带电变体

总部位于瑞士的研究人员最近发现了SARS-CoV-2奥密克戎变种中棘突蛋白的高分辨率冷冻EM结构，目前该变种已席卷欧洲和世界大部分地区。洛桑埃科尔理工学院生命科学学院病毒学和遗传学实验室的病毒学家迪迪埃特罗诺（Didier Trono）教授和同事们用200kV Glacios Cryo-Em仪筛选了蛋白质样本，然后最终数据收集在300kV Titan Krios G4上。特罗诺（Trono）及其同事在生物学评论（bioRXiv）预印本《cryo EM对Omicron SARS-COV-2变种棘突的结构分析及其对免疫逃避的影响》中写道：“数据是用CryoSPARC Live“实时”处理的，在距冷冻3小时后生成了第一张3D图谱。”预印本于2021年12月28日发布。a、 奥密克戎变体峰的冷冻电镜图谱。图谱染色对应于构成完整三聚体（A（绿色）、B（蓝色）和C（橙色））的每一个尖峰单体链。红色表示聚糖。单RBD up（单体C）的柔韧性几乎看不见。b、 奥密克戎棘突原子模型的侧面图为灰色，突变以黄色突出显示。c、 单体A的带状表示，突出显示灰色的不同区域（如图d所示）和黄色球体中的突变。突变被标记。红色标记的突变是与其他挥发性有机化合物共有的突变。d、 奥密克戎峰b区的俯视图，以黄色突出显示特定突变。[来自倪东春（Dongchun Ni）等人，bioRXiv（生物学评论）]。最近在Dubochet成像中心安装了电子显微镜，这是EPFL与洛桑大学（University of Lausanne）之间的合资项目。有了这些，研究人员能够在近原子尺度上观察奥密克戎变体的棘突蛋白的结构。DCI已经制作了一张分辨率为2Å的原始病毒棘突蛋白图像——他们声称这是迄今为止获得的最高分辨率——使科学家能够查看单个原子。EPFL和洛桑大学（University of Lausanne）的亨宁.蒂拉伯格（Henning Stahlberg）教授说：“我们现在可以准确地看到突变是什么使得奥密克戎变异体能完全抵制阿斯利康疫苗和辉瑞制药的一部分。”“在首次发现这种变异不到一个月后，确定奥密克戎的棘突蛋白的结构就像是在首次用望远镜观测后的几周内登上一颗行星，”特罗诺补充道。“这项技术的潜力非常惊人。”研究人员希望他们的cryo-EM数据将帮助科学家了解突变的棘突蛋白如何与ACE2细胞受体结合，从而为新疗法打开大门。Read the bioRXiv preprint here. About the authors： 丽贝卡.普尔博士（Dr Rebecca Pool）丽贝卡是《显微镜与分析》的新闻编辑，也是一名自由科学记者，拥有材料科学博士学位。她曾在《威利分析科学》、《自然光子学》、《SPIE光子学聚焦》、《物理世界》、《科幻一代》、《工程与技术杂志》、《世界钢铁》等杂志上发表文章。供稿：符斌

近日，融智生物合作单位北京大学深圳医院检验科纪玲主任团队使用QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱平台（MALDI-TOF MS），第三次发现了新型血红蛋白变体——Hb南昌，文章目前已经发表在Hemoglobin期刊上（https://doi.org/10.1080/03630269.2021.1956946）。血红蛋白（Hb）变体是最常见的遗传性单基因红细胞疾病，其特征是一条或多条珠蛋白链的结构异常。包括地中海贫血和Hb变体在内，目前已经被报道的血红蛋白病有1800多种。阳离子交换高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）是定量检测各种Hb变体的一线筛查方法。基质辅助激光解吸电离（MALDI）技术的发展使得使用质谱（MS）检测完整的珠蛋白链成为可能，并且MALDI-TOF MS可以通过质量差异来区分变异珠蛋白链与正常珠蛋白链。一名33岁来自江西省南昌市的女性来院进行年度体检。她的空腹血糖浓度为5.0 mmol/L，HbA1c最初通过毛细管电泳法得到的结果为5.4%（36 mmol/mol，参考区间4.0–6.0%），电泳图无异常。当时，研究团队正在评估MALDI-TOF MS系统（QuanTOF，融智生物）检测HbA1c的性能，先证者的全血作为评估样本之一。在样品的质谱图中发现了一种变异的珠蛋白链（15156 Da）出现在正常α链的右侧，与正常α链的质量差为30Da[图1（B）]。QuanTOF通过传统的β链糖基化得到的HbA1c值为5.1%（31.0 mmol/mol），通过α链糖基化得到的HbA1c值为6.8%（51 mmol/mol）。图1. 对照组和Hb南昌的MALDI-TOF质谱图。（A）对照品的质谱图显示α链（15126 Da）和β链（15868 Da），以及相应的糖基化α链（15289 Da）和糖基化β链（16031 Da）。（B）箭头表示变异α链峰值（15156 Da）。研究团队又通过毛细管电泳和阳离子交换高效液相色谱法分析Hb[图2], 未发现Hb变异的证据，以及正常的HbA2和Hb F。图2. 血红蛋白分析。(A）毛细管电泳，CE。(B) 阳离子交换高效液相色谱，HPLC。Sanger测序显示HBA2基因的核苷酸131（正向引物）或核苷酸367（反向引物）发生杂合突变（HBA2:c.46Ga）[图3]，导致甘氨酸（分子量：75 Da）在密码子15处替换为丝氨酸（分子量：105 Da），证实了QuanTOF的检测结果。据了解，这种突变尚未被报道，所以研究团队以先证者的出生地命名它为Hb南昌。图3. Sanger测序。(A) 正向引物. (B) 反向引物. 箭头表示杂合突变Hb南昌（HBA2:c.46GA）。许多Hb变体以前是通过测量Hb A1c发现的。理论上，容易检测到的变体是电荷差替换，那些无法检测的变体会导致Hb A峰和变异峰重叠，干扰检测结果。MALDI-TOF MS是一种非常有潜力的血红蛋白定量检测方法，它能通过野生珠蛋白链和变异珠蛋白链之间足够的质量差异轻松地检测到色谱或电泳沉默的Hb变体；并且允许通过α或β链糖基化来检测Hb A1c，以克服Hb变体对Hb A1c定量的干扰（在本研究案例中，QuanTOF给出了基于α链糖基化的虚假升高的Hb A1c值，和基于β链糖基化的准确Hb A1c值，这一点也证实了先前的发现）。参考文献：A Novel α-Globin Chain Variant, Hb Nanchang [HBA2: c.46GA, Codon 15 (GGTAGT) (Gly→Ser)], Detected by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，https://doi.org/10.1080/03630269.2021.1956946。

style type=" text/css" .TRS_Editor P{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor DIV{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TD{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TH{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor SPAN{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor FONT{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor UL{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor LI{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor A{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt } /style p 　　近日，中国科学院合肥物质科学研究院核能安全技术研究所· FDS凤麟核能团队，在高通量紧凑型聚变体积中子源研究方面取得新进展，相关成果以 em High-field neutral beam injection for improving the Q of a gas dynamic trap-based fusion neutron source /em 为题，发表在 em Nuclear Fusion /em 上。 /p p 　　对聚变材料/部件在高能高通量聚变中子环境下的服役性能进行测试和验证，是未来商用聚变堆投入使用的必要条件；发展高通量的聚变中子源因此成为学界研究焦点。其中基于气动磁镜（Gas Dynamic Trap）的聚变中子源，因其具有物理与工程技术难度小、中子通量高、辐照体积大、结构紧凑、成本较低等优势，获得国际同行广泛关注。 /p p 　　核能安全所近年来发展并完成了基于气动磁镜的高通量紧凑型体积聚变中子源概念设计，创新性地提出了强磁场位置注入中性束的设计方案，提高了在真空室两端聚集的快离子密度和相应的聚变功率密度。理论结果表明，此创新方案设计能够使基于气动磁镜的聚变中子源能量增益在现有设计的物理和工程基础之上提高2~3倍。Nuclear Fusion审稿人评价该研究“对气动磁镜的改进优化设计能够有效提升其作为中子源的性能”。 /p p 　　此项研究成果为高通量紧凑型聚变体积中子源提供了有竞争力的方案，为有效解决聚变核科学与核技术问题提供了新途径。此外，在发展聚变驱动乏燃料焚烧堆等方面具有重要应用前景。研究工作得到了国际原子能机构协调合作研究项目、国家自然科学基金重大研究计划和青年科学基金项目的资助。 /p p br/ /p p style=" text-align:center " img alt=" " oldsrc=" W020171211287540552692.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/uepic/f569afcc-745e-442a-9d48-9938bfb642e3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 气动磁镜强磁场位置注入中性束示意图 /p

