蛋白质沉淀

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤——01 材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。02 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。03 蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。04 样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。05 蛋白质的分析测定通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。蛋白质的分析纯化，不仅仅是选择合适的方法，必备的工具，例如微量均质器、干燥器、抗体保存盘等，也很重要。Bel-Art蛋白质分析纯化工具推荐本篇我们根据不同耗材在蛋白质分析纯化过程中的不同作用，分类为大家推荐几款合适的耗材。细胞裂解 热门优选 微量均质器-手持式货号：F65000-0000研磨组织和破碎细胞层析 热门优选 磁珠分离架货号：F19900-000分离结合在磁珠上的蛋白质以快速纯化透析热门优选 透析袋夹持器货号：F18237-0000测定热门优选贝塔盾货号：F24976-0001在进行C14分析时减少接触电泳热门优选 Spindrive&trade 轨道摇床平台货号：F37041-0001提供彻底、温和的凝胶混合，同时*限度地扩大实验室空间

干乳粉的复水性是指干粉在加水后恢复成乳液的能力。‌复水性是衡量干制品品质的重要指标之一，特别是在衡量奶粉等干制品的质量时。复水性的好坏直接关系到奶粉在加水后能否恢复到接近原始牛奶的状态。奶粉的复水性对于保证其营养价值和口感至关重要，因为它直接影响到奶粉的实用性和消费者的接受度。‌ 蛋白质含量高且以酪蛋白为主的乳制品粉末例如浓缩乳蛋白（MPC）很难完全复水，即使经过长时间的复水。MPC包含广泛的产品类别，涵盖低、中、高蛋白粉末的复水特性尚未得到广泛研究。本研究采用综合实验方法，包括测量粒度分布随时间的变化，以及使用分析离心法测量沉降行为，以表征MPC粉末在一系列蛋白质浓度下（从成分接近脱脂奶粉的 MPC35到实际上为牛奶蛋白分离物的MPC90）的复水特性。 1. 材料和方法 1.1浓缩乳蛋白粉 1.2分散性：粒度分布 用粒度仪测量MPC悬浮液在复水化90分钟和24小时后的PSD。对于每个MPC样品，观察到一个小于1 um的峰，该峰被认为代表酪蛋白胶束，而第二个大于10 um的峰被认为代表初级粉末颗粒（喷雾干燥过程中由雾化液滴形成的非团聚颗粒）。 1.3 分散：沉降和沉降压缩 分析离心机（LUMiSizer ，L.U.M. GmbH）测量透射近红外光的强度，该强度是水平放置在光路上的细胞长度上时间和位置的函数，用于测量再水化90分钟和24小时的 MPC 悬浮液中的沉降行为。将悬浮液装入PA管（2 mm）。使用两个离心步骤进行测量，36g离心10分钟，然后168g离心10分钟。离心过程中温度保持在25℃。图中显示了离心10秒、5、10、15和20分钟后的谱线。首先绘制相边界（沉积物水相）随时间的运动，然后从池底位置（129 毫米，根据去离子水的沉降曲线确定）中减去稳态值，从而计算出沉降高度。 2. 结果与讨论——分散特性 在经过合理的复水时间后，高蛋白MPC中存在较大的不易分散的颗粒。复水90分钟后，MPC70、MPC80、MPC85 或 MPC90 中最多只有2%的颗粒由酪蛋白胶束组成（图1）。复水24小时后，酪蛋白胶束的比例增加，可能是因为它们从分散性较差的初级颗粒表面表层释放出来，而初级颗粒的比例同时下降（图1）。 图1. 在25℃的去离子水中复水90分钟（灰色条）或复水24小时（白色条）后，初级颗粒（上）和酪蛋白胶束（下）的体积（占总粒子总数的百分比）。 分析离心法用于获取有关MPC悬浮液的光学特性、初级粒子的沉降行为以及所得沉积物的可压缩性的信息。图2显示了低蛋白（MPC35）、中蛋白（MPC70）和高蛋白（MPC90） 粉末在复水90分钟后的三种代表性沉降曲线；这些蛋白质类别中的其他粉末表现出与所选 MPC 粉末非常相似的行为。根据粉末的不同，随着离心的进行，可以在样品池中识别出不同的区域：稳定分散体，即胶体悬浮液中的酪蛋白胶束；初级粒子，即最初向样品池底部集中的初级粉末颗粒，但随着时间的推移会沉淀；初始沉积物，即在低速离心过程中由初级粉末颗粒形成的沉积物；压缩沉积物，即由于离心速度增加而压缩而高度降低的沉积层。 图 2. 浓缩乳蛋白 MPC35（顶部）、MPC70（中间）和 MPC90（底部）在 25℃的去离子水中复水 90 分钟后的代表性沉降曲线，显示NIR光通过样品池的透射率随时间（1 = 10秒、2 = 5分钟、3 = 10分钟、4 = 20分钟）和样品池中的位置而变化。在样品以36g离心10分钟，然后以168g离心10分钟时捕获曲线。插图显示了一个示意图，解释了离心过程中样品池内形成的不同区域。虚线表示样品池底部的位置，从中可以计算出沉淀物的高度（如果存在）。 在MPC35中，样品以酪蛋白胶束为主，酪蛋白胶束在悬浮液中稳定且不会沉淀，因此透射率不会随时间发生变化。相反，MPC90，最初整个样品池中都存在初级粒子，这会导致10秒后透射率非常低；在离心过程中，这些粒子会形成沉淀物，导致样品池底部透射率低，而其他地方透射率高；然后，随着离心速度的提高，该沉淀物被压缩（产生更高的光密度和降低的沉淀物高度）。 复水90分钟后，MPC35没有发生任何沉淀，尽管其颗粒群中有45%以上由初级颗粒组成（图1）。相反，MPC70和MPC90中的初级颗粒在离心过程中形成了明显的沉淀层，其特征是在样品池底部形成一个光学致密区域（图2）。对于MPC70，在形成沉淀层之前，这种物质集中在靠近样品池底部的地方，而对于MPC90，它分散在样品池内的更大区域，导致透射读数远低于胶体稳定性区域。复水90分钟后，沉淀物高度随着蛋白质含量从MPC70到MPC90而增加（图3）。当施加更高的离心力时，这些样品形成的沉淀层会受到压缩，这种影响对于高蛋白粉末比的MPC70更明显（图3）。随着蛋白质含量的增加，观察到沉淀区域上方的透射值更低。 图 3. 浓缩乳蛋白（MPC）粉末经过90分钟的复水后在25 ℃下以36g离心10分钟（灰色条），然后再以168g离心10分钟（白色条）形成的沉淀物的高度。 值得注意的是所有样品在复水24小时后的沉降曲线均表明完全的悬浮稳定性，跟图2中的MPC35谱图类似，尽管悬浮液中仍残留有初级颗粒大小的物质。高蛋白 MPC 粉末的沉降行为强烈依赖于复水时间，初级颗粒在复水90分钟后沉降，但在复水24小时后不会沉降。 3. 结论 a、粉末的初始复水特性和悬浮稳定性随着蛋白含量的增加而降低。 b、经过长时间的复水后，所有的粉末都能完全悬浮。 c、LUMiSizer能区分不同粉末的复水特性和悬浮稳定性，也能做粒径检测。

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。 　　近年来蛋白质组学发展迅速，其相应的方法学研究也取得了巨大的进步，一系列新技术融入了的蛋白质组学技术当中，极大的促进了这门学科的发展。在本届大会上，中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员、复旦大学的张祥民教授、中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员等专家的报告介绍了许多应用到蛋白质组学之中的新技术、新方法，本文作简要概述： 　　报告题目：基于质谱的线粒体GST蛋白质组定性和定量分析 　　报告人：中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员 刘斯奇研究员 　　刘斯奇研究员在报告中首次提出了“线粒体GSTs蛋白质组”的概念，系统地研究了属肝线粒体中的GSTs。可采用亲和色谱法及SDS-PAGE富集GST蛋白，使用MALDI Tof/Tof MS 和LC tandem MS/MS鉴别蛋白。研究结果表明，属肝线粒体中存在5种GSTs，分别为GSTA3, GSTM1, GSTP1, GSTK1 以及GSTZ1。 　　为了对线粒体GSTs的相对丰度进行定量分析，其采用了质谱结合免疫印迹的综合分析方法：利用质谱对GSTs进行定性分析时，根据质谱谱图的多反应监测(MRM)推断GSTs结构 使用重组的GST蛋白作为标准物，建立了蛋白浓缩物的线性回归方程和胰蛋白酶GST多肽的MS/MS强度，同时，通过校准估算出了鼠肝线粒体中的GSTs含量。通过对特定GSTs抗体的强度识别，使用免疫印迹对GSTs进行了定量分析 获得了GST重组蛋白的5种单克隆抗体，将其用于GST浓度校准和免疫印迹强度分析 通过免疫印迹分析获得的定性分析结果基本与MRM数据获得的结果一致。 　　报告题目：蛋白质水平的色谱分离与生物质谱鉴定新方法研究 　　报告人：复旦大学张祥民教授 张祥民教授 　　张祥民教授在报告中表示，蛋白质的分离鉴定有更多困难。一方面，蛋白质分子量大，结构与构型上的变化导致分离效率下降，对色谱填料的孔径、分布与非特异性吸附等因素有更高要求 另一方面，蛋白质鉴定需要先进行酶解以得到质谱鉴定信息。 　　在报告中，他给出了较好的解决方法，通过对液相色谱分离系统的优化，在实际蛋白质样品考察优化了系统的分离性能，构建了液相色谱分离蛋白质鉴定方法与平台。研制了蛋白水平富集预柱，并将其应用于蛋白质捕集。在离子交换色谱柱和反向色谱优化选择上，实现了蛋白质分析所需的高分辨分离。色谱分离组分点样至靶板上，利用发展的快速酶解技术完成蛋白质酶解，再通过MALDI-TOFTOFMS或LC-LTQMS进行蛋白质鉴定。该方法使得蛋白质的理论分离能力达到5000个以上，蛋白质组分能够得到浓度信息，质谱鉴定可以同时利用肽指纹图谱PMFs信息和串级序列信息，使得蛋白质鉴定的可靠性大为提高。 　　报告题目：基于离子液体的新型膜蛋白质组预处理及分离鉴定技术 　　报告人：中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员 张丽华研究员 　　膜蛋白质存在于细胞内环境、细胞与细胞外环境的界面，对执行细胞内外物质交换、信息转换、细胞识别、代谢调节、免疫应答等功能起着重要作用。深入开展膜蛋白质组学研究对于揭示细胞功能、寻找药物靶点以及研制癌症治疗药物等具有重要意义。然而，由于膜蛋白质具有疏水性强、溶解性差、易沉淀、难酶解、含量低等特点，因此在采用通常用于可溶性蛋白质组分离鉴定的方法对膜蛋白质组进行研究时遇到了很大的挑战。 　　张丽华研究员在报告中指出，要提高膜蛋白质组的分析能力，必须发展可显著改善膜蛋白质组溶解性，又不影响后续分离鉴定的新方法。她在近期研究工作中，采用离子液体作为膜蛋白质组的增溶剂，并结合纳升二维液相色谱-质谱联用系统，对鼠脑和人肝内质网提取的膜蛋白质进行了分析。结果表明，离子液体不仅可以提高膜蛋白的溶解性，而且不用影响后续酶解过程中酶的活性。此外，在样品进入质谱鉴定前，易于在除盐步骤去除，不会影响质谱鉴定。与其他膜蛋白质组研究中常用的增溶剂相比，离子液体在膜蛋白质组样品预处理中表现出明显的优势。

北京大学的研究人员报告称，他们开发出了一种遗传编码蛋白质光交联剂，其带有可转移的、质谱可识别的标签。这一研究成果发布在7月27日的《自然通讯》(Nature Communications)杂志上。　　北京大学化学与分子工程学院的陈鹏(Peng R. Chen)研究员与王初(Chu Wang)研究员是这篇论文的共同通讯作者。　　蛋白质以其自身结构和与其他蛋白质之间的相互作用为基础发挥功能，因此，研究蛋白质的结构和相互作用抑制是生命科学的重要方向。　　检测蛋白质相互作用的传统方法，如酵母双杂交、亲和色谱和免疫共沉淀等有着各自的局限性。酵母双杂交可以揭示蛋白质间的直接相互作用，甚至通过大规模筛查发现未知的相互作用，但酵母细胞未必能为异源表达的其他物种蛋白提供合适的相互作用条件。亲和色谱技术和免疫共沉淀技术其通量比较低，背景结合蛋白质与特异性结合蛋白质有时难以区分，直接与间接相互作用也通常难以区分。另外，这三种方法对于瞬间、微弱的相互作用，比如信号转导过程中松散变化的蛋白质复合物，都很难获得有效信息。　　近年来，科学家们一直在不断地发展发现及描绘生理条件下蛋白质相互作用特征的技术，其中化学与光亲和交联策略获得越来越多的关注。将生物分子间的非共价相互作用转变为共价交联，使得能够捕获到时常出现在自然界中微弱且短暂的蛋白质相互作用。光交联剂结合质谱技术是近年发展起来在活体系统中研究蛋白质相互作用的一种有力的工具，但它仍然存在着高假阳性鉴别率及无法提供相互作用界面信息等缺点。　　在这篇文章中研究人员报告称，他们开发出了一种遗传编码光亲和非自然氨基酸，可在光交联及猎物蛋白-诱饵蛋白分离后将一个质谱可识别的标签(MS-label)导入到捕获的猎物蛋白中。这一叫做IMAPP的策略使得能够直接鉴别出采用传统的遗传编码光交联剂难以揭示的光捕获底物肽。利用这一MS-label，IMAPP策略显著提高了鉴别蛋白质相互作用的可信度，使得能够同时鉴别捕获的肽和确切的交联位点，对于揭示靶蛋白及绘制活体系统中蛋白质相互作用界面具有极高的价值。　　来自多伦多大学Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI)和Donnelly中心的一组研究人员，开发出一种新技术，可以将细胞内的DNA条形码拼接在一起，以同时搜寻数百万个蛋白质配对，用以分析蛋白质相互作用。相关研究结果发表在2016年4月22日的《Molecular Systems Biology》杂志上(研究蛋白质相互作用的新技术)。　　斯克里普斯研究所(TSRI)的科学家们开发出了一种强大的新方法来寻找结合特定蛋白质的候选药物。发表在2016年6月Nature杂志上的这种新方法是一个重大的进展，它可以同时应用于大量的蛋白质，甚至直接应用于自然细胞环境中成千上万不同的蛋白质。一些小分子可以用来确定它们靶蛋白的功能，并可充当药物开发的起始复合物。TSRI的研究人员证实这一技术为许多过去认为无法很好结合这些小分子的蛋白质找到了“配体”(结合伴侣蛋白)(Nature发布突破性蛋白质新技术)。　　蛋白质是自然界的机器。它们供给氧气为我们的肌肉提供动力，催化一些帮助我们从食物中提取能量的反应，抵御细菌和病毒的感染。数十年来，科学家们一直在寻找方法设计可以满足某些医学、研究和工业特定用途的新蛋白质。现在，北卡罗来纳大学医学院的研究人员开发出了一种方法，通过将已存在蛋白质的片段拼接在一起来生成新蛋白质。这一叫做SEWING的技术发表在2016年5月的Science杂志上(Science发布突破性蛋白质技术)。

蛋白质作为生命活动的执行者,通过自身结构的动态改变,以及与其他蛋白质相互作用组装为蛋白质复合物,调控各种生物学过程。因此,如何实现蛋白质复合物的精准解析已成为当前生命科学的研究热点。化学交联结合质谱(CXMS)技术作为蛋白质复合物解析的新兴技术,利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质分子内或分子间的氨基酸残基以共价键连接起来,再利用液相色谱-质谱联用对交联肽段进行鉴定,实现蛋白质复合物的组成、界面和相互作用位点的解析。该技术具有分析通量高、灵敏度高、可提供蛋白质间相互作用的界面信息、普遍适用于不同种类和复杂程度的生物样品等优势,已成为X射线晶体衍射、低温冷冻电镜、免疫共沉淀等蛋白质复合物研究技术的重要补充。化学交联位点的鉴定覆盖度和准确度决定着该技术对于蛋白质复合物结构的解析能力。目前,为了实现蛋白质复合物的高覆盖度交联,研究人员发展了可用于共价交联赖氨酸(K)的氨基、谷氨酸(E)/天冬氨酸(N)的羧基、精氨酸(R)的胍基以及半胱氨酸(C)的巯基等多种活性基团的新型交联剂。进而,为了提高低丰度交联肽段的鉴定灵敏度,体积排阻色谱法、强阳离子交换色谱法,及亲和基团富集策略被提出用于交联肽段的高选择性富集,如可富集型化学可断裂交联剂——Leiker,与不具备富集功能的交联剂相比,通过亲和富集可以将交联位点鉴定数目提高4倍以上。胰蛋白酶镜像酶(LysargiNase)的酶切位点与胰蛋白酶互为镜像,可特异地切割赖氨酸和精氨酸的N端。由于LysargiNase的N端酶切特点,电荷主要分布在交联肽段的N端,在碰撞诱导裂解(CID)和高能诱导裂解(HCD)模式下产生以b离子为主的碎片离子,与胰蛋白酶酶切肽段以y离子为主的碎片离子互为镜像补充,为胰蛋白酶酶解肽段在质谱鉴定中b离子缺失严重的问题提供了很好的解决办法。由于具有较高的酶切特异性和酶活性,镜像酶已经成功地应用于蛋白质C末端蛋白质组鉴定、磷酸化蛋白质组研究、甲基化蛋白质组鉴定等方面,然而在CXMS中的应用仍未见报道。为进一步提高对蛋白质复合物结构及相互作用位点的解析能力,本文发展了LysargiNase与胰蛋白酶联合酶切的方法,基于镜像酶正交切割的互补特性,通过产生赖氨酸及精氨酸镜像分布的交联肽段,以增加特征碎片离子数量和肽段匹配连续性,从而提升交联肽段的谱图鉴定质量,达到提高交联位点的鉴定覆盖度和准确度的目的。通过分别对牛血清白蛋白及大肠杆菌全蛋白样品的交联位点鉴定结果的考察,评价该策略对单一蛋白样品和复杂细胞裂解液样品蛋白质复合物表征的应用潜力。蛋白质样品制备称取牛血清白蛋白粉末,以20 mmol/L 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES, pH 7.5)作为缓冲体系,配制0.1 mmol/L牛血清白蛋白溶液。大肠杆菌细胞(种属K12)在37 ℃下采用Luria-Bertani(LB)培养基培养24 h,然后于4 ℃以4000 g离心2 min,收集细胞沉淀。细胞沉淀采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍后,悬浮于细胞裂解液(含20 mmol/L HEPES和1%(v/v)蛋白酶抑制剂)中,冰浴超声破碎180 s(30%能量,10 s开,10 s关)。匀浆液于4 ℃以20000 g离心40 min,收集上清,采用BCA试剂盒测定所得蛋白质含量。稀释大肠杆菌蛋白裂解液至蛋白质含量为0.5 mg/mL。化学交联样品制备以20 mmol/L HEPES(pH 7.5)为溶剂配制浓度为20 mmol/L 的BS3交联剂母液 将交联剂母液加入牛血清白蛋白的缓冲溶液及大肠杆菌蛋白裂解液中,使交联剂的终浓度为1 mmol/L,在室温条件下反应15 min 通过添加终浓度为50 mmol/L的淬灭溶液NH4HCO3进行交联反应淬灭,并在室温下孵育15 min 在冰浴条件下,将交联样品逐渐滴入8倍体积的预冷丙酮中,于-20 ℃静置过夜 在4 ℃条件下,以16000 g转速离心,去除丙酮,然后将交联蛋白用预冷丙酮清洗2次,去除上清液后,于室温挥发掉残余的丙酮 以8 mol/L尿素溶液复溶蛋白质沉淀 将牛血清白蛋白交联样品以5 mmol/LTCEP作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原 将大肠杆菌样品以5 mmol/LDTT作为还原剂,于25 ℃下反应1 h进行变性和还原,避免大肠杆菌蛋白在酸性条件下发生变性 添加终浓度为10 mmol/L的碘乙酰胺(IAA),在黑暗中,于室温下反应30 min 以50 mmol/LNH4HCO3稀释样品至尿素浓度为0.8 mol/L后,将样品均分为两份,一份以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈50:1的比例加入胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,另一份加入终浓度为20 mmol/L的CaCl2,以蛋白样品与蛋白酶的质量比呈20:1的比例加入LysargiNase,并在37 ℃温度下酶解过夜。液相色谱-质谱鉴定及数据搜索上述所有样品经过除盐,使用0.1%甲酸(FA)溶液复溶,用超微量分光光度计测定肽段浓度,进行反相高效色谱分离和质谱分析。牛血清白蛋白样品采用Easy-nano LC 1000系统偶联Q-Exactive质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 2%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA) 流动相B: 98%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~10 min, 2%B~7%B 10~60 min, 7%B~23%B 60~80 min, 23%B~40%B 80~82 min, 40%B~80%B 82~95 min, 80%B。Q-Exactive质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 300~1800,分辨率为70000(m/z=200),自动增益控制(AGC)为3×106,最大注入时间(IT)为60 ms,母离子分离窗口为m/z 2。MS/MS扫描的分辨率为17500(m/z=200),碎裂模式为HCD,归一化碰撞能量(NCE)为35%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms,仅选择电荷值为3~7且强度高于1000的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。大肠杆菌样品采用EASY-nano LC 1200系统偶联Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪平台进行质谱分析。流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液 流动相B: 80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)FA)。梯度洗脱程序:0~28 min, 5%B~16%B 28~58 min, 16%B~34%B 58~77 min, 34%B~48%B 77~78 min, 48%B~95%B 78~85 min, 95%B。Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪采用数据依赖性模式,Full MS扫描在Orbitrap上实现,扫描范围为m/z 350~1500,分辨率为60000(m/z=200), AGC为4×105, IT为50 ms,母离子分离窗口为m/z 1.6。MS2扫描的分辨率为15000(m/z=200),碎裂模式为HCD, NCE为30%, MS2从m/z 110开始采集,MS2的AGC为5×104, IT为60 ms。仅选择电荷值为3~7且强度高于2×104的母离子进行碎裂,并将动态排除时间设置为20 s。每个样品分析3遍。质谱数据文件(*.raw)采用pLink 2软件(2.3.9)对交联信息进行检索和鉴定。使用从UniProt于2019年4月27日下载的牛血清白蛋白序列和大肠杆菌序列,搜索参数如下:酶切方式为胰蛋白酶(酶切位置:K/R的C端)、LysargiNase(酶切位置:K/R的N端) 漏切位点个数为3 一级扫描容忍(precursor tolerance)2.00×10-5 二级扫描容忍(fragment tolerance)2.00×10-5 每条肽段的质量范围为500~1000 Da 肽段长度的范围为5~100个氨基酸 固定修饰为半胱氨酸还原烷基化(carbamidomethyl [C]) 可变修饰为甲硫氨酸氧化(oxidation [M])、蛋白质N端乙酰化(acetyl [protein N-term]) 肽段谱图匹配错误发现率(FDR)≤5%。映射胰蛋白酶与LysargiNase酶解样品的交联位点在牛血清 白蛋白晶体结构(PDB: 3V03)的映射 LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品的交联位点对及单一交联位点的互补性LysargiNase与胰蛋白酶酶解样品共同得到的交联位点鉴定打分比较b+/++与y+/++离子碎片分别在α/β-肽段的碎片覆盖度LysargiNase与胰蛋白酶酶解的交联肽段质谱图大肠杆菌样品中LysargiNase与胰蛋白酶酶切鉴定蛋白质复合物信息互补性带点击了解原文：https://www.chrom-china.com/article/2022/1000-8713/1000-8713-40-3-224.shtml

