蛋白去折叠过程

使用沃特世公司SYNAPT High Definition质谱系统， 利兹大学就所获得的结果发表文章 沃特世（Waters® ）公司(股票代码NYSE: WAT) 2007年12月3日宣布利兹大学爱斯布理Astbury结构分子生物学中心使用最近购买的沃特世公司SYNAPT High Definition MS™ (HDMS) 质谱系统，在Journal of the American Society of Mass Spectrometry (JASMS) 美国质谱协会杂志上发表了蛋白研究的成果。 Ashcroft实验室正在使用SYNAPT® HDMS质谱系统研究生物分子功能。在2007年12月刊的一篇文章中，利兹的研究人员描述了对几种蛋白，如细胞色素C和贝塔-2-微球蛋白，的成功分离和分析，Ashcroft希望该成就可以通向对某些生物过程的完全了解，如淀粉纤维形成，细菌纤毛集结以及病毒衣壳的装配，这些过程都与衰老症有关。 蛋白质被人体小心地折叠，经三维长链分子装配而成。当正确地被折叠时，蛋白调节正常身体功能。当某些蛋白被折叠成特殊形状而变成错误折叠时，引起一系列反应，可导致自身聚集和淀粉纤维形成，因此一些高发疾病可能发生，包括老年痴呆症，疯牛病和帕金森氏综合症。在利兹大学，Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士和她的同事Sheena Radford诗娜拉德福德教授就是研究这样一种蛋白，贝塔-2-微球蛋白，试图探索它是如何形成纤维，在透析病人的关节聚集，并与透析相关的淀粉样变性病有关。对这些过程在分子水平的完全了解将有助于治疗方法的设计。 新型质谱为生物学研究带来新领域 作为工具，常规质谱是区分不同质量蛋白质的优秀方法。然而，一个特定蛋白的不同构象或不同的折叠形式具有同一质量数，使用常规的方法是无法区分开来的。这就是沃特世公司SYNAPT HDMS质谱系统和镶嵌其中的离子淌度技术帮助利兹大学的方式。 “一个蛋白可以折叠成紧密的三维结构，或者在某些条件下，蛋白可以打开成伸展的结构。即使这些三维结构拥有相同的质量和质荷比(m/z)，SYNAPT HDMS的离子淌度功能可以分离这些蛋白，并告诉您多少蛋白在折叠的形式而多少在非折叠的形式。而且，由于两种蛋白构象的横截面积不同，因为能够基于形状分离，SYNAPT HDMS质谱系统使我们能够区分各种不同的蛋白形状。 ”结果确实令人惊奇。”Alison Ashcroft艾利森艾斯克劳福特博士说，她是生物分子质谱研究员，质谱室主任。 来自沃特世公司的SYNAPT 质谱系统为实验室带来研究聚集过程的新的洞察力。“它为我们的研究提供新一维的空间。我们现在可以对原始状态的蛋白质定量，也可对非折叠或部分折叠的蛋白进行定量。我们也可以监测某种特定的蛋白构象在聚集过程被消耗。这为生物分子在分子水平如何工作提供了重要的新层面。”艾斯克劳福特博士补充道。 沃特世公司于2006年6月在美国西雅图美国质谱年会上推出SYNAPT HDMS质谱系统。它是第一台商业化的，在质量之外，基于尺寸，形状和电荷数分析离子的质谱。 一个管理万亿字节科学数据的决策 在生物技术和生物科学院(BBSRC) 和维尔康姆信托的资助下，艾斯克劳福特实验室拥有五台不同形式的质谱仪器，而管理其产生的数据是一个巨大的挑战。为了更有效地管理数据文件，该实验室选择沃特世公司NuGenesis Scientific Data Management System (SDMS)科学数据管理系统。 “每天在DVD上备份数据已经不需要了。科学数据管理系统SDMS 每天一次从五台质谱仪上将数据自动备份，我们的研究生和博士后可以直接从他们办公室的计算机上看到数据。存档文件对我们很重要，因为政府资助部门要求我们自建成之日起存储五或十年的数据。研究生花四年的时间拿到博士学位，所以他们需要四年或更长时间查看数据，特别是如果在拿到博士学位后要写文章” 艾斯克劳福特博士评论道。 “非分析化学背景的人们认为一台质谱就是一个复杂的称重机器。通常他们没有意识到使用这台仪器可以看到蛋白功能和行为。但是当他们发现了之后，会感到无比惊奇。”艾斯克劳福特博士说。 艾斯克劳福特博士在美国质谱协会杂志的文章全文参考: Monitoring co-populated conformational states during protein folding events using ESI-IMS-MS, D. P. Smith, K. Giles, R. H. Bateman, S. E. Radford,A. E Ashcroft, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2007 Dec 18 (12): 2180 – 90, DOI:10.1016/j.jasms.2007.09.017 文章再版要求请寄至A. E. Ashcroft 博士, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds LS2 9JT UK，或发电子邮件email: a.e.ashcroft@leeds.ac.uk 关于利兹大学生物科学系，请浏览(http://www.fbs.leeds.ac.uk/) 利兹大学的生物科学系是英国最大的生命科学研究团体之一，拥有将近一百五十名学者和四百多名博士后和研究生。该系目前活跃的研究基金约六千万英镑，资助者包括慈善，研究院，欧盟和企业。该系拥有杰出的研究成果，在上一期政府研究评价检查(HEFCE)中，所有主要评估项目均获得第五级。 关于利兹大学爱斯布理Astbury中心， 请浏览(http://www.astbury.leeds.ac.uk/) 爱斯布理Astbury结构分子生物学中心是利兹大学一个跨学科研究中心。成立该中心的目的是在结构分子生物学的各个领域从事国际水平的研究课题。Astbury中心汇集了五十多位来自利兹大学各学科的学者，拥有共同的学术兴趣。该中心以 W.T.Astbury 的名字命名，他是生物物理学家，在利兹大学长期从事科学研究(1928-1961)，工作期间在该领域成立了多个基金会。 艾利森艾斯克劳福特博士，(http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/mass.htm) 是生物分子质谱研究员，利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心质谱室主任。她的研究着重于开发和使用质谱方法探索生物分子功能。 诗娜拉德福德教授，(http://bmbsgi10.leeds.ac.uk/)，是利兹大学，生物科学系，爱斯布理Astbury结构分子生物学中心结构分子生物学教授。她的研究着重于蛋白质折叠，非折叠和聚集机理。 生物技术和生物科学研究院(BBSRC) (www.bbsrc.ac.uk)是英国生命科学资助机构。 政府投资的生物技术和生物科学研究院BBSRC 每年在很大范围的研究领域投资三亿八千万英镑，为英国国民的生活质量做出突出贡献。 维尔康姆信托(www.wellcome.ac.uk)是英国最大的慈善机构。它资助英国国内和国际创新生物医学研究，每年投资额在五亿英镑左右。 (Waters, SYNAPT, High Definition MS, High Definition Mass Spectrometry, NuGenesis 和 HDMS 是沃特世公司商标。)

大家好，本周为大家分享一篇发表在Journal of the American Society for Mass Spectrometry上的文章，Comparing Selected-Ion Collision Induced Unfolding with All Ion Unfolding Methods for Comprehensive Protein Conformational Characterization ，文章的通讯作者是美国威斯康星大学的李灵军教授和南开大学的李功玉教授。近年来，离子迁移质谱（Ion mobility−mass spectrometry, IM−MS）不断发展，成为了探究生物分子结构和稳定性的有力工具。IM-MS实验中测量得到的漂移时间可以转换为与分析物的大小或形态相对应的碰撞截面值（CCS）。碰撞诱导去折叠（collision-induced unfolding, CIU）通过将碰撞能量（CE）应用于气相分析物，研究其在去折叠过程中CCS值的变化，从而提供更多的结构细节。尽管电荷分离的CCS分布代表了气相中丰富的结构信息，但预测具有最接近native状态结构的蛋白质离子电荷态仍然存在困难。另一种方法是记录所有蛋白质电荷状态的四极杆无选择全离子去折叠方法(all ion unfolding, AIU)。如图1所示，本文中作者首先比较了四极杆选择对去折叠的影响及其产生的数据质量。然后，作者引入了一种CCS积累方法，用一个新的CCS参数——CCSacc（accumulated CCS）进行去折叠数据解析，该参数对所有观察到的电荷状态的数据进行汇总，以更好地区分气相中蛋白的结构和构象。作者发现，使用这种CCSacc方法生成的去折叠差异图更稳健，对nESI过程中产生的蛋白质电荷状态的变化具有更高的耐受性。此外，作者观察到用于比较的整体信号强度的增加，使去折叠指纹图谱质量得到改善。另外，这种CCSacc方法保留了电荷分离的CIU信息，也可以按需提取。图1.AIU和CIU工作流程比较图2a展示在不同的碰撞电压下，HSA的CCSacc的分布。CCSacc是综合的气相离子特征，以红色表示。通过CCSacc特征可以分析每个离子对结构的贡献，有助于全面了解现有的HSA结构异质性。通过计算HSA的CCSacc数据可以创建一个新的去折叠指纹图谱，将其与HSA的两种主要电荷态进行比较(图2c)发现，如果只分析单个电荷状态数据，而不将收集到的所有信息合并，就会导致信息丢失。CIU50值揭示的构象稳定性信息也显示了累积指纹图谱与单电荷态指纹图谱的差异，进一步强调了考虑所有电荷态结构信息的必要性。（图3）图2.CCSacc结构分析AIU指纹图谱结合CCSacc数据处理可以更全面地阐明蛋白质变体之间的构象差异。为了证明这一点，作者获取了BSA和HSA的AIU数据，然后提取CCSacc数据，用CIUSuite软件进行定量分析。总的来看，基于CIU50的构象稳定性比较和基于RMSD的整体去折叠指纹图谱比较都清楚地表明，AIU和CCS的累积能够提供更全面的结构信息，并对生物相似性蛋白的细微结构差异进行全面表征。图3.利用CCSacc全面比较HSA和BSA结构最后，作者将CCSacc应用于唾液化的糖蛋白bovine transferrin（bTF），快速分析糖基化对蛋白质结构的影响。图4a显示了bTF的非变性质谱图以及相应的漂移时间热图。先前的糖链研究证明，转铁蛋白是一种具有多种糖型的异质性蛋白，作者的非变性质谱数据（图4a）也明确支持多种糖型的存在。接下来，作者在AIU操作模式下追踪bTF的逐步去折叠行为（图4b-e）。图4f展示了通过CCSacc获得的累积去折叠指纹图谱。可以清楚地观察到，四种不同的构象主导了bTF去折叠过程。CCSacc弥补了不同离子种类观察到的结构差异。此外，构象特征CCS分析和相应的基于CIU50的稳定性分析表明，CCSacc主导的数据与传统CIU分析中常用的最丰富的电荷态所得数据不匹配。这些差异应该主要源于离子种类的贡献，而不是最丰富的离子种类，结果突出了在溶液中使用单一电荷态作为整个蛋白质种类的结构特征时存在的潜在偏差和/或结构损失。图4.通过CCSacc探究唾液酸化糖蛋白的结构CCSacc策略可以更好地维持蛋白质的天然构象，并降低由于仪器条件或溶液中蛋白质电荷态变化造成的影响。在提高去折叠指纹图谱的信噪比并丰富拓扑结构信息的情况下，该策略可以得到更广泛的应用。参考文献：Ashley Phetsanthad, Gongyu Li, Chae Kyung Jeon, et al. Comparing Selected-Ion Collision Induced Unfolding with All Ion Unfolding Methods for Comprehensive Protein Conformational Characterization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2022.

随着柔性电子产品的蓬勃发展对便携性、耐用性提出了更高的要去，因此折叠特性越来越受到关注。然而，这些产品的可折叠性取决于它们的旋转轴而不是电子材料，这极大地限制了它们的折叠方向和任意尺寸变化。为了满足未来柔性电子产品的各种折叠需求，能够实现任意重复真实折叠的导电材料是必要的，但很难获得。要实现上述折叠特性，首先要明确折叠（真折叠和伪折叠）的相关概念。真折是指压下折痕，使弯曲的两部分完全贴合。而伪折叠通常在折痕处打开。真折叠的最大应力可能比伪折叠大几个数量级。近年来，尽管研究人员已经付出了巨大努力来研究各种导电材料（如石墨烯、碳纳米管和MXene等）的组装和灵活性，但目前所有组装的导电材料仍然无法承受多次真实折叠而且折叠次数也通常以结构损坏为代价。鉴于此，同济大学吴庆生教授、吴彤研究员和上海师范大学万颖教授首次使用改进的静电纺丝/碳化技术成功设计并制备了一种超级可折叠导电碳材料（SFCM）。它可显着承受1,000,000次重复真折叠而无结构损坏和导电性波动。通过实时SEM折叠观察和机械模拟揭示了这种性能突破的根源。其具有适当孔隙、非交联连接、可滑动纳米纤维、可分离层和可压缩网络的结构可以协同作用在真折叠下的折痕处产生ε状折叠结构，通过凸起的层、分散的弧线完全分散应力，以及ε中的可滑动凹槽。因此，当整个材料真正折叠时，每根纳米纤维都避免直接面对180°折叠。这项工作体现了结构创新、性能突破和机制揭示，具有重大的科学意义和应用前景。相关工作以“A biomimetic conductive super-foldable material”为题发表在国际顶级期刊《Matter》上。SFCMs的制备和表征作者采用仿生定向场控静电纺丝技术制备生茧状聚合物结构，同时协同控制静电纺丝的参数。原位梯度-温度反应-保持技术与卷取过程一样，通过控制多级聚合物热解同时完成造孔、解结和层膨化，从而成功制备了SFCMs（图1）。SFCM的SEM图像显示其结构是由碳纳米纤维编织的多层网络。纳米纤维是直的、光滑的、多孔的，直径为200 nm，长度为毫米级，纵横比超过10,000。纳米纤维是逐层堆叠的但彼此之间没有粘连（图2）。非交联的编织层网络可以形成一个完整的应力传递和分散系统。这些微观结构特征与超柔韧的切茧高度相似。此外，SFCMs具有良好的导电性，在-1~ 0 V范围内具有稳定的电化学窗口，这对于超级可折叠的储能设备很有希望。图1 SFCMs的仿生合成图2 SFCM的结构表征超级折叠属性和机制作者设计并安装了一个设备对各种材料进行了大量折叠测试（图3）。平行实验表明，在整个折叠周期从1到1,000,000次，SFCMs的纳米纤维都完好无损，电导率没有明显波动，内侧只出现两个微槽，这是由于纳米纤维滑动造成的。外侧几乎没有结构变化。此外，进行不同形式的折叠，所有 SFCM 都可以保持结构完整性，甚至在展开后自动迅速反弹，这为超级可折叠性提供进一步支持。当 SFCM 完全折叠时会形成光滑的ε状结构。局部结构的放大观察表明所有纳米纤维都是无损伤的，这可能与它们在折叠过程中的上述结构调整密切相关。当SFCMs的厚度达到100 mm时，它们仍然可以通过形成ε折叠结构来保持超折叠性能。图3 SFCM 的超折叠特性以及与典型对照样品的比较除了弯曲（折叠），柔性指标还包括滚动、扭曲、拉伸和压缩，它们可能对超折叠性起到辅助作用（图4）。扭转和滚动测试表明SFCM没有纳米纤维损坏。在拉伸性能方面，SFCMs的应力-应变曲线表现出显着特征。在压缩测试中，SFCM 厚度的99.3%恢复可以在将压力逐渐增加到10 MPa后保持，结果反映了它们的高强度和弹性，这也有助于柔韧性。这些力学性能为并为超级可折叠性提供强有力的支持。图4 SFCM 折叠以外的灵活性特征SFCM的超折叠机制源于折痕处的ε折叠结构，其中包含三个典型区域：(1) 由层间分离和纳米纤维滑动引起的凸起层可以减少沿层的应力。(2) 由折痕正中层的凸起和凸起两侧的层的压缩所带来的两条分散弧，避免形成应力集中的0内角。(3) 由纳米纤维滑动引起的两个折叠微槽，垂直对应于两个分散弧的内部，可以分散厚度方向的应力。这三种协同的微观结构变化有效地分散了各个层次和方向的应力，实现了超折叠性（图5）。此外，对一些微观结构不满足超折叠性的要求的材料（如rGO膜、碳布以及织物等）折叠特性的研究间接支持了该原理。图5 折叠与相关材料对比小结：作者通过改进的静电纺丝/碳化技术制备了具有层状纳米纤维网络结构的超级可折叠导电碳材料。在折叠机上多次真实折叠过程中观察它们的结构变化和电导率波动来研究它们的超级折叠特性，并通过实时SEM折叠观察和机械模拟揭示了超级折叠机制。更重要的是，还根据这些结果总结了超折叠材料的构建原理，对制备其他超折叠材料具有重要的指导意义。全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2590238521003921