严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的演变突出了对能够区分新出现的病毒变体的多功能诊断分析的需求。然而，目前，允许我们快速解决 SARS-CoV-2 突变以识别其变体的工具并不容易获得。用于 SARS-CoV-2 变体的可扩展筛选工具理想情况下应 (i) 允许检测病毒 RNA 中的单核苷酸突变，(ii) 提供较短的样本到结果的时间，以及 (iii) 提供多路复用能力以识别多种变体。鉴于此，清华大学李景虹院士联合四川大学李为民教授、邓锐杰副教授等人报告了一种廉价（每次测试约 0.30 美元（约2块钱人民币））检测的开发和性能基准测试，用于快速（30 min 内的样本到答案时间）比色检测SARS-CoV-2 变体。研究人员将其整合到可折叠纸条中的分析利用了核酸链置换反应、与单碱基对错配相关的热力学能量损失和金属离子控制的尿素酶切来放大对病毒RNA的识别，以便通过智能手机比色读出pH值的变化。对于50份咽拭子样本，该测定同时检测到 SARS-CoV-2 的存在以及SARS-CoV-2变体α、β和γ的特异性突变，与实时定量聚合酶链反应和RNA测序完全一致。用于检测病毒及其变体的可定制且廉价的纸质化验可能有助于病毒监测。研究人员还开发了一个智能手机应用程序（应用程序）来指导诊断，并可视化和记录临床和冷链食品样品的测试结果。参考文献：Zhang, T., Deng, R., Wang, Y. et al. A paper-based assay for the colorimetric detection of SARS-CoV-2 variants at single-nucleotide resolution. Nat. Biomed. Eng (2022).https://doi.org/10.1038/s41551-022-00907-0

新型冠状病毒（COVID-19）大流行开始后，Research Path LLC和罗格斯大学的研究人员迅速投入资源开发准确可靠的COVID-19检测方法。随着变异株的出现，他们开发了一种基于分子信标的PCR检测方法，该方法不仅能诊断COVID-19感染，而且还可以识别导致感染的特定变异。他们的研究发表于《The Journal of Molecular Diagnostics.》，题为：“Multiplex PCR Assays for Identifying all Major Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Variants”。目前，他们的方法是公开的，因此能够被任何可以进行PCR测试的机构复制。与其他病毒感染不同，SARS-CoV-2不是具有一组可预测临床特征的单一感染，而是一种不断进化的疾病。不同的毒株引发的感染有其特有的临床特征，这会影响检测、症状表现，甚至是哪些器官系统会受到病毒的攻击。因此，确定毒株的类型可以获得重要的信息，如潜伏期、传染期、传播力、致病性，甚至主要症状的变化。有关毒株类型的信息一般由国际社会或几个进行基因测序的国家报告。识别SARS-CoV-2毒株的深度测序是十分准确的，并且可以识别样本中出现的每一种突变，但成本高、速度慢，还需要专门的设备。然而，了解毒株的类型对公共卫生专业人员、决策者和个人至关重要。了解到当地社区正在出现一种具有高度传染性和危险性的毒株，可以让决策者及时采取措施来控制传播；还可以为医疗系统作预警，给急诊科和重症监护室护理争取更多的准备时间。此外，知道患者感染的毒株类型，还可以帮助确定哪种治疗方法最有效。图源网络罗格斯大学利用其自主设计的实时PCR探针，设计了Rutgers-RP RT-PCR检测法，以检测SARS-CoV-2的突变。他们率先使用分子信标来识别特定的基因突变。分子信标是发夹状的分子，可以设计为选择性地与特定的突变序列结合。九个突变被选中进行测试，每个突变的信标都有不同颜色的着色。每一个原始变体——Alpha, Beta、Gamma、Delta、 和Omicron——都有这些突变的独特组合。当信标与目标分子结合时，它独特的颜色就可以被检测到。对每个信标进行单独测试，以确认其对指定突变的特异性。然后，将这些信标组合成一个多重检测，并通过RT-PCR对26份SARS-CoV2阳性患者样本进行检测，这些样本之前已通过深度测序进行了检测和鉴定。两个样本被鉴定为Alpha变异体，两个为Epsilon变异体，八个为Delta变异体。多重检测与深度测序结果完全一致，灵敏度和特异性为100%。研究人员说，这种测试的适应性也很强。当Omicron出现时，研究人员在不到一个月的时间里设计出了一个信标，以识别Omicron特有的一种突变。研究人员在此前检测过的33例额外患者样本中，发现了17例Omicron变异，结果100%一致。“我们开发的用于追踪和识别新变体的工具，将对这场大流行以及未来可能出现的任何未预见到的病毒或病原体非常有用。”该研究的主要作者Ryan J. Dikdan说。新冠疫情还没有结束，我们迫切需要一个全球监测系统，以监测新出现的可能更具传染性或致命性的毒株。Rutgers-RP RT-PCR变异检测现在可以在世界各地的实验室广泛应用，以监测所有已知的令人担忧的变异。对于每一个新出现的重要变异，将使用新的探针组以更新检测。

中国科技网讯 以前，电力用户设备在传统例行检测时必须停电。记者近日从北京中联创业电力工程有限公司(中联电力)获悉，为解决这一弊端，公司大胆引进国外先进带电检测设备，可避免因停电给用户造成的不便，还可以全面系统的检测电力设备在运行当中存在的实际问题。 　　据了解，欧美发达国家对电力设备的检测，已经用一种全新的状态监测技术替代原 来的停电打压试验技术。状态监测包含在线监控和带电检测两种技术，能更准确的让用户了解电力设备的运行状态，发现设备隐患及隐患的发展趋势。 　　其中，带电检测是指在电力设备通电运行状态下进行检测的一种高新技术，是利用传感技术和微电子技术对运行中的设备进行实时监测，获取设备运行状态的各种物理量数据，并对其进行分析处理，预测运行状况，根据实时数据得出检测报告。 　　广大10KV用户的电力设备自有，在线监控设备安装成本高，并需专业人员值守，相比之下，带电检测技术则更为灵活、适宜。用户可客观的检测出电力设备实际运行时的实时状态，杜绝非计划性停电。

p 　　美国国家标准技术研究院(NIST)的研究小组最近宣布解决了一个棘手的科学难题，即如何控制单个带电分子或分子离子的量子特性。关键是：利用拟用于未来量子计算机运算的类似“量子逻辑”操作。新技术像激光冷却和其它技术控制原子一样有效控制分子，具有广泛的应用潜力。原子的量子控制将彻底改变原子物理学，引领诸如原子钟一样的应用，但激光冷却与控制分子是非常有挑战性，因为分子比原子复杂得多。新技术仍然使用激光，但只能轻微探测到分子，其量子状态只能间接检测到。这种类型的分子离子控制，即几个带电原子结合在一起，可以导致更加复杂的量子信息处理架构，放大了基本物理研究信号，例如测量电子形状的“圆度”，并且增加了化学反应的控制。 /p p 　　NIST通过将信息转移到原子离子的方法来找到分子离子的量子态，而量子态可以用激光冷却和控制。借鉴NIST量子逻辑时钟的想法，研究人员试图操纵分子离子。NIST研究人员利用离子阱和正在进行量子逻辑时钟实验的激光，在室温下高真空室中，捕获了两个离子相距几百万分之一的钙离子。氢气泄漏到真空室中，直到一个钙离子反应形成由一个钙离子和一个氢原子结合在一起的氢化钙分子离子。 /p p 　　研究人员使用激光来冷却原子离子，从而将分子冷却到最低能量状态。在室温下，分子离子也处于其最低的电子和振动状态，但保持在旋转状态的混合物中。研究人员应用红外激光脉冲调制以防止离子的电子或振动状态发生变化，以驱动分子在超过100种可能旋转状态中的两种之间的独特转化，再用一个额外的激光脉冲来转换共享运动的变化，改变原子离子的内部能量水平。之后，原子离子开始散射光，表明分子离子的状态已经改变，并且处于期望的目标状态。随后，研究人员可以将激光诱导跃迁期间发射和吸收的光角传递到例如定向分子在所需方向的旋转状态。 /p p 　　该研究发表于5月11日的《自然》杂志上，由NIST博德(Boulder)小组执行。该小组曾于1978年进行过第一次原子激光冷却实验。 /p p style=" text-align: right " 转自：中国科技部 /p