Sigma-Aldrich/Supelco的HybridSPE荣获最佳分离产品奖 HybridSPETM-沉淀技术被SelectScience.net评选为2008 最佳新分离产品 　　-- HybridSPE(TM)-沉淀技术蛋白质沉淀操作简单快捷并且还具有SPE高灵敏性，适用于在LC-MS/MS分析之前，去除生物样品中的磷脂和蛋白质 　　Sigma-Aldrich公司宣布：Sigma-Aldrich公司旗下品牌之一—Supelco(色谱分析和纯化产品供应商)宣布HybridSPE-沉淀技术(http://www.sigma-aldrich.com/hybridspe-ppt)被SelectScience.net评选为2008 最佳新分离产品。SelectScience.net是专门提供应用化学、临床化学和生命科学网络资源著名网站，25,000位科学家通过不记名投票来评选出Scientists' Choice Award，并且在Chicago, IL 举行的Pittconn(R) 2009宣布获奖结果。 　　Sigma-Aldrich/Supelco 样品前处理产品经理An Trinh 说：“LC-MS技术的发明大大提高分析速度和分析灵敏度，但是样品前处理依旧是生物分析过程中瓶颈。我们的目标是建立全新的样品前处理平台，该平台不仅操作简单能应用于高通量操作，而且还大大提高研究数据质量。我们非常高兴我们的努力受到广大科研工作者认可。” 　　HybridSPE-沉淀技术(HybridSPE-PPT)是一个简单通用的样品前处理平台，主要应用于在LC-MS 或LC-MS/MS分析之前去除血浆和血清中内源蛋白和磷脂干扰。 　　在药物生物筛选过程中，研究人员会开发不同实验来药物定量、定量候选药物以及血浆和血清等生物体液中的代谢物。内源杂质引起的过高背景是定量生物分析中的一大难题，因此降低分析时间显得尤为重要。在生物分析质谱，背景过高会引起离子抑制。 　　生物分析中产生离子抑制问题的是因为LC-MS或LC-MS-MS分析中磷脂以阳离子电喷雾形式存在。磷脂是生物样品中仅次于甘油三酸脂第二大脂类成分并且在生物血浆样品中有着极高的浓度。 如欲了解 HybridSPE 更详细的信息，欢迎登陆西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich/Supelco)网站 或直接联系我们：地址：上海市淮海中路398号世纪巴士大厦22楼A-B座 邮编：200020 电话：+86-21-61415566 -8136email: julie.gao@sial.com

干血斑（Dried Blood Spot, DBS）是一种微量血液采集、干燥和储存的生物采样技术。该技术由Robert Guthrie于1963年首次应用于新生儿苯丙酮尿症（PKU）筛查[1]。相比于临床检验中常用的液态血液基质，干血斑技术具有采血量少、操作简便、一般不需冷冻或冷藏、储存和运输成本低等优点，已应用于新生儿疾病筛查、流行病学样本分析、药物研发等领域。将干血斑应用于蛋白质研究，拓宽了蛋白质分析研究的生物样本采集形式，具有很好的临床研究和实际应用价值。本文重点讨论两种常见干血斑蛋白质分析技术及应用。1. 基于干血斑的蛋白分析技术1.1 酶联免疫吸附分析法原理：酶联免疫吸附分析法（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，进行免疫反应的定性和定量分析，具有灵敏、特异、及易于自动化操作等特点。根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等。实验材料及分析仪器：研究人员可通过购买固相载体、抗体或抗原进行包被制备ELISA试剂盒或购买市售试剂盒。酶联免疫吸附测定试剂盒已成为实验中不可缺少的工具，目前国内外Elisa试剂盒生产厂家很多，如上海酶联生物、Abcam、BioVision等，科研人员可根据研究需求选择高质量的试剂盒品牌，以提升分析效率及结果有效性。干血斑处理：以干血斑HIV分析为例：用HIV阴性混合血液样本对阳性混合血液样本进行梯度稀释后，以固定体积点样至干血斑收集卡，室温下干燥。采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，用300 μL PBST（0.05% Tween20）室温静置洗脱，洗脱液经酶标仪测定样本吸光度值（OD值）。分析和结果处理：以标准曲线样品的浓度为横坐标，以测得的OD值为纵坐标，根据不同类型ELISA本身的特点拟合标准曲线（如竞争法和夹心法可以采用四参数拟合回归方程），选择R值大于0.99的拟合方式，并根据标准曲线计算样品浓度。分析仪器：酶标仪（MicroplateReader）即酶联免疫检测仪，是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶标仪可分为普通酶标仪和多功能酶标仪，普通酶标仪的主要功能一是充当分光光度计的角色，二是基于免疫反应的ELISA分析，价格相对较低；多功能酶标仪可实现吸光度、荧光强度、时间分辨荧光、荧光偏振和化学发光等多种检测模式拓展，满足生化分析、免疫检测、细胞研究、药物筛选和机制探索等众多领域检测需要。目前酶标仪市场常用的仪器品牌进口的有：伯腾、帝肯、美谷分子、珀金埃尔默和赛默飞等；国产的有：安图生物、奥盛和闪谱等。1.2 基于质谱技术的蛋白质分析技术基于质谱（Mass Spectrometry, MS）技术的蛋白质分析方法具有高通量、自动化程度高、分离能力强等特点，已逐渐成为蛋白质分析和鉴定的重要技术。原理：蛋白酶将样本中的蛋白质消化成肽段混合物，可采用鸟枪法（Shotgun）对蛋白组进行全谱分析，在最小限度分离蛋白质的同时实现复杂混合物中成千上万种蛋白质的鉴定和定量；或用液相色谱法（Liquid Chromatography, LC）对酶解肽段进行分离，经基质辅助激光电离（MALDI）或电喷雾电离（ESI）等软电离技术将其离子化，带电蛋白质离子通过质量分析器将具有特定质荷比的肽段离子分离，然后经检测器分析。质谱技术与干血斑技术的结合为蛋白质组学研究和蛋白生物标志物筛选提供了强有力手段。图1 基于质谱技术的蛋白质组学分析流程[2]样本处理：采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，转移至EP管中，加入少量水后用组织研磨器或匀浆机快速、彻底破碎干血斑样片，剧烈摇晃试管。后续处理与常规样本的蛋白提取相似：加入蛋白裂解液（如SDS、SDC、RIPA等），冰上裂解约半小时（辅以震荡），低温、高转速离心后取上清，得干血斑蛋白提取物。分析和结果处理：蛋白质组学数据分析和结果处理包括：①应用数据库搜库对蛋白进行鉴定并相对定量分析，借助如主成分分析、相关性分析、聚类分析等方法掌握数据的整体情况；②对蛋白的生物学功能进行注释，例如GO功能注释、KEGG注释等；③通过蛋白的生物学功能或参与的信号通路可以进一步筛选与研究目标相关的蛋白进行后续的分析。分析仪器：蛋白质组学分析主要使用高分辨液质联用系统进行。可进行蛋白质组学分析的液质联用系统目前以进口为主，常见仪器主要有布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX的Q-TOF、Q-Orbitrap、Q-Trap质谱仪等。2. 干血斑蛋白分析应用实例分享2.1 采用ELISA法分析干血斑中HIV抗体1996年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了以干血斑为载体的样本邮寄传递检测模式，并证明其可作为传统检测模式的良好补充，极大地推动了干血斑技术在传染性疾病分析中的应用。在我国，全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）第二章第4部分“常规HIV抗体或HIV抗体抗原联合检测方法”中指出：ELISA试验可使用血液（包含血清、血浆和干血斑）或尿液样本检测HIV抗体，也可联合检测HIV抗体抗原，说明干血斑在基于ELISA技术的HIV抗体检测中是可代替血浆、血清的生物样本基质，具有广阔的应用前景。近年来，相关专家多推荐受检者使用HIV自主采样包，根据说明采集干血斑样本，匿名寄至专业实验室，通过电话等方式获取结果。图2 RDA Spot公司的干血斑自主采样包（包含一次性采血针，消毒湿巾，样本采集卡，使用说明书及用于运输的特殊包装）图片来源：https://www.rdaspot.com/2.2 基于质谱技术的干血斑蛋白质组学分析研究人员建立了应用Thermo UltiMate 3000 RSLCnano纳升液相色谱联合Q Exactive HF-X质谱技术的干血斑蛋白质组学分析方法，并于2020年在Journal of Proteome Research中报道了该项工作[3]。由于全血中含有较多可溶性蛋白（如血红蛋白、白蛋白、纤维蛋白原等），研究人员为克服干扰、提高分析灵敏度，采用碳酸钠沉淀法（SCP）成功去除干血斑中可溶性蛋白并富集目标分析物疏水性蛋白。采用基于数据非依赖采集模式（DIA）的蛋白质组学分析方法，进行EMBL-EBI（针对人类蛋白GO功能分析的综合注释数据库）蛋白组学搜库分析，通过限定质谱扫描范围和延长离子累积时间等提高了分析方法的检测灵敏度。该研究最终在健康受试者干血斑样本中鉴定到1977种蛋白质，其中包含585种疾病相关蛋白。3. 小结与展望干血斑是一种先进的血液采集及保存技术，具有操作简单、对人体损伤小、便于运输和储存等优势，在临床快检中受到关注。干血斑技术与蛋白质研究的结合将有效推动蛋白质研究成果临床转化。随着分析技术的发展和相关研究的不断深入，前处理自动化仪器、高通量分析仪器和成熟的蛋白分析流程将成为干血斑蛋白质分析的有力工具，干血斑蛋白质分析定将在蛋白质分析中发挥重要作用，为高通量诊断、差异蛋白分析和疾病生物标志物挖掘等拓展新的技术平台。参考文献：[1] R. Guthrie, & Susi, A., A Simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants., Pediatrics, 32 (1963) 338–343.[2] B. Kuster, M. Schirle, P. Mallick, R. Aebersold, Scoring proteomes with proteotypic peptide probes, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6 (2005) 577-583.[3] D. Nakajima, Y. Kawashima, H. Shibata, T. Yasumi, M. Isa, K. Izawa, R. Nishikomori, T. Heike, O. Ohara, Simple and sensitive analysis for dried blood spot proteins by sodium carbonate precipitation for clinical proteomics, Journal of proteome research, 19 (2020) 2821-2827.

作者：钟丹丹博士，蒙敏博士 超滤技术专题系列 生命科学实验室的超滤设备 密理博提供的实验室超滤全套解决方案 尽管切向流过滤Amicon® Ultra的超速装置，提供优良的性能（使用水平吊篮转子尤佳）。更多的用于与大规模操作，但密理博为您开发了附有垂直膜面的生命科学实验室用超滤离心装置，常见的有 Amicon Ultra 离心超滤装置 密理博公司的Amicon离心超滤装置是一种理想的工具，可以用来对盐分、糖类、核酸、非水溶剂及其它一些低分子量物质进行去除和更换。它们还可以用来分离未结合上的游离标记物。 密理博离心超滤装置具有快速、方便、回收率高的特点，可替代并优于透析及乙醇沉淀。盐分通过滤膜的效率很高且不依赖于微溶质的浓度和大小。 Amicon Ultra内置超滤装置图解 Amicon Ultra 超滤离心管的使用方法 蛋白质样品: 把蛋白质样品加到Amicon Ultra的内管中，然后只需要10到20分钟的离心时间，就可把不需要的缓冲液和小分子超滤到外管里，从而在内管中获得高达30倍到80倍浓缩倍数的样品。 其它样品处理方法，请点击此处查看 Amicon Ultra使用示意图 Amicon Ultra 超滤离心管的应用 蛋白质样品浓缩、脱盐及缓冲液置换 样品中去垢剂的去除 双向电泳样品的制备 纯化血清多肽做生物标志物 抗体的快速浓缩 未结合标志物的去除 尿液的浓缩 核酸样品浓缩及脱盐 法医鉴定分析样品的预处理 更多有关生命科学实验室的超滤解决方案， 请咨询：china_bioscience_marketing@millipore.com 或 本文版权为密理博所有，欢迎转载或提出宝贵意见，转载时请注明密理博中国博客并附原文链接

Postnova场流分离系统应用举例——蛋白质聚集体分离的理想解决方案 蛋白质聚集体已经成为药学发展和质检上一个重要的问题。其活性，生物利用度和可能的消极免疫响应等性能直接与不同程度的聚集态的存在有关。因此不仅FDA, 更多的官方和私人研究机构都对聚集态结构产生越来越大的兴趣。他们研究的目标是确定精确的聚集情况，即药物中的蛋白质中某个时间有多少聚集态结构形成以及如何避免这种情况。 场流分离技术是分离技术的一种，它可以与液相色谱（LC）相比。就像液相主要用来分离小分子一样，场流分离主要用来分离大分子或粒子（可称为：粒子色谱）。场流分离技术是一个独特的分离技术，所有场流分离技术都使用相同的基本分离的原则，但采用不同的分离场。根据不同分离场，场流分离技术可分为流动场流分离，沉淀场流分离，热场流分离等。 当样品注射到场流分离通道时，分离应力作用于聚合物或粒子强迫它们向通道底层移动，通道底层就被称为聚集壁。样品不能透过聚集壁，所以它们再次扩散到通道中心。扩散应力被分离应力抵消，在很短的时间（一般是30～120秒）内两种力之间就建立起一个稳定的动态平衡。大小不同的颗粒有着不同的扩散系数，所以它们在通道内由于速度梯度而被分离。注射后的粒子/聚合物由于“垂直场力”的存在，受迫向垂直于流动相流动的方向移动。小粒子由于具有较大的扩散系数将会比大粒子在通道内扩散的更深远。结果就是，小粒子在通道内被“层流”更快的定位，并因此而被洗脱出来；而大粒子则定位较慢，后洗脱出来。 上图是使用AF4非对称场流分离单克隆抗体的结果。在20分钟内，不同程度的聚集态被分开，整个分离过程由于没有固定相存在，因此蛋白质的空间结构不会被破坏。样品不需要前处理，更可以通过联用多种在线检测器（LS, UV, RI, SEM, DLS），方便迅速得到需要的数据。 场流分离技术具有以下优点： • 快速、温和的分离，可以兼容任何溶剂和缓冲液 • 超高的分辨率（±1nm） • 没有任何固定相的分离通道 • 宽分离范围：粒径1nm~100mm /分子量1000Da~1012Da • 无需前处理及过滤，直接进样复杂基质样品 • 可收集所需要的样品，方便升级至制备级 • 能够连接各种检测器，如在线串联紫外、光散射、荧光、质谱等检测器 • 可同时测定分子的分子量及粒子的粒径。 这些优点使场流分离技术在蛋白质及其聚集体分离方面可以发挥巨大的作用。 更多产品详情，敬请登陆：www.tegent.com.cn 德祥热线：4008 822 822 info@tegent.com.cn

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的Letter，Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics [1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授和Kyle A. Brown博士。非离子表面活性剂是从细胞中溶解和纯化蛋白质的通用工具，是结构生物学中使用的关键试剂。N-dodecyl-β-D-maltoside(DDM)是最受欢迎的非离子表面活性剂之一，用于从非变性环境中提取蛋白质进行下游生物学实验。然而，表面活性剂的存在，即使是像DDM这样温和的表面活性剂，依然会对自上而下蛋白质组学分析产生不利影响。与表面活性剂相关的信号抑制一般是由低分子量物质较高的电离效率和信噪比引起的。此外，表面活性剂的存在会对常见的前端蛋白质分离技术产生负面影响，例如对于反相液相色谱(RPLC)而言，可能会导致再现性和稳健性方面的潜在问题。克服表面活性剂在下游蛋白质组学分析中的不兼容性问题的一种方法是插入一个可裂解键(例如酸或光不稳定键)，能够在质谱分析之前降解为无害的副产物。然而通常用于蛋白质组学的可裂解表面活性剂含有变性阴离子基团，如硫酸盐，不能用于需要非变性条件的应用。因此，急需开发一种可以在非变性条件下辅助传统的蛋白质制备方法的可裂解表面活性剂，并能适用于下游蛋白质组学分析。本文中，作者首次使用了一种非离子型可裂解的表面活性剂N-decyl-disulfide-β-D-maltoside(DSSM)，用于自上而下的蛋白质组学。(图1)　　图1. DSSM在蛋白质组学中的应用　　首先，作者在变性条件下，用碳酸酐酶(29.1 kDa)评价了DSSM与ESI-MS分析的相容性。表面活性剂通过TCEP在4℃条件下降解2 h，在DSSM降解和离心后，没有观察到不溶性降解产物。　　　　图2. DSSM与完整蛋白ESI-MS分析的相容性。　　作者进一步评估了DSSM与RPLC-MS的兼容性，以研究膜蛋白。膜蛋白是一类重要的药物靶点，由于其固有的低溶解性和低丰度，通常难以使用自上而下蛋白质组学进行研究。作者对一种模型离子通道蛋白KcsA进行了DSSM辅助膜蛋白组学分析。使用氯仿:甲醇:水沉淀法去除不相容的缓冲组分(盐、洗涤剂等)后，在DSSM (2× CMC)中溶解KcsA。表面活性剂用TCEP(在水中或50%异丙醇中)降解，用CID进行RPLC-MS/MS破碎。结果显示，作者成功地表征了防止通道失活的突变(E71A)。(图3)　　　　图3.DSSM溶解膜蛋白的自上而下蛋白质组学　　最后，作者利用DSSM提取哺乳动物细胞内源性蛋白，表面活性剂降解后直接用RPLC MS/MS进行分析。在采用TopPIC对数据进行分析之后，作者通过四次LC-MS/MS实验从206个蛋白质组中鉴定出276种proteoform。作者证明了DSSM是一种有价值的用于细胞裂解的表面活性剂，并可以用于RPLC-MS/MS分析进行proteoform鉴定。　　图4. 使用DSSM从细胞裂解液中提取的内源性蛋白质的自上而下蛋白质组学总的来说，作者证明DSSM可以促进膜蛋白的自上而下蛋白质组学表征，以确定序列变异和翻译后修饰(PTMs)。未来在蛋白质组学实验和结构生物学研究中，DSSM可以作为DDM的一般替代品。　　撰稿：张颖编辑：李惠琳文章引用：Brown KA, Gugger MK, Yu Z, Moreno D, Jin S, Ge Y. Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics. Anal Chem. 2023 Jan 6.　　李惠琳课题组网址 www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Brown KA, Gugger MK, Yu Z, Moreno D, Jin S, Ge Y. Nonionic, Cleavable Surfactant for Top-Down Proteomics. Anal Chem. 2023 Jan 6.