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics1，文章的通讯作者是密歇根大学的Brandon副教授。　　双特异性抗体(bispecific antibodies, bsAbs)是一类重要的新兴疗法，能够同时靶向两种不同的抗原，已被开发作为对某些单克隆抗体疗效有限疾病的治疗手段。尽管bsAbs具有独特的优势，但它的结构较为复杂，需要特殊的制备工艺，“knobs-into-holes”(KiH)是其中一种可以用于制备bsAbs的技术，这种技术通过将knob链CH3结构域表面的特定氨基酸突变为较大氨基酸，将hole链上的突变为较小氨基酸，从而实现“knobs-into-holes”的配对形式，提高不同轻重链在配对时的正确配对率，产生正确的bsAbs。然而，由于抗体治疗药物分子量较大，通常比传统的小分子药物表现出更大的结构复杂性和异质性，对KiH bsAb 高级结构的完整表征对定义bsAb的结构功能关系，以及确保最终治疗的稳定性、有效性和安全性都至关重要。目前已开发的分析方法有很多，但是普遍存在样品消耗量大、数据采集和解析时间较长等缺点。近年来，非变性离子迁移质谱(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)和碰撞诱导去折叠(collision-induced unfolding，CIU)逐渐被证实是用于分析单克隆抗体高级结构的有效方法，能够从存在结构异质性和杂质的几微克样品中表征单抗治疗药物的高级结构。IM可以根据气相蛋白离子的电荷和旋转平均碰撞截面(collision cross sections，CCSs)在毫秒时间尺度上对蛋白进行分离。当与质谱耦合时，可以很容易地将质荷比相同但CCS不同的离子区分开来，而CIU可以使IM-MS同步提供蛋白质结构和构象稳定性信息。CIU根据二硫键、糖基化水平、结构域交换特性等信息来区分差异。　　在这篇文章中，作者描述了定量CIU在bsAbs中的首次应用，扩展了非变性IM-MS和CIU的能力，用于稳定表征KiH bsAb及其亲本knob和hole同型二聚体单抗的高级结构。　　图1 Native、未修饰的knob(蓝色)和hole(橙色)同型二聚体，以及KiH bsAb异型二聚体(绿色)的CIU实验。(A)24+电荷态(左)及其相应重复RMSD基线(右)的平均CIU指纹图谱(n=3)。所有的指纹图谱都显示了白色虚线框所示的三个主要特征。在(B) 5 V、(C) 65 V、(D) 110 V时的标准化TWCCSN2分布。在较低的激活电位下，所有抗体均具有相似的CCS，在较高的加速电位下则存在显著差异。(E)两两的RMSD分析显示，与重复的RMSD基线(虚线)相比，抗体之间的整体高级结构差异。(F)CIU50分析说明了KiH bsAb模型的稳定性如何保持在knob和hole的同型二聚体之间。　　如图1所示，bsAb的稳定性似乎与本文研究的KiH模型的两个亲本同型二聚体单克隆抗体相关。在电压为65V时，KiH bsAb的TWCCSN2分布与亲本knob同型二聚体单抗的分布相似 而在110V时，则与亲本hole同型二聚体单抗的分布相似。并且KiH bsAb的稳定性介于两种亲本同型二聚体单抗的稳定性之间。与指纹图谱中记录的第一次CIU转换相对应的是CIU50-1值，第二次的则是CIU50-2值，从3组样本的数据分析推测，CIU50-1和CIU50-2很可能代表了KiH bsAb和mAb结构中不同结构域的局部稳定性。　　图2 knob和hole的半体CIU数据。(A)16+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，半体之间的高级结构存在显著差异。(C)CIU50分析显示，蛋白质稳定性存在显著差异。　　为了更好地展示KiH bsAb不同结构域的CIU特征，作者记录了同型二聚体单抗IM-MS光谱中16+电荷态的knob和hole半体的CIU数据。从图2A的指纹图谱可以看出，每种结构都包含4种主要的CIU特征，但是图2B的RMSD分析显示两种半体的高级结构之间存在显著差异。CIU50分析进一步表明，在观察到的两次展开过渡中，knob半体明显比hole半体更稳定。作者推测造成这种CIU主要差距的原因可能是Fab结构域的差异。　　图3 Fab和Fc片段的CIU数据。(A)13+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，knob和hole的Fab片段之间存在显著差异。(C)CIU50分析显示，不同片段之间稳定性存在显著差异。　　为了进一步将CIU特征联系到KiH bsAb的结构域当中，作者对木瓜蛋白酶消化后产生的Fab和Fc片段进行了CIU分析。从图3A可以看出，knob和hole的Fab片段都具有3种CIU特征，但是嵌合的Fc片段则具有4种CIU特征。尽管knob和hole的Fab片段具有相似的CIU指纹图谱，但是RMSD分析显示它们之间的高级结构仍然存在较大差异，并且knob的Fab片段稳定性明显高于hole的。至于Fc片段的稳定性则远高于两种Fab片段，可能的原因是重链CH3结构域的强非共价作用以及knobs-into-holes配对的影响。　　图4 去糖基化后的knob、hole同型二聚体和KiH bsAb异型二聚体24+离子(n=3)。(A)比较对照组和去糖基化抗体的RMSD分析显示，高级结构有显著差异。CIU50-1(B)和CIU50-2(C)分析显示抗体去糖基化后表现出显著的不稳定性。(D)对照组和去糖基化抗体之间的CIU50值差异图。　　先前的研究已经证明，CIU对不同水平的单抗糖基化很敏感，其中去糖基化会导致单抗高级结构的不稳定。作者利用高分辨率非变性轨道阱质谱分辨添加PNGaseF前后同型二聚体mAb和KiH bsAb糖型的变化。实验结果显示，KiH bsAb表现出高度糖异质性，包含至少12种不同的糖型。这很可能归因于组装的KiH bsAb中每个独立的knob和hole重链上存在独特的糖基化，进一步增加了其复杂性。　　总而言之，这篇文章展示了IM-MS结合CIU用于建立KiH bsAb及其亲本同型二聚体之间高级结构联系的能力。单独的CCS不足以解决此研究中抗体之间细微的高级结构差异。相比之下，CIU指纹图谱则可以分辨和区分每一个等截面的抗体。这一解释bsAb CIU细节的能力，加上对KiH bsAb稳定性的更深入理解，有可能提供支持KiH bsAb发现和发展的关键信息。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Villafuerte-Vega, R. C., Li, H. W., Slaney, T. R., Chennamsetty, N., Chen, G., Tao, L., & Ruotolo, B. T. (2023). Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics. Analytical Chemistry.

2006年，国际两家光电子杂志Laser Focus World和Photonics Spectra的编辑曾分别主动在世界技术新闻专栏中特别介绍了复旦大学陈良尧教授课题组研发的多光栅二维折叠光谱技术，认为该技术的创新原理和方法将能够被拓广并应用于更具挑战性的高效率光谱获取和分析领域，以及推广到中远红外光谱分析领域。 　　上海市计量测试技术研究院的资深光学科学家袁海林教授也曾评论到，&ldquo 采用多光栅结构对成像光谱进行高密度折叠，在很宽的光谱区内实现高分辨率、快速和长时间可靠测量，将会成为现代光谱仪设计中一个主流技术和发展趋势&rdquo 。 　　究竟是怎样的技术让国内外一片赞誉之声?为了寻求答案，近日仪器信息网编辑采访了多光栅折叠光谱仪技术的研究者&mdash &mdash 复旦大学陈良尧教授。 复旦大学 陈良尧教授 　　&ldquo 原理性创新&rdquo 　　光谱分析仪器在科学研究和工业领域有着广泛的应用，为满足应用需求，国际上已经发展了各种类型的光谱分析原理和方法，其中最主要的是采用棱镜和光栅等光学色散元件，结合高灵敏度探测器对各种光谱(如反射、透射、吸收、散射、椭圆、荧光、拉曼等光谱)进行测量和分析。但受到光电探测器光谱响应、光栅色散和机械扫描等因素的制约，只能被迫在光谱工作区宽度、分辨率和速度等参数之间做出妥协，从而严重影响和限制了其在许多重要领域的应用。这是国际学术和产业界长期未能解决的瓶颈和难题。 　　&ldquo 传统的光栅光谱仪需要使用机械装置对色散元件进行位移和旋转，这将限制测量速度的提高，而且机械转动部件的定位精度低，可靠性差，容易在操作过程中发生故障 另外，由于国内机械加工水平所限，使得国产光栅光谱仪的机械部件精度和可靠性不高，从而影响了光谱仪的整体性能水平，&rdquo 陈良尧说，&ldquo 另外，一块光栅难以覆盖全光谱范围，衍射效率为非均匀性分布，在其光谱衍射工作区的两端效率较低，影响了仪器的信噪比质量。&rdquo 　　在长期的光谱分析研究中，为克服传统仪器的这两方面局限性困难是陈良尧当初决定研发&ldquo 多光栅折叠光谱分析仪&rdquo 的原因，他希望能够研制出一种没有任何移动部件、光谱工作区宽、测量速度快的光谱仪。基于这一想法，陈良尧于90年代末开始&ldquo 多光栅折叠光谱分析仪&rdquo 的研制。&ldquo 这是原理和方法的创新，并非是&lsquo 阳春白雪&rsquo ，它的物理概念清楚，技术可靠，易于普及推广，只不过很多人没朝这方面去想。&rdquo 　　但是，当前光谱仪技术可以说是非常成熟了，再要尝试原理性创新，可能并不像陈良尧说的那么容易。在10多年时间的持续研究努力中，陈良尧教授经历了很多，如最初虽有设想，但缺少研究经费支持，在市场上也买不到现成的关键元器件，业内对这类极具应用前景的新原理和新技术的认识也不统一等等。不过，&ldquo 梅花香自苦寒来&rdquo ，2012年，最终实现的研究成果被选为国家自然科学基金&ldquo 十一五&rdquo 优秀成果。至今已经推出了多种可供实用的样机，集成组合的光栅数也由最初的3块增加到了10块。日前，陈良尧教授的&ldquo 极高密度二维折叠光谱成像装置&rdquo 课题入选了2014年高校自然基金国家重大科研仪器研制项目。 已研制完成的二维折叠光谱分析仪的整体外形图，250mm焦距，优于0.1nm光谱分辨率，全谱测量时间小于0.1s，重约8.9公斤。 　　多光栅折叠光谱仪采用了时间并联模式的快速光谱信号获取的新原理和方法，利用二维面阵探测器的优点，在一台光谱仪中，同时满足宽光谱区、高分辨率和快速测量的三项关键功能要求。在10光栅二维折叠光谱分析仪中，是将具有不同闪耀角和色散特性的10块子构成一个光栅阵列，克服了面阵CCD信号接受面的张角限制，在200-1000nm光谱区将一维约276mm光谱探测区的近2万个光谱数据点进行二维10重折叠，快速成像在二维面阵探测器的焦平面上。由于无任何机械位移部件，使得最小的光谱获取时间仅受限制于将光谱从CCD传输到数据存储器件所需要的时间，实现了全光谱高精度快速测量和分析。 　　&ldquo 所有用到光谱测量分析的地方都可以用&rdquo 　　&ldquo 多光栅光谱是通用型光谱仪，所有用到光谱测量分析的地方都可以用，如可以应用于食品环境等领域的科研与日常检测，而且未来完全可能替代常见的紫外、红外等光谱分析仪器。&rdquo 陈良尧对多光栅光谱仪的应用前景非常乐观，&ldquo 随着高性能低成本面阵光电探测器的普及，二维折叠光谱将成为主流光谱分析技术在更多领域实现推广应用。&rdquo 　　&ldquo 而且，由于改进了传统光谱仪的一些不足，使得该仪器可以用于一些极端条件检测。&rdquo 例如：由于无任何机械转动部件，多光栅光谱仪的全谱扫描速度最快能达几毫秒至数十毫秒，所以在清华大学等离子体实验室中，能利用它在真空条件下对等离子体原子谱线进行原位全谱检测分析，在相同的实验条件下，对各种原子态谱线进行比较分析，获得较为可靠的实验数据和结果。&ldquo 并且，等离子体实验室还希望通过合作，研究该技术在真空紫外条件下的应用。&rdquo 　　多光栅光谱仪既可以作为一种标准配置的光谱仪独立使用，也可以成为一个载体&mdash &mdash 作为光谱分析仪器的核心部件，可以极大简化分析仪器的结构。&ldquo 光谱仪是光谱分析仪器的&lsquo 心脏&rsquo ，目前很多国产光学分析仪器采用的还都是传统扫描型光谱仪，如果多光栅光谱仪能够得到普及，将会显著促进国产光谱仪器的更新换代。&rdquo 　　&ldquo 探测器技术与成本亟待突破&rdquo 　　&ldquo 目前在10光栅集成的仪器中，使用的是美国PI公司的CCD面阵探测器，单价在7万美元左右。高性能光电探测器依然是限制我国先进光谱分析技术发展的瓶颈，也是成本无法降下来、难于大规模普及的主要原因。&rdquo 不过，陈良尧也高兴地说到，已有国内企业正从海外引进新一代CMOS光电传感器技术，&ldquo 我们将会成为他们产品的第一批实验室用户。&rdquo 　　另一个关键元件&mdash &mdash 光栅则可以根据具体需求，既可以购买进口产品，也可以选择国内生产的。&ldquo 我们已经在国内找到一家企业，可以研制和生产出我们所需的光栅和其他光学器件。&rdquo 　　对于下一步研发方向，陈良尧介绍到，&ldquo 当前最重要的是把研究项目做好，并努力将这一技术应用到不同领域 另外，组合的多光栅模块本身也可以成为一个产品，现在的组合光栅的方位角还需要人工调试，未来希望能够采用自动化激光准直技术，研制出已被封装好、不需要调节的光栅组，用户拿到手里可以直接使用。组合的光栅数也有可能进一步增大，由现在的3-10光栅增至40-50块光栅的组合，满足更高精度的光谱分析需求。&rdquo 　　经过持续的研究努力，多光栅光谱仪已能够被实际应用。据介绍，除了面阵探测器国内目前还做不出来，其它重要部件都实现了在自己的实验室或在国内找到企业进行加工生产。说到这里，显现出了陈良尧教授比较独特的研究态度和模式，陈良尧将项目研究经费的很大一部分用于改造实验室环境，如在高性能光学仪器研究中，将购买高精度数控机床，用于仪器核心零部件的高品质研制和加工，保证质量，这在目前中国大学的实验室还比较少，对此，陈良尧说，&ldquo 这么做一方面是希望提高科学仪器的研究水平和效率，掌握核心技术，另一方面也十分需要培养研究生们的实际动手能力，不仅进行原理和方法创新，还需要采用先进制造技术，在学生时期就有能力亲手把这些仪器做出来，可靠实现创新科学仪器的各种新功能，在这方面与发达工业化国家相比，我国在培养学生具有硬科学技术研究能力方面的差距还比较大。&rdquo 　　&ldquo 由于高性能探测器价格一直居高不下，不利于大范围普及，目前仅根据一些用户需求进行定制，需要不断解决问题，让用户满意，建立良好的声誉，&rdquo 陈良尧说到。 　　后记 　　据了解，在陈良尧教授的研究成果2003年正式发表后，2007年在美国Light Smyth公司的广告中也出现了采用4种不同光栅结构参数组合的二维折叠光谱分析技术。而关于这一中国自主创新原理和技术的产业化途径，陈良尧无奈的说到，&ldquo 产业化的路还会比较长。&rdquo 究其原因，一是关键部件技术的局限，另外国家的支持政策等也是重要原因。就像采访最后陈良尧所说的，&ldquo 希望能够获得国家较高强度的产业化应用研究项目的支持，并与工业界的合作伙伴一起，使得这项技术被产业化，促进我国高性能光谱分析仪器的进步和发展，将会在国际上有自己的地位，产生出中国乃至世界上最好的光谱仪。&rdquo 　　编辑：刘丰秋

大家好，本周为大家介绍一篇发表在Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A上的文章，HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding1，文章作者是华盛顿大学的Tobin R. Sosnick。　　TonB-依赖的转运体(TBDTs)广泛存在与革兰氏阴性菌的外膜上，通过其摄取营养。但TBDTs转运时的机制尚不明确，尤其是可供底物通过的跨膜β-桶孔径打开时的结构变化机理。BtuB是一种典型的大肠杆菌TBDT，其功能和生物物理环境都得到了广泛的研究。目前推测BtuB在行使转运功能时，其通道孔径形成需要BtuB与底物维生素B12结合，其N-端7个残基(称为“Ton box”)产生较大的构象转变，从β-桶中甩出进入胞质并与下游蛋白TonB发生相互作用。但孔径形成的过程具体机理存在两个具有争议的猜想：力依赖模型认为，TonB通过将BtuB从β-桶拽出到胞质，并从膜内侧将能量传递给BtuB，这些力可能重塑塞区并导致孔径形成 而非力依赖模型则认为孔径的形成跟BtuB自身保守的Ionic Lock(IL，即R14和D316间的盐桥)相互作用有关，当B12存在时只需要IL解锁TonB就能与BtuB结合产生成孔运动。晶体学研究捕捉到了Apo BtuB、BtuB:B12和BtuB:B12:TonBCTD的结构(图1)，但晶体学研究一来存在晶体堆积导致其结构与溶液态蛋白结构产生一定差异的问题，二来静态的结构“截图”无法提供动态变化过程信息。因此，本文选择氢氘交换质谱法(HDX-MS)解析BtuB和配体结合时产生结构动态变化过程，以深入推测该过程的具体机制。　　图1. BtuB腔体结构域与两个配体结合事件的构象响应模型。　　该实验共设有4组，包括：Apo BtuB、BtuB + B12、BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB。作者对BtuB + B12的HDX速率及保护因子(PF)进行了分析(图2)：其中，N-端2-29残基(包括Ton box在内及IL中的R14)、pre-SB3区域属于快速氘代区域，SB1、SB2、SB3属于中速氘代区，其他区域属于慢速氘代区。　　图2. HDX速率分区并映射至结构。　　随后作者分析了Apo BtuB、BtuB + B12的HDX-MS实验数据(图3)。其中IL区域及其相连的Fisrt Strand区域的HDX变化情况最为显著(氘代上升)，从氘代动力学图中我们可以看到添加B12后该区域的氘代速率从较慢的水平转变为较快的水平，这说明B12的结合足以使得IL区域发生较大的构象变化，该现象呼应了TonB从较为紧凑的结构转变为较为动态/溶剂可及性高的结构。除此之外，N-端前5个残基区域经历了轻微的氘代上升 底物结合区SB1、SB2和SB3经历了一定程度的氘代下降，而SB3的前端经历了一定的氘代上升。　　图3. BtuB + B12和Apo BtuB的HDX比较。　　接着作者也考察了BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB的HDX-MS结果(图4)。结果发现，只加TonB时BtuB的IL区域并未发生较大的HDX变化，而同时添加B12和TonB的BtuB IL区产生了明显的氘代变化，这些现象进一步证实了BtuB的Ton box发生结构改变是B12结合后IL解锁产生的效应。这些实验结果支持非力依赖型假说机制，即B12结合后通过別构效应使得IL处的盐桥打破，使得Ton box区被释放至胞质中，进一步跟下游蛋白结合从而打开通道孔径。　　图4. 不同组别的IL区域的HDX氘代动力学图。　　本文通过HDX-MS实验解决了大肠杆菌离子通道家族中一蛋白BtuB配体相关的动态调控机制，通过实验的方法验证了非力依赖机制假说。本文选取的体系及蛋白样品较为巧妙，实验设计合理，实验证据充分，行文逻辑严密，为离子通道的动态调控机制提供了见解，是HDX-MS方法优势的典型体现。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　原文：HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding　　李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Zmyslowski, A. M. Baxa, M. C. Gagnon, I. A. Sosnick, T. R., HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain's allostery and unfolding upon B12 and TonB binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022, 119 (20).

