部位于瑞士日内瓦的非营利组织“Drugs for ignored Diseases”。“在这个领域，我们还有很多想做的事情。”　　Hassabis提到，去年在CASP14大会上我们揭晓了一个可以将蛋白质3D结构预测精确到原子水平的全新AlphaFold系统，此后我们承诺会分享我们的方法，并为科学共同体提供广泛、免费的获取途径。“今天我们迈出了承诺的第一步，在《自然》期刊上分享AlphaFold的开源代码，并发表了系统的完整方法论，详尽细致说明AlphaFold是如何做到精确预测蛋白质3D结构的。作为一家致力于推动科学进步的公司，我们期待看到我们的方法将为科学界启发出什么其他新的研究方法，也期待很快能和大家分享更多我们的新进展。”　　DeepMind团队认为，这一精准的预测算法可以让蛋白质结构解析技术跟上基因组革命的发展步伐。　　Baker团队也提到，“我们希望这个新工具将继续造福整个研究界。”　　中国科学院合肥物质科学研究院强磁场科学中心研究员谢灿对澎湃新闻(www.thepaper.cn)记者表示，“总的来说，对学术界来肯定是好事，肯定会促进结构生物学和相关领域的发展。在承认学术贡献的基础上的开放和共享，本来就应该是学术研究最基本的要求。”　　结构生物学是谢灿的“老本行”，“我当年花了8年的时间去解析一个蛋白的晶体结构，我能切身体会如果有一个精准预测蛋白结构的算法出现，对结构生物学家意味着什么。”　　但他认为，不必要担忧这些算法的出现会让结构生物学家失业，在技术迭代之下，结构生物学这些年受到的冲击太多了，“而事实上，只不过是某一个领域某一个技术在某一个历史阶段更容易出工作出成绩。”谢灿认为，无论再精准的预测，终究也只是预测，“AlphaFold2不是实验，同样也需要实验去证实。”　　王宏伟在AlphaFold2刚出现之时也曾评价道，对于复杂的结构生物学问题，预测手段本身还不能号称完全解决了问题。实验结构生物学领域接下来需要做的一个事情是要拥抱变化，更好地与预测方法结合以及共同发展。

p style=" text-align: justify " 　　近日俄亥俄州立大学化学和生物化学系的 span style=" font-family: times new roman " VickiH. Wysocki /span 教授课题组在AC上发表了一篇文章，题目为 span style=" font-family: times new roman " Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer /span 。 /p p style=" text-align: justify " 　　获取蛋白质复合物的四级结构信息，对于理解其生物功能来说至关重要。与传统的CID/HCD通过多次碰撞沉积能量以实现解离相比， strong 表面诱导解离 /strong ( span style=" font-family: times new roman " Surface induceddissociation，SID /span )是通过使复合物离子撞击一个具有化学惰性、刚性的表面，经过单次高能撞击后，产生相比于CID和HCD技术电荷更均匀分布的蛋白亚基(如图1)，从而提供化学计量比和互作网络等信息。此外，相比于CID常常导致小分子配体丢失，SID可以产生保留小分子配体的复合物亚基。 /p p style=" text-align: justify " 　　& nbsp /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 253" title=" SID.webp.jpg" style=" width: 600px height: 253px " alt=" SID.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/671db102-c3a5-4bc3-ad7d-5e07248fc1a3.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　图1. SID示意图 /p p style=" text-align: justify " 　　目前，SID技术在蛋白复合物方面的工作主要是在飞行时间质谱( span style=" font-family: times new roman " TOF MS /span )上完成，但随着蛋白复合物的分子量越来越大，结构解析深度越来越深入，对质谱仪器的分辨率也提出了更高的要求。每一种类型的质量分析器( span style=" font-family: times new roman " TOF、FTICR或者Orbitrap /span )都有它们的优劣势，而仪器的选择主要依赖于待解决的问题本质。为此，Vicki H. Wysocki课题组与赛默飞公司Alexander A. Makarov博士合作， strong 首次将SID解离源装配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap仪器上 /strong (如图2)。这套SID即可用来传输离子又可用来进行SID。值得一提的是，SID装置并未影响离子进入HCD池和一级质谱分析。 /p p style=" text-align: center " img title=" EMR-orbitrap.jpg" alt=" EMR-orbitrap.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/97acf2a9-f158-474e-bef1-ca2f3c2deea8.jpg" / /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 498" title=" 2.webp.jpg" style=" width: 600px height: 498px " alt=" 2.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/7c134afb-82fa-472e-8848-062123d511f0.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图2. a)SID装置3D设计图，b)SID模式下离子轨迹图，c)SID改造后EMR Orbitrap仪器图。 /p p style=" text-align: justify " 　　随后，作者 strong 利用该仪器对Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白复合物进行了质谱分析 /strong 。其中，前者是具有D2对称性的同源四聚体，后者是具有D3对称性的同源六聚体。图3为Streptavidin的一级谱及其SID谱图。先前的文献表明，通过CID主要产生的是streptavidin复合物的去折叠单聚体和三聚体，但这一结果显然不能支持streptavidin是由同源二聚体组成的结构。而11+的母体streptavidin复合物经过SID会解离成两个二聚体，分别为5+和6+，证明SID更能反映他们真实的拓扑结构(图3a-c)。值得一提的是，之前对于谱图中出现的3+单聚体和6+同源二聚体，由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能进行分辨3，但现在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接对它们二者进行分辨(图3d)，甚至盐加和离子或者N末端Met修饰与否都可以在高分辨谱图中完全获得(图3e)。