胆红素浓度

[color=#0000ff][size=4] 我想就药典中新增的安宫牛黄丸中胆红素含量测定方法问题向大家请教：为什么我们在试验中胆红素含量会很低呢？（原料牛黄中胆红素含量不低呀）操作中应该注意些什么呢？（避光，低温。） 急呀！[/size][/color]

氯芬黄敏片 水浴中胆红素被三氯甲烷溶解的不充分。想问下要怎么做才行。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/03/201803301100583840_8393_3350083_3.jpeg[/img]

求助下大家，HPLC法测定安儿宁颗粒中的胆红素含量，流动相为甲醇－四氢呋喃－1%乙酸（80：10：10），液相为岛津LC20A，色谱柱为C18柱，柱温为50度，检测波长为450nm，对照品不出峰。 后调整下流动相，分别为-乙腈（50：50）；甲醇－四氢呋喃－1%乙酸－三氯甲烷（80：5：5：10），其它条件不变，还是出不了峰！ 有谁做过？请帮忙分析下！

求助下大家，HPLC法测定安儿宁颗粒中的胆红素含量，流动相为甲醇－四氢呋喃－1%乙酸（80：10：10），液相为岛津LC20A，色谱柱为C18柱，柱温为50度，检测波长为450nm，对照品不出峰。 后调整下流动相，分别为-乙腈（50：50）；甲醇－四氢呋喃－1%乙酸－三氯甲烷（80：5：5：10），其它条件不变，还是出不了峰！ 有谁做过？请帮忙分析下！

方法：HPLC基质：药品应用编号：103623化合物：胆红素固定相：PlatisilODS色谱柱/前处理小柱：Platisil ODS 5u 250 x 4.6 mm样品前处理：1、游离胆红素制备方法： 对照品1：取胆红素对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成每1 mL 含 6.5 μg的溶液，即得。 供试品1：取本品适量，研细，取粉末约 33 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入二氯甲烷20 mL，密塞，称定重量，涡旋至充分混匀，冰浴超声处理（功率500 W，频率53 kHz）10分钟，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心（转速为每分钟 4000 转），分取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得。 2、胆红素制备方法： 对照品2：胆红素对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成每1 mL含10 µg的溶液，即得。 供试品2：取重量差异项下的本品适量，研细，取粉末 10 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10%草酸溶液2mL，密塞，涡旋混匀，精密加入水饱和的二氯甲烷25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500 W，频率 53 kHz，水温25～35℃)20分钟，放冷，再称定重量，用水饱和二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心（转速为每分钟 4000 转），分取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得。色谱条件：色谱柱： Platisil ODS 250*4.6 mm，5 μm（Cat#：99503） 流动相： 甲醇：二氯甲烷：1%磷酸溶液=81:13:6 流速： 1.0 mL/min 柱温： 30 ℃检测器： 450 nm 进样量： 游离胆红素：10 μL；胆红素：5 μL谱图：data:image/png;base64,R0lGODdhUgKNAXcAACH+GlNvZnR3YXJlOiBNaWNyb3NvZnQgT2ZmaWNlACwAAAAAUgKNAYUAAAAAADoAAGYAOpAAZmYAZrY6AAA6ADo6AGY6Ojo6OpA6ZmY6ZrY6kNtNTU1mAABmADpmAGZmZjpoaGhmZmZmZrZmkJBmtv+QOgCQOjqQkDqQkGaMjIyQtpCQ27aQ29uQ2/+2ZgCysrK2///bkDrbkJDbtmbbtrbQ0NDb////tmb/25D//7b//9v///8BAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMBAgMG/0CXcEgsGo/IpHLJbDqf0Kh0Sq1ar9isdsvter/gsHhMLpvP6LR6zW673/C4fE6v2+/4vH7P7/v/gIGCg4SFhoeIiYqLjI2Oj5CRkpOUlZaXmJmamgAARJ2dE6CjWJ1NppupqqushahC

欧盟认可的苏丹红素检测方法 (中文译文) [color=red]【由于该附件或图片违规，已被版主删除】[/color][img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=32714]欧盟认可的苏丹红素检测方法 (中文译文) [/url]

新生儿黄疸是新生儿临床上极为常见的病症。新生儿由于胆红素代谢异常或红细胞破坏加速产生的胆红素过多，超出了人体代谢能力，引起体内胆红素水平升高，外部表现为巩膜、皮肤黄染。易发展为新生儿高胆红素血症，病情加重亦可导致高胆红素脑病、核黄疸的发生，进而危害到新生儿的生命健康，造成脑神经损伤、视觉听觉障碍等严重后果。国内和国外的研究机构已经通过研究发现，可以根据呼出气体中痕量的一氧化碳（CO）浓度来反应红细胞破坏速率（胆红素的生成速率），即用呼气试验法代替侵入式穿刺采血来准确获取胆红素生成速率，并且已取得相应的诊断或干预切点。胆红素与CO同为红细胞破坏后血红蛋白的代谢产物，具有一定的数量关系，通过测定CO的浓度可快速准确判断出胆红素的产生速率，从而判断红细胞破坏速率，动态无创的监测新生儿黄疸水平，如果新生儿呼出CO浓度过高，医生可尽早采取干预措施。这种测试方法简便安全，可真正实现对新生儿黄疸进行无创、可量化的动态监测。但是，人呼出的气体中含有大约3000种成分，其中一氧化碳（CO）含量仅为百万分之一，极易受到多种因素的干扰，实现准确采集和测算的技术难度非常大，所以一氧化碳（CO）呼气试验法一直无法有效应用于临床。国外虽有医疗器械厂商研发出可用于新生儿黄疸检测的呼气试验仪器，但因测试精度不够，不能实现定量检测，没有使一氧化碳（CO）呼气试验法得到普及。[img=879711,239,300]http://news.isweek.cn/wp-content/uploads/2024/03/879711-239x300.png[/img]随着气体传感器的快速发展，目前新型的CO呼气检测仪可以用在新生儿黄疸检测干预，可实现对各种干扰因素的气体干扰进行屏蔽与优化，使其不受影响，特别是在新生儿在，容易出现乳糖不耐受的情况，会产生H2的干扰，这对CO传感器检测精度产生很大影响。而CO气体传感器作为CO呼气检测仪的主要核心器件，起到决定性作用，所以使用高精度（PPB浓度级别），不受干扰的CO传感器很重要。工采传感(ISWEEK)推荐来自英国Alphasense厂家的一款高精度，高分辨率PPB检测级别CO-B4系列传感器，同时也有带有抗高H2的CO-B4X系列。CO-B4是高分辨率一氧化碳传感器，可以检测4ppb的CO气体，分辨率高达4ppb灵敏度高，易于信号处理线性度好,具有稳定性好的特点，非常合适用在医疗呼气检测仪上。[img=英国alphasense 高分辨率一氧化碳传感器(CO传感器),300,300]https://www.isweek.cn/Thumbs/300/0170831/59a76a9d5718d.jpg[/img]英国Alphasense高分辨率一氧化碳传感器CO-B4具体性能如下:[img=998711,538,278]http://news.isweek.cn/wp-content/uploads/2024/03/998711.png[/img]