众所周知，定期对电力设备进行检修，是保证电力系统安全运行的重要措施，为了人们的日常生活工作，带电作业是保证正常供电的有效措施。带电作业危险重重，每一次的带电作业，对电力人来说都是一次挑战，幸好FLIR红外窗口能够在电力人和带电设备之间添加了一层屏障，使您免遭弧闪事故。今天小菲就来给大家说一个美国瓶装水公司实施FLIR大格式红外窗口安全电气检测的案例！适合大型设备电气检测的FLIR红外窗口北美某瓶装水公司需要一个帮助其优化资产生命周期的解决方案。为此，该公司聘请了顾问，就加拿大安大略省工厂安装的红外窗口的位置、尺寸和类型提出建议。在初步现场调查后，顾问建议采用多种尺寸的FLIR IRW xPC系列来完成该项目。FLIR IRW xPC系列是NEMA 4/IP65等级的红外窗口，非常适合室内应用，其可用尺寸有6、12和24英寸。FLIR IRW-xPC/xPS大型红外检测窗口FLIR IRWxPC/xPS系列红外窗口采用大尺寸窗口设计，符合IP67/NEMA 6标准，具有防尘/防水保护以及防腐蚀功能。它有助于您更高效地检测，让不可及的组件极易检测，并且能通过预防意外停机节约成本。长方形聚合物窗口耐冲击，提供观察区，能监视通电电气设备内完全不受干扰的资产。IR Windows-xPC/xPS在恶劣环境中经久耐用且性能稳定，适用于大多数工业环境和船上应用。该公司制定了一项可靠的维护方案，包括3至5年的改进计划，其对整个电厂的安全非常重要。在此之前，该公司已经做了必要的研究，并决定使用透明聚合物红外窗口进行改装，这是一种更安全的符合标准的检查方法。该团队决定为主开关设备总线连接安装大尺寸红外聚合物窗口，主断路器连接和熔断器开关，通过FLIR红外窗口查找热点，帮助消除带电作业的危险。各种尺寸的红外窗口红外窗口让电气检测更快、更安全如果需要对通电设备进行更频繁的检查，可以通过改装的FLIR红外窗口进行常规检查。安装红外窗口后，封闭面板检查不再需要NFPA 70E中规定的高级别个人防护设备 (PPE)，从而减少了时间和维护成本。对于该团队来说，热成像并不是新工具，因为他们之前用传统的圆形氟化钙窗户改装了一些设备。然而，已确定具有多种大格式尺寸的透明聚合物红外窗口将提供视觉和热检查，需要安装的单元更少。基于聚合物的FLIR红外窗口不受环境和机械应力的影响，这些应力通常会影响安装在配电设备上的红外窗口。通过安装基于聚合物的窗口，该公司可以帮助确保通过红外窗口收集到的温度数据在安装的整个过程中准确可靠。FLIR工业级红外窗口满足UL、CSA的强制性冲击和负载测试要求、IEEE 和IEC。安装红外窗口后，无需拆除面板或穿戴更高级别的PPE。现在可以更频繁地对电气设备进行检查，这些电气设备以前因电弧闪光入射能量高而被视为“不可检查”！装瓶公司在主断路器总线柜中安装了24英寸大幅面红外窗口FLIR红外窗口安装流程安装过程进展顺利，包括：★ 预先规划，以确定设备并获得关闭批准；★ 由两名电工对设备断电，以确保设备安全隔离、锁定和标记；★ 断电后，两名电工拆除了相关设备的所有盖子；★ 使用提供的钻孔/切割模板在适当位置安装红外窗口，并更换盖子；★ 电工穿戴了适当的PPE，设备已被拆除重新通电；★ 与操作一起，电工确认设备在正常负载水平下运行，并留出足够的时间使设备达到热稳定状态；★ 工作人员使用热成像仪对设备进行红外检查，以确保基线温度数据；★ 工作人员通过记录发现的问题来完成检查。进线连接和主断路器柜也装有24英寸的红外窗口FLIR红外窗口让客户满意并得到普及这家瓶装水公司已经意识到，在基于状态的监控程序中实施透明聚合物红外窗口，可以节省大量时间和金钱。FLIR红外窗口的使用允许更方便、更频繁的检查，从而能够在潜在问题转变为意外停机之前发现并修复潜在问题。通过这种方式，瓶装水工厂的关键电气基础设施的平均故障间隔时间（MTBF）将增加。大多数拥有大型配电系统的大型设施发现，其保险供应商需要每年对其电气系统进行红外检查，这项要求是NFPA 70B中的规定。但改装红外窗口使设施能够在更短时间内以更安全的方式执行这些检查。根据一批试点现场的结果，该瓶装水公司目前已在北美地区的29个生产基地实施FLIR红外窗口解决方案。FLIR红外热像仪搭配FLIR IRW-xPS红外窗口，能够让电气检测的速度更快、效率更高，因而更加节约成本。不仅如此，改进的工作流程还可提升相关企业的检测频次，确保变压器运行的可靠性，这对组合可谓是电气检测公司的新选择哦~

p 　　近日，科技部高新司在厦门组织召开了“十二五”国家863计划“基于国产宽禁带电力电子器件的光伏逆变器研制及示范应用”项目验收会。 /p p 　　项目以实现碳化硅和氮化镓光伏逆变器的示范应用为最终目标，开发了低缺陷SiC外延生长技术、攻克了氮化镓二极管及增强型氮化镓三极管设计技术、碳化硅二级管及MOSFET关键工艺和量产技术、高压氮化镓和碳化硅器件高频驱动技术、基于氮化镓及碳化硅电力电子器件的新型光伏逆变器拓扑设计技术等关键技术方法。完成了基于GaN和SiC器件的逆变器示范应用，形成对基于宽禁带电力电子器件新型高效光伏逆变器及并网系统的整体展示。 /p p 　　项目的实施，形成国内GaN、SiC大功率光伏逆变器研发及生产产业链，有力地支撑了我国宽禁带电力电子器件、装置及相关行业的技术进步。专家组一致认为，该项目完成了立项通知规定的研究内容及主要考核指标，同意通过验收。 /p

仪器信息网讯 秉承“国产科学仪器腾飞行动”宗旨，仪器信息网于 2018 年启动“国产科学仪器腾飞行动”之“创新 100”项目，通过筛选一批具备自主创新能力的中小仪器厂商，在企业发展的关键时期“帮一把”。五年以来，天时地利人和至，中国电镜产业迎来发展窗口期，国内电镜产业链企业们也纷纷抓住历史机遇，实现生机蓬勃的发展之势。2023 年迎来国产电镜的“全新时代”。此背景下，“创新 100”项目组在2023年底走进13家中国电镜产业链代表性企业，邀请电镜专家联合走访，探寻中国电镜产业发展进展，为发展新阶段赋能，也为 2024 年即将在苏州举办的“第三届中国电镜产业化发展论坛”的内容筹备作前期调研。走访第10站，由浙江大学农生环测试中心副主任洪健研究员 ，仪器信息网材料物性组执行主编杨厉哲、“创新 100”项目负责人韦东裕、营销服务中心经理韩永风、牛群山等组成的走访项目组走进屹东光学技术(苏州)有限公司（以下简称“屹东光学”），屹东光学总经理尉东光、产品市场部总监刘宁等接待了走访一行人员。——企业发展进展屹东光学成立于2022年，由中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（以下简称“苏州医工所”）孵化，专注带电粒子光学技术设备研发和制造。 2019年，一群心怀梦想的电镜专家陆续加入苏州医工所电镜项目组，开启了场发射扫描电镜的研发之旅；2021年底，团队实现场发射扫描电镜样机出图，随后获天使基金支持，成立屹东光学技术(苏州)有限公司，开展电子显微镜的研发、生产与市场推广；2023年，屹东光学发布第一代场发射扫描电镜YF-1801，荣获“2023年度美国工业设计师学会国际优秀设计奖（International Design Excellence Award）”，并于10月25日在仪器信息网召开线上发布会,迅速引发市场关注；同年获批科技部2023年国家重点研发计划“基础科研条件与重大科学仪器设备研发”重点专项之“场发射扫描电子显微镜”项目，获中央财政支持1500万元。当前，屹东光学正在开展超高分辨场发射扫描电镜以及其它带电粒子显微技术设备的研发工作。——产品技术与布局屹东光学YF1801扫描电子显微镜采用热场发射电子枪技术，电子光学镜筒中融入了先进的全镜筒加速技术，确保了低加速电压下电子束优异的成像性能，适用于各类材料（特别是不导电、不耐电子辐照样品）的高分辨成像。YF1801配备有镜筒内和样品室内两款二次电子探测器、背散射电子探测器、扫描透射电子探测器等，能高效收集从样品中激发出的多种电子信号进行成像，可最大程度揭示样品的微观形貌和结构信息。场发射扫描电子显微镜YF-1801屹东光学自主开发的带电粒子光学系统设计软件可实现：三阶像差计算分析、极限分辨率计算、容差计算分析、束流计算分析、光阑位置与尺寸优化等能力，与国际通用的商用软件相比，在同一套电子光学系统上的计算结果，误差低于1.5%。走访项目组参观了屹东光学的研发实验室，屹东人员现场演示了场发射扫描电镜，射频等离子清洗机、卷带表面亲水化处理仪、多功能样品清洗机等产品的工作流程。实验室参观——国产电镜发展任重道远国产电镜的发展起步并不算晚，但一直难以成气候。尉东光表示，像电子显微镜这种大型复杂的技术装备需要长时间的稳定积累，才能有所突破；而国内企业往往更注重短期收益，急于求成，缺乏对技术创新的长期投入和积累。目前，国产电镜技术水平与国外先进技术有代差，追赶之路任重道远。我国电镜行业存在着十分严重的人才短缺和供应链短板，面对强大的国外仪器巨头，国内同行唯有打破门户壁垒、抱团取暖、共同进步，才有可能在可预见的未来，在市场上获得成功。合影留念