近日，哈尔滨工业大学（深圳）徐科教授、宋清海教授课题组，提出一种基于像素编码的片上数字型超构透镜，因其灵活的设计自由度而具备强大的光场调控能力。该工作以折叠级联的方式构建了高度紧凑的色散元件，结合重构算法实现了片上集成的高分辨率光谱仪。文章提出的数字型超构透镜可显著提升面内光束聚焦、准直和偏转能力。所设计的级联折叠型超构透镜组能够很好地解决传统色散光谱仪尺寸和分辨率互为矛盾的问题。结合重构算法，该器件以100 μm ×100 μm的紧凑尺寸在近红外波段超过35 nm的波长范围内实现了0.14 nm的分辨率，并且可以完成任意光谱的重构和解析。该光谱仪完全通过标准硅光工艺制造，在系统级集成和CMOS兼容性方面具有优势。所提出的超构透镜结构还可移植到氮化硅或其他光子集成平台，以轻松扩展到可见光或中红外波长等波段，为成像、光学计算等其他应用提供有力的光场调控方案。该研究成果以“Folded digital meta-lenses for on-chip spectrometer”为题于2023年4月11日在线发表在《Nano Letters》上。随着物联网、消费电子等应用领域的不断发展，对光谱仪的小型化提出了更高的要求。近40年里，光谱仪的微型化技术经历了从基于分立器件技术到集成光学技术的发展，逐渐趋于低成本和片上集成化。近年来，受到自由空间超构表面波前调控的启发，基于超构波导的一些平面内衍射光网络正在成为片上光波操纵的有力工具。目前已报道的片上超构系统都是基于各单元长度不等的传输阵列，结构规则简单但设计自由度受限，导致系统集成度和功能的局限性。如何突破设计自由度的限制，是提升片上超构表面光场调控能力以及拓展应用的关键。借助超构表面强大的光学操控能力，有望突破传统片上光谱仪分辨率和器件尺寸相互制约的矛盾。为了解决设计自由度受限的问题，文章提出了一种基于像素编码的数字型超构表面。基本思想为求解超构表面目标相位分布。为降低算力消耗，我们将目标区域划分为多个单元，通过逆向设计对每个单元图案分别进行编码，在平面任意区域实现任意相位响应。与数字型超构波导在局部区域内的原位控制不同，本文提出的数字型超构表面可以整体操纵面内波衍射及其在整个平板区域内的传播。这种特性使该结构能够设计连续大相位梯度的高色散数字型超构透镜，允许光束在紧凑的尺寸内实现聚焦、准直和大角度弯曲等类似几何光学透镜的功能。具体设计原理如图1所示。图1. 基于数字型超构表面的超构透镜逆向设计原理。(a)超构透镜在1550 nm处的光弯曲 (θ=45°)和聚焦(f = 19.5 μm)的射线光学演示。(b)透镜的理想相位轮廓曲线(φ)，可视为45°弯曲相位曲线 (φ1)和聚焦相位曲线(φ2)的叠加。I:计算的绝对相位，II:对应的菲涅耳相位。(c)每个单元的优化器件图案和对应的理想相位曲线(φ)。(d) 计算出的理想相位掩模（黑色实线）与所设计超构透镜的模拟相位响应（红色虚线）之间的比较。(e)所设计单个超构透镜的模拟光场分布。(f)模拟超构透镜的焦点AI不同波长下沿x'轴的偏移。插图为不同波长下焦点的横截面光场分布图。要实现更高的波长分辨率，需要累积色差和增加光程。为了验证设计效果，本文设计并制备了一种基于五层折叠超构透镜的光谱仪，器件尺寸仅为100 μm×100 μm。该器件的模拟光场和实测结果如图2所示。图2(a)中的五层超构透镜功能不同，透镜I用于准直扩束输入光同时转折光路，透镜II-IV则承担着累积色散和波长分束的作用。受到读出波导间距的限制，此时该器件直接读出的分辨率约为1 nm (图2(d))。为了进一步提高光谱仪性能以及器件的制备容差，在色散分光的基础上引入了光谱重构算法。图2. 基于五层折叠超构透镜的光谱仪。(a)五层折叠超构透镜光谱仪在1550 nm处的模拟光场分布。(b)器件尺寸为100 μm×100 μm的光谱仪显微镜图像。插图:超构透镜和输出波导阵列的局部电镜图像。(c)器件实测的输出强度与输入波长的映射图。(d)两个相邻输出通道11和12的透射光谱，通道间距约为1 nm。(e)谱相关函数C(δλ)的半高半宽δλ为0.108 nm，与光谱仪的估计分辨率相对应。为了体现光谱仪的性能，构造了几种不同类型的预编程光谱来测试光谱仪的性能。重构光谱见图3。结果表明，结合重构算法后，该光谱仪的光谱分辨率提升至0.14 nm(图3(a))，整体工作带宽覆盖1530 nm-1565 nm，且性能在边带依旧保持稳定(图3(c))。此外，对于同时具有宽高斯背景和窄带单峰特征的复杂频谱(图3(d))，本文提出的片上光谱仪依旧能与商用光谱仪保持良好的一致性。图3. 使用基于五个折叠超构透镜的片上光谱仪进行光谱重建（实线表示重建光谱，虚线表示商用光谱仪测试结果）。(a)两条相隔约0.14 nm的窄光谱线的重建光谱。(b)距离约20.61 nm的双峰重建光谱。(c)在工作带宽上分别重建7处不同波长的窄带光谱。(d)宽带光源入射的重建光谱。此文提出的基于数字型超构透镜的片上光谱仪在超过35 nm的波长范围内实现了0.14 nm的分辨率。整体尺寸仅为100 μm ×100 μm，最小特征尺寸为120 nm，可通过标准硅光工艺大规模制造。该设计方案具有可移植性，使用氮化硅或其他集成平台，基于超构透镜的光谱仪可以扩展到可见光或中红外波长。目前器件的数据读出依赖于片外功率计，可以通过集成片上光电探测器阵列来改善。此外，片上数字型超构透镜作为一种功能强大的片上光场调控器件，在成像、光计算等领域也有应用潜力。

本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

“嘭！”“发射正常！”“机翼尾翼展开正常！”“螺旋桨最大功率推进！”“姿态改平正常！”“开始巡航！”“到达目标上空发现目标！”“目标锁定成功！”“完成打击！”。伴随着这一连串的指令，西北工业大学无人系统技术研究院副研究员昌敏负责的大仰角弹射长航时“游隼”管射折叠翼无人机（以下简称“游隼”长航时折叠翼无人机）捷联图像末制导闭环试验成功。管射折叠翼无人机是近年来兴起的新型巡飞与精确制导装备。由于考虑便携性和灵巧性，管射折叠翼无人机采用储存、运输、发射一体，发射管的有限空间约束极大限制了无人机机翼尺寸，从而影响了折叠翼无人机气动性能，是一门“螺蛳壳里做道场”的艺术。昌敏说：“单次折叠的串列翼布局是国际上主流的折叠翼无人机布局形式。”经过长期研究，昌敏团队发现串列翼布局对于有限尺寸的发射管来说，机翼面积更大些。但是受发射管长度限制，机翼展弦比不高。而且随着攻角的增加，串列翼布局的前后翼远距气动耦合诱导阻力增加得很快，串列布局的折叠翼无人机最佳升力系数不高，升阻比也较低，并且很难再有所提高，这意味着飞行器平台的飞行性能被这个天花板牢牢压制，因此这就成为了折叠翼无人机技术发展的瓶颈。在日以继夜的分析试飞数据和反推动力学模型后，团队发现多次折叠方案中“Z型折叠”总体上能够满足设计要求，但是其技术资料极少，其核心是高动态变体结构的气动、结构和动力学精确建模与预报技术。终于在团队不断攻关下，成功提出了“气动-结构协同的大展弦比折叠翼无人机设计技术”，首次将我国“由陆到空”“由海到空”折叠翼无人机升阻比大幅提升，将我国巡飞平台的气动性能提上了一个新的平台。在成功完成大展弦比折叠翼无人机设计后，昌敏团队又将目光投向了海空跨域飞行。由陆到空、由海到空是折叠翼无人机的主要跨域路径，而基于海面、陆地的高仰角发射飞行是约束折叠翼无人机使用范围的技术瓶颈。研究团队通过探明折叠翼面瞬时变体中的力系生成机制，揭示了变体几何布局-动力拓扑-气动力系架构-高仰角起飞瞬时转弯等时变耦合机理，突破了水面摇晃态垂直发射气动力系拓扑结构变体重构技术，实现“游隼”长航时折叠翼无人机国内首次深水释放、水面漂浮垂直冷发射无人机自主飞行验证与首次电动后推螺旋桨陆地垂直冷发射折叠翼无人机自主飞行验证。“游隼”长航时折叠翼无人机在陆地大仰角发射过程与末制导过程（西北工业大学供图）

2023中关村论坛重大科技成果专场发布会5月30日举行，发布了面向世界科技前沿、面向经济主战场、面向国家重大需求、面向人民生命健康的20项重大科技成果。面向世界科技前沿成果（共5项）硅基光电子集成芯片与多功能系统硅基光电子集成芯片是在同一硅基衬底上，集成光电子与微电子优势的微纳芯片，是在半导体领域的核心技术之一。北京大学科研团队首次研发由微腔光梳驱动的硅基片上集成系统，采用高稳定性的并行激光光源给芯片装上了“大脑”。根据应用需求，设计不同光子芯片架构，实现多通道海量信息传输、感知、计算，在超高算力密度、超高图像识别准确度等方面达到国际领先水平，广泛应用于云计算、自动驾驶等领域。（发布单位：北京大学）夸父卫星在轨获得世界一流天基太阳硬X射线图像等系列成果2022年10月9日，中国首颗综合性太阳探测卫星“夸父一号”成功发射。在轨测试期间，获得一系列重要科学观测成果。其中，全日面矢量磁像仪（FMG）首次实现我国在空间开展高时间分辨、高精度的太阳磁场观测，所获取的太阳局部纵向磁图的质量达到国际先进水平；太阳硬X射线成像仪（HXI）首次实现我国对太阳硬X射线成像，是目前唯一提供地球视角太阳硬X射线图像的专用设备；莱曼阿尔法太阳望远镜（LST）的子载荷之一，即太阳日面成像仪（SDI）首次实现在卫星平台上获取莱曼阿尔法波段全日面像，另一个子载荷—太阳白光望远镜（WST）观测到太阳上多个之前罕见的“白光耀斑”。卫星在轨表现为后续的科学运行打下良好的基础。（发布单位：中国科学院紫金山天文台、中科院国家空间科学中心）通用视觉大模型SegGPTSegGPT是国际首个利用视觉提示完成任意分割任务的通用视觉模型。SegGPT“一通百通”：给出一个或几个示例图像和意图掩码，模型就能get用户意图，“有样学样”地批量化完成同类物体分割任务，无论是在当前画面还是其他画面或视频环境中。SegGPT可以“分割一切，识别万物”，加速高级别自动驾驶和通用机器人等实体智能产业的发展。（发布单位：北京智源人工智能研究院）高能同步辐射光源直线加速器满能量出束高能同步辐射光源是探测物质微观结构的国之重器，电子束发射度达到世界顶尖水平，亮度比太阳光高一万亿倍，可为航空航天、能源环境、生物医学等多学科前沿领域，提供多维度、实时、原位表征的“探针”，解析物质结构生成及演化的全周期。2023年3月14日，作为电子诞生地的直线加速器成功加速第一束电子束，束流能量达到500兆电子伏特，标志着该设施进入科研设备安装与调束并行的阶段。该设施是在国家发展改革委支持下，中科院、北京市共建的大科学装置，建成后，将是中国首台高能量同步辐射光源，也将是世界上亮度最高的第四代同步辐射光源之一，为全球前沿基础科学和高技术领域的原始创新提供先进研究平台。（发布单位：中科院高能物理研究所）下一代云化开放无线网络新型空口试验验证平台基于6G“数字孪生、智慧泛在”的愿景与需求，中关村泛联院联合中国移动开发了下一代云化无线新型空口试验验证平台，为无线人工智能、通信感知一体化、智能超表面等6G前沿关键技术提供原型验证。该平台基带部分采用异构硬件开放架构，与5G基带相比，提升了近5倍的数据处理能力，并首次实现与多频段前端的灵活接入。该平台将为科研机构和企业提供开放的联合研发测试验证环境，支撑6G技术标准路线选型和系统方案验证，同时将协同带动芯片、器件等产业链研发布局和技术迭代。（发布单位：中关村泛联移动通信技术创新应用研究院）面向经济主战场（共5项）30微米厚度柔性可折叠玻璃超薄柔性可折叠玻璃是全球柔性显示技术与终端发展的焦点，可广泛应用于折叠手机、卷轴电视机、柔性医疗检测装备、5G天线等领域。中国建材集团科研团队成功开发出厚度30-70微米超薄柔性可折叠玻璃，其中30微米产品厚度仅为A4纸厚度的四分之一，弯折半径小于0.5毫米，弯折寿命突破100万次，核心性能指标达到全球领先，打造了超薄柔性可折叠玻璃全流程的工业化产业链。（发布单位：中国建材集团玻璃新材料研究总院）先进压缩空气储能技术中国科学院工程热物理研究所完成先进压缩空气储能技术研发，成功攻克了宽负荷压缩机、高负荷透平膨胀机和高效蓄冷蓄热器等关键技术，实现了从空气内能到电能的高效转换。基于该技术，已在张家口建成国际首套百兆瓦先进压缩空气储能示范电站，顺利并网发电，系统额定效率达70.2%，比国外同等规模的压缩空气储能电站高出10%-15%，整体性能良好。（发布单位：中科院工程热物理研究所）己内酰胺绿色生产成套新技术己内酰胺作为重要化工原料，广泛应用于纺织、汽车、电子、航空航天等领域。中国石化首创己内酰胺绿色生产成套新技术，采用新反应途径、新反应工艺、新催化材料，使碳原子利用率由80%提升至95%，使氮原子利用率由60%提升至90%，与国际同行业技术相比，装置投资下降80%，生产成本下降50%。中国已成为己内酰胺的第一生产大国，全球市场份额达60%。（发布单位：中国石化集团公司）180kW高效率氢燃料电池发动机系统亿华通自主开发180kW高效率氢燃料电池发动机系统，通过氢能转换为电能，为新能源重型卡车电机提供动力。通过优化膜电极、双极板的流道设计，大幅提升了氢燃料电池寿命、氢电之间能量转化效率、动态响应速度。电池寿命达3万小时，是行业均值的2倍；能量转化效率达52%，比行业均值高10个百分点；从怠速到平稳运行最大功率点的动态响应时间小于3.2s，发动机提速快，比行业均值缩短60%。主要指标参数行业领先。（发布单位：北京亿华通科技股份有限公司）钠离子电池中科院物理所科研团队在国际上首次研发出低成本、高性能的钠离子电池，该电池由铜基氧化物正极材料、煤基无定型碳负极材料，以及高安全电解液体系组成。目前，该电池已在短续航电动车、1兆瓦时钠离子电池储能电站等进行示范应用。（发布单位：中科院物理研究所）面向国家重大需求（共5项）随钻成像测井仪器及井地数据传输系统 开发深层和非常规油气是保障未来能源安全的需要。随钻成像测井仪器利用井下传感器探测地层特性，在钻井过程中给钻头装上“眼睛”，是石油工业最核心的技术之一。中科院地质与地球物理所科研团队攻克了强振动冲击条件下动态测量等多项关键技术，自主研制了高温石英加速度计、压力传感器等5种井下核心传感器，成功开发出地质参数成像测井仪器，实现了从随钻一维曲线测井到二维成像测井的技术跨越；同时，研发出将井下数据实时传输至地面的泥浆连续波高速传输系统，并取得了最高速率每秒12比特的重大技术突破。这套仪器为油气高效开发提供了有力支撑。（发布单位：中科院地质与地球物理研究所）集成电路用12英寸高纯钴靶材及阳极12英寸高纯钴靶材及阳极是先进制程逻辑芯片及存储芯片关键支撑材料。通过自主开发，有研亿金成功突破高纯钴深度净化、高纯熔铸、磁性能调控及高可靠焊接等多项核心关键技术。配套国内外高端PVD机台用于国内最先进制程逻辑芯片，及DRAM和3D NAND FLASH先进存储器，批量销售给国内外多家一流半导体生产企业。有研亿金成为国内唯一、全球第二家掌握集成电路用高纯钴靶材和阳极成套制备技术的企业。（发布单位：有研亿金新材料有限公司）低温法烟气污染物近零排放控制（COAP）技术当煤燃烧时产生大量有害烟气。华能集团基于低温氧化吸附脱除技术，利用多孔材料，完成烟气多污染物一体化脱除，烟气经梯级冷却降至零下温区，低温烟气进入吸附塔，一体化吸附脱除多种污染物。实现二氧化硫、氮氧化物、粉尘的排放浓度远低于国际超低排放标准，同时，还可实现三氧化硫、重金属等其他污染物的深度脱除，并实现硫的资源化利用。这一重大原始创新成果为绿色、可持续发展作出了有益贡献。（发布单位：中国华能集团清洁能源技术研究院）基因编辑新型核酸酶 基因编辑是高效、精准的生物育种技术。中国农业大学科研团队首次发现全新的、拥有自主知识产权的基因编辑核酸酶Cas12i和Cas12j。当前，已应用于水稻、玉米、小麦、大豆等主要农业生物遗传改良中，支持培育了高产玉米、高油酸大豆等产品，为基因编辑技术产业化应用提供了重要工具。（发布单位：中国农业大学）新一代人造太阳 中核集团核工业西南物理研究院研制新一代“人造太阳”，是规模和参数在国内领先的新一代磁约束核聚变研究装置，等离子体电流可达300万安培，等离子体离子温度可达1.5亿摄氏度，将使我国等离子体聚变三乘积参数达到聚变堆芯级水平，综合性能跻身国际聚变先进行列。目前该装置等离子体电流突破115万安培，书写了我国可控核聚变装置运行新纪录。（发布单位：中核集团核工业西南物理研究院）面向人民生命健康（共5项）颅内病灶磁共振引导激光消融治疗系统 由华科精准、天坛医院等机构共同研发磁共振引导激光消融治疗系统，包含磁共振监测激光治疗设备及一次性激光光纤套件，是国内首款获批上市的磁共振引导颅内激光消融治疗系统，开创了我国神经外科微创治疗可视化、可控化、可量化的全新手术方式。该治疗系统磁共振温度监控误差小于1℃，温度刷新时间间隔小于4s，关键技术参数均处于国际领先水平。目前，已在国内率先完成难治性癫痫、脑肿瘤等各类微创手术超过400例。（发布单位：华科精准（北京）医疗科技有限公司、首都医科大学附属北京天坛医院）深脑成像微型化三光子显微镜三光子显微镜基于荧光分子吸收三个光子并发射荧光的效应，实现高分辨率光学成像。北京大学科研团队研发了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜，采用新颖的光学构型设计，并自主研制传输飞秒激光的柔性光纤、微型高分辨率物镜等核心部件，一举突破此前微型化显微镜的成像深度极限。该显微镜神经元功能成像最大深度可达1.2毫米，首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构的神经功能连接机制提供了观测手段。（发布单位：北京大学）北斗卫星通信融入大众智能手机及实现产业化兵器工业集团联合中国移动、中国电科，应用先进的信道编码技术，研制射频基带一体的核心芯片，可搭载于个人智能设备，实现直连卫星，可在无地面网络情况下持续保障应急通信、即时报告位置。这是成功链接高轨卫星、随时随地实现双向通信的重大跨越。目前，核心芯片量产规模突破千万。如您的手机搭载了这款芯片，当您身处无网络的险境，可点开北斗卫星消息选项，发出短报文，将获得及时响应。北斗，为您的生命保驾护航。（发布单位：中国兵器工业集团、中国移动通信集团、中国电子科技集团）基于国际首创技术的基因测序仪赛纳生物首创荧光发生和纠错编码技术，其中荧光发生技术是荧光切换的测序化学技术，纠错编码技术则是编码再解码的自校正信息处理技术。应用两项核心技术，进行基因序列检测，准确度达99.99%。目前，推出首款桌面型S100基因测序仪，具有体型小、操作简单、通量灵活、多场景适用的特点，在肿瘤诊疗、生殖健康等领域进行基因异常检测，实现了精准的疾病预警和诊断。（发布单位：赛纳生物科技（北京）有限公司）国产体外膜肺氧合治疗（ECMO）产品长征医疗联合北京协和医院等多家知名医院悉心研制的辉昇-I型ECMO产品，能够在体外循环过程中提供动力及安全监测，适用于急性呼吸衰竭、其他治疗方法难以控制并有可预见的病情持续恶化或死亡风险的患者。主机采用航天伺服系统中的电机控制技术，可精准控制泵头转速，减少对血液的破坏。该设备稳定性强、集成度高，产品仅为同类产品重量的1/2-1/3，整体性能达到国际先进水平。