苏丹红和茜素红如何测试呀

超滤法。刘荣华等对大孔吸附树脂提取胆红素的工艺进行了考察，在应用CDA-40型大孔吸附树脂、 pH值为5～6、吸附剂用量为4g/10mL胆汁、硫酸铵盐浓度70%、搅拌吸附时间为4h的条件下，胆红素的提取率达85%以上，纯度达93%，且工艺简便、大孔吸附树脂再生容易。陈延清用7种不同种类的大孔吸附树脂来精制乐脉胶囊，用HPLC法测定丹参素、芍药苷的含量，结果显示，用树脂精制后提取物的含固率显著降低，丹参素的损失很大，芍药苷在部分树脂的保留率低于80%。 5　结语 大孔吸附树脂在天然药物的分离、富集方面有着广泛的应用前景，并日益显示出其独特的作用。目前在天然药物化学成分分离方面最常用的树脂有D-101，DA-201，AB-8，H103，LD605， CDA-40, D1300型等，还有NKA和SIP系列。目前大孔吸附树脂在苷类成分分离方面应用较广，在其他类化学成分的分离方面应用研究有待深入。应用大孔吸附树脂可将天然药物的有效成分分离出来，特别有利于解决天然药物大、黑、粗的问题。随着在天然药物化学成分提取、分离、富集中的进一步应用，大孔吸附树脂必将有利于天然药物制剂工艺的改进，有利于促进天然药物现代化研究的进程。

益生菌可以退黄疸既然不知道？益生菌对于黄疸恢复是有一定的帮助，主要是减少胆红素肝肠循环、促进胆红素排泄！[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/02/202202251653441649_2055_1642069_3.png[/img]

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我们在试制番茄调味酱,测番茄红素的方法是先用甲醇洗去黄色素,再用苯洗番茄红素,洗下的番茄红素用苯顶容,在波长485nm下测消光值,从标准曲线上查待测的浓度.大家说说这方法的利与弊,哪位高手还有更好的方法希望传教一下.