目前光刻技术存在被美国“卡脖子”，不只是工业用的，包括科研用的电子束曝光机也只能购买到落后国外两三代的产品。而电子束曝光是由高能量电子束和光刻胶相互作用，使胶由长（短）链变成断（长）链，实现曝光，相比于光刻机具有更高的分辨率，主要用于制作光刻掩模版、硅片直写和纳米科学技术研究，是半导体微电子制造及纳米科技的关键设备、基础设备。3D纳米结构高速直写机的技术起源光刻技术严重制约着我国半导体工业及科研领域的发展。近年来，一种基于热扫描探针光刻技术的产品3D纳米结构高速直写机有望替代电子束曝光机。3D纳米结构高速直写机（NanoFrazor）的主要技术起源于上世纪九十年代，由诺贝尔奖获得者Binnig教授在IBM Zurich实验室所主导的千足虫计划。该计划原本的目标是用类似原子力显微镜探针的热探针达到1Gb/s的高速数据存储读写。图1为千足虫计划中，制备的热探针的扫描电子显微图像。[1]图1. 千足虫计划所制备的热探针的扫描电子显微图像。[1]2010年后，研究团队逐渐把研究热点从数据的高速读写逐渐转向了扫描热探针用于高精度灰度光刻技术（t-SPL）。随着t-SPL技术的逐渐成熟，2014年推出了首款商业化高精度3D纳米结构高速直写机，NanoFrazor Explore 图2b)。为满足市场的不同需求，2017年推出台式系统NanoFrazor Scholar，图2a)。[2]图2 不同型号的NanoFrazor。a)为台式NanoFrazor Scholar系统，b)为旗舰型NanoFrazor Explore。[2]随后，于2019年无掩模激光直写系统被成功地整合到了旗舰型NanoFrazor Explore系统中，实现了在NanoFrazor中从微米加工到纳米加工的无缝衔接。有望替代电子束光刻技术目前NanoFrazor的技术主要用于科研院所的高端纳米器件制备，已有集成激光直写的系统以加快大尺寸大面积微纳米结构的刻写。由10根探针组成的探针阵列已经在Beta客户端测试中。在和IBM苏黎世的合作项目中已经开始了用于工业批量生产的全自动系统的原型设计。。NanoFrazor的优势体现在以下几个方面。首先，NanoFrazor是首款实现3D纳米结构直写的光刻设备，其垂直分辨率可高达1nm。因此，此设备不仅可以制备在2D方向上高分辨率复杂图案的无掩模刻写，还可以制备3D复杂纳米结构，例如复杂的光学傅里叶表面结构，图3所示。[3]图3，用NanoFrazor制备的光学傅里叶表面结构。[3]第二，由于NanoFrazor的光刻原理是通过热探针直接在热敏胶上进行刻写，与热探针接触的胶体部分被直接分解，与电子束曝光（EBL）技术相比所制备的图案不会被临近场效应所影响。因此使用t-SPL技术制备的器件，光刻胶可以被去除的非常干净，从而改善半导体材料和金属电极的接触情况，提高电子器件的性能。图4为NanoFrazor工艺中所用的热敏胶和EBL工艺中所用的光敏胶在去胶工艺后的光刻胶表面残留情况。[4]图4 采用t-SPL技术和EBL技术去胶后光刻胶表面残留对比，图中比例尺为500nm。[4]第三， 由于NanoFrazor所采用的的t-SPL光刻技术，避免了电子注入对材料的损伤，特别适合电子敏感类材料相关器件的制备。与此同时NanoFrazor针尖虽然温度很高，但是和样品的接触面积只有纳米尺度，所以样品表面不会受到高温影响，样品表面温度升高小于50度。第四，传统光刻技术中，需要通过显影才能观察到光刻图案。而使用t-SPL技术进行光刻时，热敏胶直接被热探针分解，然后再通过同步成像系统可以立即得到刻蚀图案的形貌。同时使用闭环控制刻写深度，保证纵向1nm的刻写精度。在实际使用中，可以对样品表面已有的微结构成像，实时设计套刻图案进行刻写，非常适合科学科研和新品研发。此外，相比于传统的电子束刻蚀等技术产品，NanoFrazor可以在常温常压环境中使用，维护简单费用低。其主要耗材为热探针，耗材费用将低于目前通用的电子束刻蚀系统的耗材维护费用。科研领域的得力干将目前情况来看，国内和国外的主要用户都集中在科研院所。这一特点在推广尚属早期的国内市场尤为突出。QD中国正在尽全力把NanoFrazor和相关技术介绍给中国区的用户。NanoFrazor在国内的高精度3D光刻领域暂无竞争对手，在2D光刻领域与EBL存在着某些重叠。NanoFrazor产于中立国瑞士，受国际政治影响较小。热敏胶由德国AllResist公司生产销售，热探针目前仍然由IBM苏黎世供应，计划明年由德国IMS公司生产提供，不存在卡脖子问题。凭借强大的性能，NanoFrazor帮助科研人员在多领域中取得了一系列优秀成果。在光学方面，苏黎世联邦理工的Nolan Lassaline等人使用NanoFrazor制备了周期性和非周期性的光学表面结构。[3] 制备的多元线性光栅允许利用傅里叶光谱工程精确调控光信号。实验表面，使用NanoFrazor制备的任意3D表面的方法，将为光学设备（生物传感器，激光器，超表面和调制器）以及光子学的新兴区域（拓扑结构，转换光学器件和半导体谷电子学）带来新的机遇。该论文已于2020年经发表于Nature。在电子学方面，纽约城市大学的Xiaorui Zheng等人利用NanoFrazor制备了基于MoS2的场效应管。[4] 他们的研究结果表明，使用t-SPL技术制备的器件很好地解决了困扰EBL工艺的非欧姆接触和高肖脱基势垒等问题。器件的综合电子学性能也远优于传统工艺所制备的器件。该论文于2019年发表于Nature Electronics。在3D微纳加工方面，IBM使用NanoFrazor制备的纳米微流控系统控制纳米颗粒的输运方向，并成功分离不同大小尺寸的纳米颗粒，直径相差1nm的纳米颗粒可以用此方法进行分离[6]。该方法可以用于分离样品中的病毒等纳米物体。该论文于2018年发表于Science。IBM苏黎世研究院的Pires等人利用NanoFrazor的3D加工工艺，成功地制备出了高度仅为25nm的瑞士最高峰马特宏峰，如图5所示。[5] 后经吉尼斯世界纪录认证为世界上最小的马特宏峰。优于新颖的加工工艺和优异的3D加工精度，该论文与2010年发表于Science。图5 利用NanoFrazor制备的高度仅有25nm的世界最小马特宏峰。[5]在二维材料研究方面，NanoFrazor的热探针可以直接用于二维材料的掺杂[7]，切割[8]和应力调制[9]，开创了二维材料器件制备的新方法。论文于2020年发表于Nature Communications, Advanced Materials和NanoLetters等期刊上。目前国内用户对NanoFrazor在实验上的表现十分满意，已有国内用户在Advanced Materials等顶级期刊发表文章。关于QUANTUM量子科学仪器QUANTUM量子科学仪器贸易（北京）有限公司（以下简称QDC）是世界知名的科学仪器制造商——美国 Quantum Design International 公司（以下简称QD Inc.）在全世界设立的诸多子公司之一。QD Inc.生产的 SQUID 磁学测量系统 (MPMS) 和材料综合物理性质测量系统 (PPMS) 已经成为世界公认的顶级测量平台，广泛的分布于世界上几乎所有材料、物理、化学、纳米等研究领域尖端的实验室。同时QD Inc.还利用自己遍布世界的专业营销和售后队伍打造一个代理分销网络，与世界其他领先的设备制造商合作，为其提供遍布全球的专业产品销售和售后服务网络，2007 年QD Inc.并购了欧洲最大的仪器分销商德国 LOT 公司，使得QD Inc.全球代理分销和售后网络变得更加完整和强大。由于在华业务的不断发展，QD Inc.于2004年在中国注册成立了全资中国子公司QDC。经过10多年的耕耘发展，目前QDC拥有一支高素质的科学技术服务队伍，其中技术销售及售后技术支持团队全部由硕士学历以上人才组成（其中近70%为博士学历），多年来为中国的顶级实验室和科研机构提供专业科学仪器设备、技术支持、以及科技咨询服务。这些优秀的雇员都曾被派往美国总部及欧美日等尖端科研仪器厂家进行专业系统的培训，经过公司十多年的培养，成为具有丰富的科学实验仪器应用经验的专家。他们为中国的研究机构带来了最尖端的产品和最新的科技动态，为中国科研人员的研究工作提供了强有力的支持。QDC作为引进先进技术设备进入中国的桥梁，靠着过硬的尖端产品、坚实的技术实力、一流的服务质量赢得了中国广大科研客户的赞誉。Quantum Design中国子公司还积极致力于发展与中国本地科学家的合作，并将先进的实验室技术通过技术转移进行商业化。目前Quantum Design中国子公司正立足于公司本部产品，积极致力于材料物理、纳米表征和测量技术、生物及生命科学技术领域的新业务。Quantum Design中国子公司已逐渐成为中国与世界进行先进技术、先进仪器交流的一个重要桥头堡。引用文献1. Eleftheriou, E., et al., Millipede-a MEMS-based scanning-probe data-storage system. IEEE transactions on magnetics, 2003. 39(2): p. 938-945.2. https://heidelberg-instruments.com/product/nanofrazor-explore/ .3. Lassaline, N., et al., Optical fourier surfaces. Nature, 2020. 582(7813): p. 506-510.4. Zheng, X., et al., Patterning metal contacts on monolayer MoS 2 with vanishing Schottky barriers using thermal nanolithography. Nature Electronics, 2019. 2(1): p. 17-25.5. Pires, D., et al., Nanoscale three-dimensional patterning of molecular resists by scanning probes. Science, 2010. 328(5979): p. 732-735.6. Skaug et al., Nanofluidic rocking Brownian motors. Science, 2018. 359: p. 1505-1508.7. Zheng, X, et al., Spatial defects nanoengineering for bipolar conductivity in MoS2. Nature Communications, 2020. 11:3463.8. Liu, et al., Thermomechanical Nanocutting of 2D Materials. Advanced Materials.9. Liu, et al., Thermomechanical Nanostraining of Two-Dimensional Materials. NanoLetters.关注Quantum Design中国官方微信公众号，了解更多前沿资讯！（Quantum Design 中国 供稿）