为什么要用冻干的方法制备稳定的蛋白药物产品？在蛋白药物治疗的早期研发中，有必要设计一种在运输和长期储存期间稳定的配方。显然，水溶剂的液体产品对于生产来说是很容易且经济的，对于终端使用者也是十分方便的。水溶剂的液体产品存在的问题1. 大多数的蛋白以液体状态存在时，易于化学（脱酰胺或氧化）和/或物理降解（聚合，沉淀） 2. 如果严格控制水溶剂蛋白的储存条件，并且对配方进行合理设计，可以减缓其降解，但是在实际的运输过程中，精确控制储存条件通常是行不通的，蛋白会因受到多种应力的作用而变性，包括摇动，高低温，冷冻等 3. 尽管会设计配方和运输条件尽可能规避这些应力导致的损害，但是仍然不能足够阻止在长期储存过程中造成的损害。例如，在某些情况下，尽量减少化学降解的条件会导致物理损伤，反之亦然，那么就无法找到提供必要的长期稳定性的折衷条件。解决方案：冻干配方设计合理的冻干配方，理论上可以解决以上存在的所有这些问题。在干燥的样品中，降解反应可以得到充分的抑制或减缓，蛋白产品在室温状态可以仍然维持其稳定性，保存期可达到数月或数年的时间。而且，在运输过程中，短期的温控偏离，冻干的蛋白样品通常也不会受到损害。即使在两种或多种降解途径需要不同条件才能实现最大热力学稳定性的情况下，干燥产品中反应速率的降低也可以实现长期的稳定性。因此，一般来说，当配方前研究表明在液体配方中不能获得足够的蛋白稳定性时，冷冻干燥提供了颇有吸引力的替代方案。冻干蛋白配方可能遇到的问题然而，相对水针剂产品，只需要简单灌装即可来说，冻干过程较为复杂，且耗时、成本高，再有，一个十分关心的问题，如果配方中没有合适的稳定赋形剂，大多数蛋白制剂在冻干的过程中至少部分会因冻结应力和脱水应力而变性，结果通常是不可逆的聚合，通常是在冻结之后立即聚合或在储存过程中，小部分蛋白分子发生聚合。因为大多数的蛋白药物是非肠道给药，即使只有百分之几的蛋白聚合也是不可以接受的。因此，只是简单的设计一个配方，允许蛋白能承受冻干过程中的应力，但是无法确保冻干后的样品能有长期的稳定性。一个较差的冻干配方，蛋白很容易发生反应，须要求在零度以下储存，这样的配方应当认为是不成功的。本文将提供一些实践的指导，用于配方的设计，可以在冻结和干燥过程中保护蛋白，并且在室温条件下长期储存和运输过程中具有很好的稳定性。再有，会简要地讨论，配方设计须考虑到工艺条件的物理限制，已获得最终低水分含量的良好蛋糕。我们将不讨论冻干工艺的设计和优化，也不会偏离关于赋形剂选择的实用建议，以解决关于这些化合物稳定蛋白质的机制的争论。有丰富经验的药物科学家可能跟这篇文章的内容也没有很大的关系，但是可以将蛋白药物产品推向市场，然而，我们的目标主要是针对对于稳定的冻干蛋白配方设计还不太了解以及具有很大挑战的那些研发人员提供一个很好的开始。 配方设计的主要制约因素有哪些？当合理设计冻干配方时，需要考虑的因素很多，从整体来看，工作会比较复杂，但如果能很好的理解决定最终成功的主要限制因素，那么就会容易很多。01蛋白的稳定性首先记住蛋白产品选择冻干方法的主要原因是其不稳定性，整个配方中最敏感的成分也是蛋白质，那么在配方设计中首要关心的是赋形剂的选择，能够提供蛋白好的稳定性。02最终药物配置在配方研发开始之前，须确定好最终药物的配置，需要考虑的问题包括给药途径（常为非肠道给药），共同给药的其他物质，产品体积，蛋白浓度，冻干盛装容器（西林瓶、预充针或其它）等，如果最终药物需要多次使用，在配方中需要加入防腐剂，这个可能会降低蛋白的稳定性。03配方张力在选择赋形剂时，可能会考虑设计等张溶液，甘露醇和甘氨酸通常是良好的张力调节剂，这些赋形剂经常优于NaCl,因为NaCl具有较低的共晶融化温度和玻璃态转变温度，使得冻干更难进行。另外，如果样品中含有相对低的蛋白量，经常会加入填充剂，避免在冻干的过程中蛋白损失，甘露醇和甘氨酸同时也可以充当这个角色，因为他们会最大程度的结晶并且形成机械强度较高的蛋糕结构。然而，须意识到单独使用晶体类的赋形剂通常不能够在冻干过程和储存期间给蛋白提供足够的稳定性。04产品的蛋糕结构最终冻干的样品须具有优雅的外观结构，较强的机械强度并且没有出现任何塌陷和/或共晶融化，水分残留要相对较低（1g水/100g 干物质），如果产品发生塌陷，不仅外观不能接受，而且会导致样品最终的水分含量较高，复水时间延长。05产品玻璃化转变温度为了确保干燥后蛋白具有长期稳定性，非晶态成分（包含蛋白）的玻璃转化温度要高于计划的储存温度。水是无定形相的增塑剂，需要保持较低的水分含量确保样品的Tg 要高于运输和储存的最高温度。06产品塌陷温度一般来说，达到最终的目标，在整个冻干过程中，需要维持产品温度在其玻璃转化温度以下。在干燥过程中，当冰晶升华时，对于非晶态样品，产品温度须维持在其塌陷温度以下，塌陷温度通常与热致相变温度（也就是最大冻结浓缩无定形相的玻璃态转变温度Tg’）一致，同时，也有必要维持产品温度在任何晶体成分的共晶融化温度以下。在实际中，这些温度可以通过差示扫描量热仪DSC或冻干显微镜来测定。在配方开发中有必要测定产品的塌陷温度。 冻干显微镜Lyostat5及搭配使用的DSC模块为什么要测定塌陷温度？在低于产品的塌陷温度下干燥是需要付出代价的，产品的温度越低，干燥的速度越慢，干燥的成本就越高。通常，在-40℃以下干燥是不实际的，同时样品能降低到的温度还受一些物理条件的限制，比如冻干机的性能以及产品的配方。在配方开发过程中，药物研发人员应该与工艺工程师（设计冻干工艺人员）紧密配合，并且清楚了解放大化生产型冻干机与实验室研发冻干机的区别是非常重要的，通常情况下，生产型冻干机和实验室冻干机在工艺参数控制方面会有所不同，一部分原因是生产型冻干机较大，在冻干过程中每瓶样品的产品温度差异较大。因此，如果对冻干过程熟悉的研发人员可以提供有用的信息帮助配方科学家做出正确的判断，避免由于误判导致将较好的配方排除在外。对于塌陷温度较低的产品，也有一些方法，如可以通过控制过程参数来实现短时快速干燥。配方设计需平衡蛋白稳定性和塌陷温度很明显，配方设计的一个目标是保证蛋白稳定性的前提下提供较高的塌陷温度，产品的塌陷温度主要取决于配方的组成，如果蛋白的含量超过所有溶质的20%，会对Tg’有较大的的影响。尽管单纯的蛋白溶液通常用DSC很难测出Tg’，根据实验得出，增加蛋白含量，对于大多数的配方来说，均可以提高Tg’。通过外推法得到纯的蛋白溶液的Tg’，大约为-10℃，远远高于大多数的单一赋形剂的Tg’(如蔗糖的Tg’为-32℃)，因此，从工艺过程的经济角度考虑，更期望配方中较高的蛋白质和稳定剂比例，然而，蛋白的稳定性通常随着稳定剂与蛋白含量比例的增加而提高，因此须在高的塌陷温度和较好的稳定性方面做出平衡。并且，如下文讨论的内容，随着蛋白浓度的增加，蛋白质在预冻过程中抵抗冻结应力损伤的能力就会得到改善，那么在高蛋白浓度和高稳定剂和蛋白重量比的情况下，稳定性是最好的，这样，就会导致整个配方较高的固形物浓度，给工艺带来困难，总浓度超过10%的配方将比较难冻干。如何改变Tg'？在升华之前对配方进行一些处理可以改变Tg’，如经常使用的退火处理，在退火处理过程中，会从无定形相中移走一小部分成分，如使用甘氨酸作为晶体的填充剂，取决于预冻的方法，可能一部分的甘氨酸分子会保留在样品的无定形相中，甘氨酸具有相对较低的Tg’(-42℃)，因此让甘氨酸尽可能的结晶是非常重要的，这样可以提高样品中无定形相的Tg’，加快干燥，节省成本。对于赋形剂结晶，设计理想完善的方案，可以用DSC模仿冻结和退火工艺的条件来进行，这个方法可以参考Carpenter 和 Chang的文章内容。 在哪些步骤蛋白需要维持稳定性？实际上，从灌装到最终干燥的产品复水，每一步均会对蛋白造成损伤，并且要求配方的成分能够抑制蛋白的降解。在快速处理步骤（如灌装，预冻，干燥和复水等）中，主要的问题通常是物理损害，如低聚物的形成和/或蛋白沉淀；通常，蛋白从液体到固体的转变，相对与减缓化学变化，更多的会减缓蛋白的物理变化的速率，因此，储存过程中的化学降解经常是更严重的稳定性问题。在储存期间或复水时，蛋白也会发生聚合。在预冻和干燥过程中，受到冻结和干燥应力的作用，蛋白的结构很容易遭到破坏，如果在这些过程中，能够抑制蛋白去折叠（变性），那么降解过程就会达到最小化，因此，配方设计主要的关注点就是在这些过程中能够保护蛋白，在干燥后的样品中具有较高的Tg及较低的含水量，能阻止样品内部发生化学反应，更好的保持蛋白的天然性能。01在预冻过程中的蛋白的稳定性特定的蛋白是否易受冷冻破坏的影响取决于许多因素，除了在配方中包含适当的稳定剂外。一般来说，会考虑三个很重要的参数：蛋白浓度，缓冲液的种类以及预冻方法。蛋白浓度增加蛋白质的浓度能够提高蛋白对冻结变性的抵抗力，可以通过简单地测定冻融后蛋白聚合的百分比，该百分比与蛋白质浓度呈反比。通常，如果预冻过程中去折叠的蛋白分子部分与浓度无关，那么预计增加蛋白浓度会增加蛋白聚合。然而，现在人们认为，增加蛋白质浓度会直接减少冷冻诱导的蛋白质去折叠。据推测，冻结阶段的损伤包括蛋白在冰水界面的变性，假设只有有限数量的蛋白分子在这个界面变性，增加蛋白的初始浓度会导致较低比例的变性蛋白。处于实际的目的，将蛋白浓度作为一个重要的考虑因素，在配方开发过程中尽可能保持较高的浓度，就显得特别简单了。缓冲液种类缓冲液的选择也是非常关键，主要引起问题的是磷酸钠和磷酸钾，在预冻和退火过程中，二者的pH值会有明显的变化。对于磷酸钠，其二元碱形式的容易结晶，导致在冷冻样品中，剩余的无定形相中的pH会降到4或更低。对于磷酸钾，其二氢盐结晶后，pH会变到接近9. pH改变的风险以及对蛋白的损害可以通过提高最初的冷却速度，限制退火步骤的时间，降低缓冲液的浓度等来控制，所有这些措施可以降低盐类结晶的机会。快速冷冻，不进行退火也限制了蛋白质在暴露在冷冻状态下的时间。尽管其他的赋形剂能够辅助抑制pH的改变，较好的方法是避免使用磷酸钠和磷酸钾。在预冻阶段pH有较小变化的缓冲液包括柠檬酸盐，组氨酸，Tris溶液等。预冻方法排除由于pH变化造成的问题，在实验中发现，预冻过程中，蛋白质受破坏的程度跟冷却的速率有关系，较快的冷却速度形成的冰晶体较小，冰的比表面积越大，受破坏的程度越大，这个推测是由于蛋白在冰水界面变性导致。冷却的速度通常受冻干机设备本身性能的限制，然而，一些对冷冻敏感的蛋白，即使慢速冷却也会导致其变性。02、在干燥和储存过程中蛋白的稳定性尽管整个蛋白分子在预冻过程中保持了其原有的结构，然而，在后续的脱水干燥过程中如果不加入合适的稳定剂也会面临变性的风险。简单的说，当去除蛋白分子的水合外层时，蛋白质天然的结构便遭到破坏。对多个蛋白的红外光谱研究表明：无合适的稳定剂存在时，在干燥的蛋白样品中，其结构将会遭到去折叠。如果样品迅速复水，损伤的程度（如，聚合百分比）与干燥蛋白质的红外光谱的非天然表现直接相关。因此，降低复水后结构的破坏需要减小预冻和主干燥过程中蛋白结构的去折叠。而且，即使样品立即复水后100%的天然蛋白分子被恢复，干燥的固体中也会有相当一部分去折叠的分子。在复水过程中分子内的再折叠可以主导分子间的相互作用，从而导致聚集，在复水后表现为100%的天然分子。适当的赋形剂可以阻止或至少减轻蛋白结构的去折叠，配方是否成功可以通过红外光谱检查干燥后蛋白的二级结构来立即判断，更重要的是，发表的一些研究显示，干燥样品的长期稳定性取决于干燥过程中天然蛋白的保留量，如果干燥后的蛋白样品存在结构上的去折叠，即使样品在低于其Tg温度以下储存，蛋白也会很快被破坏，因此，红外光谱法可作为蛋白配方的另外一种工具，研发人员可以在冻干后对样品进行检测，确定其结构是否遭到破坏。欢迎先关注我们，下一期内容将继续为大家带来“实用建议：如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（二）”，详细分享：蛋白样品冻干的首选赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致最终失败的一些细节问题等。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 更多关于冻干技术分享平台的介绍请点击下方阅读：● 冻干免费技术内容获取-莱奥德创金字塔冻干技术分享平台► 点击阅读如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。2009至2021年间，德祥先后荣获了“最具影响力经销商”、“年度最佳代理商“、”年度最高销售奖“等殊荣。我们始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

p style=" text-indent: 2em margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 经过多年的研究攻关，我国科学家在世界上首次实现了原子级精准控制的石墨烯折叠。这是目前世界上最小尺寸的石墨烯折叠，对构筑量子材料和量子器件等具有重要意义，这一成果今天（6日）在国际学术期刊《科学》上发表。 /p p style=" text-indent: 2em margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 探索新型低维碳纳米材料及其物性是世界前沿的科学问题之一，相关研究曾两次获得诺贝尔奖。目前在单原子层次上精准构筑和调控基于石墨烯的低维碳纳米结构仍存在巨大挑战。中国科学院物理研究所的研究团队首次实现了对石墨烯纳米结构的原子级精准按需定制的可控折叠，构筑出一种新型的准三维石墨烯纳米结构。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 194px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201909/uepic/6c45d639-a4af-4ecb-8ae2-315a94ab2409.jpg" title=" 11.png" alt=" 11.png" width=" 500" height=" 194" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 550px height: 125px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201909/uepic/1ed31027-76c9-4f90-bfe0-2c48012aad5a.jpg" title=" 22.png" alt=" 22.png" width=" 550" height=" 125" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 193px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201909/uepic/be39c92a-43c7-4e00-831c-778c162810ab.jpg" title=" 33.png" alt=" 33.png" width=" 500" height=" 193" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em margin-bottom: 10px line-height: 1.5em " 据了解，该研究成果是目前世界上最小尺寸的石墨烯可控折叠，高鸿钧院士讲到，经过折叠，这些新型的二维原子晶体材料，有可能由没有超导特性变为有超导特性，由无磁性变为有磁性，利用这些特性变化，可以去构造功能的量子器件，如量子计算等，对未来应用具有重要意义。 /p

1965年，中国科学家在世界上首次人工合成牛胰岛素，开启了生命化学研究的新时代。过去数十年历尽科研工作者的不断努力，蛋白质的人工化学合成取得了巨大进步。相较于自然界的生物合成，化学合成可创制具有各种精确控制结构及非天然结构的人造蛋白质，对于发展满足我们需求的蛋白质工具和蛋白质产品带来了新机遇。近期科研工作者们在化学合成蛋白领域又取得了新的成果，并应用了月旭科技的相关色谱柱产品，快来随小编一起饱尝科研的饕餮盛宴吧！化学合成大型镜像聚合酶并实现镜像DNA信息存储WELCH据悉，自然状态下的DNA，会经过精巧的进化来存储遗传信息。而手性倒链L-DNA具有相同的信息能力，但耐生物降解，可作为一个健壮的生物正交信息库。在一项新研究中，清华大学生命学院朱听课题组的研究人员们用化学方法合成了一个90kda的高保真镜像Pfu DNA聚合酶，它能够精确组装一个千碱基大小的镜像基因。该实验中首次使用的大型镜像蛋白质全化学合成策略及千碱基长度镜像基因的组装技术，解决了长期制约镜像生物学领域发展的大型镜像生物分子的制备难题。该研究成果以“利用高保真镜像Pfu DNA聚合酶实现生物正交的镜像DNA信息存储”（Bioorthogonal information storage in L-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase）为题，于2021年7月29日发表在Nature Biotechnology杂志上。研究成果快览研究人员们用聚合酶在L-DNA中编码路易斯巴斯德1860年的一段话，这段话第一次提出了生物学的镜像世界。为突破全化学合成对蛋白质大小的限制，研究团队通过将嵌合的D-DNA/L-DNA关键分子嵌入到D-DNA存储库中，来实现手性隐写。团队将全长为775个氨基酸的Pfu DNA聚合酶分割为长度为467个氨基酸和308个氨基酸的两个片段分别合成，将其混合后共同复性，使其正确折叠为具有完整功能的90 kDa高保真镜像Pfu DNA聚合酶，为目前已报道最大的全化学合成蛋白质；研究者还利用该高保真镜像聚合酶组装出长达1.5 kb的镜像16S核糖体RNA基因，为目前已报道最长的镜像DNA。此外，他们发现保存在自然环境条件下（当地池塘水中）的微量L-DNA条形码，在1年内仍可扩增和测序；而在相同条件下的D-DNA条形码，在1天后就已经无法扩增。背后原因只有一个：它们的手性不同。在研究中，该课题组利用Ultimate® XB-C4 （4.6*250mm, 5μm）来监测反应的进行，并检测肽段产品的纯度。同时用制备柱Ultimate® XB-C4和C18 （21.2*250mm, 5μm或10*250mm, 5μm）来分离制备粗品肽段和连接产物。全化学合成富含二硫蛋白质WELCH在生物医学研究中，富含二硫的蛋白质是有用的药物或工具分子，但它们的合成由于折叠的困难而变得复杂。有鉴于此，清华大学的刘磊教授、中国科学技术大学的郑基深教授等研究人员，使用可移除的O-连接的β-N-乙酰葡萄糖胺策略，实现了正确折叠的富含二硫键蛋白质的全化学合成，该研究成果以“Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O-Linked β-N-Acetylglucosamine Strategy”为题，发表于2022年1月3日的JACS杂志上。研究成果快览研究人员描述了一种可移除糖基化修饰(RGM)策略，它可以加速具有多个或甚至链间二硫键的正确折叠蛋白质的化学合成。实验过程中，利用Ultimate® XB-C4（120Å或300Å，250mm×4.6mm，5μm）监测蛋白的合成反应，并用半制备柱Ultimate® XB-C4和C18（300Å，250mm×10mm，5μm）成功制备得到目标蛋白。该策略包括在Ser/Thr位点引入简单的O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)基团，通过稳定其折叠中间体，有效地促进了富含二硫的蛋白质的折叠。折叠后，O-GlcNAc基团可以用β-N-乙酰氨基葡萄糖酶(OGA)被有效地去除，从而获得正确折叠的蛋白质。使用这种策略，该研究组完成了正确折叠的铁调素的合成，这是一种含有四组二硫键的铁调节激素。研究人员首次实现了正确折叠的白细胞介素5(IL-5)的全合成，这是一种26kDa的同型二聚体细胞因子，负责嗜酸性粒细胞的生长和分化。“工欲善其事，必先利其器”，月旭科技专门针对多肽、蛋白类等生物样品方法开发，推出Welch生物样品分析方法开发包，助力前沿的科学研究和日常生产分析制备工作。● 适合蛋白、多肽或其他大分子的方法开发。为了能更好地与键合相发生作用，需使用大孔径（300Å或450Å）的填料。● 不同保留能力的不同选择性键合相，满足各种分子大小的蛋白质、多肽的保留和分离。参考文献1. Ting F. Zhu, et al. Bioorthogonal information storage in l-DNA with a high-fidelity mirror-image Pfu DNA polymerase. Nature Biotechnology,2021. Nature Biotechnology | VOL 39 | December 2021 | 1548–1555.2. Lei Liu, et al. Total Chemical Synthesis of Correctly Folded Disulfide-Rich Proteins Using a Removable O-Linked β-N-Acetylglucosamine Strategy. J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 349−357.