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1、雷公藤红素抑制CML细胞增殖作者首先进行了网络药理学分析，以评估在治疗CML方面最有效的天然产物。通过对3882种天然产物进行了网络药理学分析，发现从传统中药“雷公藤”（Tripterygium wilfordii）根皮中提取的五环三萜雷公藤红素在抑制CML方面排名第一。为了验证网络药理学筛选的可靠性，作者在CML细胞中进行细胞活力测定。选择18β-甘草次酸作为阴参，因为它与雷公藤红素的结构最相似，但在3882 种天然产物中预测得分不高，选择17-AAG（HSP90抑制剂，已有文章报道HSP90是雷公藤红素的靶点）和TKI 药物伊马替尼作为阳参。结果表明雷公藤红素、17-AAG和伊马替尼均能有效抑制CML细胞增殖，而18β-甘草次酸几乎不影响细胞生长。作者进一步开展细胞实验，发现雷公藤红素对K562和K562T315I细胞表现出抗增殖活性，诱导细胞凋亡。尽管对雷公藤红素的研究很深入，但尚未系统地鉴定出雷公藤红素在CML中的直接蛋白质靶点，尤其是在耐药性CML细胞中 雷公藤红素抑制CML细胞增殖2、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的转录组和蛋白质组学分析接着，作者通过RNA 测序发现富集的通路包括铁死亡、蛋白水解调节、响应p53介导的DNA损伤等。作者还进行了蛋白质组学分析雷公藤红素对K562T315I细胞中蛋白质表达水平的调节，下调蛋白主要富集于DNA和RNA代谢途径以及 DNA损伤反应，以及蛋白质加工途径。MCODE分析发现“对DNA损伤刺激的反应”和“对未折叠蛋白的反应”分别是最具特征性的途径。雷公藤红素与其已知靶标HSP90的相互作用可能是“对未折叠蛋白的反应”上调的关键贡献事件。而目前尚未有报道称雷公藤红素的直接蛋白质靶标与“对DNA损伤刺激的反应”途径有关（ 雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的定量蛋白质组学分析3、雷公藤红素处理后 K562T315I 细胞的CETSA-MS分析作者接着检测了K562T315I细胞中celastrol处理后可溶性蛋白质水平的变化，在雷公藤红素处理后鉴定了178种差异溶解蛋白质，主要位于DNA中心区域，包括细胞核和线粒体，更具体地说是在DNA损伤位点。此外，“分子伴侣复合物”中溶解度降低，这可能是由于雷公藤红素和HSP90之间的互作所致 雷公藤红素处理后 K562T315I细胞的CETSA-MS分析4、雷公藤红素诱导 K562T315I 细胞DNA损伤对 K562T315I细胞经雷公藤红素处理后总蛋白和可溶性蛋白水平变化的系统分析表明，雷公藤红素主要诱导K562T315I细胞中的DNA损伤和未折叠蛋白反应。因此，作者进行了实验来验证这些观察结果。结果显示雷公藤红素显著诱导γ-H2AX（DNA损伤的常见标志物）的表达，并降低DNA损伤修复相关蛋白FANCD2水平，彗星试验进一步证实了雷公藤红素促进的DNA损伤（ 雷公藤红素诱导 K562T315I细胞DNA损伤5、雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定然后，作者在细胞裂解物中开展质谱耦合等温剂量反应-细胞热位移分析（MS-ITDR-CETSA）实验，以确定雷公藤红素的直接蛋白质靶标，特别是那些参与DNA损伤反应的蛋白质靶标。在检测到的3393种蛋白质中，有12种蛋白质表现出热稳定性的显著变化，代表了最有潜力且可信度高的靶标蛋白质。值得注意的是，雷公藤红素的已知靶标HSP90 (HSP90AA1和HSP90AB1) 的热稳定性仅表现出很小的变化，并且没有超过阈值。对这12个潜在靶标和定量蛋白质组学以及CETSA-MS分析的差异蛋白进行PPI分析，发现 YY1均为最紧密相关的蛋白质。因此，YY1与所有这些DEP/DSP的关联节点数量最多，并且可能是与DNA损伤相关的最重要的靶标。现有研究表明，YY1作为转录因子，可以调节参与DNA修复和细胞存活的各种蛋白质的表达，以响应DNA损伤。此外，HMCES已被确定为通过屏蔽脱碱基位点来保护基因组完整性免受氧化碱基损伤的关键蛋白。因此，作者继续通过蛋白质印迹结合细胞热位移分析（WB-CETSA）验证了celastrol与YY1和HMCES的互作。同样，报道的阳性对照HSP90蛋白也显示出明显的热稳定性增加（ 雷公藤红素在K562T315I细胞中的靶点鉴定6、雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证为了进一步验证celastrol与YY1和HMCES的直接相互作用，合成了可点击炔烃标签功能化celastrol探针（Cel-P），该探针保留了celastrol对K562T315I细胞的抑制活性。利用该探针开展Pulldown实验发现Cel-P 能够成功地从细胞中拉下HMCES和HSP90蛋白，但由于尚不清楚的原因，在蛋白质印迹膜上的下拉样本中未检测到YY1。随后，表达并纯化重组YY1（rYY1）蛋白，发现随着Cel-P浓度的增加，rYY1的标记以剂量依赖性方式增加 雷公藤红素与YY1和HMCES相互作用的验证7、雷公藤红素通过靶向YY1和HMCES诱导DNA损伤在验证了celastrol与YY1和HMCES之间的相互作用后，作者继续在K562T315I细胞中敲低 YY1或HMCES。结果显示YY1或HMCES的敲低显著增加了DNA损伤的发生率，同时影响细胞生长，增强细胞对celastrol的敏感性。此外，与HMCES相比，YY1敲低对细胞的影响更为显著，表明YY1发挥着更为重要的作用。对接分析显示，与HMCES相比，celastrol对YY1的亲和力略强，且Celastrol与YY1上的Leu132和Val316形成氢键，与HMCES的Glu127、Arg130和Arg137形成氢键 雷公藤红素通过靶向 YY1 和 HMCES 诱导 DNA 损伤鉴于YY1在雷公藤红素诱导的DNA损伤反应中发挥关键作用，作者对YY1蛋白进行了进一步实验。发现YY1过表达对细胞生长没有显著影响，但减轻了雷公藤红素引起的细胞死亡和DNA损伤，且通过裂解的PARP1和Caspase-3水平发现YY1表达与雷公藤红素诱导的细胞凋亡呈负相关。使用双荧光素酶报告基因发现雷公藤红素显著抑制了YY1的转录活性，BLI结合试验发现celastrol 可以与 rYY1 结合（图8）。图8 YY1在雷公藤红素诱导的 K562T315I细胞DNA损伤和细胞死亡中起关键作用总结研究使用多组学方法对雷公藤红素的作用机理进行了系统研究，利用蛋白质组范围的无标记靶标反卷积方法MS-CETSA来识别雷公藤红素的蛋白质靶标。研究不仅验证了雷公藤红素通过靶向HSP90来诱导未折叠蛋白反应，而且还发现它通过直接靶向耐药 K562T315ICML 细胞中的YY1和HMCES来诱导DNA损伤（图9）。研究有助于更好地理解雷公藤红素的多方面机制。研究提供了一种有效的系统药理学工作流程范例，该范例集成了网络药理学分析、蛋白质丰度和溶解度测量以及 MS-CETSA，以揭示任何天然产物或活性化合物的作用机理。