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从不同角度显示的人类蛋白质PSD95-PDZ3 的三维图像。图片来源：安德烈福尔/CRG科技日报根据6日发表在《自然》网站上的一项新研究，人类蛋白质表面的潜在治疗靶点的数量比之前认为的要多得多。西班牙巴塞罗那基因组调控中心（CRG）的研究人员开发出一项突破性新技术，揭示了许多控制蛋白质功能的“秘密大门”，从理论上讲，这些“门”可以显著改变痴呆症、癌症和传染病等各种疾病的进程。现在，他们已经绘制出这些被称为“变构位点”的靶点的第一张图。这种发现靶点的方法可能会改变药物发现的“游戏规则”，从而研发更安全、更智能且更有效的药物。它使世界各地的研究实验室能够靶向任何蛋白质，包括那些以前被认为“无药可及”（undruggable）的蛋白质。蛋白质在所有生物体中发挥着核心作用，并执行重要功能，如提供支撑结构、加速反应、充当信使或对抗疾病。它们由氨基酸组成，在三维空间中折叠成无数不同的形状。蛋白质的形状对其功能至关重要，氨基酸序列中只要有一个错误就会对人类健康造成潜在的毁灭性后果。变构是蛋白质功能中一大未解之谜。当分子与蛋白质表面结合时会产生变构效应，这反过来又会导致该蛋白质远处的位置发生变化，从而通过“遥控”来调节其功能。许多致病突变，包括许多癌症驱动因素，都是因为其变构效应而具有病理性。尽管变构位点很关键，但它们却非常难找。此次，研究人员开发了一种名为双深度PCA（ddPCA）的技术来应对这一挑战。他们将其描述为一种“蛮力实验”，就好比发现一辆车有问题之后，不只是检查局部，而是拆卸整辆车，并逐个检查零件。通过一次性测试一万件零件，研究人员确定了所有真正重要的部件。CRG系统生物学项目协调人、该研究报告的作者本莱纳教授解释说：“我们故意以数千种不同的方式打破事物，以建立一个事物如何运作的完整图景。”该方法通过改变构成蛋白质的氨基酸来发挥作用，从而产生数千种不同版本的蛋白质，而序列中只有一两个差异。然后，研究人员在实验室的活细胞中同时测试突变蛋白质的影响。研究人员称，每个细胞都是一个小工厂，会生产不同版本的蛋白质。在一个试管中有数百万个不同的工厂，因此可以非常迅速地测试一种蛋白质的所有不同版本的工作情况。实验收集的数据被输入计算机神经网络进行分析，产生全面的地图，精确定位蛋白质表面的变构位置。该技术有望促进蛋白质功能和进化的研究。如果扩大规模，可以从氨基酸序列中精确预测蛋白质的特性。研究人员认为，一旦成功，这将开启预测性分子生物学的新时代，使发展新药和清洁的、以生物学为基础的工业成为可能。

细胞是跨越了至少四个数量级的、复杂而精妙的模块化系统【1】。对细胞内模块化系统的刻画主要有两种方式，一是蛋白质荧光成像，一是蛋白质生物物理特性，这两种方面的技术可以产生大量的数据，但是这两种方式所产生的数据库具有不同的质量和分辨率，通常需要分别进行处理。那如何将两种方式的优点进行同时整合呢？近日，美国加州大学圣地亚哥分校Trey Ideker研究组（第一作者为博士生秦越）与瑞典皇家理工学院以及斯坦福大学Emma Lundberg研究组合作发文题为A multi-scale map of cell structure fusing protein images and interactions，将来自于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）【2】的免疫荧光图像与BioPlex数据库【3】中亲和纯化结果进行整合，构建了多维度细胞整合图谱MuSIC1.0（Multi-scale integrated cell），对人类细胞中的结构层次进行了统一化的分析，从而解析出69个亚细胞系统，为整合各种各样不同类型的数据来创建全蛋白细胞模型铺平了道路。真核细胞由多种大的组分组成，比如细胞器、凝聚体或者蛋白质复合体，从而形成一个多维度的结构。人类蛋白图谱系统性地对人类细胞中蛋白质在亚细胞结构中定位进行了全面解析，与此同时质谱与亲和纯化（Mass spectrometry combined with affinity purification， AP-MS）技术将临近标记引入蛋白质组学探究之中，从而能够快速检测蛋白和蛋白之间的相互作用。因此，如果能将蛋白质成像与生物物理之间的关联结合起来，便可以对细胞结果进行更进一步地解析。为此，作者们构建了一种机器学习方法，可以将蛋白质成像与生物物理特性进行关联和集成，从而构建一个亚细胞结构组成组分的统一图谱。图1 蛋白质成像与AP-MS数据库整合策略首先，作者们使用深度神经网络（Deep neural network，DNN）对蛋白质图像与相互作用数据进行整合，确定每个平台中蛋白质的坐标，对蛋白质之间的距离进行校准和组合，从而确认在不同维度下蛋白质复合体的组装方式（图1）。这两个全方位的数据库均来自HEK293细胞。作者们对蛋白质配对之间的相互作用距离进行检测，举例来说，来自蛋白质复合体中的蛋白之间相互作用距离少于20nm，而细胞器中的蛋白质之间距离可能会超过1μm。作者们分析了661个蛋白质之间的所有距离，以识别相互接近的蛋白质组分。随着距离的变化，能够产生一个蛋白质多维度结构层次图谱（图2）。由此，作者们发现所构建的MuSIC系统能够以很广的范围对生物系统内的蛋白质相互作用进行测量和捕捉。图2 结构层次图谱建立和检测的流程在建立起该整合图谱后，作者们希望对MuSIC系统进行一个全局性的评估。MuSIC图谱中有370个蛋白以前未在AP-MS实验中用于亲和标记进行相互作用因子的钓取。因此，作者们对134个猎物蛋白进行标记进行AP-MS实验，从而检测到339个相互作用配对，进而对该整合图谱的准确性进行了全面的验证。在MuSIC发现的全新的亚细胞系统中，有一个由七个蛋白质复合体组成的直径估计为81nm的系统，作者们将此系统命名为前体核糖体RNA加工组装复合体（Pre-ribosomal RNA processing assembly，PRRPA）。为了对PRRPA复合体在前体rRNA加工中的作用进行确认，作者们使用siRNA对每个蛋白进行了敲降，发现所有的敲降都会一定程度上破坏核糖体RNA的成熟。另外，作者们使用RNA免疫共沉淀定量qPCR对这些蛋白结合45S前体rRNA的能力进行检测，再次证明了这些蛋白质在前体rRNA加工过程中的作用。同时作者们发现所建立的MuSIC系统也可以对一些蛋白质的功能进行更为全面的认识，包括发现已知蛋白的全新功能和未知蛋白的潜在功能。总的来说，该工作通过汲取蛋白质荧光成像与蛋白质生物物理特性两方面之长构建了多尺度细胞整合图谱MuSIC 1.0，进一步地提高了现有蛋白质荧光图像中信息的分辨率，也为蛋白质相互作用提供了空间维度的信息，为人类细胞中蛋白质组研究提供了更为全面的认识。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04115-9

在生物学的中心法则中，信息从DNA流向RNA，最终转化为执行生物学功能的蛋白质。由于遗传变异、RNA可变剪接和翻译后修饰（PTMs）的存在，蛋白质形成了多样的蛋白分子形式（proteoforms）。目前，Top-Down 蛋白质组学（TDP）已经成为了全面研究蛋白分子形式的最强大技术，它通过Top-Down质谱（TDMS）的实验，不需要酶切，直接分析完整的蛋白质，以提供蛋白分子形式的整体视图。TDMS既需要对完整蛋白的精确质量分析（Top），也需要控制下游气相离子的碎裂来获取序列的信息和PTMs的位点（Down）。与TDP不同，Bottom-Up蛋白质组学（BUP）通过分析酶切后的肽段（通常小于3 KDa）来获取蛋白质的信息，由于多肽相对于完整蛋白更加容易分离、电离和断裂，BUP有着比TDP更加广泛的应用。但是由于BUP获取的肽段数量有限，因此提供的序列覆盖普遍偏低，这就导致了蛋白分子形式信息的丢失。此外，相较于TDP来说，BUP无法提供组合的PTMs信息。（如图1） 图1. TDP和BUP的对比TDP的基本实验流程如图2所示，包括前端样品制备和分离，完整质量分析和碎片分析，以及关于蛋白分子形式的鉴定表征和定量的信息学。 图2. TDP的基本工作流程样品制备传统的蛋白质提取方法使用Good’s缓冲液，它具有高盐浓度(100 mM)，蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和表面活性剂，用于总蛋白质的溶解。这些常规试剂往往与TDP不相容，因为它们会干扰蛋白质离子检测并抑制质谱信号。不相容的盐和小分子可以通过超滤管离心或使用尺寸排除色谱(SEC)自旋柱去除。在样品制备过程中应注意尽量减少人工引入的蛋白分子形式。例如，蛋白酶和磷酸酶抑制剂通常包括在萃取缓冲液中，以尽量减少体外蛋白质降解和去磷酸化。蛋白应该低温保存，以减慢任何的修饰反应。表面活性剂能促进疏水膜蛋白的细胞渗透和增溶，但是表面活性剂会对蛋白的质谱分析造成信号抑制。蛋白质沉淀法通常使用氯仿/甲醇混合物或丙酮，可以去除表面活性剂和其他质谱不相容的污染物。然而，蛋白质沉淀方法耗时且可能导致蛋白质损失、实验变异性或溶解性问题。因此，可切割表面活性剂已被开发出来，如可酸降解的Rapigest、ProteaseMAX、MaSDeS；可光降解的4-己基苯基偶氮磺酸酯；可氧化还原降解的N-十二烷基二硫-β-d-麦芽糖苷等。样品分离和富集前端分离和富集策略可以选择性地分离亚蛋白质组，在质谱分析之前从复杂的生物样品中捕获和富集低丰度蛋白质。例如，可以通过差速离心的方式获取细胞器，蛋白再从细胞器中提取。另一种方式是通过亲和纯化的方式，基于抗体的方式已经在完整蛋白的靶向分析上得到了应用，但是该方法受到高特异性和高质量抗体需求的限制。为了解决这些挑战，可特异性捕获蛋白的表面功能化的多价超顺磁性纳米颗粒和集成纳米蛋白质组学的方法被开发出来。仪器早期的TDP实验依靠单四极杆和三四极杆(分别为Q和QqQ)质谱仪进行完整蛋白分析。这些系统具有较差的质量分辨能力，使得电荷状态测定困难，并且有限的质量电荷比(m/z)范围导致对大蛋白质的适用性较低。高质量分辨能力对于TDP尤为重要，因为完整蛋白质产生的片段离子可以产生卷曲的质谱，其中具有不同电荷态的各种离子可以部分重叠。许多现代质谱仪器可以可靠地实现高分辨率，包括傅里叶变换质谱系统，如离子回旋共振(FTICR)和Orbitrap质谱仪，以及飞行时间(TOF)和四极杆-飞行时间 (Q-TOF)仪器。完整蛋白的分离蛋白质组的复杂性给TDP带来了巨大的挑战，需要在质谱分析之前分离完整的蛋白质。当处理较大的蛋白质(≥30 kDa)时，这一挑战尤其明显，因为随着蛋白质大小的增加，ESI质谱中的离子信号迅速减少。早期的分离方法使用凝胶电泳技术，例如二维凝胶电泳分离、虚拟的二维凝胶电泳分离、直接利用MALDI MS的干胶法和PEPPI-MS等。还可以通过SEC（尺寸排阻色谱）、RPLC（反相液相色谱）、HIC（疏水相互作用色谱）、IEX（离子交换色谱）以及多维的LC方法来分离。例如一个3D LC方法，通过耦合HIC - IEX - RPC，相较于2D IEX -RPLC MS将蛋白质的鉴定数目提高了14倍。此外，CE-MS的最新进展可以用于变性和非变性的TDP分离。离子淌度质谱（IMS）是基于分子在电场作用下的气相运输性质和碰撞截面积（CCS）分离蛋白质，高分辨率的IMS已被证明可以用于分离高序列同源性的蛋白。串联质谱技术串联质谱（MS/MS）技术，在TDP中通常包括通过选择前体蛋白离子，将其解离成更小的片段离子并分析片段离子，从而得出蛋白质的初级结构和修饰（如图3a）。有多种活化/解离方法可用于生成产物离子。大多数仪器可以进行碰撞诱导离解(CID)，也称为碰撞激活离解，通过与中性气体分子(如氮气或氩气)相互作用的碰撞激活来产生b/y离子(图3b)。红外多光子解离(IRMPD)涉及吸收低能红外光子产生b/y离子，并可能在吸收多光子后产生二级和高阶片段离子，从而产生更广泛的蛋白质序列信息。基于电子的解离方法（ExD），如电子捕获解离（ECD）和电子转移离解(ETD)，在产生高序列覆盖率方面往往优于CID。ExD产生的c/z产物可用于确定的蛋白质形态表征和PTM定位。使用193 nm或213 nm激光，紫外光解离（UVPD）可以生成更复杂的串联质谱，序列覆盖率与ExD方法相当或更高。此外，结合四极质量过滤器、线性离子阱和Orbitrap的混合平台可以进行质子转移电荷还原（PTCR），以简化产物离子谱。图3. a, 串联质谱技术示意图。b, 不同解离方式产生的碎片离子。数据采集可采集的谱图数量取决于仪器的占空比和峰的宽度。最常见的TDP数据采集方法是数据依赖的采集（DDA）。在DDA中，收集一个完整的质谱扫描，并选择几个前体离子（通常是最丰富的）进行片段化。与数据非依赖的采集（DIA），即不分离前体离子的质谱扫描碎片，正在迅速发展并在BUP工作流程中采用，为TDP提供了令人兴奋的机会。结果处理TDP的数据信息丰富但是解析难度大，考虑到同位素和电荷态的影响，以及人类蛋白质组的高动态范围，使得谱图分析和对于低丰度蛋白的检测更加困难。TDP的谱图往往有更加复杂的同位素包络，通常不会观察到单同位素峰。大多数工具依赖于Averagine模型来解同位素并预测理论同位素分布。当谱图不能进行同位素分解时，谱图去卷积可以使用多个电荷态离子来推导出一种蛋白分子形式的平均质量。目前正在开发用于存储质谱数据的标准化文件格式。最通用的文件格式是mzML（最新版本1.1.1），这是一种由人类蛋白质组组织蛋白质组学标准倡议(HUPO-PSI)支持的XML格式。几个开源软件库可以转换，读取和写入质谱文件格式，包括ProteoWizard，JmzML，mzJava和pymzML。获得去卷积谱图后的下一步是针对蛋白质或蛋白质序列数据库搜索去卷积质谱，以识别具有错误发现率(FDR)控制的蛋白分子形式并表征PTMs，具体的搜索原理的概述可以查看原文Results-data analysis部分，在这里不再赘述。最后，定量分析不同样品间丰富度的差异。数据库可以使用来自UniProt、RefSeq、GENCODE或相关资源的蛋白质序列数据库。这些数据库只包含序列，不包含PTMs的信息。可以根据PTMs位点和类型，构建可用的数据库，但要注意限制PTMs的可变数目，否则产生的组合数据会过于庞大。DNA或RNA-seq数据可用于构建具有样品特异性基因突变和备选剪接事件的蛋白分子形式序列数据库。定性与定量分析TDP提供了对蛋白分子形式的全面了解，使鉴定、新蛋白分子形式的发现和深入的序列表征成为可能。TDP具有独特的优势，因为它可以表征组合PTMs与多基因家族中不同基因编码的同型异构体，这些异构体通常具有高序列同源性。例如，肉瘤蛋白具有多种亚型和PTMs，如N端二甲基化、乙酰化、磷酸化和甲基化。单个肌肉细胞的蛋白质形态变化可以通过TDP进行研究。当单个蛋白分子上存在多个PTMs时，TDP是唯一可以解析复杂蛋白形态和组合PTMs的技术。例如，TDP可以鉴定组蛋白的多种蛋白分子形式，以及定量描述PTMs之间的化学计量学。TDP的定量方式和BUP类似，主要有非标记定量（label free）：采用不同蛋白分子形式的信号强度定量；同位素标记（isotope labeling）:采用不同分子量的同位素标记来定量；化学标记（chemical labeling）：采用化学报告基团来定量，尤其是在MS2水平上。（如图4）其他标记技术——如氨基酸稳定同位素标记(SILAC)、同量异位（isoabric）标记、假同量异位（pseudoisobaric）标记和NeuCode SILAC——已经显示出定量TDP的潜力。图4. 不同定量方法统计学分析和错误率计算TDP的软件通常会使用E值和P值来反映串联质谱和蛋白分子形式的匹配程度，此外FDR值也常被用来描述鉴定的可靠性。对于定量的TDP.对于定量TDP分析，统计分析通常使用单向方差分析和Stundent’s 检验(双尾)。多次测试调整通常使用benjamin - hochberg方法进行。如有必要，可采用非参数Kruskal-Wallis单因素方差分析和Wilcoxon秩和检验进行组间比较。对于人类临床样本的定量TDP，随机截距的线性混合效应模型可以进一步表征人类个体之间的异质性。作者还介绍了一些TDP软件，例如，TopPIC、MSPathFinder、TopMG和pTop等。应用作者在这一部分列举了许多相关研究，考虑到篇幅限制，感兴趣的读者可以在原文中的Application部分查看。主要包括（1）全球蛋白分子形式的发现。（2）癌症：例如，一项全球TDP研究从结直肠癌细胞的2332种蛋白质中鉴定出23000多种蛋白分子形式，并揭示了转移性和非转移性细胞之间蛋白分子形式水平的巨大差异。（3）心血管疾病：将蛋白质组学应用于心脏生物学和临床诊断已经取得了进展。例如，TDP分析了“CARDIA研究”中的配对血清样本，揭示了载脂蛋白AI和AII与心脏代谢指标之间的蛋白分子形式特异性关联。（4）神经退行性疾病：失调的PTMs可以影响神经退行性疾病中的蛋白质聚集，许多PTMs是神经退行性疾病中蛋白质病变的调节剂。例如，阿尔茨海默病受到β或tau淀粉样蛋白磷酸化和β淀粉样蛋白中异天冬氨酸形成的影响。（5）传染病。（6）生物制剂：例如单克隆抗体，抗体偶联药物等基于蛋白的药物。（7）临床TDP，例如，使用MALDI-TOF-MS鉴定病原体，它可以直接从完整的细菌细胞表面快速检测到蛋白分子形式。重现性与数据存储TDP是一个相对较新的领域，与成熟的BUP方法不同，普遍接受的实验方法和数据报告标准尚未制定。由CTDP（Consortium for TDP）领导的标准化工作正在推动实验室间的比较，以更好地了解挑战并提高重现性。蛋白分子形式易受样品处理和仪器方法变化的影响，因此科学的严谨性和充分的数据报告实践非常重要。所有TDP数据都应公开提供。许多期刊已经实现了这一要求，但这需要共同的努力来确保正确的数据处理和报告实践得到执行。CTDP的Proteoform Repository为科学家提供了一个独特的中心，可以浏览存储的蛋白分子形式并提供TDP数据集。数据存储库对于TDP数据遵守FAIR数据存储标准是必不可少的。将TDP数据集平台化并作为中央存储库的新途径和举措将对促进TDP数据的可访问性和共享非常有价值，这反过来将使TDP领域受益。面临的挑战与优化策略TDP的新技术在不断地发展，但是仍旧面临着诸多的挑战：（1）灵敏度。传统的TDP工作流程需要大量的样品（微克级的总蛋白或者数百万的细胞），以获得高质量的数据。新的高灵敏度的方法正在开发，例如CE-MS可实现对于单个细胞的检测，Nanopots技术可用于TDP，还有可以提高蛋白提取率的表面活性剂与尿素联用。（2）高分子量的蛋白质分子形式。高分子量的蛋白质难分离、信号差、仪器负担大。这就需要超高分辨率的平台，如FTICR质谱仪。在质谱分析之前，基于SEC或凝胶技术的基于尺寸的分离方法，例如，整合蛋白质组学方法或PEPPI-MS，可以解决大离子分析的挑战。但是没有单一的分离策略或者MS/MS仪器可以分析整个蛋白质组，需要开发新方法、新仪器以及改进的信息学工具来克服。（3）蛋白质的串联质谱。蛋白质在序列末端的片段化效率较高，而在中间的片段化覆盖率有限。这种差异在较大的蛋白质中更为明显，并且被认为是由于在变性条件下仍然存在的。内部碎片离子是由至少两个骨干断裂产生的，没有N或C端，在TDP碎片离子中越来越多地被考虑。最近开发的TDP软件ClipsMS可以将内部片段质量分配给蛋白质序列，从而提高整体覆盖深度。（4）定位修饰位点。由于不稳定的PTMs，低丰度的蛋白形式，PTMs的实验定位和蛋白质分子形式化学成分的精确表征具有挑战性。富集策略可以增强低化学计量或低丰度信号；还需要优化特定的碎片方法，例如，通过使用更温和的基于电子的方法，如ETD或ECD。（5）通量问题。TDP相对较低的吞吐量和较高的数据复杂性是新老用户的主要障碍。基于发现的TDP数据处理包括去卷积和数据库搜索，这可能需要几个小时到几天，具体取决于软件性能和搜索参数。自动制备和分离系统的发展，以及软件性能的提升都有助于改善通量的问题。展望TDP是目前唯一能够确定蛋白质形分子形式特征并量化其丰度的技术。由于蛋白质分子形式的基本重要性及其作为细胞、环境或生物系统健康标志的潜在作用，TDP技术有望继续快速发展。需要解决的两个关键领域是改进复杂蛋白质分子形式混合物的深度表征和大分子量蛋白的识别和表征。一个令人兴奋的发展是单离子测量，它可以在现有的商业仪器和专门的前体类型上实现。液相色谱固定相、CE-MS、基于IMS的分离的发展以及与多维方法的整合将继续改善蛋白质组学的测量。利用基因组、转录组以及BUP的信息，可以构建更精准的数据库，用于分析一些更复杂的PTMs，例如蛋白的糖基化，这也是TDP的一个优化方向。为了将蛋白质分子形式与相关的可测量输出(例如转录物和代谢物)联系起来，并破译生物学的基本原理，可以将多组学的测量结合起来。此外，通过结合微流体、质谱成像和单离子测量等先进技术，有望将单细胞和空间生物学扩展到蛋白质分子形式分析。本文发表在Nature Reviews Methods Primers 上，Top-Down Proteomics[1] ，通讯作者是美国威斯康辛大学麦迪逊分校化学系的Lloyd M. Smith和Ying Ge教授。文章介绍了Top-Down蛋白质组学的基本工作流程、应用以及面对的挑战。[1] Roberts, D.S., Loo, J.A., Tsybin, Y.O., et al. Top-down proteomics[J]. Nature Reviews Methods Primers，2024，4(1)：38.