研究背景蛋白质分子在真实生命条件下的结构和功能特性往往受多种环境因子调控，包括配体分子、缓冲条件以及各种类型翻译后修饰等。作为一种常见的翻译后修饰，蛋白不稳定聚糖修饰，例如糖基化中的唾液酸化修饰，在各种生物过程中发挥着至关重要的作用。然而，由于天然可变性和环境敏感性，在完整蛋白水平研究唾液酸化修饰的构效关系一直缺乏合适的结构分析手段。论文简介近日，南开大学李功玉课题组（研究方向：大分子结构质谱分析）与福州大学李金宇课题组（研究方向：计算化学生物学与药物化学）合作，发展《糖型分辨去折叠离子淌度质谱》方法，利用课题组自主开发的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》技术，成功揭示了唾液酸化修饰与糖蛋白构象稳定性之间的复杂关系（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。该研究通过对唾液酸化模式、化学计量学信息及其对构象稳定性影响的综合分析，系统阐明唾液酸化调节蛋白质动态三维结构的分子机制，为蛋白低丰度翻译后修饰结构的快速高效解析提供一种新思路。该工作是李功玉课题组在《构象分辨质谱分析》领域的应用方法学拓展与深化，通过发展全离子去折叠、非变性离子淌度质谱和全原子分子动力学模拟技术，使构象分辨质谱分析从小肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202314578 Chem. Sci. 2023, 5936-5944 Anal. Chem. 2023, 2221-2228）跨越至大蛋白（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G Anal. Chem. 2023, 10895-10902 Anal. Chem. 2022, 2142-2153），成功实现微小差异的蛋白动态构象的快速高效分辨分析，有效提高了结构质谱解析气相蛋白动态构象的结构分辨率（Nat. Commun. 2019, 10, 5038），属于化学测量学领域质谱分析方向的前沿研究课题。研究亮点开发了一种糖型分辨蛋白构象去折叠策略，通过课题组前期报道的全离子去折叠 (AIU) 与非变性离子淌度质谱 ( Native IM-MS ) 联用技术，实现了对不同糖型蛋白质构象的稳定性快速分析和动态去折叠过程的可视化追踪（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。通过自主构建的定量分析构象参数，定量揭示唾液酸化对蛋白构象稳定性的调控作用，首次发现唾液酸化可以稳定蛋白质构象，并限制其动态构象转变（Chem. Sci. 2024, DOI: 10.1039/D4SC03672G）。将课题组前期（Chem. Sci. 2023, 5936-5944）提出的《结构质谱指引下的分子动力学模拟》新思路，首次拓展至大蛋白（ 80 kDa）结构解析。利用这种独创结构质谱解析平台，课题组近期成功解析蛋白气相去折叠的新型分子机制（Chin. Chem. Lett. 2024, in press），发现富含片层的结构域优先去折叠，并观察到 β-片层到 α-螺旋的动态转变，同时证明 α-螺旋比 β-片层具有更高的稳定性。该方法具有较强的广泛适用性，未来可应用于几乎所有蛋白体系。研究内容首先，为了表征不同胎球蛋白的唾液酸化模式，作者进行了基于 EThcD 的自下而上的糖蛋白质组学实验，图 1b 总结了牛胎球蛋白（bFT）和人胎球蛋白（hFT）的位点特异性糖基化模式。值得注意的是，具有两个唾液酸的糖型在 bFT 中占主导地位，而具有一个唾液酸的糖型在 hFT 中最为丰富（图 1c）。图1. bFT 和 hFT 的糖基化模式为了探究完整蛋白质结构与特定糖型之间的联系，作者开发了一种糖型分辨去折叠策略，该方法结合了非变性离子淌度质谱（Native IM-MS）与全离子去折叠（AIU）技术。通过优化转移池电压， hFT 的氧鎓离子和主要蛋白形式（电荷状态 12+ 、 13+ 和 14+）都得到了很好的分离，通过糖型分辨去折叠实验确定的糖型也与糖蛋白组分析一致（图 2b）。为了更加直观地比较蛋白质构象，作者为每种糖蛋白生成了 AIU 指纹图谱。实验结果表明，随着唾液酸数量的增加，第二个构象与第三个构象之间的 CCS 值差异逐渐缩小。此外，三唾液酸化的 hFT 具有四个构象，而其他唾液酸形式则具有五个构象，由此说明唾液酸的数量可能与胎球蛋白的构象灵活性有关（图 2c）。图2. 糖型分辨全离子去折叠可视化图谱为了进一步阐明唾液酸化诱导的蛋白质结构变化，作者量化了一系列的构象参数，包括 CCS 、 AIU50 等。第一个构象转变（T1）的 AIU50 值随着唾液酸个数增加而升高（图 3b 和 3f），这意味着唾液酸化会稳定糖蛋白结构，作者推测这可能是通过促进唾液酸和蛋白质结构域之间的额外静电相互作用和氢键作用实现的。值得注意的是，在 hFT 的第二个转变（T2）中观察到了相反的趋势，作者推测可能是唾液酸化在一定程度上促进了蛋白质的构象灵活性（图 3f）。之后，作者利用展开曲线来量化去折叠比例，并绘制了关于唾液酸化构象稳定性和动态转换的图谱。通过监测 CCS 变化百分比与碰撞电压的关系，绘制了展开曲线（图 3c 和 3g）。展开曲线显示，随着唾液酸数量的增加，去折叠起始能量逐渐增加，这表明存在明显的依赖唾液酸数量的展开趋势。同时，糖型分辨去折叠策略放大了构象差异， bFT 和 hFT 的 RMSD 分别为 5.9%~20.8% 和 7.7%~20.9% （图 3d 和 3h）。这些发现凸显了基于 AIU 方法在表征由不稳定的聚糖修饰诱导的细微构象变化方面的优势。图3. 糖型分辨去折叠定量分析胎球蛋白构象稳定性最后，为了研究唾液酸化与蛋白质结构之间的相互作用，作者使用唾液酸水解酶对 bFT 进行消化，同时通过分子动力学模拟进一步阐明了气相中 Asn99 和 Asn156 唾液酸化对蛋白动态构象变化的影响。唾液酸化与去唾液酸化牛胎球蛋白的 MD 结果都表现出四个构象，且具有可接受的 CCS 误差（图 4d）。唾液酸化亚型（646.8 K）的熔解温度（Tm）高于去唾液酸化亚型（642.1 K），表明唾液酸化有助于维持蛋白质构象（图 4e）。对去折叠中间体中 α-helix 和 β-sheet 结构占比的分析表明，唾液酸化有利于维持 bFT 中二级结构的适当折叠（图 4f）。加热过程中的代表性展开特征（图 4g ）表明唾液酸化聚糖可以包裹并紧实蛋白质结构。综上，作者认为末端唾液酸化稳定了胎球蛋白构象并限制了其动态结构波动。图4. 唾液酸化对胎球蛋白构象的稳定作用该研究为深入理解蛋白质不稳定聚糖修饰的结构和功能提供了新的见解，为疾病诊断和治疗提供了新的理论基础。同时，该研究也为开发新的蛋白质结构解析方法提供了新的思路。相关研究成果以“Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometry”(《构象分辨质谱助力微小差异蛋白构象高效解析》)为题在线发表于化学领域重要期刊、英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上。 南开大学化学学院 2022 级硕士研究生王雅梅、科研助理贾翼菲以及南通大学刘以畅博士为该文共同一作。李功玉研究员和李金宇教授为本文共同通讯作者。美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授和刘源博士对本项目提供了重要的技术支持。本文主要质谱数据均采集于天津《物质绿色创造与制造海河实验室》结构质谱分析平台。本研究工作获国家重点研发计划、国家高层次人才计划、国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费等项目资助。另附：南开大学李功玉课题组（详细信息请参考课题组主页：李功玉课题组 ( x-mol.com )）常年招聘科研助理和师资博士后，欢迎对大分子结构质谱感兴趣的同仁联系（ligongyu@nankai.edu.cn），重点引进具有有机合成化学、计算化学、细胞生物学和蛋白质组学等背景的相关研究方向人才。论文信息Sialylation-induced stabilization of dynamic glycoprotein conformations unveiled by time-aligned parallel unfolding and glycan releasing mass spectrometryYifei Jia, Yichang Liu, Yamei Wang, Jinyu Li* and Gongyu Li*Chem. Sci., 2024https://doi.org/10.1039/D4SC03672G作者简介 王雅梅 硕士研究生南开大学本文第一作者，2022 年本科毕业于南京师范大学，同年保送至南开大学化学学院攻读硕士学位（导师：李功玉研究员），研究课题主要聚焦疾病相关蛋白的结构质谱解析新方法开发。 刘以畅 讲师 南通大学 本文共同第一作者，2022 年于福州大学获物理化学博士学位（导师：李金宇教授），现任南通大学药学院讲师，研究方向为计算化学生物学与药物化学。 李功玉 研究员南开大学本文通讯作者，南开大学化学学院，特聘研究员、博士生导师。国家高层次青年人才计划入选者、国家重点研发计划青年项目首席科学家。2017 年博士毕业于中国科学技术大学化学系，随后在密西根大学和威斯康星大学麦迪逊分校完成博士后研究，于 2021 年 2 月加入南开大学化学学院，研究方向为大分子结构质谱分析。 李金宇 教授福州大学本文共同通讯作者，教授、博士生导师，福州大学化学学院院长助理。2011 年于荷兰阿姆斯特丹大学和法国里昂高等师范学院获化学与材料学双硕士，2015 年于德国亚琛工业大学医学院获生物学博士学位，同年于德国于利希研究中心先进模拟研究院从事博士后研究，2016 年加入福州大学化学学院、生物药光动力治疗技术国家地方联合工程研究中心。研究方向为蛋白质计算化学生物学理论方法开发与应用。本文说明了离子淌度技术在蛋白构象研究中的重要作用。沃特世一直致力于不断开发创新质谱相关技术，如特色离子淌度技术、特色成像技术等，同时以“助力客户成功”为使命，期待更多的用户合作及科学成果！

海顿科克直线传动是直线传动领域的领军企业，最近公司又推出了一款180度折叠安装驱动电机的RGS导轨，这种设计可以很好的满足在狭小的空间需要精确定位的应用环境。 这种折叠式的RGS导轨包含一个传统直线系统应含的所有部件，包括一个步进电机，同步带，传动丝杆，底座支撑，导轨和负载块。在底座上还带有可以安装传感器等部件的U型槽，电机和丝杠之间的标准传动比有2：1，1：1和1：2，使用轻质铝带轮和玻璃钎维增强尼龙同步带。丝杠导程范围从0.050in/rev到1.2in/rev。当使用2：1传动比，0.050in/rev丝杠和200步每转的步进电机，位置分辨率可达到千分之0.125in。在高速应用中，1：2传动比的同步带和1.2in/rev的丝杠配合可提供的最大速度达到7in/s。 海顿科克所有的RGS和RGW直线导轨都配有带消隙螺母的负载滑块，消隙螺母可以有效的提高定位精度和重复定位精度，镁铝合金做成的花键形式的导轨和303不锈钢做成的螺杆都涂有Kerkote TFE涂层，终身免维护，该折叠式RGS导轨最大的负载能力可以达到35lbs。 更多信息请访问海顿直线电机（常州）有限公司网站http://www.haydonkerk.com.cn

据新华社南昌4月8日电 智能手机近年来获得了长足的发展，而电池技术发展却相对缓慢。近日，江西理工大学研制出一款新式的可折叠锂电池，轻薄如纸、可任意弯曲，性能优于目前的普通锂离子电池。 　　江西理工大学&ldquo 江西省动力电池及材料重点实验室&rdquo 研发团队主要成员胡经纬表示，普通电池的电极材料附着在金属片上，即便再薄，电极材料也容易脱落，而用一种碳纳米管形成的宏观膜替代传统的金属片，便解决了这个问题。同等条件下，这款电池的比容量、能量密度均高于传统商用锂离子电池。该电池在经历5次持续折叠情况下仍能保持正常工作。 　　胡经纬说：&ldquo 这款电池主要是顺应了可穿戴设备的发展，可穿戴设备要受到一定的弯曲甚至折叠，要求它的电池也具备弯曲和折叠性能。我们设计的这款电池，最大限度地满足了可穿戴设备对电池柔性的需求。此外，由于轻质碳纳米管膜替代了金属箔材，该电池的能量密度有明显提高，因而可改善可穿戴设备续航能力不足的缺点。&rdquo

作为动态生物分子，蛋白质在肿瘤产生和发展过程中会发生丰度和结构的变化。与肿瘤发生关联的蛋白质异质性为阐明癌症发病机制提供了诊断信息，因此特异性蛋白是肿瘤诊断和药物设计的重要生物标志物。小细胞外囊泡（sEV）是由细胞释放的纳米尺度（直径30–200 nm）的膜囊泡。来自源细胞的蛋白质、核酸和脂质等与肿瘤产生发展相关的生物载物可以选择性地包装到sEV中，并通过膜融合和内吞作用等生理途径传递到受体细胞，影响受体细胞的生理功能，进而促进肿瘤的发生和发展。图 1 细胞外分泌囊泡的提取和纯化由于肿瘤来源sEV中的蛋白质异质性与肿瘤的恶性程度相关，并反映了肿瘤进展和转移的能力，因此对sEV蛋白组分的研究，有助于阐明sEV在肿瘤转移和侵袭中的作用，并促进体液活检的发展和癌症标志物的开发。传统蛋白质组学仅限于获得肿瘤细胞衍生的sEV族群的蛋白质表达信息，其在用于研究单个sEV蛋白组分时缺乏分辨率和灵敏度，特别是对蛋白质结构信息的获取。因此单个sEV的分子分析和异质性评估在技术上仍具有挑战性。光学表征提供了无损、快速、非侵入性的便捷探测手段研究蛋白质的组分和结构信息，然而由于远场光谱学的微米级光斑与百纳米级sEV直径之间的尺寸差异，使得远场光谱技术仅限于开展对sEV族群的大样本分析，其检测灵敏度和特异性受到sEV的异质性和sEV纯化挑战的影响。针对单个sEV蛋白组分分析的瓶颈，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心L04组陈佳宁研究员，SM4组叶方富研究员与国家纳米科学中心朱凌研究员、杨延莲研究员、王琛研究员和中国科学技术大学附属第一医院马小鹏副主任医师合作。利用自搭建纳米红外光谱系统（nano-FTIR）的10 nm尺度红外光场局域增强，在蛋白质酰胺I带（1600–1700 cm-1）和酰胺II带（1510–1580 cm-1）的指纹光谱频段内，通过对直径160–200 nm，高度为50–60 nm的单个sEV开展原位红外指纹光谱研究。图 2 单个细胞外分泌囊泡的近场红外成像和原位红外吸收光谱结合酰胺I带吸收频率对蛋白质骨架结构的高度敏感性，通过对健康和不同恶性程度细胞来源的单个sEV的红外光谱进行统计分析发现由于蛋白质中的C-O键和氨基酸C-OH基团中的氢键随着癌症的发展遭到破化，酰胺I/II吸收比值随着sEV来源细胞系的恶性程度增加而增加；高恶性癌症细胞来源sEV中蛋白质二级结构α-螺旋+随机卷曲的含量发生显著下降，反平行β-折叠+β-转角显著增加，这种蛋白质二级结构的改变一方面与癌细胞来源sEV在癌症发展演化起到的生理功能有关，另一方面在癌变细胞中富含β-折叠+β-转角的蛋白质的生物合成消耗更多的能量，癌症中线粒体异常的有氧糖酵解表现出异常能量代谢（即Warburg效应）在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用，而癌变细胞来源sEV中β-折叠+β-转角含量增加带来的更多能量消耗是Warburg效应的一种表现。图 3 单个细胞外分泌囊泡的蛋白指纹光谱作为癌症恶性程度的指标作为临床应用的探索，进一步分析了从两名乳腺癌患者的原发肿瘤组织中提取的sEV（I期，无转移；IIB期，有淋巴结转移）。相较于无转移患者来源的sEV，淋巴结转移患者的α-螺旋+随机卷曲比例显著降低，分子间反平行β-折叠+β-转角比例显著提高，病人组织来源sEV蛋白质二级结构占比的变化与细胞来源的sEV中的结论一致。研究结果显示了nano-FTIR在单个sEV分子鉴定的优势，证明了sEV蛋白异质性在癌症检测和肿瘤恶性评估中的意义和临床价值，为基于sEV的nano-FTIR分子指纹谱识别的癌症诊断提供了体液活检解决方案。图 4组织来源细胞外分泌囊泡的蛋白指纹光谱区分无转移和淋巴结转移的乳腺癌患者国科温州研究院博士后薛孟飞（中国科学院物理研究所毕业）和清华大学博士叶思源（国家纳米科学中心联合培养）为共同一作。陈佳宁研究员和国家纳米科学中心的朱凌研究员、杨延莲研究员为共同通讯作者。相关工作近期以“Single-vesicle Infrared Nanoscopy for Noninvasive Tumor Malignancy Diagnosis”发表在《JACS》杂志上，上述研究工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、中国博士后科学基金和中国科学院青年创新促进会的支持