“100家国产仪器厂商”专题：访上海三信仪表厂 　　为推动中国国产仪器的发展，了解中国国产仪器厂商的实际情况，促进自主创新，向广大用户介绍一批有特点的优秀国产仪器生产厂商，仪器信息网自2009年1月1日开始，启动了“百家国产仪器厂商访问计划”。日前，仪器信息网工作人员走访参观了上海三信仪表厂(以下简称“上海三信”)，上海三信仪表厂总经理吴旭明先生接待了仪器信息网到访人员。 　　上海三信仪表厂成立于1991年，是电化学分析仪器和电极的制造商，已通过ISO9001:2000认证，其产品具有CMC和CE证书。该厂位于中国上海漕河泾工业开发区内，生产场地面积约1200平方米。 　　吴旭明先生(左一)为仪器信息网工作人员介绍上海三信 　　上海三信的产品主要包括：pH计、电导率仪、溶解氧仪、离子浓度计、水质硬度仪以及各类pH电极、ORP电极、电导电极和离子电极。该厂还可根据客户特殊要求进行产品设计和OEM加工。 　　紧跟国际市场趋势 主攻第四代电化学仪表 　　吴旭明先生首先向我们介绍了第四代电化学仪表的特征，“第四代电化学仪表的主要特征是按仪表系列进行规划，从仪器的研发、生产、工艺和质量控制全过程都按整个仪表系列的最高级别(譬如pH0.001级、电导率0.5级)进行设计，对仪表的技术要求、外观设计、操作模式、主要器件、生产工艺等进行统一规划，突破以往单一产品先低后高、先简后繁的开发模式，一开始就从高精度、全系列的多参数仪表着手，再根据用户需求对仪器测量项目进行分类组合，形成单参数、双参数、多参数的不同产品型号，满足用户的不同需求。由于系列仪表遵循同样的设计规则和操作模式，这给生产管理和用户使用带来很大的便捷。”　 表1 第一代至第四代电化学仪表的特点(来源：上海三信仪表厂) 产品分类 仪表特征 第一代电化学仪表 采用静电计管作为输入级，用指针式电表显示测量值的电化仪表 第二代电化学仪表 采用运算放大器和A/D转换集成电路，用电位器调节进行校准的电化学仪表 第三代电化学仪表 在第二代基础上，将一些标准数据储存在芯片中，采用软件技术进行自动校准，具备一些智能化功能的电化学仪表。 第四代电化学仪表 以多参数( pH、mV、离子浓度、电导率和溶解氧 )为设计对象，采用相同的设计规则，硬件材料和操作模式，使用不同软件程序，配置不同的传感器和配件，组成单参数、双参数或多参数的系列电化学仪表。 　表2 国外第四代电化学仪表所占的市场份额(来源：上海三信仪表厂) 第二代 电化学仪表 第三代 电化学仪表 第四代 电化学仪表 2001~2002年 4.8% 77.4% 17.9% 2005~2006年 5.3% 65.3% 29.3% 2007~2008年 2.9% 44.3% 52.9% 2009~2010年 2.9% 33.3% 63.8%说明：以上数据根据美国Cole-Parmer仪器样本中pH计的资料统计　 　　“上海三信统计了2001~2010年美国Cole-Parmer仪器样本中的pH计产品，从统计数据我们可以很清楚地看出国际上电化学仪表的发展现状与趋势：目前，第二代电化学仪表已经很少，而第四代电化学仪表已占据三分之二的市场份额，是绝对的主力产品 但在国内，第二代电化学仪表还占50%以上，第四代电化学仪表所占比例不足15%。” 　　“近年来，上海三信发展很快，除生产电极外，还大力研发仪表制造技术，并直接瞄准国际上最先进的第四代电化学仪表进行攻关。目前，已开发成功MP500系列台式电化学仪表(有25个产品型号)、SX700系列防水型便携式电化学仪表(有11个产品型号)以及SX600系列防水型笔式测量仪(有4个产品型号)。上海三信第四代电化学仪表的生产比例达到70%，第三代电化学仪表占30%，第二代电化学仪表为0，和国际水平完全接轨。” 　上海三信生产的MP500系列台式电化学仪表 　　上海三信生产的SX700系列便携式电化学仪表 　　 上海三信的实验室 　　打造“流动实验室” 　　“相对于进口的第四代电化学仪表，上海三信产品的技术指标与它们的几乎一致，有些性能甚至更好，但我们产品的价格只是它们的10%-20%，具有很高的性价比。” 　　“除台式外，上海三信还提供笔式和便携式的电化学仪表，将仪器、电极、标准溶液及所有附件都装在一个轻便、小巧的手提箱里，配套齐全，打造‘流动实验室’，为用户带来更多实惠和便捷，在环保和水处理行业有广泛的应用前景。” 　　上海三信的电极车间 　　上海三信的仪表车间 　　“小型笔式电化学仪表的市场需求将扩大” 　　“我们的电化学仪表的核心技术(传感器技术、电子技术和软件技术)都是自主研发生产。上海三信研发第四代电化学仪表已三年，在国内处于领先水平，后期要加大新产品尤其是传感器相关技术的研发力度。” 　　“市场方面，上海三信的知名度还有待提高。这两年，我们参加了很多国内和国际的专业展会，今年上半年在中东迪拜，美国奥兰多和俄罗斯参加了三个知名的国际实验仪器展，反响很好。三信产品的市场正逐步扩大，上半年销售创历史新高。我们估计：随着社会的进步，小型笔式电化学仪表的市场需求将逐步扩大。” 　　上海三信的产品展示厅 　　上海三信仪表厂 　　附录：上海三信仪表厂网站 　　http://www.shsan-xin.com http://sanxin.instrument.com.cn

雅培收购美艾利尔改变IVD行业格局，深深牵动着业内人士的神经。继上篇为大家详细解构美艾利尔之后，本篇将继续为大家抽丝剥茧，对雅培解读一二，从而为了解本次收购的前因后果及把握对IVD未来的影响提供参考。　　一、收购前，IVD世界是这样滴：　　二、收购后，IVD世界就变成这样了：　　三、英雄莫问出处：曾经辉煌的雅培　　收购美艾利尔后，很多人为雅培欢呼，说雅培真牛逼，有种挑战罗氏!可很多人不知道，20年前的雅培更牛逼，彼时就已问鼎IVD世界霸主的位置!为大家刨出尘封很久的、非常珍贵的历史数据：　　而老大不是那么好当的，因为希望当老大的人很多。话说1997年前，IVD世界还几乎没有罗氏诊断什么事，区区几亿美金的销售额实在拿不出手，是典型的“小小罗”。虽然“小小罗”在IVD世界里默默无闻，在某个角落里自个儿玩他的PCR(1991年花3亿美金从Cetus Corporation拿过来的)。可他的老妈很厉害——罗氏制药，一个财大气粗的主，在1997年的5月24日，对“小小罗”说，你该干点正经事了，拿点小钱(不多，只有110亿美金!)去把Boehringer Mannheim GmbH给收了。Boehringer Mannheim，就是赫赫有名的宝灵曼诊断哪!在IVD世界稍微有点年资的人，都知道这个牛X的公司。以至于某印度公司，专门跑到德国曼海姆成立了Erba Mannheim GmbH，在全世界招摇撞骗自己是德国血统的公司，还学人家到处搞收购，涉及土耳其，捷克，美国和意大利等国家的公司，可即使这么折腾，还是没有弄出啥来。　　噢，不好意思，跑题了，还是言归正传说罗氏吧。　　罗氏收购宝灵曼时，宝灵曼自身的销售额约35亿美金，其中包含了诊断23.5亿美金，制药12亿美金，而那时罗氏整体销售额是120亿美金。收购宝灵曼后，罗氏立即成为IVD世界的老大，看看1998-2000年的数据对比就知道了。　　而此后，罗氏就不再是原来那个“小小罗”了，就像打了鸡血似的，一路狂奔，甩开雅培几条街，成为无可争议的“罗老大”!看看最近五年(2011-2015)的数据，我们不禁唏嘘：差距咋就这么大咧!　　四、往事不要再提：差点被卖掉的雅培　　时间来到2006年，波澜不惊的IVD世界来了一位强势入侵者：西门子医疗。他们的梦想是要打通体内诊断(In-Vivo Diagnostics)和体外诊断(In-Vitro Diagnostics)，提供更好的医疗服务。他们首先花18.6亿美金拿下了DPC：一家做免疫的美国公司，2005年的销售额是4.81亿美金。接着又拿下拜耳诊断和德灵诊断，迅速成为IVD世界的老二，地位直逼罗老大。　　不过，这些标志性的事件并没有让罗老大烦恼，倒引起了西门大叔的竞争对手GE医疗的担忧：西门大叔的动作会破坏医疗器械圈的生态平衡。为此，哥决定以牙还牙，誓言也要收购IVD公司。哥在IVD领域一直有布局，且增长不错，不过他的雄心始终没有被激发出来，直到西门大叔兵临城下。　　哥环顾四周，发现雅培诊断是个好标的，于是向雅培递上橄榄枝，说：嫁给我吧!那时候雅培诊断业务利润率下降，新产品上市推迟，正想甩掉这个包袱，于是一拍即合：我愿意!2007年1月，哥的掌门人，姐夫(Jeff Immelt)宣布将以81.3亿美金收购雅培诊断除了分子的业务(27亿美金销售额)，业界并不看好，认为哥最少多付了20亿美金。　　一门亲事眼看就要达成，说时迟那时快，FDA又跳出来活生生把两人给分开：2007年3月，雅培在德州的工厂收到FDA的警告信，要其限期整改!那时哥的某外科产品也遇到了法规问题，看到雅培也有问题，立即借机打了退堂鼓，说拜拜了。据说当时雅培很多员工都已经做好积极拥抱哥的心理准备了，不想还是要“不辞长做雅培人”。　　五、痛定思痛：奋起直追的雅培　　既然自然增长乏力，卖也卖不掉，只好“华山一条路”：硬着头皮上呗。沉寂了几年之后，在2016年的春节，终于迎来了收购美艾利尔的契机，再次回到罗老大有力竞争者的位置。　　纵观IVD世界，雅培是化学发光和血液筛查的领导者，而在其他领域如血球、生化、凝血、微生物、分子诊断和测序以及POCT等，都落后于人。在这些子领域中，传统分支如血球、生化、血凝和微生物增长有限，快速增长的市场只有分子诊断、测序和POCT。而罗氏在分子诊断和测序方面具有先发优势，短时间赶超几乎不可能，唯有POCT领域值得一搏。 在这个历史节点上，正碰上美艾利尔自身发展的危机时刻，顺势拿下确实是再好不过了。　　美艾利尔的优势是通过强力并购，在POCT领域形成了超大体量，在市场份额上遥遥领先，一骑绝尘 劣势则是运营和整合不力，持续亏损。而雅培的弱势，是研发乏力，产品组合与迭代疲软 优势是品牌和运营能力超强。所以，这一单买卖，绝对是优势互补之举。　　而且我们知道，雅培和美艾利尔之间是非常熟悉的对手和合作伙伴，也就是说他们早就你中有我，我中有你了。上世纪90年代，雅培从美艾利尔的前身收购了Medisense血糖业务 2005年美艾利尔又从雅培日本收购了传染病快速诊断业务。　　曹操说得好：老骥伏枥志在千里。雅培花费巨大代价收购美艾利尔重构体外诊断业务，是雅培雄心回归的体现。相信雅培不会就此罢手，IVD行业老二的位置也不会让她满足，后续应该还会有大动作继续冲击罗老大的地位。　　而一直默不作声的罗老大将如何回应此事呢?这也是值得业界关注的问题。　　回顾IVD世界过去20年的点点滴滴能够启迪未来。我们可以看到，基本上每隔十年左右，就会有大的变化发生：如1997年罗氏收购宝灵曼，2006-2007西门子收购DPC、拜耳和德灵，2016年雅培收购美艾利尔等。在大的变化发生之时，作为行业的从业者，我们要看清看楚，积极应对，才能和大象共舞，才能游刃有余。　　数据来源：罗氏、雅培、西门子、美艾利尔等公司年报