研究蛋白质热稳定性的几种方法蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长得样子其实都是不同的。蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(meltingtemperature，Tm)来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 01 圆二色谱法（CD）圆二色光谱（简称CD），或红外（傅里叶变换红外（FourierTransformInfrared，FTIR）光谱），是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单的方法。圆二色谱法诞生于20世纪60年代，其原理是利用左、右两束偏振光透过具有手性结构的生物大分子等活性介质，获得的圆二色谱来分析其结构特点，是蛋白质、核酸、糖类等生物大分子二级结构分析的常规手段之一。蛋白由α螺旋和β折叠构成，α螺旋和β折叠在红外和紫外光段有特异的光吸收。蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收存在差异，利用远紫外区（190~260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别出蛋白质的三级结构类型，变温过程中测量蛋白等物质的圆二色谱，能反映其随温度升高结构变化的趋势。此外，通过测定蛋白质在不同温度下的平均残基摩尔椭圆度[θ]可以获得蛋白质的Tm值。特点：圆二色光谱（CD）适用于测定稀释溶液的热稳定性，操作相对简单，成本较低。但是相关仪器很昂贵，对缓冲液要求也高，要求溶液不能有任何的紫外吸收，也很难做到高通量检测。 02差示扫描量热法（DSC） 蛋白变性时会有温度变化，检测温度变化就能知道蛋白变性程度。差示扫描量热法的应用始于20世纪60年代，是在程序控温下，通过测量输给待测物和参比物的功率差与温度的关系，以获得吸放热量的技术。差示扫描量热法能定量测量热力学参数，可提供与蛋白质热变性过程中构象变化有关的热效应信息。差示扫描量热法（DSC）是一个很经典的一个技术，基于的蛋白变性过程中对热量的吸收。蛋白是有三维结构的，比如氢键，疏水键，范德华力。一旦通过加热然后把结构破坏掉，需要吸收热量。所以可以测量热量变化，就是加热结构变化过程中的热量吸收。通过对参照物和样品同时进行升温或冷却处理，测定两者为保持相同温度所产生的热量差，从而计算蛋白质的Tm值。特点：差示扫描量热法（DSC）能够提供直接的热量变化数据，定量准确、操作简便。但检测通量低、耗时较长，需要的样品体积和浓度比较大。相关仪器中最核心的部件是样品池，对周围环境要求极高。 03 动态光散射法（DLS）动态光散射是基于光学的方法，检测的是蛋白变性之后会发生聚集，导致颗粒的大小发生改变，对散射信号的影响。蛋白在变性过程中，从一个规则高级折叠结构打开，变成一个线性的松散结构。本来外部是亲水的氨基酸，内部是疏水的氨基酸。一旦打开之后，这些疏水的氨基酸会相互就是结合到一起。就是因为疏水的一个相互作用，然后变成一个球状聚集体。此过程会引起这个光的散射的变化。基于动态光散射的信号随着加热的过程的变化就代表粒径的变化，可以计算出蛋白质的Tm值。动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。特点：动态光散射可以做到孔板式的检测，具有比较高的通量。但是对于某些样品的检测有限制，因为并不是所有的蛋白在变异之后都会形成这种聚集体，而有一些可能需要很高的浓度才会提升，浓度较低条件下，就观察不到粒径的变化。 04 外源差示扫描荧光法（DSF）差示扫描荧光（DSF）也被称为热荧光法（ThermoFluor），是一种经济高效且易于使用的生物物理技术，通过检测当温度升高或变性剂存在时荧光发射光谱的相应变化来确定蛋白质的变性温度(热变性温度Tm值或化学变性Cm值)。Pantoliano等最先应用此技术测定了上百种蛋白质的热稳定性。差示扫描荧光法分为添加外源荧光染料与不添加荧光染料两种方式，都是利用加热使蛋白内部疏水基团暴露这一特点进行检测Tm值。传统DSF经常使用350/330比值法来进行数据分析根据荧光源不同分为内源荧光DSF和外源荧光染料DSF。基于外源染料荧光的DSF其原理是利用能与蛋白内部疏水基团相互作用的染料为荧光源。蛋白质加热变性后疏水基团暴露，疏水基团与亲和性染料结合产生荧光信号，检测荧光强度变化测定蛋白质的Tm值。特点：借助荧光定量PCR适用于高通量筛选，信号强度可控，灵敏度和准确性都较高。但添加的外源染料可能会对蛋白质结构和功能产生影响，且操作较复杂，不适用于所有蛋白研究。比如做膜蛋白研究时，溶液环境中需要添加双亲性的分子，一端疏水一端亲水。这种情况荧光分子会直接结合到疏水端，导致直接产生荧光信号。并且染料种类的选择、浓度的选择也很繁琐。外源荧光染料DSF也可能会产生背景荧光以及非特异吸附等假阳性结果。 05 内源差示扫描荧光法（inDSF）内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时(如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(RedShift)，即向更大的波长区域移动。特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验过程简单方便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，所以对于部分样品检测灵敏度不够，且检测可能会受其他基团影响。 06 技术对比总结总得来说，DSF和DLS法在样品用量及测定效率上更有优势，比较适合进行高通量筛选。但DSF法需要样品含有色氨酸、酪氨酸或额外添加荧光染料，这可能会对样品测量范围带来一定限制，DLS对样品浓度有要求。DLS还可以获取聚集体粒径大小的信息。DSC法虽然在样品用量与检测效率上不及DSF，但作为量热的经典方法仍是不可缺少的Tm值测量手段，在进行批量样品的热稳定性筛选时，可以使用DSF法初筛，DSC法复筛。此外，DSC能测定蛋白质变性过程中的热容变化ΔCp、焓变ΔH、解折叠自由能ΔG、玻璃态转变温度、分子流动临界温度等其他重要热力学参数。CD作为检测蛋白二级结构的经典方法，在Tm值测定方面具有其独特优势和一定的局限性，也是研究加热过程中蛋白结构改变的重要方法。蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响，研究结构域改变与功能活性改变关联性等。比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点。 07 国产蛋白稳定性分析仪PSA-16 北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产蛋白稳定性分析仪，该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需荧光染料、高通量、低样品消耗量的检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。 多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16在各学科的研究中都有重要的意义。1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4. 抗体偶联药物（ADC）研究5. 多结构域去折叠特性研究6. 物理和化学条件强制降解研究7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10. 蛋白纯化条件快速优化等

人类和老鼠的外貌可说是天渊之别，但实际上他们却有着近99%相同的基因组。何以&ldquo 失之毫厘差之千里&rdquo ？正是蛋白质放大了他们基因上的细微差别。 日前，中国人类蛋白质组计划全面启动。&ldquo 基因组学中微小的差异，在蛋白质组学中可以被千倍甚至几近万倍地放大。&rdquo 亚太蛋白质组组织主席、中国科学院院士贺福 初表示，这一计划的实施将对基因组序列图进行&ldquo 解码&rdquo ，进而全景式揭示生命奥秘，为提高重大疾病防诊治水平提供有效手段。 解码生命的&ldquo 密钥&rdquo 提起蛋白质，大家并不陌生。它是生物体内一种极为重要的高分子有机物，约占人体干重的54%。 不过，&ldquo 蛋白质组&rdquo 一词却鲜有人了解。其实，蝴蝶由卵变虫、成蛹、再破茧成蝶，幕后&ldquo 操盘者&rdquo 并非基因组，而是蛋白质组。&ldquo 1994年澳大利亚科学家率先提出蛋白质组这个概念，指某个时刻、某个组织、器官或个体中所有蛋白质的集合。&rdquo 贺福初说。 科学家们之所以对蛋白质组产生浓厚兴趣，还要从人类基因组计划说起。2003年4月，耗资27亿美元、经由6国科学家历时13年奋战的人类基因组计划，以人类基因组序列图的绘制完成为标志，画上了句号。 没想到，更大的挑战还在后头&mdash &mdash &ldquo 科学界曾经认为，只要绘制出了人类基因组序列图，就能了解疾病的根源，但是错了&rdquo 。国际蛋白质组组织启动计划主席萨姆· 哈纳什说，事实上，我们此时只了解10%的基因的功能，剩下的90%仍是未知的。 &ldquo 人类基因组计划并不像事前所预期的那样，能够逾越蛋白质这一生物功能的执行体层次，揭示人类生、老、病、死的全部秘密。基因组序列只是提供了一维遗传信息，而更复杂的多维信息发生在蛋白质组层面。&rdquo 贺福初表示。 就 人体而言，各个器官的基因组是一样的，而它们之所以形态、功能各异，正是其结构与功能的物质基础&mdash &mdash 不同的蛋白质组在&ldquo 操盘&rdquo 。&ldquo 就像蛹化蝶，无论形态如 何变化，基因组是不变的。&rdquo 军事医学科学院放射与辐射医学研究所研究员钱小红说，人的每一种生命形态，都是特定蛋白质组在不同时间、空间出现并发挥功能的 结果。比如，某些蛋白质表达量偏离常态，就能够表征人体可能处于某种疾病状态。 &ldquo 无论是正常的生理过程还是病理过程，最直接的体现是蛋白质以及它们的集合体&mdash &mdash 蛋白质组。&rdquo 上述专家们表示。&ldquo 生，源于基因组；命，却一定由蛋白质组决定。只有蛋白质组才能根本阐释生命。&rdquo 贺福初说。 独辟蹊径的&ldquo 中国画卷&rdquo 事实上，早在上世纪90年代人类基因组计划成形之际，已有科学家提出解读人类蛋白质组的想法。其目标是，将人体所有蛋白质归类，并描绘出它们的特性、在细胞中所处的位置以及蛋白质之间的相互作用等。 《科学》杂志在2001年，也将蛋白质组学列为六大科学研究热点之一，其&ldquo 热度&rdquo 仅次于干细胞研究，名列第二。 不过，严峻的现实挑战，让这一想法迟迟停留在&ldquo 纸上谈兵&rdquo 阶段。&ldquo 生物蛋白质数的差别大概是基因数差别的三个数量级左右，人类基因总数大概2万多个，人体内的蛋白质及其变异、修饰体却是百万级的数量。&rdquo 贺福初表示。 不仅如此，人类基因组图谱只有一张，而蛋白质组图谱每个器官、每个器官的每一种细胞都有一张，且在生理过程和疾病状态时还会发生相应改变。工程的艰巨性可想而知。 但困难并未阻挡住科学家们对其探索的脚步。1995年，首先倡导&ldquo 蛋白质组&rdquo 的两家澳大利亚实验室分别挂牌成立蛋白质组研究中心。随后欧美日韩等国均有行动。 1998年初，从事基因组研究的贺福初敏锐地嗅到这朵夜幕后悄然盛开的&ldquo 莲花&rdquo ，逐渐将精力投入到这个新兴领域。 2001年，&ldquo 基因组会战&rdquo 尚未鸣金，《自然》、《科学》杂志即发出&ldquo 蛋白质组盟约&rdquo 。同年秋，&ldquo 人类蛋白质组计划&rdquo 开始孕育。 2002 年4月，贺福初在华盛顿会议上阐述&ldquo 人类肝脏蛋白质组计划&rdquo 。同年11月，&ldquo 人类血浆蛋白质组计划&rdquo &ldquo 人类肝脏蛋白质组计划&rdquo 正式启动，贺福初担任&ldquo 人类 肝脏蛋白质组计划&rdquo 主席。其后两年间，德国牵头的&ldquo 人类脑蛋白组计划&rdquo 、瑞士牵头的&ldquo 大规模抗体计划&rdquo 、英国牵头的&ldquo 蛋白质组标准计划&rdquo 及加拿大牵头的 &ldquo 模式动物蛋白质组计划&rdquo 相继启动。 然而，很少有人知道，这种以生物系统为单元的研究策略酝酿之初饱受诟病。贺福初回忆，在华盛顿，中国人提出蛋白质组计划必须按生物系统（如器官、组织、细胞）进行一种战略分工和任务分割，一石激起千层浪，争议四起。 &ldquo 要想通过分工合作来完成全景式分析人类蛋白质组的宏大目标，必须以人体的生物系统作为研究单元和分工的规则。这个策略，10年来合者渐众，不过目前仍存争议，中国的先见之明可能得在下个10年成为不可阻挡的潮流。&rdquo 贺福初坦陈。 定位疾病的&ldquo GPS&rdquo 历经10余年的努力，以贺福初为代表的中国蛋白质组研究团队，在该领域向世界交了一份漂亮答卷： 成功构建迄今国际上质量最高、规模最大的人类第一个器官（肝脏）蛋白质组的表达谱、修饰谱、连锁图及其综合数据库； 首次实现人类组织与器官转录组和蛋白质组的全面对接； 在 炎症诱发肿瘤等方面，发现一批针对肝脏疾病、恶性肿瘤等重大疾病的潜在药靶、蛋白质药物和生物标志物。如，2008年，张学敏课题组首次发现炎症和免疫的 新型调控分子CUEDC2，可作为肿瘤耐药的新标志物，从而为克服癌细胞耐药提供了原创性的药物新靶点和治疗新思路。2010年，周钢桥课题组&ldquo 逮到&rdquo 肝 癌的易感基因，为肝癌的风险预测和早期预警提供了重要理论依据和生物标记。2012年，张令强课题组研制出世界上首个能特异性靶向成骨细胞的核酸递送系 统，提供了一种基于促进骨形成的全新骨质疏松症治疗途径，向解决骨丢失无法补回这一医学难题迈出了坚实的一步。2014年，张令强课题组首次在国际上揭示 泛素连接酶Smurf1是促进结直肠癌发生发展，并且导致病人预后差的一个重要因子&hellip &hellip 上述几项成果均发表于国际顶级的《科学》、《自然》系列杂志。 还没来得及分享这一喜悦，激烈的角逐又让他们绷紧了神经。日前，英国《自然》杂志公布美国、印度和德国等合作完成的人类蛋白质组草图。研究人员表示，这一成果有助于了解各个组织中存在何种蛋白质，这些蛋白质与哪些基因表达有关等，从而进一步揭开人体的奥秘。 &ldquo 尽 管还有许多不完善的地方，但确实是蛋白质组学领域乃至整个生命科学领域，具有里程碑意义的科学贡献。&rdquo 中国科学院院士饶子和直陈。中国科学院院士张玉奎指 出，虽然中国在蛋白质组的一些领域走在了世界前列，但国外有些团队正快马加鞭，我们不得不警醒，否则很快将被甩出第一阵营。 6 月10日，中国人类蛋白质组计划全面启动实施。&ldquo 蛋白质组，可以揭示疾病的发病机制和病理过程，发现新型诊断标志物、治疗和创新药物，可以全面提高疾病防 诊治水平。这个项目完成后，将揭示人体器官蛋白质组的构成，一旦哪一部位出现异常即可实现&lsquo GPS定位&rsquo ，进而找到针对性的诊断措施、干预措施和预防措 施。&rdquo 记者了解到，中国人类蛋白质组计划第一阶段，将全面揭示肝癌、肺癌、白血病、肾病等十大疾病所涉及的主要组织器官的蛋白质组，了解疾病发生的主要异常，进而研制诊断试剂以及筛选药物。这将在2017年左右完成。 &ldquo 这是真正的原始创新，也是中国能够引领世界科技发展的重要领域之一。&rdquo 贺福初强调说。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