p 　　Alphabet(谷歌)旗下公司 DeepMind 的人工智能 AlphaGo 曾在国际象棋、围棋等项目中取得了超越人类的表现，其研究不仅震惊世界，也两次登上 Nature。如今，该公司已将人工智能技术应用到最具挑战性的科学研究问题中，其刚刚推出的 AlphaFold 可以仅根据基因“代码”预测生成蛋白质的 3D 形状。 /p p 　　DeepMind 表示，AlphaFold 是“该公司首个证明人工智能研究可以驱动和加速科学新发现的重要里程碑”。看来，人类医学研究要前进一步了。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/fc4cf612-a444-4567-b697-76cdcdfc9dea.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 2017 年 5 月，谷歌 DeepMind 人工智能项目 AlphaGo(执棋者：黄士杰博士)对战当时世界第一的围棋选手柯洁。 /span /p p style=" text-indent: 2em " 周日，在墨西哥坎昆举办的一场国际会议中，DeepMind 的最新 AI——AlphaFold 在一项极其困难的任务中击败了所有对手，成功地根据基因序列预测出蛋白质的 3D 形状。 /p p 　　“蛋白质折叠”是一种令人难以置信的分子折叠形式，科学界以外很少有人讨论，但却是一个非常重要的问题。生物由蛋白质构成，生物体功能由蛋白质形状决定。理解蛋白质的折叠方式可以帮助研究人员走进科学和医学研究的新纪元。 /p p 　　“对于我们来说，这真的是一个关键时刻，”DeepMind 联合创始人兼 CEO Demis Hassabis表示，“这个项目就像灯塔，这是我们关于人和资源的首次重大投资，用于解决一个根本性的、现实世界的重要问题。” /p p 　　在 2016 年 AlphaGo 击败李世乭后，DeepMind 就开始将目光转向蛋白质折叠。尽管实践证明，游戏是 DeepMind AI 项目的优秀试验场，但在游戏中取得高分并非他们的终极目标。“我们的目标从来就不是赢得围棋或雅达利比赛的胜利，而是开发能够解决蛋白质折叠这类问题的算法，”Hassabis 表示。 /p p 　　 strong 为什么要预测蛋白质结构 /strong /p p 　　人体能够产生数万甚至数百万的蛋白质。每个蛋白质都是一个氨基酸链，而后者的类型就有 20 种。蛋白质可以在氨基酸之间扭曲、折叠，因此一种含有数百个氨基酸的蛋白质有可能呈现出数量惊人(10 的 300 次方)的结构类型。 /p p 　　蛋白质的 3D 形状取决于其中包含的氨基酸数量和类型，而这一形状也决定了其在人体中的功能。例如，心脏细胞蛋白质的折叠方式可以使血流中的任何肾上腺素都粘在它们上面，以加速心率。免疫系统中的抗体是折叠成特定形状的蛋白质，以锁定入侵者。几乎身体的每一种功能——从收缩肌肉和感受光线到将食物转化为能量——都和蛋白质的形状及运动相关。 /p p 　　通常情况下，蛋白质会呈现出能量效率最高的任何形状，但它们可能会纠缠在一起或者折叠错误，导致糖尿病、帕金森和阿茨海默症等疾病。如果科学家可以根据蛋白质的化学构成来预测其形状，他们就能知道它是做什么的，会如何出错并造成伤害，并设计新的蛋白质来对抗疾病或履行其它职责，比如分解环境中的塑料污染。 /p p 　　 strong AI 如何改变研究方法? /strong /p p 　　正因为蛋白质的结构如此重要，在过去的五十年中，科学家已经能使用低温电子显微镜和核磁共振等实验技术确定蛋白质的形状，但是每一种方法都依赖大量的试验与误差反馈，每种结构可能需要花费数万美元、历时数年进行研究。因此生物学家转攻 AI 方法，以完成这一困难且单调的过程。 /p p 　　幸运的是，由于基因测序成本快速降低，基因组领域的数据非常丰富。因此在过去几年中，依赖于基因组数据的预测问题正越来越多地借助深度学习方法。DeepMind 非常关注这一问题，并提出了 AlphaFold，这一项工作目前已经提交到了Critical Assessment of Structure Prediction (CASP)。 /p p 　　DeepMind 用 AlphaFold 参加了 CASP，这是一年两次的蛋白质折叠奥运会，吸引了来自世界各地的研究小组。比赛的目的是根据氨基酸列表来预测蛋白质的结构，这些氨基酸列表会在几个月内每隔几天发送给参赛团队。这些蛋白质的结构最近已经通过费力又费钱的传统方法破解，但还没有公开。提交最准确预测的团队将获胜。 /p p 　　尽管是首次参加比赛，AlphaFold 就在 98 名参赛者中名列榜首，准确地从 43 种蛋白质中预测出了 25 种蛋白质的结构。而同组比赛中获得第二名的参赛者仅准确预测出了 3 种。值得一提的是，AlphaFold 关注从头开始建模目标形状，且并不使用先前已经解析的蛋白质作为模板。AlphaFold 在预测蛋白质结构的物理性质上达到了高度的准确性，然后基于这些预测可以使用两种不同的方法预测构建完整的蛋白质结构。 /p p 　　 strong 使用神经网络预测物理属性 /strong /p p 　　AlphaFold 构建的模型都依赖深度神经网络，这些经过训练的神经网络可以从基因序列中预测蛋白质的属性。DeepMind 的研究人员表示，神经网络预测的蛋白质属性主要有：(a)氨基酸对之间的距离 (b)连接这些氨基酸的化学键及它们之间的角度。这些方法的首要进步就是对常用技术的提升，它们可以估计氨基酸对是否彼此接近。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/noimg/d256b4f4-6189-437b-8ead-d45a99ae81de.gif" title=" 2.gif" alt=" 2.gif" width=" 375" height=" 375" style=" width: 375px height: 375px " / /p p style=" text-indent: 2em " 为了构建 AlphaFold，DeepMind 在数千已知的蛋白质上训练了一个神经网络，直到它可以仅凭氨基酸预测蛋白质的 3D 结构。给定一种新的蛋白质，AlphaFold 利用神经网络来预测氨基酸对之间的距离，以及连接它们的化学键之间的角度。接着，AlphaFold 调整初步结构以找到能效最高的排列。该项目花了两周时间来预测其第一个蛋白质结构，但现在几小时内就可以完成了。 /p p 　　根据神经网络预测的两种物理属性，DeepMind 还训练了一个神经网络以预测蛋白质成对残基(residues)之间距离的独立分布，这些概率能组合成估计蛋白质结构准确率的评分。此外，DeepMind 还训练了另一个独立的神经网络，该网络使用集群中的所有距离来估计预测的结构与实际结构之间的差距。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/b1b25d1b-42ba-454c-ae29-93402575df61.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/noimg/3bbdee91-2067-417d-8e22-92b8a5543cc6.gif" title=" 4.gif" alt=" 4.gif" style=" text-align: center width: 533px height: 178px " width=" 533" height=" 178" / /p p 　　 strong 预测蛋白质结构的新方法 /strong /p p 　　这些评分函数可以用来探索蛋白质内部，以找到与预测匹配的结构。DeepMind 的第一种方法建立在结构生物学的常用技术上，用新的蛋白质片段反复替换蛋白质整体结构的某个部分。他们训练了一个生成神经网络来创造新的片段，这些片段被用来不断提高蛋白质结构的评分。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/e657a13d-1262-4040-8074-dda8e8ac5791.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" width=" 492" height=" 315" style=" width: 492px height: 315px " / /p p 　　先通过神经网络预测氨基酸之间的距离和化学键角度，然后再根据两种物理属性对结构进行评分，最后通过梯度下降优化评分。 /p p 　　第二种方法是通过梯度下降来优化评分，得到的结构高度精确。梯度优化被用在整个蛋白质链，而不是组装前必须单独折叠的片段，这种做法降低了预测过程的复杂性。 /p p 　　 strong 未来可期 /strong /p p 　　首次涉足蛋白质折叠领域的成功表明，机器学习系统可以整合各种信息来源，帮助科学家快速找到各种复杂问题的创造性解决方案。人工智能已经通过 AlphaGo 和 AlphaZero 等系统掌握了复杂的游戏，与此类似，利用人工智能攻克基本科学问题的未来同样可期。 /p p 　　雷丁大学的研究人员 Liam McGuffin 在比赛中带领得分最高的英国学术团体。他表示，“DeepMind 今年似乎取得了更大的进展，我想进一步了解他们的方法。我们的资源并不充足，但我们仍然有很强的竞争力。” /p p 　　“预测蛋白质折叠形状非常重要，对解决很多世纪难题有重大影响。这种能力可以影响健康、生态、环境，基本上可以解决任何涉及生命系统的问题。” /p p 　　“包括我们在内的很多团队几年来一直都在使用基于机器学习的方法，而深度学习和人工智能的进步似乎也产生了越来越重要的影响。我对这个领域很乐观，我觉得我们会在 21 世纪 20 年代真正解决这个问题。”McGuffin 表示。 /p p 　　Hassabis 也表示还有很多工作要做。“我们还没有解决蛋白质折叠问题，目前只是迈出了第一步。这是一个极具有挑战性的问题，但我们有一个良好的体系，还有很多想法尚未付诸实践。” /p p 　　蛋白质折叠的早期进展令人兴奋，它证明了人工智能对科学发现的效用。尽管在能够对疾病治疗、环境管理等方面产生量化影响之前，我们还有很多工作要做，但我们知道人工智能的潜力是巨大的。在一个专注于研究机器学习如何推进科学发展的专业团队的努力下，我们期待看到技术能够有所作为。 /p

p 　　近日，英国皇家学会院士、美国科学院外籍院士、英国皇家化学会候任主席、牛津大学Doctor Lee冠名教授Carol Robinson教授在上海交通大学做客第95期大师讲坛，为交大师生带来题为“Mass spectrometry-from folding proteins to rotating motors”的精彩报告。 /p p style=" text-align: center " img width=" 350" height=" 473" title=" 001.jpg" style=" width: 350px height: 473px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/9c5b334e-bdec-4b44-ae4d-2e6ca2dbdf7e.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　质谱分析是目前蛋白质研究的最重要工具之一。Carol Robinson教授介绍了质谱的原理和自己探寻质谱研究的历程，阐述了她领导的团队在 strong 质谱技术优化和应用质谱分析百万道尔顿级膜蛋白研究方面的进展 /strong 。关于质谱在生物领域的应用，她介绍了2002年诺贝尔化学奖获得者J. B. Fenn和K. Tanaka做出的贡献。在蛋白质的结构研究方面，她强调了对受体膜蛋白性质的研究在药物设计和研发领域的重要地位。 /p p 　　 strong Carol Robinson教授介绍，她的研究团队将膜蛋白溶入洗涤剂溶液，并通过毫微电喷雾电离汽化质谱技术对膜蛋白与脂类小分子之间的相互作用及计量性质和其自身在小分子稳定作用下的折叠过程进行了探索和研究。 /strong 在结合诸如离子淌度法、核磁共振法等其它技术后，进一步提取出更多关于折叠膜蛋白的拓扑结构信息和性质。Carol Robinson教授团队从1993年开始应用质谱分析证实了蛋白质折叠与伴侣分子稳定效果的关系，并于2008年使用质谱分析研究疏水膜蛋白并取得突破。最近，她的团队对螺旋低聚膜蛋白在界面脂分子作用下的稳定效果进行量化，取得的成果发表在Nature及Science系列期刊上。她展示了原始的质谱分析例图，讲解了如何使用图谱判断样品蛋白是否折叠，并讲解了在旋转马达ATP合成膜蛋白内部的亚单位相互作用及折叠机制。 /p p 　　Carol Robinson教授总结，质谱分析对膜蛋白方面的研究意义重大，具有独特性和创新性。她指出，自己在最初决定进行这方面研究时遇到了很大困难和阻力，并因此鼓励年轻人不必拘泥形式，要敢于设计实验。 /p p 　　在提问环节中，Carol Robinson教授回答了研究中遇到的困难、质谱与冷冻电镜等分析方法在生物结构研究方面的应用和蛋白质在真空中折叠的机理与现实环境中的区别等问题。Carol Robinson教授还和同学们探讨了如何平衡家庭和学术事业等话题。 /p p 　　大师讲坛学生组委会向 Carol Robinson教授赠送了精心制作的泥塑人像作为纪念品，以表达交大学子对她到访由的衷感谢和诚挚祝福。 /p p 　　【嘉宾介绍】 /p p 　　Carol Robinson，英国皇家学会院士、美国科学院外籍院士、英国皇家化学会候任主席。现担任牛津大学化学系Doctor Lee冠名教授，牛津大学埃克塞特学院教授会员。她1982于剑桥大学获得博士学位，先后在基尔大学、牛津大学、剑桥大学工作。她2001年晋升为剑桥大学历史上第一位女教授，2011年被英国皇家学会授予跨领域奖，2013年在新年授勋中被授予大英帝国爵级司令勋章，2015年获得世界杰出女科学家成就奖。 /p p 　　【背景介绍】 /p p 　　质谱是一种通过ESI和MALDI等方法电离分子并根据其质荷比进行记录的分析方法，在化学及结构生物领域有着广泛的应用。使用质谱法分析膜蛋白质要求电离蛋白质分子，同时不破坏其分子结构。 /p p 　　Carol Robinson教授长期从事质谱相关领域的研究。她在对生物高分子配合物进行汽化以用于质谱法分析领域进行了大量突破性研究，并在使用质谱研究例如膜蛋白等大配合物结构方面做出了杰出贡献。Carol Robinson教授以第一作者或通讯作者在Nature和Science等杂志上发表了一系列文章，是质谱在化学、生物等领域研究方面的权威学者。 /p p & nbsp /p

01 活动背景 层浪一直致力于高端流式细胞仪的研究和发展，我们坚信国产高端流式细胞仪是行业未来的趋势和方向。作为一家国内领先的流式细胞仪研发企业，我们一直在积极探索和引领国产流式细胞仪的新高度。我们非常注重与专家学者的合作，以便更好地推动行业的发展。 为此，我们诚挚地邀请您参与我们的征文活动。本次活动旨在征集光谱/质谱/纳米流式领域的相关文章，其中光谱流式是我们首期重点关注的方向。我们希望通过您的专业知识和经验，为行业发展贡献自己的力量。 我们相信，您的研究成果和经验心得将会为其他专家和学者提供宝贵的参考和启示。同时，您的文章也将有助于推动流式细胞仪技术的发展和应用，为人类健康事业做出更大的贡献。 如果您有相关的研究成果或者经验心得，欢迎积极参与我们的活动，与我们分享。我们将根据文章质量和相关度进行评选，并对获选作者进行奖励和表彰。 02 活动介绍光谱流式的优点在于其高灵敏度和多参数分析能力，能够实现更精细的细胞分析和检测。然而，目前国产光谱流式仍面临一些挑战，如设备稳定性、分辨率和自动化程度等。我们希望通过您的文章，展现光谱流式的发展潜力，为国产光谱流式的进步贡献力量。 03 活动奖品一等奖 华为折叠屏手机 Pocket S（1名）价值5988 二等奖 华为墨水平板MatePad paper Pad（2名）价值2999元 三等奖 华为蓝牙耳机FreeBuds Pro 2（3名）价值1299元 参与奖 华为手环8 NFC版（前15名）价值309元 04 参与方式 活动详情请在微信公众号搜索“层浪生物”，关注公众号并参与高手约稿活动。 05 活动时间征集日期：公元 2023年9月26日-10月31日开奖日期：公元 2023年11月11日公布发放形式：开奖后层浪联系获奖者邮寄奖品 注：最终解释权归层浪所有 关于层浪生物 层浪聚焦流式细胞领域，致力于实现流式技术系统化、自动化、智能化，在临床领域推动流式技术的常规化，在科研领域推进国产流式高端化。目前已推出多款流式产品：2激光8色流式细胞仪于2021年初成功获得NMPA注册证；科研型产品3激光14色流式细胞仪FongCyte&trade 上市一年，仪器性能获得客户的高度认可；临床型产品3激光14色流式细胞仪LongCyte&trade 26种型号均获CE认证。公司核心团队均在流式技术领域有10余年经验，十年如一日专注流式技术研究，致力于研发生产稳定、可靠、性能优异的产品。层浪未来将陆续推出更多流式产品，为中国的流式技术发展尽绵薄之力，做行业中流式技术普及者，做客户信赖的流式伙伴，为中国的临床和科研事业助飞。

前 言*图片来源于湖北药检所官网人纤维蛋白原(human fibrinogen, Fg)是一种由肝脏合成的球蛋白，发挥止血和凝血功能。Fg可用于治疗先天性和获得性Fg缺乏症患者的凝血功能障碍。目前Fg制剂是由健康人血浆经分离、提纯并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。Fg这类蛋白质药物具有大分子、多电荷、结构复杂等特点，其稳定性往往较差。而稳定性是保证药物发挥其作用的基础。2023年3月，湖北省药品监督检验研究院王文晞博士近期发表“多功能蛋白质稳定性分析仪在人纤维蛋白原制品质量控制中的应用”，借助NanoTemper公司的PR Panta对不同企业生产的Fg产品的质量进行快速分析质控。/ 实验步骤/NanoTemper多功能蛋白质稳定性分析仪PR Panta可用于快速测定蛋白质的热稳定性，通过热变性、粒径分布聚集倾向和粒径大小等参数对产品进行评估。使用毛细管吸取10uL 20mg/ml样品置于PR Panta上，首先在DLS模块上检测Fg的水力学半径（Rh），然后进行1℃/min的升温（25℃-95 ℃）。使用1份样品，同时且实时的检测获得Fg的样品热变性中点温度（Ｔｍ）、蛋白质初始去折叠温度(Tonset)、粒径开始变化温度(Tsize)和流体力学半径(Rh)等多种参数。/ 研究结果/nanoDSF检测模块结果显示21批次样品Tｍ 值为51.20~53.31 ℃(表1)。不同企业产品Tｍ值存在一定差异，最高相差 2.1 ℃， 表明各企业间产品稳定性存在较大差异。其中企业Ｆ产品Tｍ值最高（53.28℃），企业Ａ产品Tｍ值最低（51.22℃），差别2.06℃。表１ 不同企业Fg蛋白热变性中点温度Ｔｍ值测定结果21批次样品的Tonset值为47.29~49.32 ℃（表2），不同企业产品Tonset值存在一定差异。其中企业Ｆ的产品Tonset值最高，企业A Tonset值最低，总体与Ｔｍ值趋势一致。表２ 不同企业Fg蛋白质初始去折叠温度Tonset值测定结果21批次样品Tsize值45.36~46.99 ℃，不同企业产品Tsize值差异较小。表３ 不同企业Fg蛋白粒径开始变化温度Tsize值结果 21批次样品Rh值 19.03~30.75 nｍ，不同企业产品Rh值存在一定差异。表４ 不同企业Fg蛋白流体力学半径 Rh 值结果综上可知企业Ｆ产品热稳定性最好，企业Ａ产品热稳定最差。除稳定性外，纯度是反映Fg产品中可凝固蛋白与总蛋白的比值是产品有效性的重要指标。作者通过凯氏定氮仪进行样品检测后并依据下方公式计算纯度。结果显示21批次样品纯度80.3%~95.9%（表5），其中企业Ｆ产品纯度最高，平均94.6%。企业Ａ产品纯度最低平均83.2%。表5 Fg纯度测定结果作者将纯度与在PR Panta检测得到的Tｍ值进行相关性分析，结果显示相关系数为0.729,Ｐ＜0.05 。即产品纯度与Tｍ值呈显著相关, 热稳定性高的产品纯度较高。为了明确Fg的组分分布，作者采用HPSEC-MALLS测定纯度最高与最低产品的组分分布。企业Ｆ产品（稳定性&纯度最佳）由Fg单体和多聚物２个组分组成，企业Ａ产品（稳定性&纯度最佳最差）由 Fg单体、多聚物和蛋白质降解产物３个组分组成。结合以上部分稳定性与纯度呈相关性的结果可以进一步分析得出，Fg热稳定性较差，在生产、存放、复溶后放置的过程中会形成可溶性寡聚体，导致产品纯度降低。因此可根据产品热稳定性测定结果初步分析不同企业产品纯度高低，进而能简单、快速 地对不同企业间产品质量进行初步评估，为企业工艺优化和制剂筛选提供更加快速、准确的依据。多功能蛋白质稳定性分析仪可以测定产品纯度与稳定性，为人纤维蛋白原产品保护剂的筛选和生产工艺优化提供相应数据参考，且能对不同企业产品的质量进行初步分析，仪器操作简便、检测时间短、检测效率高。——摘自本文文献对PR Panta的评价