采用无机分析的最新创新，实现通用数据采集功能，能够节省客户时间，增加生产效率 新奥尔良 - 应用检测和分析解决方案的全球技术领先者珀金埃尔默生命与分析科学部，在 PITTCON® 2008 的 2555 号展台推出了 Optima™ 7000 系列电感耦合等离子体发射光谱仪 (ICP-OES)。为满足客户不断变化的要求，Optima ICP-OES 不断完善自身功能。Optima 7000 系列专为提供一流的无机分析而设计，适用于环境、地球化学、产品测试和生物柴油等各种行业。最新一代 Optima 系列具有“通用数据采集”模式，它可以记录每份样品的所有光谱数据。这能够使客户检索最初没有报告的数据而无需再次运行样品，这样就节省了时间，增加了生产效率。 　　“无机分析各领域的客户为我们提供了有价值的见解，我从中了解到如何改进已处于市场领先地位的 Optima 解决方案，帮助他们进一步提高实验室效率”，珀金埃尔默生命与分析科学部无机分析业务副总裁 Ian Shuttler 博士说道。“我们的客户需要“通用数据采集”功能帮助他们减少分析时间，因为此功能不需要再次运行样品。” 　　Optima 7000 为实验室人员提供了几项节省时间的增强功能。为了能够迅速查看分析结果，如果样品分析结果高于或低于用户指定的值，Optima 7000 会生成错误标记。要确保始终获得高水平的数据并且不需要其它资源，该仪器能够自动生成“质量控制”(QC) 图，该图可以显示在指定时期内的分析结果。 　　Shuttler 又补充道：采用了现代电子技术后仪器的生命周期得以延长，能够提供高于先前技术的投资回报率。 　　Optima 7000 系列是 Optima 2100、5100、5200 和 5300 的升级换代产品。

新一代电磁力天平基于模块化理念设计而成，它由许多独立的模块组合而成，用户可以根据使用的需要选择相应的模块。模块包含电磁力传感器模块，内校系统模块，运算控制模块，显示模块，RS232接口模块，USB接口模块等。脉宽调制电磁力平衡技术，提高了天平的抗干扰能力。 新一代电磁力天平 新一代电磁力密度天平 产品特点： 模块化电磁力平衡传感器 量程指示白光大屏幕液晶显示器 高灵敏度轻触按键 内藏式下称吊钩 玻璃门运输保护锁 RS232接口模块 USB接口模块 内置时钟 独立清零、去皮按键 ______________________________________________________________________________________ 联系方式：上海舜宇恒平科学仪器有限公司 地址：上海市虹漕路456号8号楼5-6楼 邮编：200233 电话：021-64956777 E-mail：sales@hengping.com http://www.hengping.com

在HPLC和UHPLC中，哪一种检测器效果最好？这个问题很难简单回答，因为没有任何一个检测器能够满足所有的检测需要。UV检测器虽然应用最为广泛，但无紫外吸收的化合物无法检测，其它的所谓通用检测器的实际性能也往往达不到多种应用综合后的复杂要求，从而导致检测空白。这就是检测器的局限性。 现在，由ESA采用最新突破性技术研制的电喷雾检测器（CAD）可谓是最佳的解决方案。CAD基于独特的创新检测原理，其问世使得目前需要在不同检测器（如示差折光（RI）、低波长紫外（UV）、蒸发光散射（ELSD）等）上完成的分析任务只需在一台通用型检测器上即可完成，大大提高了分析效率。 目前，CAD检测技术凭借比其它技术更高的灵敏度，更宽的动态监测范围以及更一致的检测结果，已被制药企业广泛接受，它的主要优势如下： ●　灵敏度高 ●　重复性好 ●　信号响应一致 ●　动态监测范围宽 ●　应用范围广 ●　操作直观简单 应用领域广 Corona电喷雾检测技术是UV和质谱检测器的强有力补充，可实际应用于任何非挥发或半挥发性化合物，包括： ●　药物化合物 ●　药物支架分子 ●　碳水化合物 ●　脂类 ●　类固醇 ●　多肽 ●　蛋白质 ●　聚合物 对任何一个检测器来说，被分析物能在很宽的范围内准确测定非常重要，但几乎每种检测器都有它的侧重，这可能会导致同一种分析物在不同的检测器上响应不一样，或流动相的改变对不同的检测器有不一样的影响。 Corona Ultra检测结果与分析物颗粒有关，信号电流与样品中分析物的质量成正比，因此无论何种化合物，只要进样质量相同响应都基本一致，所以Corona Ultra检测器能检测所有非挥发物，包括不含发色团的物质，不论被测物分子结构如何。 工作原理： 步骤一：Corona Ultra检测器将分析物转化成溶质颗粒。颗粒的大小随着被分析物的含量而增加。 步骤二：溶质颗粒与带正电荷的氮气颗粒相撞，电荷随之转移到颗粒上 – 溶质颗粒越大，带电越多。 步骤三：溶质颗粒把它们的电荷转移给收集器，通过高灵敏度的静电检测计测出溶质颗粒的带电量，由此产生的信号电流与溶质的含量成正比。 几款通用型检测器的性能对比 Corona Ultra & ELSD检测器的优势 非线性响应 Corona Ultra和ELSD在全量程范围内都是非线性响应，但Ultra的重现性更好且在小浓度范围内响应基本呈线性。 响应因子 进样量相同的一组难挥发化合物，Corona Ultra的响应值更为接近。 灵敏度与检出限 与ELSD相比，Corona Ultra的灵敏度更高、检出限更低，且检测与化学结构无关，相同进样质量的响应值相似，且全面兼容快速液相，是一款真正意义上的通用型检测器。 常用指标比较 梯度下重现性依然出众—反梯度方法 反梯度即在色谱柱后进入检测器前加入另一与分析溶剂时时组成相同但比例相反的溶剂，使进入检测器的溶剂浓度保持不变，从而使检测条件更加稳定，提高检测效果。 梯度试验中，有机溶剂在洗脱液中的比例不断变化，使得整个洗脱液的挥发性、粘度等一系列性质也不断变化，导致在形成气溶胶过程中的挥发程度不同，从而影响Corona Ultra 检测的结果，导致其与真实值有一定偏差。而反梯度在色谱柱后加入另一反比例的有机溶剂，使得进入Corona Ultra的洗脱液有机组成始终不变，因此保证了检测的真实、准确。 Corona Ultra 应用实例 Corona Ultra检测混合物中的降解产物 检测条件不同（如加热时间长短）可能导致被测物降解，而通过Corona Ultra可以准确分辨样品是否有降解，降解程度多少。另外，此功能也可用于检测许多代谢产物，并可根据已知化合物响应值对未知物进行半定量。 Corona Ultra同时检测阴阳离子 同一样品中的阴阳离子可以同时检测，大大提高了检测效率。 Corona Ultra检测牛奶中三聚氰胺 三聚氰胺可用多种方法测定，但Corona Ultra可快速定性，且前处理简单，方法稳定、可靠，值得推广。 Corona Ultra检测脂肪酸 脂肪酸一般很难用HPLC方法测定，而气相方法又因其高温下不稳定而需要先甲酯化，通过Corona Ultra检测不但简单方便，检测结果同样令人满意。 关于ESA—戴安旗下子公司 有着超过40年的历史，ESA为发展生命科学分析检测做出了大量贡献—已经和很多美国以及国外的合作伙伴的一起研制出了用于分析和诊断的设备。ESA有着全方位的服务，通过了ISO的认证并且在FDA注册了仪器的使用许可，拥有配套的试剂和可以立即投入使用的检测系统。2009年9月16号戴安正式收购ESA，秉承戴安公司技术领先、服务客户的理念，我们会一如既往的为您提供最先进的仪器和最优质的服务，无论是何种级别的需求，您都可以通过我们得到支持—包括从帮助您选择最佳的解决方案，到安装、培训和售后服务等一系列环节。 戴安中国有限公司市场部