引言准确预测蛋白质-配体(在本文的语境中，配体意指小分子有机化合物)的结合构象是计算生物学中的一项重要任务。一方面，它有助于人们理解蛋白质与内源小分子或药物分子的互作机制。另一方面，在药物设计或药物筛选(无论是单个蛋白-多个配体的正向筛选，还是单个配体-多个蛋白的逆向筛选)的过程中，也离不开对复合物构象的准确预测：这是准确计算蛋白质-配体结合稳定性(亲和力)的必要条件。对于给定蛋白和给定配体分子，依据是否已知结合口袋(也称配体结合位点)可以将复合物构象预测任务分为两类：口袋未知的盲对接(blind docking)任务和口袋已知的局部对接(local docking)任务。其中，盲对接任务是更普遍的、更富有挑战性的任务。在传统的对接流程中，这一任务又被划分为几个子任务：先借助口袋搜索算法确定可能的结合位点(即，转化为局部对接任务) 再利用构象生成(采样)方法生成大量可能的复合物构象，并依据打分函数评价各个构象(即，进一步确定配体的位置、朝向，以及各个键对应的扭转角) 挑选出打分值最优者作为最终结果。但是，对接过程面临着打分函数不够准确、构象搜索空间巨大导致计算耗时过长等挑战。比如，对于后者，文献[1]计算结果表明：对于单个配体复合物的盲对接任务而言，借助GNINA和Glide这两款传统的对接软件，生成百万量级的复合物构象并从中挑选最优者，平均耗时分别约为150 s和1500 s。在巨型分子库的(如ZINC 15数据库，含有约数十亿个化合物分子[2])虚拟筛选过程中，使用传统方法逐一对接每个分子在计算速度上是不可接受的。而数据驱动的机器学习方法为优化各个子任务的准确性和计算效率带来希望。此外，同样基于机器学习方法，部分研究者发展出“端到端”的、更为直接的对接流程：训练一个拟合自由能面(free energy landscape)的模型，无需将原有的对接任务划分为多个子任务，以蛋白质与配体的三维结构为输入，输出即为可能的复合物构象。参照Anfinsen提出的蛋白质折叠热力学假说，可以设想：如果存在一个能量函数，能够将复合物在三维空间下的所有状态映射到它对应的自由能，那么可以将复合物构象预测问题转化为该能量函数的最优化问题[3]。这是机器学习拟合自由能面的出发点。与传统的对接方法相比，这样的方法也同样可能在准确性和计算效率等指标上得到提升。本文将针对口袋搜索、构象生成、打分函数、自由能面建模这四个方向：整理相应的评价体系，包括常用的评价指标或测试集 挑选并简要介绍部分具有代表性的机器学习模型 结合模型评估实验讨论当前模型或评价体系存在的不足以及未来可能的发展方向。1.机器学习口袋搜索 1.1 评价体系目前存在两种描述蛋白质-配体结合口袋的方式。其中一种方法借助蛋白质表面的点云(surface points)来描述。这种方法被称作以配体为中心(ligand-centric)的方法。另一种方法则借助蛋白质上的原子来描述，那些蛋白质上的、与配体重原子距离小于一定阈值的重原子被定义为配体结合原子。这种方法被称作以蛋白质为中心(protein-centric)的方法。这两种描述方法相应地衍生出两类评价指标。对于前者，通常以配体原子中心距(预测的口袋中心与配体任意原子的距离，distance between the center of the predicted site to any atom of the ligand，DCA)、配体中心距(预测的口袋中心与配体中心的距离，distance between the center of the predicted site to the center of the ligand，DCC)、体素交并比(预测的口袋体积与配体所占据的空间体积的交并比，discretized volume overlap，DVO)等指标来衡量[4][5]。直观上，在这三个指标中：DCA最为宽松(只需大致判断配体位置)，DCC更为严格(额外考察了配体大小)，DVO最为严格(额外考察了配体构象)。但在多数文献中，常使用DCA和DCC这两个指标，并以4 Å作为预测成功与否的阈值[4]。对于后者，Yan等人以原子水平的交并比(Intersection over Union)来衡量[6]。具体地，计算预测的配体结合原子与标注的配体结合原子的交集与并集的比值。这也是机器学习目标检测任务中的常用指标。1.2 模型方法目前发展的大多数口袋搜索算法，都是以搜索蛋白质表面点云为目标。例如Krivák等人于2015年提出的P2Rank[7]：刻画蛋白质Connolly点云中各个点的物化特征，并使用随机森林模型对每个点进行可靶性预测，最后对点聚类得到口袋预测结果。以DCA为评价标准，P2Rank在多个数据集上表现优于传统方法Fpocket。Krivák等人后续还提供了P2Rank的网络服务[8]，并对多种方法口袋搜索方法进行了更加全面的总结和比较，其中包括Jiménez等人于2017年开发的、使用3D网格(体素)刻画结合位点的DeepSite[9]。值得一提的是，在Krivák等人的结果中(测试数据集为COACH420、HOLO4K，评价指标DCC)，DeepSite表现不及Fpocket 而在Jiménez等人的结果中(测试数据集CHEN251，评价指标DCC、DVO)，DeepSite表现显著优于Fpocket。最近，Yan等人另辟蹊径，以鉴定蛋白质上的配体结合原子为目标，发表了PointSite方法[6]，并声称其在多个数据集上(包括COACH420、HOLO4K、CHEN251等等，以原子水平的交并比为评价指标)取得了SOTA。Yan等人将口袋搜索问题转化为计算机视觉领域的点云分割问题 此处的点以蛋白质上的原子表示，以充分挖掘原子之间的键连特征。此外，作者还指出：将PointSite方法引入到其它口袋搜索方法如FPocket、P2Rank中(具体而言，使用点云分割的结果对后者的预测结果进行过滤)，可以进一步提升配体结合位点的鉴定效果。1.3 讨论从以上几种方法的评估实验中可看出，模型在不同测试数据集上的相对表现可能存在差异，因此需要建立一套统一的、合适的数据集进行测试。另外，在训练数据集的准备过程中，将未鉴定到配体结合的位点直接划分为负样本也值得考量。2.2在具体使用建议上，最近有研究将口袋搜索方法引入到完整的对接流程中[10][11]，相较于FPocket、P2Rank等方法，PointSite表现最优。　　2. 机器学习构象生成 2.1 评价指标对于构象生成模型而言，需要考察所生成构象的多样性和准确性，由此分别衍生出两类指标：覆盖率(COV，coverage)和匹配程度(MAT，matching metrics)。针对测试集中的每一个构象：查看是否能够在生成的构象集合里找到RMSD值小于给定阈值的构象(如果能，则表示该模型能够覆盖当前测试构象)，可以计算得到覆盖率 计算生成的构象集合与当前测试构象的最小RMSD值，取平均可以得到匹配程度的值。以上是从测试集的角度衡量模型表现(召回率) 相应地，将测试集构象与生成集构象在计算中对调，则可判断模型的准确率。目前常见的测试数据集包括GEOM-QM9和GEOM-Drugs[12]。2.2 模型方法构象生成模型沿着两个思路发展：直接生成各个原子的3D坐标 先生成原子对距离、二面角等中间参数，再将分子3D坐标还原。对于前者，技术难点在于保证模型对于输入分子的旋转-平移不变性(整体改变分子坐标，得到的构象是相同的，也即对齐过程)。对于后者，则可能生成不合法的中间参数(比如违反三角几何关系)，或者中间参数的误差在训练过程中不断累积，影响分子3D坐标重构，需要进行后续的力场优化 但这是目前大多数方法所选取的道路。此处简要介绍最近发展的GeoDiff模型[13]和DMCG模型(Direct Molecular Conformation Generation)[14]。Xu等人于2022年提出GeoDiff，使用扩散模型直接生成原子坐标。GeoDiff在GEOM-Drugs数据集上测试集覆盖率可达约89%、匹配程度约0.86 Å，并且经过力场优化之后可以进一步提升模型表现。作者指出：在逆向扩散过程中(生成过程)，如果某一时刻T的密度函数具有旋转-平移不变性，且逆向生成的条件概率函数具有旋转-平移不变性，则T时刻以前任意时刻的密度函数也具有旋转-平移不变性。同年， Zhu等人提出基于变分自编码器的DMCG模型，在GEOM-QM9和GEOM-Drugs数据集上均取得最优(对于后者，覆盖率约96%，匹配程度约0.70 Å)。作者指出：模型除了满足旋转-平移不变性外，对于对称结构还应当满足置换不变性(交换对称原子的坐标，得到的构象是相同的)。为此，计算任意旋转-平移操作以及对称原子置换操作下的两个结构的距离最小值，并将其引入损失函数中，以满足以上两种不变性。消融实验表明，如果不考虑这一项损失，则覆盖率将下降约20个百分点，匹配程度将提高约0.3 Å。2.3 讨论今年3月，Zhou等人[15]基于RDKit设计了一种简单的生成算法：使用RDKit分别采样二面角、采样几何片段、采样能量并生成相应的构象，随后按照能量大小进行聚类。在GEOM-QM9和GEOM-Drugs两个数据集上，与GeoDiff、DMCG等深度学习方法相比，该算法几乎在所有指标上取得SOTA。作者认为，目前的测试基准不足以覆盖实际应用中(如分子对接中)涉及的构象生成任务。　　事实上，生成足够的分子构象不会降低测试构象集上的匹配程度和覆盖率(召回率)，但可能降低生成构象集的相应指标(查准率)。而Zhou等人(包括Zhu等人的DMCG)并未在文中给出关于后者的模型评价，因此模型的实用性仍有待考察。另外，目前的构象生成方法均以单个配体的势能极小值作为优化目标，针对(已知口袋的)复合物中配体的构象生成模型仍有待开发。最后，GeoDiff模型与DMCG模型的发展也启示我们挖掘任务目标中蕴含的性质(对称性、不变性)，在模型训练中引入合适的归纳偏置。　　3. 机器学习打分函数3.1 评价指标Su等人[16]于2019年建立了一套打分函数的基准测试数据集CASF-2016。CASF-2016及其前身CASF-2013已被广泛用于评估打分函数的表现。同时，Su等人设计了四类指标分别考察打分函数的打分能力、排名能力、对接能力和筛选能力。打分能力通常以Pearson相关系数来衡量：考察天然蛋白复合物的计算打分值与实验结合常数的对数之间的线性相关性。排名能力通常以Spearman等级相关系数或Kendall等级相关系数来衡量：对于同一蛋白、不同配体的多个天然蛋白复合物结构，考察计算打分值给出的排名与实验结合常数给出的排名之间的匹配程度。对接能力以对接成功率衡量：对于单个复合物，在天然配体结合构象和一系列计算生成的诱饵分子构象(decoy)中，若计算打分最高者与真实结合构象的RMSD小于2 Å，则认为对接成功 对于多个复合物，进一步计算对接成功率。筛选能力以筛选成功率衡量：在天然配体和一系列其它配体分子中，计算打分前1%(5%、10%)结果里包含天然配体的比例。由此可见，打分能力直接以实验数据作为参考，是评估打分函数是否可靠的基本测试。排名能力是对打分能力的补充。打分能力越好，排名能力通常也越好 反之则未必成立(存在对实验结合常数进行非线性拟合的打分函数)。对接能力测试将计算生成的构象引入测试集中，因此更贴近实际对接操作、对于打分函数的选择更具参考意义。需要指出的是，对接能力测试给出的结果通常只能代表该打分函数的对接能力上限，在CASF-2016的测试中可能呈现分数虚高的情形(在测试中能够以90%的成功率在top-1中挑选出天然配体构象，但在实际应用中却不能达到这一表现)。这主要归结于实际应用中计算生成的构象不够充分。筛选能力涉及多种配体的对接，因此可视为对排名能力和对接能力的综合考察。3.2 模型方法针对打分函数的机器学习方法，前人已给出详尽的综述[17][18][19]。本文将展开介绍经典的ΔVinaRF20打分函数[20]，以及最近发展的DeepDock[21]和RTMScore[22]。ΔVinaRF20由Wang等人于2016年提出，在CASF-2013、CASF-2016测试集上的各指标中均排名靠前[16][20]。具体地，在CASF-2016测试集上，ΔVinaRF20在打分能力和排名能力两个指标上分别以0.82和0.75取得最优，在对接能力上以89.1%(top1)仅次于Autodock Vina(90.2%)，在正向筛选能力以42.1%(top1)取得最优、逆向筛选能力以15.1%(top1)位居第五(次于最优方法ChemPLP@GOLD约2.4%)。Wang等人指出：机器学习打分函数与经典的打分函数在这些指标中各有所长，前者长于打分，后者长于对接和筛选。因此作者拟结合二者优点：一方面对训练集进行数据增强，将计算生成的诱饵结构引入训练集中(同时计算估计亲和力作为标签)，以提高机器学习打分函数的对接和筛选能力 另一方面使用随机森林方法对AutoDock Vina中的打分函数进行参数化修正(使用Δ-machine learning方法，类似残差拟合)。Méndez-Lucio等人于2021年提出的DeepDock方法在CASF-2016的正向筛选和逆向筛选能力评估中分别以43.9%和23.9%取得SOTA，但DeepDock给出的打分值与实验结合常数的对数之间不存在相关性(在训练过程中未引入实验结合常数的相关信息)。DeepDock方法使用二维分子图刻画配体、多面体网格点刻画蛋白质口袋(参考了MaSIF的编码框架[23])，分别学习蛋白质口袋与配体原子的节点表示 随后两两组合配体和靶蛋白的节点形成节点对，使用混合密度函数拟合节点对的距离分布(概率密度函数)。作者指出：相较于通过最小化距离误差来学习节点对距离的平均值，混合密度函数能够学习训练集中节点对多个可能的距离，从而更好地刻画构象预测任务中的多值特性。在DeepDock的基础上，Shen等人从两方面进行改进得到RTMScore：一方面，使用无向图编码蛋白质口袋残基，在编码过程中满足对于输入复合物坐标的旋转不变性 另一方面使用Graph Transformer模型以学习更深层次的特征。作者声称RTMScore在CASF-2016测试集上的对接能力和筛选能力达到SOTA，相较DeepDock得到大幅提升：对接成功率达到98.6%，正向筛选成功率达73.7%，逆向筛选成功率达38.9%。3.3 讨论DeepDock等方法的发展展现了图模型在捕获蛋白质-配体互作的潜力，以及直接拟合蛋白残基-配体原子距离似然函数的有效性。事实上，距离似然函数不仅能作为打分函数评估当前构象，还能够作为某种“势能面曲线”指导构象优化。此外，这些新近提出的DeepDock等方法有待更广泛的测试验证。在其它论文的评估实验中[24]，RTMScore在对接能力中依旧表现最优。但考虑到缺少打分能力、排名能力等测试数据，后续仍需要更多的测试评估(尤其是将打分函数整合到完整的对接流程中)以验证这些方法的可靠性。　　4. 机器学习自由能面4.1 评价体系拟合自由能面的模型直接处理盲对接任务，生成复合物构象。其中存在两类评价指标。一类指标评估计算准确性。通常以预测复合物(如果模型给出多个可能的构象，则选取打分值top-1者)中配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例来衡量模型对接能力。一般以2 Å作为对接成功与否的判断阈值[10]。还有通过配体质心距离小于2 Å(或5 Å)所占的比例来考察模型是否能够找到正确的结合口袋。此外，为判断生成的配体构象在化学上是否合理，Corso等人额外考察了配体构象中存在位阻冲突(steric clash，配体内部重原子之间的距离是否小于0.4 Å)的比例。另一类指标评估计算效率 这在大型分子数据库的虚拟筛选过程中同样不可忽视。以对接一个分子所需的平均CPU(如果可能，使用并行加速)或GPU时间来衡量。4.2 模型方法拟合蛋白质-配体自由能面的机器学习方法最近得到逐步发展，代表性的方法包括EquiBind[1]、TANKBind[25]、DiffDock[10]。Stärk等人于2022年提出基于图几何深度学习的EquiBind方法，在机器学习方法直接预测蛋白质-配体结合构象这一问题中做出开创性贡献。该方法以随机的配体分子构象(比如使用RDKit生成的构象)作为输入，无需经过大规模的构象采样即可在约0.1 s的时间内给出复合物结构。由此给出的结构在寻找结合口袋的能力上与传统方法(如QuickVina-W)相当(配体质心距小于2 Å的比例均约40%)，但在配体结合构象的预测上却表现不佳(配体RMSD小于2 Å的比例约6%，不及QuickVina、GLIDE等方法所达到的约20%)。虽然可以在该结构的基础上结合传统方法进一步微调配体位置和构象，但将增加预测所需的时间成本至数十秒或数百秒。同年，Lu等人提出TANKBind。相较于EquiBind，在保留推理速度(约0.5秒)的同时，TANKBind在配体构象预测上取得和传统方法相当的结果(配体RMSD小于2 Å的比例约19%)，口袋预测能力则获得较大提升(配体质心距小于2 Å的比例约56%)。不同于EquiBind对整个蛋白质进行编码的方法，TANKBind采用P2Rank寻找口袋位置，随后针对该位置的蛋白质区块(由半径20 Å内的残基构成)，拟合蛋白质残基与配体原子的距离。此外，受AlphaFold2的启发，TANKBind将三角几何约束引入残基与配体原子的距离建模中。消融实验表明，三角几何约束可以显著提升模型表现：配体RMSD小于2 Å的比例提升约15%，配体质心距小于2 Å的比例提升约12%。同年十月， Corso、Stärk等人提出DiffDock模型。该模型在对接准确性上首次实现了对传统对接模型的大幅超越。在holo态的蛋白晶体对接结果中，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例可达到38.2%，约为传统方法的两倍。这一结果对应于40次采样，消耗计算时间约40秒。与DeepDock想法类似，DiffDock使用生成模型来学习构象的概率分布并建立了一套相应的“扩散”方法(构象采样方法)。4.3 讨论今年2月，Yu等人[11]重新设计实验，考察了DiffDock等机器学习模型在盲对接任务中的哪一阶段领先传统方法、领先到何种程度。作者将盲对接任务拆分为口袋搜索和局部对接两个子任务，设计了三组实验：完全使用DiffDock等模型完成盲对接 使用其它方法搜索口袋(如前文所述的PointSite、P2Rank)，使用Uni-dock[26](一种基于AutoDock Vina 1.2的GPU加速对接方法)局部对接 使用DiffDock搜索口袋，使用Uni-dock局部对接。结果表明：DiffDock方法在口袋搜索中效果更佳(相较于PointSite等方法而言，引入了配体分子的结构信息)，但与ground truth、即表中的GT pocket相比仍存在提升空间 口袋确定，传统对接手段得到的结果优于DiffDock等机器学习模型。作者进一步指出：给定口袋下预测蛋白质-配体构象的机器学习方法是后续发展的方向(正如机器学习构象生成中所讨论的) 对于端到端的模型比较实验中，需要更审慎地评估传统方法的表现。另外，随着蛋白质结构预测方法的发展，评估模型在apo态蛋白质上的对接表现是有必要的，也是更符合实际情形的。事实上，目前几种模型所使用的训练集均为holo态蛋白(缺乏足够数量的与holo态对应的apo态蛋白结构)。为泛化模型的对接能力至apo态蛋白结构，通常采取折中方案：假定apo态与holo态的主链变动不大，而在模型编码过程中只使用主链碳原子的信息。DiffDock论文中首次评估了各种方法在ESMFold给出的蛋白质结构上的对接能力。结果显示，各模型的对接表现均显著下降(对于DiffDock而言，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例从38.2%下降至20.3%)。机器学习方法建模对接过程中蛋白质的结构变化仍然道阻且长。将分子动力学模拟过程中产生的动态信息引入模型中也许是一种可能的突破方向[27]。最后，正如AlphaFold2可作为打分函数评估蛋白质结构是否合理[3]，DiffDock等拟合自由能面的模型，其在打分函数的各项评价指标中表现如何也值得进一步探究。　　参考文献　　[1] Equibind: Geometric deep learning for drug binding structure prediction　　[2] Artificial intelligence–enabled virtual screening of ultra-large chemical libraries with deep docking　　[3] State-of-the-Art Estimation of Protein Model Accuracy Using AlphaFold　　[4] A Critical Comparative Assessment of Predictions of Protein-Binding Sites for Biologically Relevant Organic Compounds　　[5] Improving detection of protein-ligand binding sites with 3D segmentation　　[6] PointSite: A Point Cloud Segmentation Tool for Identification of Protein Ligand Binding Atoms　　[7] P2RANK: Knowledge-Based Ligand Binding Site Prediction Using Aggregated Local Features　　[8] P2Rank: machine learning based tool for rapid and accurate prediction of ligand binding sites from protein structure　　[9] DeepSite: protein-binding site predictor using 3D-convolutional neural networks　　[10] DiffDock: Diffusion Steps, Twists, and Turns for Molecular Docking　　[11] Do Deep Learning Models Really Outperform Traditional Approaches in Molecular Docking?　　[12] GEOM, energy-annotated molecular conformations for property prediction and molecular generation　　[13] GeoDiff: a Geometric Diffusion Model for Molecular Conformation Generation　　[14] Direct Molecular Conformation Generation　　[15] Do Deep Learning Methods Really Perform Better in Molecular Conformation Generation?　　[16] Comparative Assessment of Scoring Functions: The CASF-2016 Update　　[17] Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking　　[18] Protein–Ligand Docking in the Machine-Learning Era　　[19] From machine learning to deep learning: Advances in scoring functions for protein–ligand docking　　[20] Improving scoring-docking-screening powers of protein–ligand scoring functions using random forest　　[21] A geometric deep learning approach to predict binding conformations of bioactive molecules　　[22] Boosting Protein–Ligand Binding Pose Prediction and Virtual Screening Based on Residue–Atom Distance Likelihood Potential and Graph Transformer　　[23] Deciphering interaction fingerprints from protein molecular surfaces using geometric deep learning　　[24]: A fully differentiable ligand pose optimization framework guided by deep learning and a traditional scoring function　　[25] TANKBind: Trigonometry-Aware Neural NetworKs for Drug-Protein Binding Structure Prediction　　[26] Uni-Dock: GPU-Accelerated Docking Enables Ultralarge Virtual Screening　　[27] Pre-Training of Equivariant Graph Matching Networks with Conformation Flexibility for Drug Binding　　本文作者：ZF责任编辑：WFZ

p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 近日，浙江大学方群团队联合北京大学黄超兰团队在单细胞蛋白质组学分析研究领域取得了突破性进展。 /span 此项成果近日以全文形式在线发表于美国化学会的Analytical Chemistry杂志上(影响因子 6.32)，论文题目为“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/0d88aade-7372-4d68-b5da-4d57efa64b73.jpg" title=" 001.jpg" width=" 650" height=" 478" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 650px height: 478px " / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 图：纳升级油-气-液滴(OAD)芯片和自动定位(SAM)装置的结构示意图(a)和用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和上样的全流程图(b)。 /strong /span /p p 　　蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 单细胞内蛋白质含量极少，就典型体细胞而言仅为0.1- 0.2 ng，远远小于常规蛋白质组学样品前处理所需要的微克级蛋白量。 /span 并且细胞内的蛋白质通常需要在离心管内完成复杂多步的前处理操作，包括细胞裂解和蛋白质释放、蛋白质沉淀纯化、蛋白质还原和烷基化、酶切等，一个全细胞裂解蛋白质组的最后反应体积均是几十甚至过百微升，在这个蛋白质组学常规前处理的过程中，由于样品与离心管的接触、多步的样品转移和不完全上样等原因，在进入质谱之前不可避免地带来了蛋白质的损失。用此流程来处理单细胞，即使之后结合液相色谱仪器的自动进样阀可以以小于十微升的体积完成上样也无济于事，因为尚未等到分离蛋白质样品就有可能已经损失大半了。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/ce546442-97dc-4a87-a243-558d62afe43e.jpg" title=" 003.png" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 如果说单细胞蛋白质组学是在米粒上雕刻，那么两个团队就是造出了适合在米粒上雕刻的工具刀。 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究起自2014年，两个团队的研究人员协同合作将微流控液滴技术与蛋白质组分析技术相结合，发展了一种微型化的油-气-液“三明治”芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成少量细胞蛋白质组学分析所必需的多步样品前处理操作，并且实现了将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的液相色谱分离与质谱检测。 /span 通过采用优化后的芯片材料、裂解试剂、酶切比例和色谱质谱参数等实验条件，该芯片系统可以分别成功地从100、50、10和1个HeLa细胞内鉴定到1360、612、192和51个蛋白质。更重要的是，研究人员首次实现了以单个鼠卵母细胞为初始样本的蛋白质组学分析，一共鉴定到355种蛋白质，其中存在一系列与生殖发育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相关(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在该工作中，还采用两种常规的基于离心管的前处理方法进行了对照实验，实验结果明确证实了微流控液滴体系具有更低的样品吸附损失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白质鉴定能力等明显优势，更适用于微量蛋白质样品的蛋白质组学分析。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 此项研究带来三个突破 /span ：首先是成功发展了适合进行单细胞及类似微量样品的蛋白质组学分析样品前处理芯片和方法。芯片内550 纳升的液滴与芯片的接触面积仅为常规离心管模式下的十五分之一，显著减少了样品与反应器接触所带来的损失；二是发展了一种实现纳升级液滴的直接进样方法，利用3D打印加工的自动定位装置和高压气泵高效地(& gt 99%)将液滴样品注入到分析色谱柱内，完全避免了样品转移和经过液相仪器内复杂管路带来的损失；第三是为避免在常规微流控液滴系统中由于油相直接接触液滴而造成的缺陷，提出了一种采用气相来间隔液滴相和油相的新型液滴芯片结构，在成功防止液滴明显蒸发的同时，还避免了油相和液滴相直接接触带来的脂溶性样品的损失，也使系统能更方便地进行后续的分离柱进样、色谱分离和质谱检测。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 该项研究在基于质谱的单细胞及微量样品的蛋白质组学分析方面开启了全新的技术，其所具有的系统结构简单、容易搭建、操作方便、可靠性高等特点，使其有望被广泛应用到细胞间异质性的研究以及与临床相关的研究，包括稀有的循环肿瘤细胞分析、生殖细胞相关研究和疾病诊疗等方面，因此在未来具有巨大的持续开发和应用转化前景。 /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/91e71d83-0fde-4b69-8b5f-10de6af33876.jpg" title=" 未命名_meitu_0.jpg" width=" 400" height=" 400" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 400px height: 400px " / /span /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " （左上：浙江大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 方群、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右上： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 北京大学 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 教授 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄超兰、 /span /strong strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 左下： /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 浙江大学博士生李紫艺、 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 右下：前国家蛋白质科学中心· 上海高级工程师 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 黄敏 /span span style=" color: rgb(0, 112, 192) " ） /span /strong /p p 　　该论文的第一作者为浙江大学博士生李紫艺，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授。工作得到了国家自然科学基金和中国科学院杰出技术人才项目的支持。黄超兰教授的部分工作在前单位中科院国家蛋白质科学中心· 上海完成，特此鸣谢! /p p style=" line-height: 16px " img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/b0d2802c-066e-4fdf-86c9-b683f1c317de.pdf" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis.pdf /span /a /p p span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 文章链接： /span a href=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" _src=" https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661 /span /a /p