蚕和蜘蛛生产的丝蛋白纤维以其无与伦比的机械强度和其源于天然结构中丰富的β折叠晶体所产生的可扩展性而为著名。受到传统的成像技术低化学敏感和低空间分辨的限制，在纳米尺度对丝蛋白纤维中的β折叠构象转变的研究具有大的挑战。近期，中科院微系统所陶虎教授带领的研究团队利用neaspec公司的近场光学显微镜（neaSNOM）高化学敏感和10 nm空间分辨的优势，在纳米尺度近分子水平研究了电调控下丝蛋白中的多形态转变。该工作发表在高水平的Nature Communication杂志上。该研究小组通过neaspec公司的散射型近场光学显微镜（s-SNOM）配合1495cm-1和1790cm-1可调谐中红外QCL激光器（图1d），采用的伪外差近场成像技术，对硅基底上尺寸约为10–350 nm的含高密度β折叠丝蛋白聚集体（图1e形貌），进行了纳米尺度的红外成像研究。从近场相成像图（图1f）中可以看出，在1631cm-1激光下，富含β折叠结构的丝蛋白与硅基底具有很强的对比。该对比主要源于β折叠结构中的二结构amide I在1631cm-1激光下的强烈吸收。然而，在1710cm-1激光下，近场相图（图1g）对比消失，显示该波长下丝蛋白结构小的红外吸收。同时通过不同波长下，对富含β折叠结构的透明丝蛋白的近场相信号变化研究，绘制出了波长与近场相信号变化的曲线（图1h），从曲线中可以明显看出1631cm-1激光下的丝蛋白的强烈吸收信号，与早期其他研究结果一致。图1 电调控下丝蛋白中纳米尺度下的多形态转变该研究在纳米尺度实现了蛋白质结构转换的探测，结合纳米精度的电子束光刻技术能为我们在二维及三维尺度实现丝蛋白的结构控制提供有力的方法；同时该工作为开启纳米尺度的蛋白质结构研究和探究蛋白质电诱导构象变化的临界条件铺平了道路；为未来设计基于蛋白质的纳米结构提了供新的规则。在取得前期研究成果的基础上，该研究团队再次利用neaspec公司的近场光学显微镜（neaSNOM）研究了不同类型的丝蛋白不同曝光时间的红外吸收响应，并成功实现了基于蛋白生物材料的光刻蚀平板印刷技术。该研究成果以全文的形式发表在Advanced Science杂志上。研究人员利用s-SNOM的直接成像和化学识别功能，突破了传统FTIR空间分辨率的限制，在纳米尺度下探索了UV曝光下薄层蛋白局域化学结构的变化。在1635cm-1波长下，获得了不同曝光时间样品UV–Silk30, UV–Silk90，UV–SilkHTP和UV–LC的相应近场相成像（图2d）。结果显示相对比度（丝蛋白和硅）随着曝光时间增加而减弱表明交联度的不断增加。另外，不同蛋白微米图案中吸收信号和曝光时间的关系曲线（图1e）显示，不同蛋白与曝光时间表现出随交联度变化的不同行为。例如：UV–Silk30的吸收强度线性随曝光时间增加而减小，表明交联度随曝光时间而持续增加。图2 UV-silk和UV-LC的FTIR和s-SNOM表征 截止今年11月17日，以neaspec稳定的产品性能和服务为支撑，通过neaspec国内用户的不断努力，近两年的时间已发表了关于近场光学成像和光谱的文章近30篇，其中超过半数发表在Nature Communication 、Advance Materials、ACS Nano、ACS Photonics和 ACS Sensor 及Nature子刊Light：Science & Application 等高水平期刊。伴随更多的研究者信赖和选择neaspec近场和光谱相关产品， neaspec国内用户的持续增加，坚信neaspec国内用户将在2018年取得更加丰厚的研究成果。人物介绍陶虎研究员于2016年荣获由《科学中国人》颁发的“科学中国人年度人物”奖项， 同时已在国际知名期刊和会议发表学术论文50余篇，近5年ISI总引用达1000多次，多项创新前沿成果受到了国际同行广泛关注和评价。他曾多次受邀在哈佛大学、杜克大学、麻省理工林肯实验室、美国洛斯阿拉莫斯实验室等国际知名学府和研究机构作特邀学术报告，其研究成果被Science、Nature、Nature Materials等国际期刊多次专题报道。 参考文献 1. Nanoscale probing of electron regulated structural transitions in silk proteins by near field IR imaging and nano-spectroscopy， Nature Comm. 7:130792. Precise Protein Photolithography (P3): High Performance Biopatterning Using Silk Fibroin Light Chain as the Resist, Adv. Sci. 2017, 1700191. 相关产品及链接 1、超高分辨散射式近场光学显微镜：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100980/C170040.htm2、纳米傅里叶红外光谱仪：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100980/C194218.htm3、太赫兹近场光学显微镜：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100980/C270098.htm

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

“Touch Taiwan 2016：贺利氏推出用于导电高分子薄膜上的乾膜光阻黄光图案化制程技术，并展示用于柔性触摸显示屏的快速红外固化解决方案” 在今年8月24-26日举办的Touch Taiwan 展览会上，贺利氏将推出通过DFR（Dry-Film Resist 干膜光阻）黄光蚀刻技术在Clevios导电高分子薄膜图案化的新触控面板制程。该工艺是与台湾工业技术研究院（ITRI）联合开发研制。展示全功能7英寸GFF型用DFR干膜光阻黄光蚀刻技术制程的触控面板。 “触控传感器的高解析度图案是高阶触控面板，特别是可弯曲及可折叠的触控显示器的先决条件。高解析度图案制程在Clevios薄膜上是一个很重要里程碑。我们的客户正在快速实施。他们的反馈极佳。”史伯德——电子化学品业务部总经理表示。 基于此项贺利氏的新创技术，可以轻松实现行50um的线宽解析度，甚至更细的解析度也可以达成。 现在整个Clevios触控面板制程的参数设置和工艺窗口均可提供客户在其生产中实施。Clevios薄膜和传感器可以轻松耐受超过30万次曲率半径低于1mm的折弯，而不产生损伤。 最佳创新：快速红外（IR）固化为优质基材做出贡献 贺利氏展台的第二项创新是基于超薄柔性聚酰亚胺基材的7英寸Clevios导电聚合物柔性触摸面板。聚酰亚胺固化是贺利氏特种光源的业务领域，其定制的快速红外固化技术实现超薄聚酰亚胺基材薄膜的最快速和高效的固化，而该材料是下一代柔性显示屏和触摸面板基材的关键材料。红外辐射器以极高的效率进行非接触式传热。与传统的热风炉相比，几分钟即可完成固化工艺，而不是以前的几小时。此外，由于没有空气流动，将污染减少至最低限度。与材料的吸收波长精确匹配的红外辐射器可以更快地进行加热。碳中波辐射器满足聚酰亚胺的吸收光谱要求，可以实现快速的红外固化和烘干。

#本文由马尔文帕纳科医药业务发展经理 韩佩韦博士供稿# 蛋白质的热稳定性研究对于加深对蛋白质的结构和功能的了解有着非常重要的意义。差示扫描量热技术（DSC）是直接测量热转变过程焓变（ΔH）唯一的分析方法，例如蛋白质，核酸或其他生物多聚物的热变性过程，为表征蛋白质及其他生物分子的热稳定性建立“金标准”技术。 一、焓变对于蛋白质的稳定性意味着什么？ 1，什么是焓（hán）变（ΔH）？ ΔH（焓变）是在恒压状态下将系统升高至温度T过程中摄取的总能量。对于蛋白质而言，这意味着用于使蛋白质发生去折叠所花费的能量（热量），此过程中 ΔH 是为正值，代表这是一个吸热过程。这种能量与蛋白质中所有原子和分子运动相关，以及维系蛋白质保持折叠构象中的键能。 通过将吸热谱图下方的面积进行积分（见图 1）可以计算得到焓变（ΔH）。焓变用每摩尔蛋白质的吸收的卡路里（或焦耳）来表示。由于蛋白质在 DSC 实验中暴露于升高的温度，因此蛋白质开始发生热变性，并伴随着非共价键的断裂。焓变（ΔH）与维系蛋白质天然（折叠）构象中所需的价键数量有关。焓变（ΔH）也取决于我们测量总蛋白质浓度的准确程度。如果蛋白质浓度不是很准确, 则会影响到计算出的ΔH值。 2，焓变（ΔH）值可以在实践中告诉我们什么？ 当您比较不同蛋白质的DSC结果时，具有较大ΔH值的蛋白质不一定比具有较小ΔH的蛋白质更稳定。由于ΔH值会对蛋白质摩尔浓度归一化，因此该值通常与蛋白质的尺寸成比例。大多数蛋白质具有相同的键密度（单位体积内的价键数量），因此，期待具有较大分子量的蛋白质也具有较大的焓变（ΔH）值也是合理的。 3，焓变（ΔH）的决定因素是什么？ 焓变（ΔH）取决于溶液中天然蛋白质的百分比。 一个非常重要的考虑是DSC仅测量初始处于折叠（天然）构象中的蛋白质的ΔH值。ΔH值取决于具有折叠（活性）构象的浓度。如果初始折叠蛋白质组分小于总蛋白质浓度（即活性浓度小于100％），则计算出的ΔH值将相应地变小。 下图显示了在储存期间的不同时间测量的相同蛋白质的DSC图谱。蓝色曲线图谱表示新鲜制备的蛋白质，是100％天然（折叠）蛋白质。当蛋白质样品在储存期间发生部分变性时，溶液中的天然蛋白质的比例开始下降，导致DSC图谱的焓变降低。当我们拥有100％天然蛋白质的参考DSC图谱时，我们可以根据不同状态样品的相对ΔH值来估计每个样品中的折叠蛋白质比例。 4，如何判断蛋白质是否失活？ 到目前为止，我们已提及的焓变是指通过DSC仪器直接测量到的“热”焓，也就是热力学焓变，通常表示为ΔHcal，这是其他任何非量热技术，例如圆二色谱（CD），表面等离子共振（SPR）等技术不能获取的焓变量。 还有另一种其他技术可以获取的焓变类型，即范霍夫焓变 - ΔHVH，我们同样可以通过DSC数据计算得出。范霍夫焓变（ΔHVH）可从通过DSC非两状态模型（non-2-state model）拟合得到。 两种不同的焓变对蛋白质热稳定性的测定又有什么实际意义呢？ 在DSC技术中，ΔHcal仅由DSC热转变峰曲线积分的面积来确定，而ΔHVH仅通过热转变峰曲线的形状来确定。转变峰形越尖锐，ΔHVH越大，反之亦然。ΔHcal是具有浓度依赖性的，但ΔHVH不是。 若ΔHcal/ΔHVH比例为1，通常意味着所研究的热转变状态符合两状态去折叠（Two-state unfolding model）模型。如果ΔHcal/ΔHVH比例大于1，则意味着存在显著密集的中间体存在 而ΔHcal/ΔHVH比小于1，则意味着存在分子间相互作用。 使用ΔHcal/ΔHVH可以帮我们估测是否有很大部分蛋白质是失活的。如果我们有一个简单的单结构域蛋白质，并且假定没有中间体，则我们可以预测，其去折叠过程的ΔHcal/ΔHVH的比值不会远离1。因此，如果ΔHcal显著低于ΔHVH，可以表明很大部分蛋白质已经失活。 综上所述，对DSC中ΔH数据的分析可以让我们了解蛋白质的去折叠机制，以及多少蛋白质处于其活性的天然构象。 二、TM值如何与和蛋白质稳定性相关？ 中点转变温度TM我们可以从DSC数据中提取多个热力学参数，例如ΔH，ΔHVH（范霍夫焓变），ΔCP和ΔG，但最广泛使用的参数是TM。顺便提一下，这也是最容易和最准确的值 - TM是最大峰值所对应的温度。 “蛋白质稳定性”有多种定义。最常见的是，对于工业上有重要意义的蛋白质，该术语是指在生理温度下的功能（或操作）稳定性 即，他们可以在37°C下发挥多长时间的生物功能？这可以通过需要花几天或数周时间的等温研究来评估，或者，如果使用差示扫描量热法（DSC），则可以在几分钟内变性蛋白质。 通过DSC获得的哪个热力学参数与功能稳定性相关度最佳？事实证明，是TM值。 热力学稳定性（ΔG）是功能稳定性的较差的预测因子 技术上，ΔG仅适用于可逆去折叠过程，此外，它由TM，ΔH和ΔCP计算得到，后者可能很难获取。 一个例子是TM和ΔG与人肉杆菌蛋白抗原血清型C的半数聚集时间(half time)（作为功能稳定性的量度）的相关性，用作模型蛋白。ΔG与T1 / 2 agg. 相关系数（R）仅为0.4，而TM 与 T1 / 2 agg.的相关系数是0.92。（来自J Pharm Sci的数据，2011 Mar 100（3）：836-48） 思考TM的一种方式： 如下图所示，假设我们用 DSC 扫描两种不同配方中的蛋白质或两种不同的蛋白质构建体，则 TM 值向低温方向 5℃ 的负偏移（稳定性下降）实际上反映了在 37℃ 条件下的 Fu （蛋白去折叠比例）由2％增加到 3％。温度 T 下的 Fu 蛋白可以通过图像化的方式估算，即温度 T 以下的曲线下阴影区域面积和整个曲线下方面积的百分比。 由于聚集体的生成可能是浓度依赖的过程，因此较高浓度的去折叠蛋白质（红色扫描曲线）将导致较快的聚合（更大组分的去折叠状态（U）才能转换为不可逆变性状态（I）。参见下面的原理图。 这种解析的一个推论是，曲线的整体形状应该是相似的。我们假定这种情况是对于在不同配方中的相同蛋白质或由一个母分子衍生出来的具有相似构建体的蛋白质。但是，对于完全不同的蛋白质，使用TM值作为用于稳定性比较的预测指标则应该谨慎使用。 扩展阅读（www.malvernpanalytical.com）Differential Scanning Calorimetry (DSC): Theory andpracticeDifferential Scanning Calorimetry (DSC) forBiopharmaceutical Development: Versatility and PowerThe Power of Heat: Digging Deeper with DifferentialScanning Calorimetry to Study Key Protein Characteristics PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪：DSC差式扫描量热法（DSC）是一种直接分析天然蛋白质或其他生物分子热稳定性的技术，无需外在荧光素或者内源荧光，它通过测定在恒定的升温速率下使生物分子发生热变性过程中的热容变化来实现。 马尔文帕纳科 MICROCLA PEAQ-DSC 微量热差示扫描量热仪能够帮助用户快速确认维持高级结构稳定性的最佳条件，提供简介、无缝的工作流程和自动化批量数据分析，其所提供的热稳定性信息被业内视为“金标准”技术，是一种非标记、全局性的数据。 关于马尔文帕纳科马尔文帕纳科的使命是通过对材料进行化学、物性和结构分析，打造出更胜一筹的客户导向型创新解决方案和服务，从而提高效率和产生可观的经济效益。通过利用包括人工智能和预测分析在内的最近技术发展，我们能够逐步实现这一目标。这将让各个行业和组织的科学家和工程师可解决一系列难题，如最大程度地提高生产率、开发更高质量的产品，并缩短产品上市时间。

概念蛋白质芯片技术是在ＤＮＡ芯片技术基础上发展的一项蛋白质组学技术。其原理是将大量不同的蛋白质分子（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）通过微阵列的形式有序排列在固相载体表面，利用蛋白质与蛋白质或者蛋白质与其他分子之间的特异性结合，获得与之特异性结合的待测蛋白（如血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等）的相关信息，便于我们分析未知蛋白的组分、序列，体内表达水平、生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等。蛋白质芯片技术的出现，为我们提供了一种比传统的凝胶电泳、Western blot和Elisa更为方便和快速研究蛋白质的方法。该方法具有高通量，微型化和快速平行分析等优点，不仅对基础分子生物学的研究产生重要影响，也在临床诊断、疗效分析、药物筛选及新药研发等领域有着广泛应用。特点①蛋白芯片具有高特异性、重复性、准确性。这是由抗原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的。②蛋白芯片具有高通量和操作自动化的特点，在一次实验中可对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高。③可发现低丰度、小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质，特别是膜蛋白质。④蛋白芯片具有高灵敏性，只需0.5-5μL样品，或2000个细胞即可检测。蛋白芯片技术在分子生物学及生物化学基础研究中的应用01 在蛋白质水平上检测基因的表达由于基因转录产物mRNA数量并不能准确反映基因的翻译产物蛋白质的质与量，因此在蛋白质水平上检测基因的表达对于了解基因的功能非常重要。蛋白质芯片技术产生前，蛋白质双向电泳技术是蛋白质组规模上进行蛋白质表达研究的唯一方法，但这种技术操作繁琐而且难以快速检测样品中成百上千种蛋白质的表达变化。蛋白质芯片的特异性、灵敏性和高通量等特点，在检测基因表达终产物蛋白质谱的构成及变化中发挥着不可替代的作用。02 高通量筛选抗原/抗体相互作用目前蛋白质芯片检测利用最广泛的生物分子相互作用是抗原抗体的特异性识别和结合，单克隆抗体是蛋白质芯片检测中使用最广泛的生物分子。运用蛋白质芯片可以研究不同抗原/抗体的特异性作用，而且对于检测样品中极微量的抗原/抗体分子作用非常有利。03 蛋白质/蛋白质相互作用分析酵母双杂交系统是近年来基因组规模上研究蛋白质相互作用的主要方法，但存在体内操作、假阳性、假阴性和外源蛋白质折叠、修饰等局限。蛋白质芯片技术不依靠任何生物有机体而在体外直接检测目标蛋白质，实验条件可随意控制，同时实验步骤自动化程度高，一次分析的蛋白质数量巨大，因而成为目前除酵母双杂交系统外进行大规模研究蛋白质相互作用的主要方法。04 酶/底物作用分析耶鲁大学的Snyder小组用蛋白芯片对酵母基因组编码的119种蛋白激酶的底物专一性进行了研究。实验中将蛋白激酶表达为谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白，针对17种不同的底物，平行测定了119种GST2蛋白激酶融合蛋白的底物专一性，发现了许多新的酶活性，大量蛋白激酶可以对酪氨酸进行磷酸化，而这些激酶在催化区域附近有共同的氨基酸残基。也证明了蛋白质芯片可作为高通量筛选酶-底物作用的良好平台。蛋白芯片的检测目前蛋白芯片的检测主要有两种方式。一种是以质谱技术为基础的直接检测法，采用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术，用激光解析电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来。具体过程为：芯片经室温干燥后，加能量吸附因子如芥子酸，使其与蛋白质结合成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解析和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解析成荷电粒子，根据不同质荷比离子在仪器场中的飞行时间长短不一，通过飞行时间质谱来精确地测定出蛋白质的质量，并由此绘制出一张质谱来，以分析蛋白质的分子量和相对含量。另一种为蛋白质标记法，样品中的蛋白质预先用荧光染料或同位素等标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号，用CCD照相技术及荧光扫描系统等对激发的荧光信号进行检测。与飞行时间质谱相比，该方法定量更加准确，操作也更加简便。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴含着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件进行图像分析、结果定量和解释。其中应用最广的是荧光染料标记法，原理较为简单、使用安全、灵敏度高，且有很好的分辨率。可直接用广州博鹭腾 GelView 6000Plus进行拍摄。图1.GelView 6000Plus智能图像工作站GelView 6000Plus 配备600万像素科学级制冷CCD相机，制冷温度为环境温度下 55℃，极低的暗电流，很大程度降低背景干扰。而且独有的红外感应开关，自动控制样品台的开启与关闭，同时也减少了实验时对仪器的污染。