三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机），该试验机引进西方先进技术，采用进口最新科学高能配件，历经多年结合试验机新产品市场需求研制而成，与国际研发接轨，独家研创，外形精美，操作方便，低耗高能，性能稳定可靠。能最大化的满足客户的试样试验需求，是各类金属、非金属材料试样试验的首选。广泛应用于各种塑胶、橡胶、金属、航空航天、船舰、建工、军工、商检、高等院校等相关行业的试验测试。三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）已批量生产，安全可靠。设备可在常温及高温状态下恒力保持不低于800小时。控制器具备2个BNC接口满足用户模拟数据采集，具有可编程数字输入通道1个，可编程数字输出通道2个。今天深圳三思纵横试验机小编就来给各位深入分析一下这款产品的优势吧！一、三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）1、产品型号：FBUTM5000、FBUTM6000、FBUTM4000；2、产品主要用途：可应用于各种金属材料及非金属材料的拉伸压缩、弯曲、剪切、剥离、撕裂等力学试验；广泛应用于航空航天、核能、军工、高等院校等领域；主要测试项目：断裂学测试、材料力学性能测试。二、三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）的设备优势1、试验机整体设计精致美观，减震地脚更平稳；2、国内首家独创新一代电子万能试验机横梁位移显示屏以及手控盒装置；3、独家首创测控系统机箱盒，独立于设备主机之外；4、动力系统引进高端科学技术，顶尖装配，低耗高能，环保安全。三、三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）的应用场景风暴系列新一代电子万能试验机的应用场景十分广泛，主要包括但不限于以下几个领域：1、航空航天：在航空航天领域，该试验机可用于各种金属材料及非金属材料的拉伸、压缩、弯曲、剪切、剥离、撕裂等力学试验，以测试材料的强度、韧性等性能指标，为航空航天器的设计和制造提供重要数据支持；2、核能：在核能领域，该试验机同样可用于测试核能设备所需材料的力学性能，确保设备在极端环境下的安全性和可靠性；3、军工：在军工领域，该试验机可用于测试各种武器装备材料的力学性能，为武器装备的研发和制造提供重要参考；4、高等院校：在高等院校的科研和教学工作中，该试验机可用于材料力学、机械工程等相关学科的实验教学和研究工作，为学生提供实践机会，促进科研创新。四、三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）的适用标准1、GB/T16491电子万能试验机；2、JB/T6146引伸计技术条件；3、JJG475电子式万能试验机计量检定规程；4、ASTM、DIN、JIS等相关标准。总的来说，三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）是一款具有高性能、高精度、广泛应用领域的先进试验设备。三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机（双立柱试验机）能够为科研和工业领域提供精准的试样试验数据，是材料测试和产品研发的得力助手。

三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机可应用于各种金属材料及非金属材料的拉伸压缩、弯曲、剪切、剥离、撕裂等力学试验。广泛应用于航空航天、核能、军工、高等院校等领域。本文深圳三思纵横小编为大家划出风暴系列新一代电子万能试验机的重点相关内容，大家一起来看看吧。三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机：1、稳：光杠导向，精准平稳；2、新：自主研创的新一代电子万能试验机横量位移显示屏及手控盒装置；3、超：新一代超高控制、采集频率控制系统；4、低：动力系统采用最新技术低耗高能，环保安全。一、风暴系列新一代电子万能试验机的设备优势1、试验机整体设计精致美观，减震地脚更平稳；2、国内首家独创新一代电子万能试验机横梁位移显示屏以及手控盒装置；3、独家首创测控系统机箱盒，独立于设备主机之外；4、动力系统引进高端科学技术，顶尖装配，低耗高能，环保安全。二、风暴系列新一代电子万能试验机的适用标准1、GB/T16491 电子万能试验机；2、JB/T6146 引伸计技术条件；3、JJG475 电子式万能试验机计量检定规程；4、ASTM、DIN、JIS等相关标准。三、风暴系列新一代电子万能试验机的主要规格参数1、500000-1000000码的高分辨力数字控制器，并兼容实验室信息管理系统；2、控制器数据采样速率：1000-5000HZ；3、控制器闭环控制速率：1000-5000HZ；4、支持传感器自识别和自校准功能；5、机架型式：落地式并带预应力的高精度双立柱滚珠丝杠结构；6、最大试验力：10-600kN；7、试验机准确度等级：0.5级；8、单通道采样速度：不低于1000点/秒（单个通道采集频率可调）；9、单通道控制环频率：不低于1000点/秒（单个通道采集频率可调）；10、位移分辨力：0.00004mm；11、变形测量范围：0.4-100%FS；12、速度与载荷：满载时可以全速。综上所述，三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机是一款具有高性能、高精度、广泛应用领域的先进试验设备。三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机能够为科研和工业领域提供精准的试样试验数据，是材料测试和产品研发的得力助手。