苏丹红检测方法1 应用范围本方法涉及以辣椒为主要成分的产品中苏丹红1号、苏丹红2号、苏丹红3号、苏丹红4号、苏丹橙B、苏丹红7B和胭脂树橙的检测。2 定义苏丹红是应用于诸如油彩、蜡、地板蜡和香皂等化工产品中的一种非生物合成着色剂，一般不溶于水易溶于有机溶剂，胭脂树橙是一种食品着色剂但不允许在辣椒粉和调味品中使用。3 方法要点上述着色剂经乙腈提取后，过滤，滤液用反相高效液相色谱仪进行色谱分析。以波长可变的紫外—可见检测器定性与定量。4 试剂与标准品除有特殊指明外，本方法中涉及试剂均为分析纯，实验用水均为蒸馏水、去离子水或相同质量的分析用水。4.1 乙腈 色谱纯4.2 水 色谱级4.3 冰醋酸4.4 氯仿4.5 苏丹红1号(Aldrich Chemical Company)4.6 苏丹红2号（Acros organics 化工合成有机物）4.7苏丹红3号（Acros organics 化工合成有机物）4.8苏丹红4号（Acros organics 化工合成有机物）4.9苏丹橙B（Acros organics 化工合成有机物）4.10 苏丹红7B（Acros organics 化工合成有机物）4.11 胭脂树橙(特殊合成产品)4.12 标准溶液4.12.1 标准贮备液称取50.0mg着色剂（按产品标明的纯度折算成纯着色剂）并按以下方式移入100ml容量瓶定容。着色剂溶解和转移溶剂定容溶剂苏丹红1号乙腈乙腈苏丹红2号乙腈乙腈苏丹红3号氯仿乙腈苏丹红4号氯仿乙腈苏丹橙B乙腈乙腈苏丹红7B乙腈乙腈胭脂树橙氯仿氯仿4.12.1 标准工作液取上述标准贮备液各5ml移入50ml容量瓶中以乙腈定容，再分别从以上容量瓶中吸取0.5ml、1ml、2.5ml、4ml和5ml溶液移入50ml容量瓶中以乙腈定容，此时溶液中各种着色剂的浓度分别为0.5,1,2.5,4和5μg/ml。5 仪器与设备5.1 万分之一天平5.2 250ml具塞三角瓶5.3 直径10cm的漏斗5.4 50ml容量瓶5.5 5ml[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]5.6 100ml量筒5.7 5ml一次性注射器5.8 0.45μm滤膜 5.9 185mm滤纸 5.10 打浆机5.11 Ultra Turrax均质机5.12 配有紫外-可见检测器的高效液相色谱仪5.13 色谱柱 LiChroCART250-4HPLC Cartbridge Supersher 100RP185.14 进样瓶6 样品制备将采集样品放入一个容量较大的密闭容器中混合均匀。对于固体样品要用打浆机或粉碎机磨细。7 操作方法7.1 样品处理7.1.1 甜椒或红辣椒粉称取10g（准确至0.01g）样品于三角瓶中，用量筒加入100ml乙腈。7.1.2 粉状调味品称取5g（准确至0.01g）样品于三角瓶中，用量筒加入100ml乙腈。7.1.3 调味辣椒酱、原味辣椒酱、辣椒油等称取20g（准确至0.01g）样品于三角瓶中，用量筒加入100ml乙腈。7.1.4 Merguez香肠、西班牙加调料的口利左香肠和肉制品称取20g（准确至0.01g）样品于三角瓶中，用量筒加入100ml乙腈。之后在Ultra Turrax中充分混合数分钟，振荡1小时后过滤于三角瓶中。检测样品取样量和其稀释液浓度要视产品中的辣椒含量而定，以符合液相色谱检测限的要求。7.2 高效液相色谱测定7.2.1 流动相溶剂A：酸性水溶液（165ml乙酸溶于1000ml水中）溶剂B：乙腈7.2.2 梯度洗脱时间溶剂A％溶剂B％梯度曲线03070线性20.0595线性30.00100线性42.00100流速:0.7ml/min基线稳定后开始进样两次进样间隙时间为10分钟7.2.3 进样量:10μl 7.2.4检测波长在300nm到600nm波长范围进行扫描,确定三个测定波长（432nm,478nm和520nm）7.2.5 标准曲线用5个标准工作溶液的测定值绘制标准曲线,各种色素的标准曲线分别在最大吸收波长处由5点回归计算（苏丹橙B在432nm波长有最大吸收，苏丹红1号, 苏丹红2号和胭脂树橙在478nm波长有最大吸收和苏丹红3号，苏丹红4号和苏丹红B在520nm波长有最大吸收）。将7.1制好的样过0.45μm的膜装入自动进样器的小瓶后进行液相色谱测定得到结果。标准回归曲线经过每次实验配制的系列标准溶液测定结果的验证。7.3 计算着色剂含量按以下公式计算：R=C×V×D/M 单位：mg/kgC-样品中待测组分的浓度,单位：μg/mlM-检测样品取样量（g）V-样品溶液体积（ml）D-样品溶液的稀释倍数8 苏丹红1号8.1 第一步是确定方法的操作条件应用Norm NF V03 110 获得以下操作条件：标准曲线模型是线性的478nm下的检测限是0.013μg/ml478nm下定量的最低浓度为：0.106μg/ml在辣椒粉样品中的添加回收率高于90%对于其它食品基质中的色素方法也进行了研究并可应用类似方法对所有着色剂进行检测。8.2 应用LC/MS确证苏丹红1号对于复杂食品基质本底或一种新的基质本底，确证苏丹红1号分子的存在是非常必要的。如果光谱分析结果不令人满意（如待分析物浓度较低或可能存在结构类似物时）也可以应用这种技术进行确证。8.3 设备8.3.1 液相色谱与电喷雾离子化质谱仪联用8.3.2 色谱柱：PHENOMENEX LUNA C18 3μm 150×2nm 8.3.3 柱温箱温度调至30℃ 8.4 HPLC测定 8.4.1 流动相溶剂A:20%酸性水溶液(0.1%乙酸溶液)溶剂B:80%乙腈流速:0.2ml/min8.4.2 进样量:10μl8.4.3 检测器正电喷雾设定条件: 喷雾电压:5300V 喷雾口电压:120V 周边电压:9.50V 辅助气体温度:300℃ 8.4.4 测定步骤7.12取得的提取物先稀释10倍后再稀释100倍后经0.45μ膜过滤于自动进样瓶中. 8.5 结果 样品中苏丹红1号组分与样准品出峰时间基本一致相对误差为5%,并经质谱检测由m/Z为249和1022的离子定性,误差为0.01u.

生化检测仪器在医药上主要用来检测人体生化指标，如　1.肝功类 　　GPT/ALT(谷丙转氨酶) ALP(碱性磷酸酶) Alb(白蛋白) 　　GOT/AST(谷草转氨酶) T-Bil(总胆红素) CHE (胆碱脂酶) 　　TTT (麝香草酚浊度) D-Bil(直接胆红素) FB(纤维蛋白原) 　　NH3 (血氨) TP(总蛋白) 　　2.肾功离子 　　BUN(尿素氮) K(血清钾) Na(血清钠) 　　Cr(肌酐) Fe(血清铁) Ca(血清钙) 　　UA(尿酸) Mg(血清镁) Cl(血清氯) 　　CO2-Cp(二氧化碳结合力) Zn(血清锌) P(血清磷) 　　血糖血脂 T-CHO(总胆固醇) HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇) 　　TG(甘油三脂) LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇) 　　GLU(血糖) 　　心肌酶谱 　　CK(肌酸激酶) 　　LDH(乳酸脱氢酶) 　　GOT(谷草转氨酶) 等