蛋白质组学与转化医学第七届中国蛋白质组学大会暨第三届国际蛋白质组学论坛 　　(第二轮通知) 　　为积极促进蛋白质组学的研究与发展，增进国际间合作交流，由中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO)和国际蛋白质组学论坛(IFP)主办，北京蛋白质组研究中心、国际蛋白质组学论坛组委会及浙江大学共同承办的第七届中国蛋白质组学大暨第三届国际蛋白质组学论坛定于2011年4月15日—18日在浙江省杭州市召开。 　　一、会议安排 　　本届会议设有大会报告、分会(专题)报告和墙报三种形式。大会将邀请蛋白质组学及相关领域的国际著名专家和教授作大会报告或专题报告，会议规模约1000人左右。 　　拟邀请大会报告人：路甬祥、陈 竺、沈 岩、饶子和、王红阳、贺福初 　　Roger Y. Tsien (诺贝尔奖获得者，University of California, San Diego, USA) 　　John Yates (The Scripps Research Institute, USA) 　　Ruedi Aebersold (Institute of Molecular Systems Biology, Switzerland) 　　Matthias Mann (Max Planck Institute for Biochemistry, Germany) 　　Amos Bairoch (Swiss Institute of Bioinformatics, Swiss) 　　Christopher M. Overal (University of British Columbia, Canada) 　　同时将邀请Profs. Gilbert Omenn, Henry Rodriguez, Daniel Chan, Julio Celis, PeipeiPing，秦钧, 刘斯奇, 杨芃原, 郑树森, 钱小红等 　　大会安排2011年4月15日上午举行“第七届中国蛋白质组学大会暨第三届国际蛋白质组论坛”开幕式及大会报告， 　　4月15日下午举办“国际蛋白质组学论坛” 　　4月16-17日召开“第七届中国蛋白质组学大会”， 　　4月15-16日中午举办蛋白质组学培训班。 　　会议同时举办与生物化学与分子生物学、蛋白质组学等研究领域相关的仪器、设备、试剂和新技术的展览、展示会。 　　二、会议议题 蛋白质组学与转化医学 组织/器官蛋白质组 蛋白质翻译后修饰 定量蛋白质组 蛋白质组新技术新方法 蛋白质相互作用 信号转导与调控 计算蛋白质组学 植物蛋白质组 代谢蛋白质组 临床蛋白质组 抗体及芯片 模式动物蛋白质组 结构蛋白质组 　　三、会议语言 　　英文 　　四、会议组织 　　组织单位 　　 主办单位：中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO) 　　国际蛋白质组学论坛(IFP) 　　 承办单位：北京蛋白质组研究中心 国际蛋白质组学论坛 浙江大学 　　 主 席：贺福初，Ping Peipei，段会龙 　　学术委员会 　　 主 席：John Yates (TSRI, USA) 　　Ruedi Aebersold (ETH-IMSB) 　　 委 员： (按姓氏汉语拼音顺序排列) 　　陈正军 陈志南 丁建平 高友鹤 何大澄 贺福初 李亦学 梁宋平 刘斯奇 　　刘银坤 钱小红 强伯勤 秦 钧 饶子和 施 前 施蕴渝 汪尔康 王红阳 杨芃原 杨晓明 张学敏 张玉奎 赵晓航 　　组织委员会 　　 主 任：贺福初 　　 副主任：杨芃原 杨晓明 秦 钧 　　 委 员：(按姓氏汉语拼音顺序排列) 　　陈志南 丁建平 高友鹤 何大澄 贺福初 李 明 梁宋平 刘斯奇 陆满晴 潘全威 钱小红 秦 钧 饶子和 施 前 王东根 徐 平 杨芃原 杨晓明 杨秀荣 张先恩 张玉奎 甄 蓓 　　 秘 书 长：钱小红 　　 副秘书长：甄 蓓 施 前 　　秘书处 　　 北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心 　　 联系人： 甄 蓓 北京蛋白质组研究中心 　　邓 宁 浙江大学 　　张雪莉 北京蛋白质组研究中心 　　 电 话：010-80705188 传 真：010-80705155 　　 E-mail：cnhupo@163.com 　　 会议网站：www.cnhupo-congress.cn 　　http://61.50.138.116/bprchy/cn 　　媒体支持 　　仪器信息网 生物谷中国卫生检验杂志 　　五、征文范围及要求(参照模版) 　　投稿论文收录入会议论文集，大会将组织优秀论文评选。参加会议代表将授予继续教育学分10分。 　　凡未在国内外公开刊物发表过的研究成果，均可投稿，具体要求如下： 　　征文范围：有关蛋白质组学及相关领域近年来研究的学术成果，以英文论文摘要形式投稿。 　　稿件要求：每篇论文摘要按正式发表论文要求撰写，300字以内，使用Word软件撰写。文责自负。(参照模版) 　　字体要求：标题—Times New Roman四号加粗 　　作者—Times New Roman五号居中，拟作报告者请在其姓名下方划一横线。 　　注：大会报告幻灯片一律要求英文准备 　　单位、地址、邮编、E-mail—Times New Roman小五号居中 　　摘要—Times New Roman五号 　　参考文献—Times New Roman五号 　　投稿方式：请登录 http://61.50.138.116/bprchy, 点击会议注册, 阅读注册须知, 在页面下端点击 “已阅读完注册须知,点击开始注册”, 进入注册界面. 红字显示选项为必填项. 用户ID请使用有效邮箱信息. 您可以登录网站修改您的个人信息及摘要信息. 注册之后,您可以根据需要提交会议摘要, 并进行酒店预订等. 　　E-mail:cnhupo@163.com 　　截至日期：论文摘要投稿截至日期为2011年3月15日 　　六、报到时间 　　2011年4月14日 　　七、会议注册费(国内代表) 　　2011年1月20日前注册：1200元(人民币)/位(在读学生：900元/位) 　　2011年1月20日后注册：1400元(人民币)/位(在读学生：1100元/位) 　　技术培训费(与注册费一并交纳)：200元(人民币)/位 　　八、注册须知 　　1.请与会代表携带本人身份证，学生代表需携带学生证。已交费代表请带好汇款凭证，以备核对。 　　2.注册代表权益： 　　正式代表和学生代表，可以参加会议组织的所有活动、注册费包括会务费、资料礼品费、会议安排旅游、4月15日—17日中晚餐及4月14日晚餐费用。 　　九、会议地址和住宿宾馆 　　 会议地址：浙江杭州 第一世界大酒店(浙江杭州萧山区湘湖路92号) 　　 酒店电话：086-0571-83866888 　　 住宿安排：浙江杭州 第一世界大酒店 　　五星：标准间480元/天，单人间480元/天 　　四星：标准间350元/天，单人间350元/天 　　十、学术发言及证书登记 　　大会和分会发言及壁报交流的参会代表，请在注册当日(2011年4月14日)将报告材料或壁报资料(国际标准大小1.0m×1.2m(宽×长))交至大会学术组，报告材料须为Powerpoint文件，一律要求英文准备，存储于USB闪盘之中，大会提供笔记本电脑和幻灯放映设备，不接受个人电脑接入。如有特殊需求，请提前与大会会务组联系。 　　所有参会代表可登记领取学分证书。 　　十一、退费说明 　　已交费的参会代表因个人原因不能参会或其他原因需要退款，请提前与会务组联系。退费原则：2011年3月15日前退还所交款项的80%，3月15日~4月1日退还所交款项的50%，4月1日及以后恕不退款。 　　十二、会后旅游 　　湘湖半日游：湘湖被誉为西湖的“姊妹湖”，横跨8000年的古文明。湘湖旅游度假区规划总面积51.7平方公里，恢复湖面7.5平方公里。“湘湖八景”在生态湘湖、文化湘湖的基础上，建立科学的湘湖生态系统，形成飞鸟禽鱼的乐园，营造出一处湘湖古越文化氛围。 　　具体旅游安排以会议第三轮通知为准。 　　十三、联系方式 　　会议网址：http://www.cnhupo-congress.cn 　　http://60.191.25.30/bprchy 　　大会会务组: 　　电 话：010-80705188(学术) 80705166(招商) 　　传 真：010-80705155 　　E-mail：cnhupo@163.com 　　地 址：北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心 　　邮 编：102206 　　*请注明：“蛋白质组学大会” 　　注册费汇至： 　　帐 户：中国人民解放军62032部队 　　开户行：北京工商行永定路支行 　　帐 号： 0200004909008520585 　　* 务必注明：蛋白质组学大会*(汇款前请先打电话联系，汇款后将汇款凭据传真至我处，以确保汇款安全到帐) 　　十四 、附件 　　附件：论文摘要模板.doc 　　第七届中国蛋白质组学大会 　　秘书处 　　二〇一〇年十一月

p style=" line-height: 1.5em text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-align: justify " 日前，黄超兰课题组及合作者的最新成果，利用新型绝对定量质谱法解析T细胞受体(TCR)磷酸化修饰动态全过程，揭示了CD3ε 的新型信号转导及其在CAR-T细胞治疗中的应用。相关成果近日发表在《Cell》。 /span br/ /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 193px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/c9be87de-7748-4400-ab38-28fab92a68ad.jpg" title=" 黄超兰.png" alt=" 黄超兰.png" width=" 600" height=" 193" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " strong span style=" text-align: justify " 　　2020年7月29日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队，中科院上海生化与细胞所许琛琦团队、美国加州大学圣地亚哥分校惠恩夫团队，联手在Cell上发表了题为“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的论文，该研究通过开发基于质谱的绝对定量蛋白质组新方法，揭示了T细胞受体-共受体(TCR-CD3)复合物酪氨酸在不同抗原刺激下的动态磷酸化修饰全貌，解析了不同CD3链ITAM结构域磷酸化特征的奥秘，从中发现了其中一条亚基CD3ε的单磷酸化新功能，有望助力于设计全新的CAR-T疗法。 /span /strong /p p style=" text-align: justify " strong span style=" text-align: justify " /span /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 245px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/b6abe943-5c1a-4258-8d80-ee14ae449013.jpg" title=" high light.png" alt=" high light.png" width=" 600" height=" 245" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　TCR-CD3复合物在T细胞的发育、激活及对病原的免疫反应中起着决定性作用。这一重要作用来自于CD3链胞内端的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多样性功能主要取决于其结构域的酪氨酸(Tyrosine)磷酸化，比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70进而激活下游的信号传导。另外，ITAM的功能也被广泛应用在对嵌合抗原受体(CAR)的研究中。其中CD3ζ亚链便常用于构建CAR-T细胞疗法抗肿瘤活性，但其他CD3链的功能和对于CAR的设计也还有很多未知。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 深入探索 CD3 ITAM的酪氨酸动态磷酸化模式可为全面理解不同CD3链的功能提供核心信息。 /strong TCR-CD3受体复合物有10个ITAM结构域分布着20个磷酸化位点，在时间分辨率下实现对全部磷酸化位点的同时定量分析在技术上极具挑战性。为了直观比较不同TCR刺激下的磷酸化模式，精确绘制出TCR所有酪氨酸磷酸化的动态过程，黄超兰团队开发了一种新颖的绝对定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative Mass Spectrometry(TIMLAQ-MS)。区别于目前报道的蛋白组绝对定量手段，不需要加入同位素重标的合成肽段，而是巧妙地利用串联质量标签(TMT)，设计将6个标准样品和4个分析样品混合起来作为内标。标准样品为不同浓度梯度的合成非重标磷酸化/非磷酸化CD3肽(A)和从未经抗原刺激的T细胞中通过IgG抗体免疫沉淀下来的背景蛋白(B)的混合物 用数据依赖采集(Data-dependent acquisition, DDA)结合平行反应监测(Parallel reaction monitoring, PRM)的方式获得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀(IP)复合物中不同酪氨酸位点的磷酸化/非磷酸化在不同时间点的定量结果。 strong TIMLAQ 成功绕过了以前的定量方法中通常使用的同位素重标记肽，既节约了成本，又有效降低了方法的复杂性和数据采集误差，进一步提高了定量准确性，最终可完全实现在一次测量中对不同时间点全部ITAM磷酸化修饰的绝对定量，描绘TCR-CD3复合物的酪氨酸动态磷酸化修饰全貌。 /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 492px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/17408230-fe19-4e90-a93b-06bbeea1254b.jpg" title=" 111.png" alt=" 111.png" width=" 600" height=" 492" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" line-height: 1.5em text-align: center " 基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修饰鉴定 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　 strong 利用这一方法鉴定到在不同的TCR刺激条件下，CD3各亚基主要表现为双磷酸化修饰模式，而唯独CD3ε呈现出单磷酸化修饰模式。 /strong 前研究表明，双磷酸化的ITAM与激酶家族蛋白ZAP70有很强的结合而激活下游信号传导，而单磷酸化的ITAM则表现出很低的结合性。 strong 本文中这一特殊的新发现驱使作者进一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潜在功能。 /strong 结果显示，单磷酸化的CD3ε可通过专门募集抑制性Csk激酶减弱TCR信号传导， strong 说明TCR中既有激活基元又有抑制基元，总体呈现为一种自制的信号传导机制。 /strong 作者团队进一步深入研究，发现一旦将CD3ε细胞质结构域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM结构域可以通过募集Csk减少CAR-T细胞因子的产生，而CD3ε的BRS结构域则可以通过募集p85促进CAR-T细胞的持久性。总体而言，将CD3ε应用于CAR的设计可显著提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。 /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　 strong 　从一个重要的基础生物学问题开始，为解决问题而开发一个新颖方法，得到新发现，再深入探索生物学功能，最后有望贡献在治疗方法上。黄超兰教授，许琛琦教授和惠恩夫教授作为本文的共同通讯作者，完美地演绎了不同交叉领域共同合作而产生的精彩结果。 /strong /p p strong /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 338px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/e5f4a9aa-d6b8-4604-a6a5-28e0177de6e9.jpg" title=" 222.png" alt=" 222.png" width=" 600" height=" 338" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " span style=" text-align: justify " 　　黄超兰教授是北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任，北京大学医学部基础医学院长聘副教授，北京大学生命科学联合中心研究员，曼彻斯特大学荣誉教授。近年来，黄超兰教授带领团队积极开发基于质谱的蛋白质组学新方法，实验室拥有国际领先的仪器、技术和方法，致力于为生物学和临床研究中遇到的难题提供最有质量保证的全面蛋白质组和质谱技术手段。 仅从2015年至今，黄教授在高影响因子的杂志上就发表了近50篇文章 (目前已累计发表SCI论文80余篇)，不但自己开发最前沿的质谱技术(迄今为止，课题组研发的单细胞蛋白质组技术，在单一体细胞中鉴定的蛋白数量是全球领域最高水平)，更发挥了强大的合作力量，以她高超的质谱技术助力了众多科学家的科研发展。曾协助美国普林斯顿大学教授，美国科学院外籍院士颜宁课题组，利用质谱技术有效分析了ACAT1蛋白周围游离的脂质，为ACAT1作用底物的鉴定提供了最为直接有效的证据，相关工作发表在Nature上 sup 1 /sup 。最重量级的是协助中科院院士，西湖大学校长施一公教授利用高分辨交联质谱技术对剪接体复合物的成分和相互作用进行准确鉴定，促进了剪接体复合物在冷冻电镜上的超高分辨率结构鉴定，相关工作发表在两篇Science上 sup 2，3 /sup 。 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.5em text-indent: 2em " strong span style=" text-align: justify " 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心 /span /strong span style=" text-align: justify " ，在“双一流”的支持下，正式成立于2018年6月，为北京大学医学部直属二级单位。黄超兰教授担任中心主任。中心主要基于临床医学热点和难点问题，通过临床医学，创新技术和基础学科的交叉，开展协同创新研究和研发，攻克医学重大难题。 /span span style=" text-indent: 2em " 以重要的临床问题为根，利用前沿的高通量多组学技术（基因、转录、蛋白、翻译后修饰、代谢、微生物）和人工智能分析手段，结合临床信息，打造成规模化专业化的临床生物标志物（包括疾病预防，诊断，机制，疗效和药物靶点）开发、验证和标准化的创新平台。 /span /p p style=" text-align: justify " span style=" text-align: justify " br/ /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　原文链接： a href=" https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.018" target=" _blank" https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.018 /a /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " br/ /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　　参考文献： /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " 　 span style=" font-size: 14px " 　 sup 1 /sup Qian et al., Nature, 2020 581(7808):333-338 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-size: 14px " 　　 sup 2 /sup Yan et al., Science, 2015 349(6253):1182-1191 /span /p p style=" line-height: 1.5em text-align: justify " span style=" font-size: 14px " 　　 sup 3 /sup Wan et al., Science, 2016 351(6272):466-475 /span /p p br/ /p

蛋白质组学研究是我国目前生命科学研究的前沿和重点研究项目，“十一五”期间我国蛋白质组学研究取得多项重大成果，以北京蛋白质组研究中心为代表的国内科研机构更是将我国蛋白质组研究提升到世界领先地位!2009年9月科技部中国生物技术发展中心在深圳组织召开了有关蛋白质组研究战略研讨会，标志着“十二五”发展战略规划蛋白质组研究项目正式启动!我国的蛋白质组研究将迎来一个新的发展机遇期。 　　为了积极促进我国蛋白质组学的研究与发展，中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委会主办、北京蛋白质组研究中心和德国慕尼黑国际博览集团承办的“2010蛋白质组学与疾病”专题研讨会定于9月16-18日慕尼黑上海分析生化展期间在上海新国际博览中心召开。 　　此次研讨会由北京蛋白质组研究中心技术总监钱小红教授担任会议主席，中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会主任贺福初院士担任名誉主席。 大会将重点围绕蛋白质组学及其在疾病研究中的应用取得的新进展进行研讨。演讲嘉宾将包括：中南大学湘雅医院院长陈主初教授，复旦大学化学系杨芃原教授，中国协和医科大学赵晓航研究员，北京蛋白质组研究中心魏开华研究员，徐平研究员，姜颖副研究员等。 　　安捷伦科技公司作为大会的金牌赞助商将全程支持此次大会的召开。在同期举办的analytica China 慕尼黑上海分析生化展上，安捷伦科技公司也将向广大用户全面展示包括在蛋白质组学与疾病研究领域的高端仪器在内的各类仪器产品以及“以先进的技术和整体解决方案为用户提供一站式服务”的理念。欢迎届时参观安捷伦科技的展台1202。 　　“2010蛋白质组学与疾病”专题研讨会：http://www.a-c.cn/ac/Conference/Proteomics/ 　　关于安捷伦科技 　　安捷伦科技(NYSE: A)是全球领先的测量公司，是通信、电子、生命科学和化学分析领域的技术领导者，公司的18,000名员工在110多个国家为客户服务。在2008财政年度，安捷伦的业务净收入为58亿美元。要了解安捷伦科技的信息，请访问：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/。