蛋白表征生物大分子药蛋白质是由不同氨基酸连接形成的多聚体，并且通过正确折叠为一个特定构型，发挥蛋白药物的生物学功能。氨基酸序列的特定位置可以与化学基团共价结合，发生蛋白质翻译后修饰，这些翻译后修饰会导致蛋白的结构发生改变，从而影响蛋白药物的生物学活性，所以需要对蛋白的分子量、肽段覆盖率、翻译后修饰等进行检测。精确分子量分析：分子量的检测是鉴定蛋白的第一步，使用高分辨率质谱分析可得到蛋白质的多电荷信号，通过对信号进行去卷积分析，可获得精确分子量数值，并初步判断蛋白的修饰状态。对于抗体药物还可打开轻重链或者去除糖基，分别分析糖基化和去糖基化轻链和重链的分子量。我们推荐THERMO高分辨质谱来进行：Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL 是离子阱和轨道阱高分辨组合质谱仪，通过强大的功能、稳定性以及低运行成本成为蛋白质组学和代谢组学研究的最佳选择，完全超过并替代 Q-TOF系统。通过高分辨、精确质量数测量和多级碎片解析，完成复杂体系成份鉴定和表征。LTQ-Orbitrap XL采用全新HCD八极碰撞反应池，实现信息更丰富的MS/MS应用，包括蛋白质差异定量分析iTRAQ、PTM分析、de novo 序列分析以及代谢组学研究。Thermo Scientific&trade Q Exactive&trade 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物。 本台式 LC-MS/MS 系统将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数（HRAM）Orbitrap 检测相结合，提供出色性能和多功能性。 Q Exactive 质谱仪特别适用于非目标或目标化合物筛查，也能够实现广泛的定性和定量应用，可广泛用于药物发现、蛋白质组学、环境和食品安全、临床研究和法医毒理学。2.肽段覆盖率及肽段分析：肽段覆盖率是指检测到的肽段氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质肽段覆盖率的检测，对于蛋白质类药物的一级氨基酸序列的确证，保证蛋白质类药物的高级结构形成及维持蛋白质类药物性质均具有很重要的意义。3.二硫键分析：二硫键是蛋白质通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起的化学键，对蛋白质分子保持正确的高级结构，维持必要的生物活性至关重要。所以在蛋白质类药物的结构分析中，二硫键一直是分析的重点。4.N-糖糖型分析：N糖（聚糖与天冬酰胺的氮链相连）是生物药物中，尤其是单抗药物中最广为人知的糖基化形式，其中N-聚糖结构会影响药代动力学、药效学和免疫原性，因此需要对糖型进行分析。另外，抗体结构分析还可以用到毛细管电泳系统，我们推荐BECKMAN PA800 PLUScIEF法测定单抗药物等电点 使用CE(毛细管电泳仪)对样品与已知等电点多肽作为参照物进行cIEF等点聚焦，依据样品与参照肽段的相对迁移时间计算样品的等电点。 cIEF 法测定单抗样品电荷异质体纯度 使用CE(毛细管电泳仪)对样品进行cIEF等点聚焦，而后对主峰纯度进行积分，得出样品电荷异质体纯度。 CE-SDS 法测定单克隆抗体纯度 将样品还原后，使用SDS毛细管电泳电泳与紫外检测器分析，检验轻链或重链的纯度及杂质含量。

一张可折叠的纸质锂电池 　　电池是各种便携式电子产品的重要却又恼人的部件。尤其碰到大而且重的电池，让设备的移动性更差，而较小的电池，又会导致设备性能降低或电池寿命变短。不过，现在斯坦福大学开发的新型锂离子电池或将让这一切变得更加便捷：新型的超薄可充电电池已经可以制作在一张纸上，从此变得轻型，灵活，就像普通的A4纸一样方便。 　　来自斯坦福大学的一位材料科学家将薄膜碳纳米管涂在另一张表层含有金属的锂化合物纳米管上。这些很薄的双层薄膜放在普通纸张的两面，纸张既是电池的支撑结构，同时也起到分离电极的作用。锂作为电极，而碳纳米管层则是电流集合管。这样以来，电池仅有300微米厚，而且节能效果比其它电池更好。这也并非一次性的电池，经过300多次循环充电测试，性能仍然令人满意。更让人兴奋的是，这种电池生产难度不高，比其他瘦身电池的方法更加容易投入商用化。 　　虽然目前这种电池还不太成熟，也可能并非所有移动设备的最理想配件，但它们可能在未来大有用处，如智能化包装，电子标签应用以及电子纸产品等领域。

研究蛋白质热稳定性的几种方法蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长得样子其实都是不同的。蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(meltingtemperature，Tm)来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 01 圆二色谱法（CD）圆二色光谱（简称CD），或红外（傅里叶变换红外（FourierTransformInfrared，FTIR）光谱），是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单的方法。圆二色谱法诞生于20世纪60年代，其原理是利用左、右两束偏振光透过具有手性结构的生物大分子等活性介质，获得的圆二色谱来分析其结构特点，是蛋白质、核酸、糖类等生物大分子二级结构分析的常规手段之一。蛋白由α螺旋和β折叠构成，α螺旋和β折叠在红外和紫外光段有特异的光吸收。蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收存在差异，利用远紫外区（190~260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别出蛋白质的三级结构类型，变温过程中测量蛋白等物质的圆二色谱，能反映其随温度升高结构变化的趋势。此外，通过测定蛋白质在不同温度下的平均残基摩尔椭圆度[θ]可以获得蛋白质的Tm值。特点：圆二色光谱（CD）适用于测定稀释溶液的热稳定性，操作相对简单，成本较低。但是相关仪器很昂贵，对缓冲液要求也高，要求溶液不能有任何的紫外吸收，也很难做到高通量检测。 02差示扫描量热法（DSC） 蛋白变性时会有温度变化，检测温度变化就能知道蛋白变性程度。差示扫描量热法的应用始于20世纪60年代，是在程序控温下，通过测量输给待测物和参比物的功率差与温度的关系，以获得吸放热量的技术。差示扫描量热法能定量测量热力学参数，可提供与蛋白质热变性过程中构象变化有关的热效应信息。差示扫描量热法（DSC）是一个很经典的一个技术，基于的蛋白变性过程中对热量的吸收。蛋白是有三维结构的，比如氢键，疏水键，范德华力。一旦通过加热然后把结构破坏掉，需要吸收热量。所以可以测量热量变化，就是加热结构变化过程中的热量吸收。通过对参照物和样品同时进行升温或冷却处理，测定两者为保持相同温度所产生的热量差，从而计算蛋白质的Tm值。特点：差示扫描量热法（DSC）能够提供直接的热量变化数据，定量准确、操作简便。但检测通量低、耗时较长，需要的样品体积和浓度比较大。相关仪器中最核心的部件是样品池，对周围环境要求极高。 03 动态光散射法（DLS）动态光散射是基于光学的方法，检测的是蛋白变性之后会发生聚集，导致颗粒的大小发生改变，对散射信号的影响。蛋白在变性过程中，从一个规则高级折叠结构打开，变成一个线性的松散结构。本来外部是亲水的氨基酸，内部是疏水的氨基酸。一旦打开之后，这些疏水的氨基酸会相互就是结合到一起。就是因为疏水的一个相互作用，然后变成一个球状聚集体。此过程会引起这个光的散射的变化。基于动态光散射的信号随着加热的过程的变化就代表粒径的变化，可以计算出蛋白质的Tm值。动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。特点：动态光散射可以做到孔板式的检测，具有比较高的通量。但是对于某些样品的检测有限制，因为并不是所有的蛋白在变异之后都会形成这种聚集体，而有一些可能需要很高的浓度才会提升，浓度较低条件下，就观察不到粒径的变化。 04 外源差示扫描荧光法（DSF）差示扫描荧光（DSF）也被称为热荧光法（ThermoFluor），是一种经济高效且易于使用的生物物理技术，通过检测当温度升高或变性剂存在时荧光发射光谱的相应变化来确定蛋白质的变性温度(热变性温度Tm值或化学变性Cm值)。Pantoliano等最先应用此技术测定了上百种蛋白质的热稳定性。差示扫描荧光法分为添加外源荧光染料与不添加荧光染料两种方式，都是利用加热使蛋白内部疏水基团暴露这一特点进行检测Tm值。传统DSF经常使用350/330比值法来进行数据分析根据荧光源不同分为内源荧光DSF和外源荧光染料DSF。基于外源染料荧光的DSF其原理是利用能与蛋白内部疏水基团相互作用的染料为荧光源。蛋白质加热变性后疏水基团暴露，疏水基团与亲和性染料结合产生荧光信号，检测荧光强度变化测定蛋白质的Tm值。特点：借助荧光定量PCR适用于高通量筛选，信号强度可控，灵敏度和准确性都较高。但添加的外源染料可能会对蛋白质结构和功能产生影响，且操作较复杂，不适用于所有蛋白研究。比如做膜蛋白研究时，溶液环境中需要添加双亲性的分子，一端疏水一端亲水。这种情况荧光分子会直接结合到疏水端，导致直接产生荧光信号。并且染料种类的选择、浓度的选择也很繁琐。外源荧光染料DSF也可能会产生背景荧光以及非特异吸附等假阳性结果。 05 内源差示扫描荧光法（inDSF）内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时(如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(RedShift)，即向更大的波长区域移动。特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验过程简单方便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，所以对于部分样品检测灵敏度不够，且检测可能会受其他基团影响。 06 技术对比总结总得来说，DSF和DLS法在样品用量及测定效率上更有优势，比较适合进行高通量筛选。但DSF法需要样品含有色氨酸、酪氨酸或额外添加荧光染料，这可能会对样品测量范围带来一定限制，DLS对样品浓度有要求。DLS还可以获取聚集体粒径大小的信息。DSC法虽然在样品用量与检测效率上不及DSF，但作为量热的经典方法仍是不可缺少的Tm值测量手段，在进行批量样品的热稳定性筛选时，可以使用DSF法初筛，DSC法复筛。此外，DSC能测定蛋白质变性过程中的热容变化ΔCp、焓变ΔH、解折叠自由能ΔG、玻璃态转变温度、分子流动临界温度等其他重要热力学参数。CD作为检测蛋白二级结构的经典方法，在Tm值测定方面具有其独特优势和一定的局限性，也是研究加热过程中蛋白结构改变的重要方法。蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响，研究结构域改变与功能活性改变关联性等。比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点。 07 国产蛋白稳定性分析仪PSA-16 北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产蛋白稳定性分析仪，该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需荧光染料、高通量、低样品消耗量的检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。 多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16在各学科的研究中都有重要的意义。1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4. 抗体偶联药物（ADC）研究5. 多结构域去折叠特性研究6. 物理和化学条件强制降解研究7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10. 蛋白纯化条件快速优化等

仪器信息网讯 2014年4月，我国生命科学领域中第一个综合性的国家级重大科技基础设施&mdash &mdash 蛋白质科学研究(上海)设施(以下简称为：上海设施)通过工艺测试，正式进入开放试运行阶段。近日，仪器信息网工作人员参观拜访了上海设施及同步筹建的国家蛋白质科学中心· 上海(以下简称为：上海中心)，一睹这一国家级重大科技基础设施的先进水平和创新风采，上海中心科研项目高级主管汪利俊博士及行政事务主管高馨热情接待了我们。 国家蛋白质科学研究(上海)设施/国家蛋白质科学中心· 上海建筑群 　　为了形成国际一流的蛋白质科学研究体系，并为我国蛋白质科学研究提供&ldquo 利器&rdquo ，2008年11月，&ldquo 蛋白质科学研究设施国家重大科技基础设施项目&rdquo 列入国家高技术产业发展项目计划，项目分北京设施、上海设施两部分，其中北京设施以蛋白质组学研究为主，而上海设施以结构生物学研究为主。 　　两年后的2010年12月，上海设施在上海浦东张江高科技园区内动工建设，总投资7亿元，项目总建筑面积3.3万平方米。而今历经3年多建设，上海设施/上海中心正式进入试运行阶段，预计于今年年底正式面向多用户、多领域开放。 　　据介绍，上海设施配备了蛋白质科学研究所需的各种大型科学仪器设备，以及由上海设施的技术人员自主研发的规模化、系统化技术装备体系。目前，上海设施由基于同步辐射光源的五线六站、规模化蛋白质制备系统、质谱分析系统、核磁分析系统、电镜分析系统、分子影像系统、复合激光显微成像系统、数据库与计算分析系统、动物设施等平台组成，可为在分子水平、细胞水平和个体水平上研究蛋白质、蛋白质复合体、蛋白质机器的结构与功能提供全面和完整的技术与条件保障。 　　在各大平台中，最令上海设施团队自豪的是几项创新：其中一项是将蛋白质表达实现了从&ldquo 手工作坊&rdquo 到&ldquo 智能工厂&rdquo 的转变。目前，在科研界和制药业对于各种蛋白样品的需求日益强烈，但蛋白表达是一个公认复杂、高成本、耗时和资源占用的过程。上海设施规模化蛋白质制备系统自主设计了五套大型自动化装置，将软件控制、硬件设备和生物应用结合在一起，实现了大规模蛋白表达过程的自动化(包括克隆、蛋白表达和纯化)。 高通量自动化克隆系统 　　整个流程实现了自动化，从大规模PCR扩增开始，依次自动进行重组质粒的构建、细胞生长、诱导表达、蛋白表达(构建了大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞三种表达体系)，最终完成蛋白纯化及蛋白性质表征。以克隆过程为例，实验效率从传统手工一人次一天10个基因克隆提升到一天1000个基因克隆。 　　第二项创新则是分子影像系统自主研发的高精度激光双光镊系统。据悉，设备的所有零部件都购自现成。光镊采用激光辐射压对微米级粒子进行捕获，并通过高精度的测量技术实现亚纳米级位移和亚皮牛级力的测量。依靠这套系统，激光是&ldquo 镊子&rdquo ，能研究蛋白质如何折叠、变形，以及大分子生物酶的工作原理。高精度激光双光镊系统 　　第三项创新则是上海设施团队基于平台开发的相关研究方法。有了最先进的仪器，没有相应的研究方法也是枉然。为此，上海设施/上海中心的年轻PI们除了从事科学研究外，方法开发也是他们工作的重点。 　　以核磁系统分析平台为例，上海设施目前拥有5台核磁共振波谱仪，其中有国内第一台最高磁场强度的核磁共振设备(布鲁克900M NMR)，主要用来测试蛋白质的溶液结构。上海中心PI周界文带着研究人员开展了核磁共振新技术的开发和新方法的研究。目前新方法的主体研究已完成，正进入软件测试阶段，对推广核磁共振技术在结构生物学领域的广泛应用有重要意义，特别是对依托高场强核磁共振设施进行大蛋白质的三维结构测定过程将更加可行。 布鲁克900M 核磁(左)、安捷伦800兆核磁(中)、安捷伦600兆核磁(右) 布鲁克600兆核磁(左)、安捷伦700兆核磁(右) 核磁系统分析平台一览 　　同样，上海设施的质谱分析系统平台也很强大，拥有赛默飞、AB SCIEX、安捷伦、沃特世等主流质谱品牌的仪器13台，是全国目前最大、质谱仪器种类最全的质谱分析平台之一。这个实验室在上海中心PI黄超兰的主持下，已自主研发了一系列国内其他实验室尚不具备的研究手段，吸引了全国各地甚至美国的诺奖获得者的研究组等多家科研单位前来合作，在短短半年间已有超过70多个合作项目在进行。 赛默飞质谱系统 (2台 Q Exactive、1台LTQ Orbitrap XL、1台LTQ Orbitrap Elite、1台 LTQ Orbitrap Elite-ETD) AB SCIEX质谱系统 (左上：QTRAP 6500、左下：Triple TOF 5600+、右：MALDI-TOF/TOF 5800) 安捷伦质谱系统 (1台 6530Q-TOF、1台6550 ifunnel Q-TOF、1台6490 QQQ) 沃特世质谱系统 (左：Xevo TQ-S 右：Synapt G2-Si HDMS) 质谱分析系统平台一览 (左：FEI TitanKrios 300kV 球差矫正透射电镜 右上：FEI TF20 场发射冷冻透射电镜 右下：FEI T12 冷冻透射电镜) 电镜分析系统平台一览 (左上：ZEISS Cell Observer SD 转盘式激光共聚焦 左下：NIKON N-SIM 超高分辨率显微镜 右上：LEICA SP8 激光共聚焦显微镜 右下：OLYMPUS FV1200MPE 双光子显微镜) 复合激光显微成像系统平台一览 　　此外，上海中心还自主研发了一套科研物资管理系统(e-Supply)，所有实验室的研究人员都可通过ID登录系统下单购买实验试剂、耗材，资金从课题组经费账户中扣除，而上海中心则能以&ldquo 团购&rdquo 方式，拿到最优的价格。并且上海设施还为供应商提供了库存仓库，供应商只需付较少的费用就可以把上海设施常用的试剂、耗材存于此，这样也极大方便了研究人员，省去了试剂耗材运送的时间。现该系统已获国家计算机软件著作权，除管理上海中心物资外，还兼管筹建中的上海科技大学的物资，不久有望在中科院其他研究院所推广。 科研物资管理系统(e-Supply) 供应商在上海设施库存的商品 数据库与计算分析系统机房 　　上海设施不仅仅是一个供科学家使用的科研平台，更是一个具有强大科研能力的科学中心。目前，上海中心有PI 14位，仅在上海设施试运行期间，上海中心各研究组就已获得了包括中科院战略性先导科技专项和国家重大科学研究计划项目在内的多项重大课题，相关研究成果已在《自然》、《癌细胞》等国际著名学术刊物上陆续发表。 　　许琛琦研究组在阐明人体免疫机制方面取得突破性进展，首次证明钙离子能够改变脂分子功能来帮助T淋巴细胞活化，提高T淋巴细胞对外来抗原的敏感性，从而帮助机体清除病原体。 　　周界文研究组在研究重要离子通道蛋白p7的精细空间结构以及p7与抑制剂金刚烷胺类药物相互作用的分子机理方面也取得重大突破，相关研究成果将大大推动新一代抗丙型肝炎病毒治疗手段的研发。 　　周兆才研究组研究发现原癌蛋白质YAP的一个天然拮抗剂蛋白&mdash VGLL4，并在蛋白质晶体结构解析的基础上发展出一个针对YAP的多肽类抑制剂，为以胃癌为代表的肿瘤治疗提供了新的策略和途径。 　　雷鸣、张荣光研究组的研究论文首次在原子水平上解析了端粒酶的结构，第一次从原子层面对脊椎动物端粒酶复合物中蛋白质-RNA的相互作用进行了描述。 　　未来，上海设施将对中国乃至全球的科学家开放，旨在让上海设施发挥其更大的作用与价值。(撰稿：杨娟) 　　附录：国家蛋白质科学研究(上海)设施及国家蛋白质科学中心· 上海网址 http://www.sibcb-ncpss.org/ 　　http://www.ncpss.org