尿常规干化学试纸条与尿液发生颜色反应后，每项物质（胆红素，白细胞。。。。。）它们可见光吸收曲线怎么找呢？？？

[size=5]超临界流体色谱分析番茄红素[/size] 来源: 作者:齐国鹏,赵锁奇摘 要：以超临界C02作为流动相，在压力15.0～20.0MPa，温度25～50％，携带剂乙醇或正己烷的浓度分别为0～30％和0～20％的范围内考察了番茄红素及其氧化产物在C18色谱柱上的保留值的变化规律，确定了最佳的分离条件。对超临界丙烷萃取的番茄红素原料、萃取产物及萃余物进行了定量分析，考察了重复性及平行性。结果表明：在优化条件下，番茄红索的保留时间在3min以内，定量结果的重复性与平行性好。关键词：超临界流体色谱，番茄红素1 引 言番茄红素属于类胡萝卜素的一种，广泛分布于番茄、西瓜、葡萄等各种植物体中，作为多烯芳香烃，番茄红素是很强的抗氧化剂，可以消除血管中的自由基，淬灭单线态氧，对于抑制癌症有一定的效果。近年来，对番茄红素的分析方法的研究也日益增多。常用的方法是HPLC、TLC和紫外分光光度法等。这些方法各有特点，HPLC准确度较高，但有机溶剂耗费多；TLC设备要求不高，但分析时间长、精密度差；紫外分光光度法比较简单，但由于p．胡萝卜素等的干扰，容易产生较大的误差。利用超临界流体色谱分析胡萝卜素已有报道，LesellierE列和Aubert 利用超临界流体色谱对α-胡萝卜素和β-胡萝卜素进行了分析。但采用超临界流体色谱专门分析番茄红素还未见报道。超临界流体具有高的扩散性和较强的溶解能力，有机溶剂用量少，操作温度低等优点，本文通过考察色谱柱温度、超临界流体的压力、超临界流体的组成及携带剂浓度等因素对番茄红素分离的影响，为研究番茄红素建立一种有力的分析分离方法。2 实验部分2．1 仪器与试剂本实验室自行组装的超临界流体色谱仪，包括：两台ISCO 260DM 型注射泵输送二氧化碳，一台ISCO100DM型注射泵输送携带剂，三台泵由一台控制器控制，可以准确控制柱前压和携带剂的流量；冷冻机(重庆四达实验仪器厂)冷冻二氧化碳到一6℃；恒温箱(海安石油仪器厂)；TSP-100高压UV-VIS检测器(美国TSP公司)；Rhendyne 7125形六通进样阀配20μL定量管等部分。二氧化碳(北京氦普北分气体工业有限公司，纯度99.99％)；无水乙醇(北京化工厂，分析纯)；正己烷(北京化工厂，分析纯)。2．2 样品及处理样品包括：番茄红素标准品，β-胡萝卜素，室温下放置半个月后的氧化的番茄红素标准品，加入β-胡萝卜素的氧化番茄红素标准品；超临界丙烷萃取番茄产品，萃取的番茄原料，萃余物。将上述样品分别称取适量溶于正己烷中。2．3 色谱条件Spherisorb Ctg色谱柱(中国科学院大连化学物理研究所，尺寸：250mm×4.5mm，10μm填料)；流动相为二氧化碳-乙醇，二氧化碳-正己烷；检测波长：472nm；进样量：20μL；温度、压力、流动相流速及组成以下说明。3 结果与讨论3．1 番茄红素的定性分析本实验所用的番茄红素的样品为超临界丙烷萃取番茄产品，其中主要的杂质为β-胡萝卜素，同时由于番茄红素易于氧化，所以对番茄红素、番茄红素氧化物、胡萝卜素进行了定性分析。在相同的色谱条件下，分别注入番茄红素标准液、氧化后的番茄红素标准溶液、加入β-胡萝卜素的番茄红素标准溶液。结果如图可看出，番茄红素及其氧化物，β-胡萝卜素的保留时间随极性的减小而增加。3．2 最佳条件的确定为了保证番茄红素的定量准确，通过考察压力、温度、流动相组成及浓度对番茄红素与其氧化物分离的影响，确定了番茄红素分离的最佳条件。3．2．1 柱前压的影响 改变柱前压，当柱前压由17.0MPa增加到20.0MPa时，番茄红素及其氧化物的容量因子逐渐减少，两者的保留时间都缩短，但番茄红素与其氧化物可以实现分离。3．2．2 柱后压的影响 当柱前压、温度及携带剂流速不变，将柱后压由15MPa增加到19MPa，番茄红素与其氧化物的容量因子均减小，但番茄红素与其氧化物的相对保留值随柱后压的增加而减小，分离度也有减小的趋势。3．2．3 温度的影响 容量因子随温度增加的变化趋势如图看出，随温度升高，番茄红素与其氧化物的容量因子降低。番茄红素与其氧化物的相对保留值在室温时最大。由图也可看出，分析温度较低时，番茄红素与其氧化物的保留时间较长，但分离度较大，所以，分离的温度可选择室温。3．2．4 携带剂的影响 当乙醇浓度由5％增加到8％时，番茄红素容量因子减小很快，当浓度增大到16％时，番茄红素与其氧化物的相对保留值减小，乙醇合适的浓度为8％～10％。若以正己烷做携带剂，变化趋势与乙醇相同，番茄红素与其氧化物的相对保留值与乙醇作为携带剂时的值相差不大，大约1.2。但在相同的浓度下，正己烷做携带剂分离番茄红素的容量因子比乙醇小。3．3 番茄红素的定量分析3．3．1 绘制番茄红素的标准工作曲线配制一系列浓度的番茄红素标准溶液，分别取20μL的上述标准溶液进色谱，并根据浓度．峰面积作标准曲线，标准曲线方程为Y =一0.049+7.42×0.0000001X(Y的单位为g／L)，拟合度为0.9990，线性关系较好。线性范围：3～240mg／L。3．3．2 超临界萃取番茄红素样品色谱图 选好适当的色谱分离条件，取20μL番茄红素产品的正己烷溶液进色谱，将产品中番茄红素的峰面积代入标准曲线，即可求出溶液中番茄红素的浓度，并求出产品中的番茄红素含量。3．3．3 精密度及平行性测定 分别称取适量的同一批番茄产品、原料、萃余物各2份，溶于10mL的正己烷中。取各份上述溶液平行测定4次，结果列入表可以看出，测量结果的相对标准偏差均在6％以内，具有良好的精密度，且结果的平行性也很好。结合含量及总量进行物料恒算可以看出，原料中的番茄红素总量与产品及萃余物中番茄红素的总量较吻合，得到的结果可靠、准确。4 结 论(1)使用超临界流体色谱，在C18色谱柱上定性分析番茄红素，可通过改变温度、压力、携带剂浓度来改善分离条件。本研究确定的优化条件为柱前压20.0 MPa，柱压降在3.0～4.0MPa，分离的温度选择室温，携带剂浓度在8％～10％。番茄红素的保留时间大约3min，分析时间短于HPLC。(2)超临界流体色谱定量番茄红素，相对标准偏差在6％以内，结果的重复性和平行性较好。References1 Cheng Jian(成坚)，Zeng Qingxiao(曾庆孝)．Food and Fermentation lndustr／ez(食品与发酵工业)，1999，26(2)：75～782 Wang Qiang(王强)，Han Yashan(韩雅珊)，Dai Yunqing(戴蕴青)．Chinese J．Chromatogr．(色谱)，1997，15(6)：534～535