p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全，中南大学教授、博士研究生导师、博士后合作导师，英国皇家医学会会士(FRSM)、美国科学促进会(AAAS)会员、欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)的会士和国家代表、美国肿瘤学会(ASCO会士、欧洲科技合作组织(e-COST)的海外评审专家，中国抗癌药物国家地方联合工程实验室技术委员会委员、技术带头人和副主任，临床蛋白质组学与结构生物学学科学术带头人和学科负责人，国家临床重点专科建设项目重点实验室建设项目学科带头人，湖南省百人计划专家、湖南省高层次卫生人才“225”工程医学学的学科带头人、中南大学“531”人才工程专家。目前正致力于从多参数系统策略角度阐述肿瘤的分子机理、发现肿瘤分子标志物，研究并整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的变异来实现肿瘤的预测、预防与个体化治疗及精准医学。已发表学术论文130 余篇，主编国际学术专著3 本，参编国际学术专著16 本，获得美国发明专利2 个。受邀在中科院1 区影响因子9.068 MassSpectrometry Reviews 和中科院2 区影响因子3.65 Frontiers in Endocrinology 的国际期刊上客座主编了3 个专刊。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 本篇文章仪器信息网获得授权转载，来源中国科技成果杂志。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 深入剖析蛋白质组学技术最新进展与应用 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：人类结构基因组测序接近尾声，人们就从结构基因组学研究转向功能基因组学研究，即对转录组和蛋白质组进行研究。1995 年正式提出了”蛋白质组”和”蛋白质组学”的概念，距今已有25 年历史了。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 蛋白质组学的主要技术包括蛋白质组的分离技术、鉴定技术和蛋白质组信息学技术。 span style=" text-indent: 2em " 蛋白质组的分离技术主要有双向凝胶电泳(2DE)和多维液相色谱(2DLC)。蛋白质组的鉴定技术主要是基于质谱(MS)的技术，主要分为肽质指纹(PMF)和串联质谱(MS/MS)分析技术，其用于蛋白质大分子分析的两大离子源主要有MALDI 和ESI。质谱技术发展很快，主要朝向高灵敏度、高通量和高精度方向发展。 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　蛋白质组信息学技术主要是用来构建蛋白质相互用网络的相关技术。蛋白质组的分离技术和质谱技术的不同联合就形成了各种类型的蛋白质组学分析技术：如2DE-MS和2DLC-MS。2DE-MS 又有2DE-MALDI-PMF 和2DE-ESI-LC-MS/MS, 该技术在蛋白质组学研究的头10-15 年是其主要技术，然而常规概念认为2DE 的通量不高，即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 个蛋白质，通常一次实验其通量仅能鉴定几十到一千个蛋白质，这样其在蛋白质组学中的地位逐渐被淡化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 2DLC-MS 主要有iTRAQ or TMT-based SCX-LC-MS/MS and labelfree LC-LC-MS/MS, 这就是人们通常说的“Bottomup”蛋白质组学，该技术在最近10 ～ 15 年在蛋白质组学中起着核心技术的作用，因为其通量明显增加，一次实验其通量可达到几千到一万的蛋白质能被鉴定，但该法鉴定的结果是一个protein group, 实质上鉴定的是编码蛋白质的基因, 而并没有鉴定到真正意义上的蛋白质，即蛋白质存在形式(Proteoforms 或Protein species)。蛋白质存在形式(Proteoforms)是蛋白质组的基本单元。人类基因大约2 万个，人类转录本至少10 万个，每个转录本指导核糖体按三联密码子决定一个氨基酸残基来合成氨基酸序列，刚合成出来的蛋白质氨基酸序列是没有功能的，它必须到达其指定的位置如胞内、胞外，和不同的亚细胞器等，形成特定的三位空间结构，并与其周围的相关分子相互作用，形成一个复合物(complex)才能发挥其功能作用。从核糖体刚合成出来到其指定的位置过程中有很多的蛋白质翻译后修饰(PTMs 据估计人体有400 ～ 600 种PTMs)。我们最近对蛋白质存在形式的概念给出了最新最完整的定义：蛋白质的氨基酸序列+ 翻译后修饰+ 空间构型+ 辅助因子+ 结合伴侣分子+ 空间位置+ 特定的功能。而蛋白质的概念被定义为：由同一个基因编码的所有蛋白质存在形式的集合体。这样，人类蛋白质组中的蛋白质存在形式(Proteoforms)至少有100 万或甚至达10 亿 (图1)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 427px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/1d18fad3-b010-4ea5-a812-432853ad4ec6.jpg" title=" 1111111.png" alt=" 1111111.png" width=" 600" height=" 427" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图1 ：Proteoforms 的概念及形成模式 (Zhan et al,Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　如此庞大数量的Proteoforms/Protein species, 如何对其进行大规模的探测、鉴定和定量，是一个至关重要的事情。目前关于Proteoforms 的研究有两套策略一是“Top-down”MS 技术， 二是“Top-down” 和“Bottom-up”相结合的技术即2DE-LC/MS 技术(图2)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 415px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/94f48c94-fd0b-4959-90fb-dd399cebf074.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" width=" 600" height=" 415" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图2 ：Proteoforms 研究技术比较(Zhan et al., Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　“Top-down”MS 技术能探测、鉴定和定量Proteoforms，获得蛋白质的氨基酸序列和PTMs 信息，然而该技术的通量较低，目前最大通量鉴定到5700 个Proteoforms, 对应到860 蛋白质。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　最近，詹显全教授团队发现2DE-LC/MS 技术是一超高通量的技术平台，在探测、鉴定和定量Proteoforms方面, 可以鉴定达几十万至上100 万的Proteoforms。随着质谱灵敏度的显著提高，自2015 年以来，詹显全教授团队就发现每个2D 胶点包含了平均至少50 个甚至达几百个Proteoforms，并且大多数是低丰度的 并在近1 ～ 2 年来发表了相关论文来全面阐述2DE-LC/MS 的新理念和实践，完全打破了40 多年来人们对双向电泳的传统认识 (即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 蛋白质)，为大规模的Proteoforms 研究提供了技术基础。Proteoforms/Protein species 概念的发展极大的丰富了蛋白质组的内涵，是蛋白质组学研究的更高层次，是国际科学发展的前沿，必将影响着整个生命科学和医学科学的研究和实践，有助于发现可靠而有效的疾病标志物，用于深度理解疾病分子机制和决定药物靶点，或者用于有效的预测、诊断、预后评估。另外，蛋白质组是表型组的重要成分，是基因组功能的最终执行者，是基因组和转录组研究所不能替代的，要实现真正的个性化医学和精准医学，蛋白质组学研究是不能绕过去的。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 基于整合组学发现疾病标志物才是精准发展之重 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　1. 您一直专注于肿瘤蛋白质组学的研究，例如垂体瘤、卵巢癌等相关恶性肿瘤结合组学的研究，请谈谈在这方面的最新的研究成果，以及过程中的主要挑战和解决方案 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全： 垂体瘤是颅内常见肿瘤，绝大多数是良性的，只有少数具有侵袭性和恶性，并能引起激素分泌紊乱和颅内压迫症状，出现严重的临床症状，危害人体健康。临床上分为功能性垂体瘤和非功能性垂体瘤，并且非功能性垂体瘤不表现血中激素水平增加，不易早期诊断，经常是当肿瘤体积增加到压迫周围组织器官产生压迫综合征时才被诊断，这时已经是中晚期了，且其分子 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　机制并不清楚，缺乏早期诊断标志物和药物治疗靶标。因此，非功能性垂体瘤被选为主要研究对象。虽然垂体瘤是在颅内，但我们认为垂体瘤是一种多病因、多过程、多结果的全身性的慢性疾病，并且还具有肿瘤的异质性 它涉及到一系列的分子改变，包括发生在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和相互作用组水平上的改变，而这些不同水平改变的分子和信号通路又不是孤零零的起作用，而是相互间具有千丝万缕的联系。因此，我们很难用一种单一因素来解决其预测、预防、诊断、治疗和预后评估 而必须从单因素模式转向多参数系统思维模式。垂体瘤的多病因、多过程、多结果、全身性、慢性、分子网络系统性给其“同病同治”提出了严峻挑战，同时为实现其个性化的精准预测、精准预防、精准诊断和精准治疗提供了机遇和条件。多组学(基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学)和系统生物学技术的发展驱动了这一多参数系统思维模式的转变、推进了其个性化医学和精准医学的研究和实践。因此，我们认为多参数系统策略观和多组学是进行垂体瘤个性化医学和精准医学的研究和实践的重要理念和技术方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们从2001 开始进行垂体瘤的蛋白质组学及其翻译后修饰组学研究，从2008 年开始进行多组学和分子网络研究，及预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)研究。经过过去近20 年未间断的研究，我们在垂体瘤的蛋白质组学、翻译后修饰组学、多组学、分子网络和系统生物学研究方面在国际上处于了主导地位。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　在我们研究过程中，我深深体会到一个重大思转变就是从以前的单参数模式转向了多参数系统思维模式，这符合肿瘤的真实情况。另外，就是多组学技术促进了这一模式的转变，并是其主要的解决方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　2. 从您的研究方向及重点出发，您认为多组学研究在精准医学中接下来的研究应当侧重于哪些方面，以及如何才能比较好的实现从研究到临床的转化落地? /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：我的研究对象是肿瘤(垂体瘤、卵巢癌、肺癌、胶质瘤)，研究理念是肿瘤的多参数系统策略观，技术手段是多组学和系统生物学，研究的目标是要解决肿瘤的预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们认为多组学中的不同组学对PPPM/PM 的贡献是不平衡的，即个性化的表型组是基因组通向PPPM/PM 应用实践的桥梁，而蛋白质组和代谢组是表型组中两重要成分。蛋白质组的内涵包括蛋白质的拷贝数变化、剪切变化、翻译后修饰、转位、再分布、空间构型、与周围分子相互作用、及信号通路网络问题。代谢组的内涵涉及到体内所有物质(包括糖、脂、蛋白质、核酸)的代谢产物及其代谢网络问题。要真正实现PPPM 和PM，蛋白质组和代谢组的贡献是基因组所不能替代的是不能绕过去的。人们应从以基因组为中心的研究和实践转向以表型组为中心的研究和实践。其中蛋白质组的研究又应以翻译后修饰和蛋白质存在形式(Proteoforms)作为今后的研究方向。Proteoforms 的研究必将影响着整个生命科学和医学科学。从临床转化研究来看，基于多组学的整合生物标志物是发展方向。对于这里的生物标志物，我们将其分为两类：一类是解决疾病分子机制和药物靶点的生物标志物，这类生物标志物一定要有因果关系 一类是解决预测、诊断、预后评估的生物标志物，这类标志物不一定要求有因果关系，但必要要有量的变化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　3. 作为EPMA(欧洲预测预防个体化医学协会)的中国代表，想请您分享下国际上对于组学研究在精准医疗中的应用现状、趋势以及发展规划 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)是国际个体化医学领域领头的学术协会，由来自全球55 个国家和地区的专家学者组成，其创办的官方杂志EPMA Journal( 中科院2 区，ESI IF5.661) 涵盖了24 个专题内容，较全面地反映了预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)的研究、实践与最新动态，还涉及到PPPM 和PM 的政策、伦理、卫生经济和社会保障等许多方面，为PPPM 和PM 的科研、实践提供了一个很好的交流平台。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 我本人作为EPMA 的中方代表(National Representative of EPMA in China) 和其官方杂志EPMA Journal 的副主编，参与了其经历的重要活动。我从2008 开始起在EPMA 中主要负责多组学和创新技术方面，在EPMA 白皮书中的“肿瘤预测预防个体化医学的多参数系统策略观”这部分最早就是我写的，之后我们写了一系列文章来论述基于多组学的多参数系统策略的研究和实践。因此，在EPMA，我们的基于多组学的多参数系统策略观还是比较早的，近五六年来多组学研究在EPMA 圈内(55 个国家和地区)发展得很快，已经深入到PPPM 的各个领域。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　另外，我认为，精准医学在理念上没错，严格意义上的精准医学是个理想化的概念，人们只能无限去逐步接近它。现阶段搞精准医学还是要回归到人类健康的保护过程，即预测、预防、诊断、治疗和预后评估，这里应该是针对个人来说而不是针对群体，严格说来应该是个性化的精准预测、精准预防、精准诊断、精准治疗和精准预后评估。对于人类健康保护过程来说，预测、预防还是上策，其次就是早诊断、早治疗。多组学研究已渗入到人类健康保护过程的每个环节，主要用来寻找基于多组学的生物标志物，当然这里的生物标志物应泛指前面说的两类：一类是解决疾病机制和治疗靶点的标志物，一类是解决预测、诊断、预后评估的标志物。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 因此，基于多组学的PPPM/PM 的研究和实践一定是今后发展的一个长远趋势。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 802px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/581ff7cf-5c3e-4fd6-8f5f-805989791ee5.jpg" title=" 詹.jpg" alt=" 詹.jpg" width=" 600" height=" 802" border=" 0" vspace=" 0" / /p p br/ /p

近期，中国科学技术大学教授刘海燕、副教授陈泉团队采用数据驱动策略，提出一条全新的蛋白质从头设计路线，相关成果2月9日以“用于蛋白质设计的以主链为中心的神经网络能量函数”为题发表于《自然》（Nature）杂志。　　蛋白质是生命功能的主要执行者，其结构与功能由氨基酸序列所决定。目前，能够形成稳定三维结构的蛋白质几乎全部是天然蛋白质，其氨基酸序列是长期自然进化形成。在天然蛋白结构功能不能满足工业或医疗应用需求时，想要得到特定的功能蛋白，就需对其结构和序列进行设计。目前，国际上报道的蛋白质从头设计工作主要使用天然结构片段作为构建模块来拼接产生人工结构。然而这种方法存在设计结果单一、对主链结构细节过于敏感等不足，限制了设计主链结构的多样性和可变性。蛋白质从头设计中最困难的问题是如何充分地探索蛋白质主链结构空间，发现新颖的、“高可设计性”主链结构，目前还缺乏相关的系统性解决方法。 　　中国科大相关团队长期深耕计算结构生物学方向的基础研究和应用基础研究。刘海燕、陈泉团队十余年来致力于发展数据驱动的蛋白质设计方法，经过长期不懈努力，建立并实验验证了给定主链结构设计氨基酸序列的ABACUS模型，进而发展了能在氨基酸序列待定时从头设计全新主链结构的SCUBA模型。SCUBA采用一种新的统计学习策略，基于核密度估计（或近邻计数，NC）和神经网络拟合（NN）方法，从原始结构数据中得到神经网络形式的解析能量函数，能够高保真地反应实际蛋白质结构中不同结构变量间的高维相关关系，在不确定序列的前提下，连续、广泛地搜索主链结构空间，自动产生“高可设计性”主链。　　理论计算和实验证明，用SCUBA设计主链结构，能够突破只能用天然片段来拼接产生新主链结构的限制，显著扩展从头设计蛋白的结构多样性，进而设计出不同于已知天然蛋白的新颖结构。“SCUBA模型+ABACUS模型”构成了能够从头设计具有全新结构和序列的人工蛋白完整工具链，是RosettaDesign之外目前唯一经充分实验验证的蛋白质从头设计方法，并与之互为补充。在该研究中，团队展示了9种从头设计的蛋白质分子的高分辨晶体结构，它们的实际结构与设计模型一致，其中5种蛋白质具有天然蛋白质中尚未观察到的新型拓扑结构。 　　Nature审稿人认为，“与现有方法不同，现有方法要么使用参数方程来描述预定义螺旋结构的空间，要么基于片段组装的方法依赖于已知蛋白质片段。SCUBA方法原则上允许人们探索任意主链结构，然后填充序列，允许人们设计比自然界中观察到的更广泛的蛋白质几何结构”，“蛋白质从头设计仍然具有挑战性，本工作中六种不同蛋白质的高分辨率设计是一项重要成就，表明此方法工作良好”，“本研究中报道的成功设计数量之多令人印象深刻，并提供了强有力的证据，证明了基础技术是鲁棒的。所采用的基于神经网络的能量项是新颖的，因为它们刻画了更传统的统计方法无法企及的多维特征，该方法具有足够的新颖性和实用性”。 　　该研究为工业酶、生物材料、生物医药蛋白等功能蛋白的设计奠定了基础。研究工作得到科技部、国家自然科学基金委和中科院的资助支持。 　　论文链接

The First China Workshop on Computational Proteomics (CNCP2010) 　　2010年11月10日至11日, 北京 　　一.会议简介 　　随着蛋白质组学的兴起，特别是质谱技术的快速发展，蛋白质组学研究中产生的数据规模越来越大。依靠简单的手工处理已经远远不能满足问题的需求,通过先进的计算机算法与软件工具来自动处理大批量的蛋白质组数据已经成为蛋白质组学研究的重要分支，这就是“计算蛋白质组学”(Computational Proteomics)。 　　“计算蛋白质组学”是以计算技术为主要手段，通过开发高效的算法和实用的软件工具来处理大规模的蛋白质实验或模拟数据，解决蛋白质组学研究中的蛋白质鉴定、翻译后修饰分析、蛋白质定量、蛋白质相互作用、蛋白质定位、蛋白质结构或蛋白质动力学等领域中的问题。我国的计算蛋白质组学与国际基本处于同步的发展态势，特别是最近十年内在中国蛋白质组学项目的驱动下，计算蛋白质组学的研究发展迅速。 　　为了推动计算技术在中国的蛋白质组学研究中发挥出更加切实的作用，由中国科学院计算技术研究所主办的“首届中国计算蛋白质组学研讨会”将于2010年11月10日至11日在北京召开，为了更好地促进国内的学术交流，本会议不收取注册费，并对按时返回会议回执(10月8日前)的代表免费提供会议期间的餐饮。欢迎从事与计算技术和蛋白组学研究相关的科研人员和研究生参加。 　　二.研讨内容 　　会议主题：计算蛋白质组学 　　研讨内容： 　　质谱数据分析 　　蛋白质鉴定 　　翻译后修饰 　　蛋白质定量 　　蛋白质相互作用 　　蛋白质定位 　　蛋白质结构 　　蛋白基因组学等 　　三. 邀请专家 　　11月10日和11日两天全天为邀请专家作大会报告，本次会议不征文，只设邀请报告。确认参会的部分专家名单如下，报告题目将在第二轮通知中发布。 　　关慎恒 美国加州大学旧金山分校 　　曾嵘 中国科学院上海生命科学研究院 　　钱小红 北京蛋白质组研究中心 　　朱云平 北京蛋白质组研究中心 　　徐平 北京蛋白质组研究中心 　　应万涛 北京蛋白质组研究中心 　　刘斯奇 中科院北京基因组研究所 　　董梦秋 北京生命科学研究所 　　陈涉 北京生命科学研究所 　　张学工 清华大学 　　江瑞 清华大学 　　高友鹤 中国协和医科大学 　　邵晨 中国协和医科大学 　　杨芃原 复旦大学 　　陆豪杰 复旦大学 　　谢鹭 上海生物信息中心 　　邹汉法 中科院大连化学物理研究所 　　叶明亮 中科院大连化学物理研究所 　　何庆瑜 暨南大学 　　王 通 暨南大学 　　马斌 加拿大滑铁卢大学 　　余维川 香港科技大学 　　孙瑞祥 中科院计算所 　　付岩 中科院计算所 　　卜东波 中科院计算所 　　张法 中科院计算所 　　赵屹 中科院计算所 　　四.会前培训 　　为了使参会人员能够获得有关蛋白质组质谱数据分析的基本技能，同时了解到本学科发展的最新动态，我们有幸邀请到美国加州大学旧金山分校的关慎恒老师，他将为参会人员作如下内容的培训讲座。关于关老师的详细介绍，可参见： 　　http://ms-facility.ucsf.edu/staff/guan.html 　　11月8日上午：质谱技术与蛋白质组学基础 　　11月8日下午：蛋白质组信息学 　　11月9日上午：翻译后修饰与定量技术 　　11月9日下午 蛋白质定量与从头测序(De Novo)分析软件 　　关老师的技术培训讲座后还有来自中科院计算所在分析质谱数据方面富有经验的人员作数据库搜索、从头测序(De Novo)与蛋白质定量分析的算法与软件培训。从基础入手，手把手教如何分析质谱数据。推荐参加培训的人员带上个人笔记本电脑，可以实地实时操作软件，现场体会分析质谱数据的乐趣。 　　本培训自愿报名，培训费用学生为500元(报到时需提供学生证)，其他人员为800元，培训费包含培训讲义资料、优盘、分析数据和软件、两天的工作餐等，培训费现场缴纳。 　　五.会议回执 　　请于10月8日前将本回执发送到CNCP2010@ict.ac.cn, 邮件标题为: 　　CNCP2010回执(姓名)。鉴于已经预订的会场座位有限，10月8日之后返回回执者，请见谅我们无法确保您的座位安排。 姓名 性别 职称 电话 手机 E-mail 单位 2住宿选择: A.燕山酒店 B.天创宾馆 C.自行安排 单人间还是合住: 是否参加11月8日和9日的两天培训 是否需协助预订返程票 （如需要请提供信息） 预计到会时间 11月 日 预计离会时间 11 月 日 　　1. 如为学生，请注明硕士生/博士生 　　2. 燕山酒店: 四星,标准间约 450元/天，单人间约400元/天(均含早餐和上 　　网),距离会场约15分钟车程(有专车每天接送) 　　天创宾馆:标准间约198元/天(含早餐和上网,优先学生预订), 到会场步行约5分钟。 　　六.联系我们 　　会议网站： http://cncp2010.ict.ac.cn 　　联系邮件： CNCP2010@ict.ac.cn (尽量邮件联系) 　　联系电话： 010-62601352 任菲 刘玉东 　　会务组织： 中国科学院计算技术研究所pFind研发组