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 466" title=" 3.webp.jpg" style=" width: 600px height: 466px " alt=" 3.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/335862ab-316e-4d66-8193-777c95b0aa48.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图3. a)Streptavidin四聚体拓扑结构(PDB ID：1SWB)，b)Streptavidin四聚体一级质谱图，c)11+价态Streptavidin四聚体的SID谱图( span style=" font-family: times new roman " 45 V，495 eV /span )，d)高分辨率模式下3+价态Streptavidin单聚体和6+价态的二聚体，e)3+价态单聚体和6+价态二聚体的N末端蛋氨酸修饰和Na离子加和谱图。 /p p style=" text-align: justify " 　　此外，作者还考察了 span style=" font-family: times new roman " L-Glutamate Dehydrogenase /span 同源六聚体的拓扑结构。HCD结果表明，该六聚体很难在气相中发生解离，需要较高HCD能量和高电荷态，常常导致先失去一个去折叠单体，无法真实反映亚基组成。而通过SID可以获得比较稳定的三聚体信号，反映出 span style=" font-family: times new roman " L-GlutamateDehydrogenase /span 同源六聚体的拓扑结构主要为三聚体-三聚体界面，在低能量下主要断裂较弱的三聚体界面(图4a)，当能量逐渐升高单体会从三聚体亚基中解离出来(图4b)。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 461" title=" 4.webp.jpg" style=" width: 600px height: 461px " alt=" 4.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/f1e97f6c-ca94-485b-825b-e918eeceb873.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　图4. 28+价态L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚体在a)175 eV和b)235 eV能量下的SID谱图。 /p p style=" text-align: justify " 　　综上所述，相比于SID-TOF MS仪器，具有更高质谱分辨率的SID–EMR Orbitrap仪器后续将为大蛋白复合物提供更丰富的四级结构信息。此外，Vicki H. Wysocki课题组先前还报道了将SID装载到FTICR-MS仪器，在SID谱图中可对霍乱毒素(Cholera toxin B，CTB)多种亚基进行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7)，例如8+四聚体、6+三聚体、4+二聚体和2+单聚体4，感兴趣的学者们可进一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高质量分辨率，相信SID源将在蛋白-蛋白、蛋白-金属离子、蛋白-小分子配体复合物体系中发挥越来越重要的作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 参考文献： /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-family: times new roman " [1] VanAernum, Z. Gilbert, J. Belov, M. Makarov, A. A. Horning, S. Wysocki, V. Anal. Chem., 2019, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b05605. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[2] Zhou, M. Wysocki, V. H. Acc. Chem. Res., 2014, 47, 1010-1018. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[3] Quintyn,Royston S. Yan, J. Wysocki, Vicki H. Chem. Biol., 2015, 22, 583-592. /span /p p style=" text-align: justify " span style=" font-family: times new roman " 　　[4] Yan, J. Zhou, M. Gilbert, J. D. Wolff, J. J. Somogyi, Á . Pedder, R. E. Quintyn, R.S. Morrison, L. J. Easterling, M. L. Pa?a-Toli?, L. Wysocki, V. H. Anal. Chem., 2017, 89,895-901. /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 文献链接： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href=" https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605" target=" _blank" span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/acs.analchem.8b05605 /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " （文献原文可联系仪器信息网编辑部提供，联系电话：010-5165-4077-8223） /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 文中提及的赛默飞 span style=" font-family: times new roman " ExactivePlus(EMR)Orbitrap /span 相关信息可点击链接：& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm" target=" _blank" span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/C152611.htm /span /a /p