一、案例2005年2月18日，英国最大的食品制造商第一食品公司生产的沙司中发现了被欧盟禁用的“苏丹红一号’’色素。而这些沙司又卖给了大量食品厂商和超市卖场。从此，苏丹红成为全世界食品安全问题的代名词。苏丹红事件已过去几年了，但随后与苏丹红相关联的食品安全事件还时有发生，如红心鸭蛋等，有效的预防措施是随时进行检查，将可能受到苏丹红污染的食品杜绝在人们的消费前，才能保证食品消费的安全。二、选用的国家标准GB／T 1968l一2005食品中苏丹红染料的检测方法——高效液相色谱法。三、测定方法1．样品处理(1)粉状样品(如辣椒粉等) 准确称取样品1．000～5．000g于锥形瓶中，加入10～30mL正己烷，超声过滤5min，再用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝色谱柱中(氧化铝色谱柱的制备方法：在色谱柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用)，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2ram左右时上样，在层析过程中保持柱的湿润，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入色谱柱；控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于O．5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30ml。正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5％丙酮的正己烷液60mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。(2)油状样品(如红辣椒油、火锅料、奶油等)称取0.500～2.000g样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解(1～10mL)，难溶解的样品可于正己烷中加温溶解，其余同上操作。(3)含水量较多的样品(如辣椒酱、番茄沙司等) 称取10.00～20.00g样品于离心管中，加10～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮(3：1)，匀浆5min，3000r／min离心10min，吸出正己烷层，下层再分别用20mL正己烷匀浆两次，离心后合并3次正己烷，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5min，用5ml,正己烷溶解残渣后，其余同上操作。(4)肉制品(如香肠等) 称取粉碎样品10.00～20.00g于锥形瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5min，滤出清液，再分别用20mL正己烷匀浆两次，过滤后合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5ml。以下，其余同上操作。2．样品测定(1)色谱条件①色谱柱：ZorbaxSB—C18 3.5μm，4.6mm×150mm(或相当型号的色谱柱)。②流动相：溶剂A(0.1％甲酸的水溶液：乙腈===85:15)；溶剂B(O.1％甲酸的乙腈溶液：丙酮一80:20)。③流速：1mL／min。④柱温：30℃。⑤检测波长：苏丹红I 478nm；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520nm，于苏丹红I出峰后切换。⑥进样量：10μL。(2)标准曲线的制作 吸取标准储备液O、0.1ml、O.2ml、O.4mL、O.8mL、1.6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列使用液浓度为O、0.16μg／mL、O.32μg／mL、0．64μg／ml、1.28μg／mL、2.56μg／mL，取10μL按色谱条件进样测定，并绘制标准曲线。(3)样品测定 依色谱要求条件，进样操作，测得结果，代入公式计算。3．结果计算R=C×V/m式中 R——样品中苏丹红的含量，mg／kg；C——由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，μg／mL；V——样液定容体积，mL；m——样品质量，g。4．试剂①乙腈：色谱纯。②丙酮：色谱纯、分析纯。③甲酸：分析纯。④乙醚：分析纯。⑤正己烷：分析纯。⑥无水硫酸钠：分析纯。⑦色谱柱管：lcm(内径)×5cm(高)的注射器(管)。⑧色谱用氧化铝(中性100～200目)：105℃干燥2h，于干燥器中冷至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用。⑨5％丙酮的正己烷溶液：吸取50mL丙酮用正己烷定容至1L。⑩标准储备液：分别称取纯度≥95％的苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各10.Omg(按实际含量折算)，用乙醚溶解后用正己烷定容至250mL。5．仪器①高效液相色谱仪(配有紫外可见光检测器)。②分析天平：感量0.1mg。③旋转蒸发仪。④均质机。⑤离心机。⑥O.45μm有机滤膜。