为了积极促进我国蛋白质组学的研究与发展，由中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO)主办，北京蛋白质组研究中心和复旦大学共同承办的第六届中国蛋白质组学大会定于2009年7月28日—31日在江苏省泰州市召开。 　　一、会议安排 　　本届学术会议设有大会报告、分会(专题)报告和墙报三种形式。大会将邀请蛋白质组学及相关领域的国内外著名专家和教授作大会报告或专题报告，会议规模约600人左右。 　　会议同时举办与生物化学与分子生物学、蛋白质组学等研究领域相关的仪器、设备、试剂和新技术的展览、展示会。 　　大会安排于2009年7月28日举办蛋白质组学新技术培训，届时将邀请蛋白质组领域的国内、外知名专家授课。 　　二、会议议题 　　会议主要讨论蛋白质组学研究的现状及其进展，内容包括：疾病蛋白质组学，功能蛋白质组学，药物蛋白质组学，结构蛋白质组学，蛋白质化学，生物信息学，蛋白质修饰和相互作用，抗体相关技术，蛋白质组微分析、蛋白质芯片以及蛋白质组新技术新方法等研究领域。 　　三、会议语言 　　中文和英文 　　四、会议组织 　　组织单位 　　主办单位：中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO) 　　承办单位：北京蛋白质组研究中心 复旦大学 　　主 席：贺福初院士 　　顾问委员会：(按姓氏汉语拼音顺序排列) 　　陈志南院士 强伯勤院士 饶子和院士 施蕴渝院士 汪尔康院士 王红阳院士 　　张玉奎院士 　　执行主席：钱小红 杨芃原 　　组织委员会 　　主 任：贺福初院士 　　副 主 任：杨芃原 杨晓明 钱小红 　　委 员：(按姓氏汉语拼音顺序排列) 　　陈志南院士 丁建平 高友鹤 何大澄 贺福初院士 李 明 梁宋平 刘斯奇 陆满晴 潘全威 钱小红 　　饶子和院士 施 前　王东根 杨芃原 杨晓明 杨秀荣 张先恩 张玉奎院士 甄 蓓 　　秘 书 长： 王东根 　　副秘书长：甄 蓓 施 前 　　学术委员会 　　主 任：饶子和院士 　　副 主 任：王红阳院士 张玉奎院士 　　委 员：(按姓氏汉语拼音顺序排列) 　　陈正军 陈志南院士 丁建平 高友鹤 何大澄 贺福初院士 李亦学 梁宋平 刘斯奇 刘银坤 钱小红 　　强伯勤院士 饶子和院士 施 前 施蕴渝院士 汪尔康院士 王红阳院士 杨芃原 杨晓明 张学敏 　　张玉奎院士 赵晓航 曾 嵘 　甄 蓓 　　秘 书 长：钱小红 　　副秘书长：甄 蓓 施 前 　　秘书处 　　北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心 　　电话：010-80705188 传 真：010-80705155 　　E-mail: cnhupo6@163.com 　　五、征文范围及要求(参照模版) 　　投稿论文收录入会议论文集，大会将组织优秀论文评选。参加会议代表将授予继续教育学分10分。 　　凡未在国内外公开刊物发表过的研究成果，均可投稿，具体要求如下： 　　征文范围：有关蛋白质组学及相关领域近年来研究的学术成果，以英文论文摘要形式投稿。 　　稿件要求：每篇论文摘要按正式发表论文要求撰写，限A4纸1页，使用Word软件撰写。文责自负。(参照模版) 　　字体要求：标题—Times New Roman四号加粗 　　作者—Times New Roman五号居中，拟作报告者请在其姓名下方划一横线。 　　注：大会报告幻灯片一律要求英文准备， 　　单位、地址、邮编、E-mail—Times New Roman小五号居中 　　摘要—Times New Roman五号 　　参考文献(Times New Roman五号)。 　　投稿方式：论文摘要请用E-mail附件传递，并在E-mail信中“主题”栏内写明“蛋白质组学会议” 若无上网条件请邮寄论文摘要一式两份，同时提交光盘(未提交者会议将不予录用)。 　　E-mail: cnhupo6@163.com 　　投稿地址：北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心第六届中国蛋白质组学大会收 　　邮编：102206 　　截至日期：论文摘要投稿截至日期为2009年5月31日，以当地邮戳为准。 　　六、报到时间 　　2009年7月27日(参加培训的人员报到时间)、28-29日 　　七、会议注册费(国内代表) 　　2009年6月20日前注册：800元(人民币)/位(在读学生：500元/位) 　　2009年6月20日后注册：900元(人民币)/位(在读学生：600元/位) 　　技术培训费(与注册费一并交纳)：100元(人民币)/位 　　八、重要时间提示 　　回执截止日期：2009年5月31日前(以当地邮戳为凭) 　　征稿截止日期：2009年5月31日前(以当地邮戳为凭) 　　会前注册时间：2009年6月20日前(以当地邮戳为凭) 　　九、交通指南 　　由于参会人员较多，大会组委会不安排车辆接送。请代表自行乘车抵达报到地点，望参会代表谅解。 　　十、注册须知 　　1.请与会代表携带本人身份证，学生代表需携带学生证。已交费代表请带好汇款凭证，以备核对。 　　2.注册代表权益： 　　正式代表和学生代表，可以参加会议组织的所有活动、注册费包括会务费、资料礼品费、会议安排旅游及7月29日—31日早餐、午餐和晚餐费用。 　　十一、会议地址和住宿宾馆 　　 会议地址：江苏省泰州市扬子江药业集团海燕大酒店(江苏省泰州扬子江南路1号) 　　 邮编:225300 　　 住宿安排：海燕大酒店——标准间280元/天，单人间280元/天， 　　扬子江大酒店——标准间160元/天(距会场5分钟车程，会议期间班车接送) 　　十二、学术发言及证书登记 　　大会和分会发言及壁报交流的参会代表，请在注册当日(2009年7月27、28日)将报告材料或壁报资料(国际标准大小1.0m×1.2m)交至大会学术组，报告材料须为Powerpoint文件，一律要求英文准备，存储于移动硬盘、USB闪盘或光盘之中，大会提供笔记本电脑和幻灯放映设备，不接受个人电脑接入。如有特殊需求，请提前与大会学术组联系。大会发言鼓励使用英文，如有不便可使用中文。 　　论文被录用的参会代表可登记领取会议论文证书，所有参会代表可登记领取学分证书。 　　十三、旅游及定票须知 　　大会组委会设有旅游票务组专门负责参会代表的旅游及定票事宜。 　　组委会指定旅行社负责组织本次会议的会后(7月31日)旅游，会议期间请参会代表尽量不要安排旅游活动。旅游费用现场交纳并开具发票。军人和学生代表请携带相关证件，可享受门票优惠。 　　请参会代表至少提前两周提交返程票务预定单(附件二)，否则组委会无法保证其预定。费用现场交纳，预订火车票须加收手续费，预订飞机票需向秘书组告知姓名及身份证号，不加收任何费用。 　　参会代表在注册报到时，须在旅游票务组登记确认自己的旅游和返程票务事宜，并交纳费用。会议期间如有问题，请随时与旅游票务组或大会秘书处联系。 　　十四、退费说明： 　　已交费的参会代表因个人原因不能参会或其他原因需要退款，请提前与会务组联系。退费原则：7月1日前退还所交款项的80%，7月1日~26日退还所交款项的50%，7月27日及以后恕不退款。(已预订火车票者扣除票价退票费和手续费后进行退费) 　　十五、联系方式 　　会议回执和论文发送或邮寄至： 　　第六届中国蛋白质组学大会会务组 　　电话：010-80705188 80705116 80705166 　　传真：010-80705155 　　E-mail：cnhupo6@163.com 　　地址：北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心 　　邮编：102206 　　*请注明：“蛋白质组学大会” 　　注册费汇至： 　　帐 户：中国人民解放军62032部队 　　开户行：北京工商行永定路支行 　　帐 号： 0200004909008520585 　　* 务必注明：蛋白质组学大会*(汇款前请先打电话联系，汇款后将汇款凭据传真至我处，以确保汇款安全到帐) 　　十六 、附件 　　附件1：第一轮通知回执 　　附件2：返程票务预订单 　　附件3：论文摘要模板。 　　第六届中国蛋白质组学大会秘书处 　　二OO八年十二月一日 　　附件1 　　第六届中国蛋白质组学大会 　　第一轮通知 回 执 　　姓名： 性别： 职称： 联系电话： 　　工作单位： 传真： 　　通讯地址： 邮编： 　　E-mail： 参加会议： 是 □ 否 □ 　　论文摘要题目： 　　所属专业：系统生物学□ 疾病蛋白质组学□ 功能蛋白质组学□ 　　药物蛋白质组学□ 结构蛋白质组学□ 蛋白质化学□ 生物信息学□ 　　蛋白质修饰和相互作用□抗体相关技术□ 蛋白质组微分析□ 蛋白质芯片□ 　　蛋白质组新技术新方法□ 其他□ 　　拟作报告形式： 大会报告 □ 分会报告 □ 墙报 □ 参加技术培训： 是 □ 否 □ 　　住宿标准： 　　海燕大酒店 　　(四星)标准间单人间 　　280元/天280元/天 　　扬子江大酒店 　　(三星)标准间 　　160元/天 　　选择房间类型： 　　海燕大酒店 标准间□ 单人间□ 　　扬子江大酒店 标准间□ 　　入住时间： 月 日～ 月 日 　　参加会议者请将回执于2009年5月31日之前发送或邮寄至： 　　E-mail: cnhupo6@163.com 　　投稿地址：北京昌平区科学园路33号北京蛋白质组研究中心第六届中国蛋白质组学大会收 　　邮编：102206 　　附件2 　　返程票务预订单 　　返程日期航班号 　　(车次)目的地代表签字 　　备注 　　附件3 　　Identified the nonspecific binding proteins in depletion of Albumin and IgG from Human plasma 　　Wang Yundan1, Ning Yunshan1,3, Jiang Yin2, Deng Xinyu2, Fang Qinmei2, Hong Yanhua3, 　　Li Ming1,3 　　1 College of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou, P. R. China, 510515 　　2 Beijing Institute of radiation Medicine, Beijing, P. R. China, 100850 　　3 Boang Antibody Company, Shanghai, P. R. China, 200233 　　tommy604@fimmu.com 　　Depletion of high abundant proteins in plasma samples was necessary for the further study of new biomarkers mining in HPPP. We used the high specific mouse mAb against human albumin and Protein G to remove Albumin and IgG respectively from human plasma in denatured condition and native condition. We observed the different capacity of depletion in the presence of chaos reagents, non-ionic detergent and high concentration of salts. In native condition, the elution proteins were separated by 2DE and 104 spots in the gel were excised and trypsin digested for tandem mass spectrum (MS/MS) analysis. The binding proteins including Albumin, IgG, Fibrinogen, Vitamin D binding protein, Alpha-1 antitrypsin, transferrin, Transthyretin, Proapolipoprotein, Keratin, Complement component 3. The remained spots are albumin and IgG fragments. In denatured condition, the capacity of depletion for albumin become lower but IgG not affected. The concentration of nonspecific binding proteins including the fragments of Albumin in elution sample was lower. The results may explain the relation between low non-specific binding and presence of albumin fragments in condensed plasma samples processed by MARC or MARS system using commercial buffer. 　　Keywords: 　　High abundant protein / Depletion / 2-DE / MS / Nonspecific / Human plasma protein / Monoclonal antibody / Denature 　　References 　　1. Huang, H. L., Stasyk T., Morandell, S., Mogg, M., et al., Electrophoresis 2005, 26, 2843-2849 　　2. Anderson, N. L., Polanski M., Pieper, R., Gatlin, T., et al., Molecular & Cellular Proteomics 2004 Apr 3(4):311-26. 　　3. Shen, Y. F., Kim, J. K., Strittmatter, E. F., Jacobs, J.M., et al., Proteomics 2005, 5,4034-4045 　　4. Omenn, G. S., States D. J., Adamski M., Blackwell T. W., et al., Proteomics 2005, 13, 3226-3245

近日，华东理工大学光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋、朱麟勇、陈显军团队在活细胞蛋白质标记与成像研究中取得重要进展，相关研究在《细胞发现》发表。 人造荧光蛋白及荧光探针。华东理工供图生物过程可视化一直吸引着科学家的好奇心。不同类型的荧光成像工具可以帮助科学家观察生命体中多种生物事件的发生过程，其中最著名的是荧光蛋白标记技术。荧光蛋白及其衍生技术经历了近30年的飞速发展，为生物学各个领域的研究作出了极大贡献，但伴随着显微镜技术的飞速发展，现有荧光蛋白的性质已经难以适应新型仪器的成像要求。相比之下，基于蛋白质标签和激活型荧光团的荧光标记工具凭借其理化性质成为新的研究热点。该团队针对自催化蛋白质标签SNAP-tag，设计开发了高信噪比的青色人造荧光蛋白SmFP485。SmFP485的荧光产生十分迅速，避免了荧光蛋白生色团成熟导致的延迟，因此可以用于实时监测蛋白质的合成过程。研究团队随后对SmFP485的结构进行了解析，探究了人造荧光蛋白的荧光激活原理。在此基础上，研究团队通过化学进化方法设计出一系列光谱覆盖绿色到近红外波段的人造荧光蛋白，它们均具有高亮度和高信噪比特点，特别是其在近红外波段的亮度已远超现有成像工具，能够对活细胞以及活体动物中的蛋白质表达、蛋白质降解、蛋白质组装、蛋白质相互作用以及蛋白质运输进行原位实时标记与成像。最后，研究团队在多色人造荧光蛋白的基础上，采用蛋白质与荧光团共进化的方法设计开发出一系列光谱涵盖青色到近红外波段的钙离子遗传编码荧光探针，实现了对哺乳动物细胞中钙离子震荡的实时监测，为荧光探针的构建提供了新的荧光载体。综上，研究团队开发了一系列高性能人造荧光蛋白，它们具有荧光产生迅速、亮度高、信噪比高、光谱范围广等优点，为活细胞以及活体动物中蛋白质的可视化提供了有力工具，同时也为荧光探针的构建提供了新的思路和策略。

随着质谱技术以及色谱与质谱联用技术的快速发展，蛋白质组学分析技术在未知蛋白质的鉴定、蛋白质结构的解析、靶向蛋白质定量、以及生物技术药物研发、质量控制和体内药代动力学研究方面应用越来越广泛。药典委拟制定《中国药典》蛋白质组学分析方法及应用指导原则，并于2024年2月20日发布第一版公示稿并征求意见。为确保标准的科学性、合理性和适用性，现将拟增订的蛋白质组学分析方法及应用指导原则（第二次）公示征求社会各界意见（详见附件）。公示期自发布之日起一个月。蛋白质组学分析方法及应用指导原则公示稿（第二次）.pdf蛋白质组学分析基本流程主要包括：1. 蛋白样品的提取，变性还原，酶解与多肽分离富集；2. 多肽的分析与鉴定；3. 数据分析。在分离和富集中采用凝胶电泳和色谱技术，分析与鉴定中采用质谱、二维凝胶电泳、X射线分析、核磁共振波谱和透射电子显微镜技术。蛋白质组学分析方法及应用指导原则第二次公示稿修改说明 根据 2024 年 2 月蛋白质组学分析方法及应用指导原则第一次公示稿的反馈 意见和建议，国家药典委员会相关专业委员会进行了研讨，在第一次公示稿的基 础上修订了部分内容，主要为：一、适用范围1. 将文中“蛋白”修改为“蛋白质”。二、蛋白质组学的分析策略 1. 将“通过质谱分析技术检测到肽指纹图谱进行多肽的鉴定和定量分析” 修改为“通过质谱分析技术检测肽段一级与二级谱图进行多肽的鉴定和定量分 析”。2. 将文中“图谱”修改为“谱图”。三、蛋白质组学分析方法 1.“2.1 质谱技术”增加其他质谱碎裂技术，修订为：“蛋白质组样品经过提 取、分离富集或者进一步变性还原、酶切、多肽分离富集处理后，选择适宜的分 离系统导入离子源离子化，电离生成带电荷离子，离子通过碰撞诱导解离 （Collision induced dissociation, CID）、高能碰撞诱导解离 High energy collision dissociation, HCD）、电子活化解离（Electron activated dissociation，EAD）或其 它适宜的解离技术进行碎片化，后在加速电场的作用下形成离子束进入质量分析 器，通过质量分析器分离和过滤不同质核比的离子，过滤后的离子最终经检测系 统转换为可测量的信号，从而得到质谱图，以获得蛋白质的相关信息”。 2. 将文中“质核比”修改为“质荷比”。 3. 将“数据库检索对肽段碎裂质谱谱图和数据库中的理论序列谱图进行匹 配，实现肽段鉴定”修改为“质谱数据文件的数据库检索对肽段碎裂质谱谱图和 数据库中的蛋白质计算机模拟消化肽段碎裂模式进行匹配，以进行肽段鉴定”。4. 将“肽谱图匹配（peptide spectrum matching，PSM）”，“肽谱图匹配 （peptide-spectrum matches，PSM）”，统一为“肽段谱图匹配 (peptide-spectrum matches, PSMs)”。 5. 将“统计学分析（如 p 值）”修改为“统计学指标（如 p 值）”。 2024 年 6 月 与第一次公示稿比较，修改处加橙色标记 四、蛋白质组学分析的质量控制 1. 在表 1 中增加样品处理中酶解漏切率、酶解位点特异性等 QC 评价指标 及描述；增加色谱分析中峰宽和半峰宽等 QC 评价指标及描述；增加质谱分析中TIC 图等 QC 指标及描述。2. 调整仪器性能参数的描述顺序。将“建议结合仪器的性能进行设置，例 如可将两个参数均设置为 20ppm，也可以将母离子质量误差设置为 10ppm，子离 子质量误差设置为 0.02Da”修改为“建议结合仪器的性能设置质量误差，如将母 离子质量误差设置为 10 ppm，子离子质量误差设置为 0.02 Da，也可将两个参数 均设置为 20 ppm”。3. 将“鉴定的蛋白质应具有至少 70%的覆盖率，即被鉴定的多肽的氨基酸 序列覆盖蛋白质氨基酸序列的百分比，70%的蛋白覆盖率可提高鉴定结果的可信 度和全面性”修改为“蛋白质覆盖率是指被鉴定的多肽的氨基酸序列覆盖蛋白质 氨基酸序列的百分比，70%及以上的蛋白质覆盖率可提高鉴定结果的可信度和全 面性”。

国家蛋白质科学基础设施北京基地(凤凰工程)建设正式启动 　　2012年11月30日上午，中关村生命科学园晴空万里，彩旗飘扬。国家蛋白质科学基础设施北京基地(凤凰工程)在园区正门9号地隆重举行奠基典礼。北京市副市长张工、总后卫生部副部长方国恩、国家教育部部长助理陈舜、国家发改委高技术产业司司长綦成元，中国科学院副院长张亚平院士、北京大学常务副校长王恩哥院士、清华大学副校长邱勇，军事医学科学院院长贺福初院士，副院长徐卸古、陈学如、张伟平、张为，科技部部长徐天昊、院务部部长王峰，国家生物医学分析中心主任张学敏院士以及国家有关部委、中国科学院、清华大学、北京大学、北京市中关村管委会、昌平区政府等相关部门领导出席。奠基典礼由军事医学科学院政委高福锁主持。 奠基仪式 　　总后卫生部副部长方国恩在奠基典礼上作了重要讲话。方国恩指出，凤凰工程的奠基是我国、我军医学科技史上的又一件大事，有助于增强我军参与国际研究的合作和竞争能力，有助于完善国家和军队医学科技创新体系，大力提升国家和军队在蛋白质科学研究领域的原始创新能力，有力促进我国在国际蛋白质组学研究领域的主导地位。“凤凰工程”的建设是落实党中央、国务院、中央军委军民融合式发展的重大战略举措，是推进军民融合发展的一个重大的标志性成果。希望通过基地项目这个纽带，更好地聚焦国家战略、服务国家战略，在更广领域、更高层次上进一步深化合作，不断推进军民融合，结出更加丰硕的成果。 　　方国恩特别强调，总后首长非常重视基地建设工作，多次听取建设方案汇报，并提出明确要求。下一步，总后卫生部将会同有关部门，加强协调，密切配合，扎实推进各项建设工作。相信在大家的共同努力下，“凤凰工程”一定能够如期、圆满完成建设任务，一定能够实现国际先进，国内一流的建设目标，也一定能够为国家和军队医学科技事业做出新的更大的贡献! 　　北京市副市长张工代表北京市委、市政府对“凤凰工程”开工表示热烈祝贺!张工在讲话中指出，近年来，北京市生命科学研究和相关产业发展迅速，创新能力显著提升，在国内的领先地位日益增强，得到国家发改委、教育部、科技部、中国科学院等部委以及解放军四总部的充分肯定和密切关注。“凤凰工程”最终落户北京，就是国家部委、军队总部对首都建设大力支持的结果。“凤凰工程”是国家“十一五”期间重点建设的十二项重大科技基础设施项目之一，同时也是北京市政府和军事医学科学院战略合作共建“236工程”的重要组成部分。从“凤凰工程”的项目申请到落地建设，市委、市政府一直高度关注和积极支持，市区相关部门也密切配合，积极推进各项筹建工作。 　　张工表示，北京市将进一步深化与包括军事医学科学院、清华大学、北京大学、中国科学院等在内的驻京单位合作，一如既往地做好各项服务工作，同时继续发挥中关村引领创新和成果的产业化，加快建设中关村国家自主创新示范区，为建设创新型国家做出应有贡献。 　　国家发改委高技术产业司司长綦成元在讲话中指出，蛋白质科学研究设施(北京)命名为“凤凰工程”，寓意着科技工作者在生命科学领域不畏艰难、追求卓越，孜孜以求、不断创新。“凤凰工程”是我国在生命科学领域提高原始创新能力的重要战略部署，将从系统生物学角度分析和揭示蛋白质的功能、探索蛋白质结构与功能对个人生命过程的作用，在分子、细胞和生物体等多个层次上阐述生命活动规律和现象本质，并揭示疾病发生发展的分子机理。“凤凰工程”也是军民结合、协同创新的重要体现，承担项目的四家单位——军事医学科学院、清华大学、北京大学和中科院生物物理所，都是国内相关领域具有一流实力的科研单位，四家单位的强强联合，体现了我国集中力量办大事的优势。“凤凰工程”从申请立项到今天的正式奠基实施，凝聚了总后、教育部、中科院和北京市等各方的心血，在大家共同努力和支持下，“凤凰工程”必将建设成为我国蛋白质科学和技术的重要创新基地，蛋白质研究领域高端人才的培养平台，以及我国大规模蛋白质实物库、数据库和信息中心。“凤凰工程”必将展翅高飞、有力支撑我国乃至全世界蛋白质科学的发展和腾飞。 　　綦成元代表国家发改委对“凤凰工程”提出了两点希望：一是加强合作，精心组织。“凤凰工程”由4家单位联合建设，各自有相应的建设任务。军事医学科学院作为项目法人单位要进一步加强与项目共建单位的紧密联系与合作，切实牵头做好项目建设的统筹，精心组织、认真实施，共同完成好项目的建设任务。希望总后勤部加强与教育部、中科院、北京市的沟通、协调和配合，继续指导和支持项目的建设、运行和发展。二是探索机制，开放共享。“凤凰工程”在抓紧进行项目建设的同时，要在管理机制和使用机制方面进行探索和创新。要探索如何在建成后的各子系统进行统筹，促进其形成合力、协调运行。要前瞻部署研究设施运行管理的组织工作，将设施作为深化科技体制改革的重要抓手，在开放共享、协同创新方面发挥先行先试作用，为我国生命科学研究和生物医药产业发展提供重要支撑。 　　作为项目法人单位，贺福初院长代表院党委和全院同志对军地有关部门领导的大驾光临，表示热烈的欢迎!对国家发改委、教育部、北京市政府、总后勤部和中科院、清华大学、北京大学给予我院的大力支持表示衷心的感谢! 　　贺福初在致词中指出，2003年，基于成功领衔“国际人类肝脏蛋白质组计划”这一历史契机，我院萌发了建设蛋白质科学设施的战略构想。在中国传统文化里，龙生九子、凤引九雏等典故表明，“九”与龙凤的关系源远流长，代表着“神圣”、“吉祥”和最高境界。正是经过9年的漫长孕育，今天我们才迎来了这喜庆的奠基典礼。此时此刻，我们将亲手助力“凤凰”出壳，亲耳聆听“雏鸟”鸣唱，亲眼见证中国生命科学的珠峰崛起，亲身感受北京科技力量的雄峰屹立。 　　“凤凰工程”规划为一体两翼，今天奠基的是总部设施。从天空俯视，这栋建筑将呈鲜明的英文“R”型，就像一艘巨大的“航母”，意在代表科学研究圣地，引领生物科技创新。根据规划，清华、北大还将建设以冷冻电镜、高频核磁等配套设施，同时吸纳中科院相关平台，从而打造世界蛋白质科学的核心基地和研究旗舰。作为项目法人单位，我们一定不负厚望，全力以赴将“凤凰工程”建设成经得起历史检验的国家级平台、国际性重镇。 　　贺福初强调，21世纪是生物科技的时代，更是创造新纪元的时代。当前，机械化的洪水仍在前行，信息化的波涛正在澎湃，生物化的桅杆渐现端倪。可以预见，随着各种技术的不断飞跃和深层融合，人类跨越的时间将得到极大延伸，涉猎的空间将得到极大拓展，人类生存与活动的质量和境界将得到极大提高。习主席讲，“人世间的一切幸福都是要靠辛勤的劳动来创造的。”古往今来，任何物种、任何国家的王者地位并非从来就有，也绝非亘古不变。正是辛勤的劳动、不断的创造推动了人类的进化，我们只有永远进击，才能创造更加美好的明天。 　　贺福初表示，刚刚闭幕的党的十八大确立了创新驱动发展战略，并将科技创新定位于国家发展全局的核心位置，这是时代赋予我们的机遇，这是历史赐予我们的厚礼。我们今天构筑的“凤巢”，是种下一林千年梧桐，旨在感召百鸟朝凤，旨在孵化金色凤凰。我们满心期待——不久的将来，在神州神奇的大地上，能够走出光耀星空的科学巨匠，能够诞生流芳千古的旷世鸿著，能够铸就改变人类历史进程的丰功伟绩。 　　贺福初强调，千百年来，人类螺旋式上升、迂回式前进的奋斗足迹告诉我们，逾越的台阶越高，变革的量级越大，遇到的困难就会越多，面临的挑战就会越大，但我们坚信，只要胸怀科学大志，发扬愚公移山精神，就一定能够为民族的伟大复兴、为人类的发展进步建立卓越功勋。 　　据了解，出席奠基典礼活动的还有国家部委、中科院、北京大学、清华大学、深圳大学、北京市科委、北京市外联办、中关村发展集团、昌平生命科学园相关部门领导，我院机关三部和直属单位领导、科技干部，凤凰工程设计单位、施工单位、监理单位代表共600余人参加，人民日报、新华社、光明日报、中央人民广播电台、中央电视台、经济日报、科技日报、健康报、中国科学报、中国医药报等13位中央媒体记者也来到奠基现场进行采访。