胆固醇稳态对机体正常的细胞和系统功能至关重要，胆固醇平衡失调是心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等其他疾病的基础[1]。胆固醇代谢包括内源性胆固醇合成、吸收和排泄等环节。研究表明，胆固醇在体内不能被降解，有效排泄是维持其稳态的重要环节[2]。体内积累的胆固醇最终通过肠道以粪便消除胆固醇和胆汁酸的形式达到平衡，目前已知的胆固醇排泄途径包括了胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）途径和经肠胆固醇排泄（transintestinal cholesterol excretion，TICE）途径；前者是肝脏将胆固醇转化为胆汁酸后经肠排出，后者是由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇，二者交汇于肠道，因此，肠道在胆固醇稳态中发挥了重要作用[3-4]。调血脂治疗是防治体内高胆固醇含量诱导的相关疾病的有效方法，目前临床常用调血脂药物他汀类的作用是通过降低低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）以限制内源性胆固醇合成，从而防治心血管等疾病的发生发展，但其相关发病率和死亡率仅降低了30%[5]。这意味着需要更多策略来解决这个严重的公共卫生事件。 雷公藤红素（celastrol，CeT）是一种从传统中药雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.中提取分离出的活性成分，具有抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种药理活性[6]，且具有良好的成药性，被《Cell》杂志列为最可能转化为现代药物的5种有潜力传统药物之一[7]。Zhang等[8]前期研究发现，体外有效成分为CeT的南蛇藤能够通过在促进RCT减少脂质蓄积方面具有积极作用，其机制主要是通过激活清除剂受体B类成员1（scavenger receptor class B member 1，SRB1）、ABC转运体和细胞色素P450家族7亚家族A成员1（cytochrome P450 family 7 subfamily A member 1，CYP7A1）途径促进胆固醇代谢。然而，有关CeT调控胆固醇代谢的作用机制探索尚不完善。此外，迄今为止，并无有关CeT通过调控肠道TICE途径介导胆固醇代谢的相关研究。因此，本研究采用网络药理学和系统生物学理论，通过构建“CeT-靶点-肠道胆固醇代谢”多层次网络，初步预测CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用机制[9-10]，并结合实验深入探讨和验证CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的作用及机制，旨在为维持体内胆固醇稳态提供新的方向和理论依据。 1 材料 1.1 细胞 大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞（批号ZQ0783）由中国科学院上海细胞库提供。 1.2 药品与试剂 CeT（批号C0869）购自美国Sigma公司；肝X受体α（liver X receptor α，LXRα）抑制剂GSK2033（批号HY-108688）、Bodipy荧光染色（批号HY-W090090）购自美国MCE公司；0.25%胰蛋白酶（批号PB180229）购自美国Hyclone公司；DMEM高糖完全培养基（批号ZQ-121）、DMEM基础培养基（批号09122）购自上海中乔新舟生物科技有限公司；磷酸酶抑制剂（批号CW2383S）、蛋白酶抑制剂（批号CW2200S）、BCA试剂盒（批号CW0014S）、SDS-PAGE试剂盒（批号CW0022S）、Loading buffer（批号CW0028S）液购自康为世纪生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒（批号C0037）、RIPA裂解液（批号P0013B）、ECL化学发光试剂盒（批号P0018S）购自碧云天生物技术股份有限公司；油红O染色试剂盒（批号G1262-4）购自北京索莱宝科技有限公司；PVDF膜（批号ISEQ00010）购自美国Millipore公司；兔抗三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G5（adenosine triphosphate-binding cassette transporters G5，ABCG5）抗体（批号27722-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批号SA00001-2）购自美国Proteintech公司；兔抗ATP结合盒转运蛋白G8（ATP-binding cassette transporters G8，ABCG8）抗体（批号A01482-2）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗NPC1样细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1）抗体（批号PA5-116672）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗LXRα抗体（批号ab41902）、DAPI染液（批号ab228549）购自英国Abcam公司。 1.3 仪器 ix 73型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；FC型酶标仪、Forma 3系列CO2培养箱、EVOS fl auto全自动荧光倒置荧光学显微镜（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统、Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳系统（美国Bio-Rad公司）。 2 方法 2.1 网络药理学研究 将PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到的CeT 3D结构导入PharmMapper（http://www. lilab-ecust.cn/pharmmapper/）进行药物靶点预测。通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到肠道和胆固醇代谢靶点。并与CeT靶点取交集得到共有靶点；通过STRING（https://STRING-db.org）进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建，并导入Cytoscape 3.9.1软件构建网络模型并分析；通过DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；利用PDB（https://www.rcsb.org/）筛选并下载分辨率小于0.25 nm的靶点的结晶复合式，结合上述得到的CeT 3D结构，采用Autodock进行分子对接，运用PyMol可视化处理。 2.2 实验验证 2.2.1 IEC-6细胞培养 IEC-6细胞用DMEM高糖完全培养基于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养。 2.2.2 CCK-8法检测细胞存活率 将对数生长期的IEC-6细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。每孔加入100 μL含不同浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 μmol/L）CeT的培养基，另设置加入无药物培养基的对照组，每组设置5个复孔，培养箱中培养24、48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂，于培养箱中孵育1～2 h后，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A）值，计算细胞存活率。 细胞存活率＝A给药/A对照 2.2.3 油红O染色评估CeT对肠上皮细胞胆固醇的影响 设置对照组、模型组和CeT（0.05、0.10、0.20 μmol/L）组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（cholesterol micelles, C-M，10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型[11]，给药组加入不同浓度的CeT溶液，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，加入ORO Fixative固定液固定细胞；加入1 mL 60%异丙醇浸洗；加入油红O染液（ORO Stain A∶ORO Stain B＝3∶2），洗涤至孔内无红色剩余；加入Mayer苏木素染色液，洗涤；加入油红O染液缓冲液；加入蒸馏水覆盖细胞并拍照，使用Image-Pro Plus软件以脂滴与整个图像的面积比进行定量。 2.2.4 Bodipy荧光标记法 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，PBS洗涤，室温下多聚甲醛固定30 min；每孔加入2 μmol/L Bodipy染色液，于37 ℃细胞培养箱中孵育15 min；弃去染色液，PBS洗涤；DAPI复染核5 min，PBS洗涤；观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件以荧光强度进行统计。 2.2.5 Western blotting检测TICE相关蛋白表达 按“2.2.3”项下方法进行分组和给药，干预24 h后，收集细胞；PBS洗涤后使用蛋白裂解液提取总蛋白质，BCA定量法测定蛋白质浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶封闭3 h，用TBST洗涤后加入一抗，4 ℃孵育过夜；洗涤后加入二抗，室温孵育2 h；洗涤后进行显影，使用Image-Pro Plus软件分析条带灰度值。 2.2.6 免疫荧光检测LXRα/ABCG8和LXRα/ NPC1L1通路相关蛋白的影响 设置对照组、模型组、CeT（0.1 μmol/L）组、GSK2033（10 μmol/L）组和CeT＋GSK2033组，除对照组外，其余各组加入DMEM基本培养基配制的胆固醇胶束（10 mmol/L）构建肠上皮细胞高胆固醇模型，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基。干预24 h后，PBS洗涤3次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次后加入Trition X-100，室温下通透10 min；PBS洗涤3次后，加入免疫染色封闭液封闭60 min，吸去多余的牛血清白蛋白；分别滴加100 μL LXRα（1∶200）、ABCG8（1∶200）、NPC1L1（1∶200）一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，PBS浸洗3次，滴加100 μL二抗（1∶300），室温避光孵育60 min；PBS洗涤3次，滴加DAPI复染核15 min，PBS洗涤3次；滴加抗淬灭剂10 μL，扣片，正面朝下盖在载玻片上，荧光显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus软件分析荧光强度。 2.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以表示。两组间数据分布的正态性和方差齐性分别以Kolmogo? rov-Smirnov和Levene检验确定。组间均数比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间有差异进一步采用SNK-q检验进行两两比较。 3 结果 3.1 网络药理学研究 3.1.1 CeT-肠道胆固醇代谢靶点 通过TCMSP等数据库得到94个CeT相关靶点。通过NCBI Gene等数据库得到15 415个肠道相关靶点、14 177个胆固醇代谢相关靶点。并构建韦恩图预测CeT-肠道胆固醇代谢共有靶点，见图1。 图片 3.1.2 CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络构建 将PPI导入Cytoscape 3.8.1软件进行可视化，发现1个关键的子网络，见图2。 图片 3.1.3 CeT-肠道胆固醇代谢的GO功能富集分析 对CeT调控肠道胆固醇代谢的作用及机制进行GO富集分析，分别得到855个生物进程、17个细胞组成、53个分子功能，根据P＜0.05，选出排名前10的条目，见图3。 图片 3.1.4 CeT-肠道胆固醇代谢的KEGG通路富集分析 CeT调控肠道胆固醇代谢的通路涉及34条，根据P＜0.05，选出排名前10的通路，见图4。其中，主要涉及脂肪的消化和吸收、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）等信号通路。其中，肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）的靶点（ABCG5、ABCG8、NPC1L1）主要涉及CeT-靶点-肠道胆固醇代谢网络的关键网络之一（图5）。并且该网络主要涉及胆固醇排泄的关键途径——TICE途径。 图片 图片 3.2 分子对接分析 CeT与NR1H3（LXRα）结合能为?28.131 4 kJ/mol，可视化显示，匹配度良好，化合物与靶点结合的最优构象以氢键的方式呈现，结合活性良好，见图6。 图片 3.3 体外实验研究 3.3.1 CeT浓度筛选 不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L）的CeT分别干预IEC-6细胞24、48 h后，如图7所示，干预24 h时随着CeT浓度的增加细胞存活率降低，CeT的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为0.2 μmol/L。本研究在探索CeT安全浓度调控IEC-6细胞胆固醇代谢活性的同时，为了更进一步研究CeT在IC50时是否较安全浓度的效果更好，因此，选择0.05、0.10、0.20 μmol/L的CeT处理细胞24 h进行后续研究。 图片 3.3.2 CeT对IEC-6细胞内脂质的影响 如图8所示，油红O染色与Bodipy荧光标记结果均显示，与对照组比较，胆固醇胶束干预显著增加脂滴染色和荧光强度（P＜0.001），表明造模成功；与模型组比较，各剂量CeT均显著抑制IEC-6细胞中脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001）。 图片 3.3.3 CeT对TICE途径关键蛋白的影响 NPC1L1是胆固醇吸收的重要蛋白，ABCG5/G8与胆固醇流出密切相关。如图9所示，与对照组比较，模型组NPC1L1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，CeT（0.2 μmol/L）组NPC1L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），CeT（0.1、0.2 μmol/L）组ABCG5和ABCG8蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。因此，CeT可能通过抑制NPC1L1，促进ABCG5、ABCG8的表达，调控TICE途径介导的胆固醇摄取和流出。 图片 3.3.4 LXRα是CeT调控TICE途径的关键蛋白 如图10所示，与对照组比较，模型组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，CeT组LXRα、ABCG8表达显著增加（P＜0.001），NPC1L1表达显著降低（P＜0.01），LXRα抑制剂GSK2033组ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.05）；与CeT组比较，CeT＋GSK2033组LXRα、ABCG8表达显著降低（P＜0.01），NPC1L1表达显著增加（P＜0.01）。因此，CeT可能通过促进LXRα的表达，调控TICE途径中的关键蛋白NPC1L1、ABCG8介导的胆固醇摄取和流出。 图片 4 讨论 胆固醇广泛存在于机体中，具有广泛的生理作用，是组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的重要原料，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，研究表明，心血管疾病、胆石症和肿瘤与高胆固醇血症密切相关[12-13]。胆固醇在体内不能被降解，机体有效排泄胆固醇是维持胆固醇稳态的重要环节[2]。因此，促进体内胆固醇排泄以维持体内胆固醇的动态平衡可能是治疗胆固醇失衡相关疾病的新策略。 基于此，本研究通过网络药理学方法，探讨CeT通过调控肠上皮细胞胆固醇代谢的潜在靶点及相关机制。PPI网络发现，CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢涉及1个核心子网络。其中，ABCG5/8与NPC1L1为胆固醇摄取与流出相关的核心靶点。本研究通过体外构建和模拟肠上皮细胞高胆固醇环境，探索CeT调控肠上皮细胞胆固醇代谢的机制，油红O和Bodipy结果均显示，CeT能够呈浓度相关性地降低胆固醇胶束干预的肠上皮细胞内的脂质积蓄。进一步通过结合KEGG通路分析发现，该子网络中的核心靶点与肠道脂质代谢的关键通路（fat digestion and absorption）相匹配，通过深度分析该通路发现，其主要涉及肠上皮细胞摄取与流出胆固醇中的TICE途径。已有研究表明，胆固醇从体内排出的唯一途径是通过粪便直接排出或转化为胆汁酸后排出，粪便排泄可通过2种独立途径进行，第1种途径是胆汁分泌，该途径已被广泛描述和研究。第2种途径是通过TICE途径[14]。在2009年Van团队初步研究估计，TICE对野生型小鼠体内排出的粪便中性固醇总量的贡献约为30%[15]。接下来，该团队在2010年通过实验得出在小鼠中TICE途径占粪便中性甾醇排泄的70%[16]。在人体生理情况下，TICE途径排泄的胆固醇占粪便胆固醇排泄总量的35%[2,17]。TICE指由血直接经肠道分泌和排出血浆脂蛋白来源的胆固醇。包括肝源性含载脂蛋白B的脂蛋白被基底膜侧低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和其他可能受体吸收、内化，最终通过ABCG5/G8以及其他可能的转运体从顶端膜流出排泄到肠腔[18]。另有研究发现，利用Ezetimibe抑制NPC1L1介导的胆固醇摄取可显著增强TICE途径[2]。而本研究表明，CeT干预处于高胆固醇环境中的肠上皮细胞后，NPC1L1被抑制，而ABCG5、ABCG8被激活。提示，CeT主要通过抑制NPC1L1减少肠上皮细胞胆固醇摄取和促进ABCG5、ABCG8增加胆固醇流出。 LXRα由于其抗动脉粥样硬化、去除胆固醇和抗炎活性，在胆固醇稳态的转录调控中发挥极其关键作用[19]。研究发现，LXRα可调控NPC1L1在肠上皮细胞中的表达，降低肠道胆固醇的吸收[20]。此外，ABCG5和ABCG8是LXRα的直接靶基因，常形成异二聚体ABCG5/G8发挥作用，负责将细胞内胆固醇泵入肠腔并最终通过粪便排出体外[21]。PPI子网络表明，NPC1L1、ABCG5以及ABCG8主要由LXRα交联。因此，在上述研究的基础上，通过分子对接模拟了CeT与LXRα的对接模式，结合活性良好。采用LXRα抑制剂GSK2033处理，结果显示，NPC1L1和ABCG5/G8主要受LXRα调控。提示，CeT可能通过LXRα/ABCG5/ABCG8和LXRα/ NPC1L1途径分别介导IEC-6细胞胆固醇摄取和流出，进而促进TICE途径介导的胆固醇排泄。 本研究通过网络药理学和相关实验发现，CeT可能通过抑制肠上皮细胞胆固醇摄取和促进胆固醇流出维持机体胆固醇稳态，这一效应与核心靶点LXRα密切相关，本研究拓展了CeT调控体内胆固醇代谢的机制，为维持体内胆固醇稳态和胆固醇失衡相关疾病的新药研发提供了新思路。