导读：进入21世纪以来，科学技术的发展已难以用日新月异来描述。新工艺、新材料、新的制造技术催生了新的一代电子元器件，同时也促使电子测量技术和电子测量仪器产生了新概念和新发展趋势。本文拟从现代电子测量仪器发展的三个明显特点入手，进而介绍下一代自动测试系统的概念和基本技术，引入合成仪器的概念，以供读者参考。 　　现代电子测量仪器的发展趋势 　　仪器性能更加优异 　　仪器的性能更加优异，测量功能更加强大，仪器的测量精度，测试灵敏度，测量的动态范围等都达到了前所未有的高度。例如，Agilent公司的PSA频谱分析仪的测量灵敏度高达169dBm(接近物理界热噪声174dBm)，PNA网络分析仪的动态范围高达143dB，Agilent83453A高分辨率分光计分辨带宽=0.0001nm(亚皮米)(突破皮米分辨带宽的壁垒)，Agilent86107A精密时基参考模块，对小于100ns的时延，抖动为1.7psRMS(突破皮秒抖动瓶颈)，DSO80000系列的示波器，其单一A/D芯片具有20GSa/s实时高采样率，使之成为世界上采样率最快的示波器(40GSa/s实时采样率，13GHz带宽)。另外，更多强大的测量功能被赋予单台仪表中，如Agilent公司的8960系列无线综合测试仪(集移动手机和基站的射频测试与协议测试于一身) ESG/PSG矢量信号源可以灵活产生包括连续波/调幅/调频/调相/脉冲调制，全制式通信协议(GSM/EDGE/WCDMA/TD2SCDMA/CDMAOne/CDMA2000/CDMA20001X2EV/蓝牙/WLAN/PHS/PDC/NADC/DECT/TETRA等)，任意波形及用于今后的其他信号 MSO混合信号示波器(2/4个模拟测量通道16个逻辑分析通道)使单台仪器同时具备示波器和逻辑分析仪的功能 Infiniium示波器内装VSA矢量信号分析软件后也成为世界上测量分析带宽最宽的矢量信号分析仪。 　　仪器与计算机融为一体 　　仪器和计算机技术的前所未有的融合。首先，越来越多的仪器选用以Windows软件和Intel芯片为平台，采用WindowsGUI和基于军用标准的软件，用Windows软件代替仪器内部操作软件，并易于与MS办公室应用软件连接，充分发挥其效能，如Agilent公司的仪器可用Word语言捕获屏幕图像，用Excel语言绘制的波形数据，用Excel语言捕获测量数据，易于自由地从互联网下载和升级最新的软件版本，利用WindowsHelp提高了仪器操作学习的方便性 同时，触摸屏被广泛利用，话音控制可解决双手同时被占用时操作仪器的问题，通过网络控制仪器操作，并用基于MSWindows和MSVisualStudio实现测试自动化 另外，仪器内部的VBA软件可有效地帮助实现生产过程中的测试自动化。 　　其次，由于计算机技术被大量应用到仪器之中，使得仪器具备了更加先进的连通性，如Agilent公司的仪器大都具备采用了USB接口，LAN接口，GPIB接口。同时，也安装了标准光标指示器(鼠标、跟踪球、触摸键、操纵杆等)和其他部件(键盘、CDRW驱动器、直接连结打印机的并行接口，用于外部监视器的VGA输出，内部硬盘驱动器等)。特别值得一提的是，在军工等特殊行业，测试数据的安全性和保密性要求格外重要，为此，Agilent公司在仪器上设计了可卸出的硬盘(如PNA矢量网络分析仪和Infiniium示波器)，使工作人员在实验室完成测试任务后，卸出硬盘，单独运输仪器至测试现场(如战地)，再由操作人员取出随身携带的硬盘装入仪器，再进行现场测量，从而保证了数据的安全性和保密性。 　　测试及仿真软件在仪器中广泛应用 　　随着计算机的运算速度和处理数据能力的不断增加，及计算机仿真技术的广泛应用，仪器的硬件和测试软件及仿真软件的结合越来越紧密。首先，硬件的模块化设计，使得通过不同的硬件模块组合配以不同的软件，从而形成不同功能的仪器和不同的测试解决方案，如Agilent公司的DAC-J宽带示波器86100C，通过插入不同的模块并配以不同软件，该仪器可成为抖动分析仪，宽带示波器，数字通信分析仪，时域反射分析仪 此外，VXI结构的测试仪器更加充分地解释了模块化结构仪器的灵活配置和应用。 　　其次，软件无线电的概念已有了全新的解释和现实的应用，Agilent公司的89601A矢量分析软件是实现这一理念的最好例证，它利用计算机强大的数学运算和数据处理能力将大量的数字信号处理功能和数据分析功能充分展现在计算机软件之中，通过与不同的数据采集前端(如VXI结构的矢量信号分析仪，频谱分析仪，Infiniium数字示波器)相结合，组合出不同功能的矢量信号分析仪。 　　同时，其捕获的信号和数据分析的结果可以作为EDA仿真软件(如Agilent公司的ADS高级设计仿真软件)的数据输入来源，用于驱动ADS高级设计仿真软件进行部件及系统级仿真 并且，ADS高级设计仿真软件的仿真结果可送入Agilent公司的ESG/PSG矢量信号源产生出信号通过VSA矢量信号分析仪的捕获和分析，反过来可进行产品设计与真实产品之间的数据验证，即实现设计、仿真、测量和验证的有机结合。以AgilentADS高级设计仿真软件为代表的EDA软件，通过与Agilent公司测试仪器(包括:频谱分析仪，网络分析仪，信号源，示波器，逻辑分析仪等)的动态链接，从而实现了测量域与仿真域的有机结合，在设计、仿真和验证之间架起了桥梁，从而加速设计，提高设计质量，完善系统及部件的半实物仿真手段，达到迅速拓展满足需要的测量解决方案的目的。 　　自动测试系统的发展历史和现状 　　随着测量仪器功能的不断提高和完善，与其相关的自动测试系统(特别是军用ATS测试系统)的组建与发展也经历了从台式仪器ATS系统到卡式仪器ATS系统，从卡式仪器ATS系统到卡式仪器与台式仪器混合的ATS系统的发展过程。到目前为止，VXI结构的仪器(主要对于大通道数的数字信号测量)与GPIB标准的台式仪器(主要对于性能要求严格的射频/微波信号测量)相结合组建ATS测试系统已成为军用ATS测试系统普遍遵从的主流原则和典范。这与以美国为代表的军工用户在90年代提倡的采用COTS(CommercialOff-the-Shelf)流行商用仪器来构建军用ATS测试系统有很大关系，它可以极大地降低整个测试系统的组建、开发、维护、替换和升级的成本。 　　但是，由于军工行业系统研制周期和认证周期相对较长，系统维护和需要支持的周期通常在10年至20年，而民用科技的发展日新月异，流行商用仪器的更新速度越来越快，一些COTS产品在军工行业被大规模全面使用之前就已废型和停产，对于已定型的测试系统的维护和支持成为军工客户面临的最大问题，特别是那些基于特定硬件而开发的测试软件(TPS)的维护、支持和更新更是面临巨大的挑战。这一点在中国的客户群中也遇到了同样的问题。如何实现硬件的可互换性和软件的可互操作性成为保证整个系统生命力和生命周期的关键。与此同时，军用ATS测试系统还要满足其可靠性、机动性和灵活性的要求，并尽可能地降低开发、维护的成本，节省人力资源，改进硬件的现场替换效率和维修中心替换效率，改进武器系统快速应对地区乃至全球支持的战略要求。 　　下一代的自动测试系统 　　下一代测试技术及测试系统的标准 　　以美国为首的用户和仪器厂商近一年以来提出了一种新的测试仪器理念和技术以解决COTS仪器带来的问题，并同时满足未来测试系统的发展要求。该技术称之为NxTest，它就是基于LAN的模块化合成仪器(SyntheticInstrument)。安捷伦科技公司和VXITechnology公司于2004年9月为自动测试系统推出基于LAN的下一代模块化平台标准化-LXI。 　　LXI(仪器的LAN扩展)不仅提供了机架和堆叠式仪器的嵌入式测量技术和PC标准I/O连接能力，还实现了基于插卡式仪器的系统的模块化特点并减小了体积。对于为航空/国防、汽车、工业、医疗和消费电子市场开发电子产品的研发和制造工程师来说，LXI紧凑灵活的封装、高速输入/输出和可靠的测量功能有效地满足了他们的需求。VXI总线为所有高密度高速度应用提供了理想的标准，LXI则同时融合了VXI和以太网的优势，为用户提供了一个良好的高性能仪器平台，满足VXI通常没有满足的应用需求。LXI基于LAN的结构为例，为在航空和国防行业中长寿命仪器的实现奠定了基础。LXI没有带宽、软件或计算机底板结构限制。它可以利用日益提高的以太网吞吐量，为面临下一代自动测试系统挑战的工程师提供理想的解决方案。 　　LXI标准将由LXI协会负责管理。LXI协会是一家由主要测试测量公司组成的非营利机构。该集团的目标是开发、支持和推广LXI标准。安捷伦科技公司和VXITechnology公司利用其拥有悠久历史的模块化仪器设计，推出LXI平台，这是测试系统使用的开放式标准仪器发展中必然的可行一步。由于几乎每台电脑中都内置了以太网(LAN)，以太网已经成为业界广泛认同的通信接口。互联网硬件价格正不断下降，速度正不断提高，局域网提供了其它点到点接口标准中没有提供的对等通信。测试和测量工程师日益认识到使用高速局域网替代专有测试测量接口(如GPIB)的好处，业内需要更低成本、更高带宽和更快的数据传送速率，这给专有测试测量接口提出了挑战。 　　LXI测试测量模块是为用于设计检验或制造测试系统而优化的。连接局域网的能力使得各模块可以装在世界上任何地方，并从世界上任何地方访问模块。与采用昂贵电源、底板、控制器和MXI卡和电缆的模块化组件不同，LXI模块自带处理器、局域网连接、电源和触发输入。LXI模块可以采用全宽或半宽，高度为一个机架单位或两个机架单位，实现了非常简便的混配功能。信号输入和输出位于正面，局域网和输入交流电源则位于每个LXI模块的背面。LXI模块由计算机控制，不要求传统机架和堆叠式仪器配备的显示器、按钮和拨号装置。LXI模块采用标准网络浏览器诊断问题，使用IVI-COM驱动程序进行通信，简化了系统集成。 　　LXI仪器的特点 　　LXI仪器具备了以下五大特点： 　　(1)开放式工业标准 　　LAN和AC电源是业界最稳定和生命周期最长的开放式工业标准，也由于其开发成本低廉，使得各厂商很容易将现有的仪器产品移植到该LAN-Based仪器平台上来。 　　(2)向后兼容性 　　因为LAN-Based模块只占1/2的标准机柜宽度，体积上比可扩展式(VXI/PXI)仪器更小。同时，升级现有的ATS不需重新配置，并允许扩展为大型卡式仪器(VXI/PXI)系统。 　　(3)成本低廉 　　在满足军用和民用客户要求的同时，保有现存台式仪器的核心技术，结合最新科技，保证新的LAN-based模块的成本低于相应的台式仪器和VXI/PXI仪器。 　　(4)互操作性 　　作为合成仪器(SyntheticInstruments)模块，只需30～40种左右的通用模块即可解决军用客户的主要测试需求。如此相对较少的模块种类，可以高效且灵活地组合成面向目标服务的各种测试单元，从而彻底降低ATS系统的体积，提高系统的机动性和灵活性。 　　(5)新技术及时方便的引入 　　由于这些模块具备完备的I/O定义文档(由军标定义)，所以，模块和系统的升级仅需核实新技术是否涵盖其替代产品的全部功能。如此看来，合成仪器(SyntheticSystems)将实现下述五大目标:①非常长的产品和系统支持周期，应用软件将不再依赖于特定的硬件。②很小的系统体积，仪器不包含多余的显示、输入和其它美学设计部分。③应用清晰明确，仪器界面一致，升级快捷方便。④系统生命周期与产品生命周期保持一致。⑤供应商独立，测量硬件与测量技术没有直接联系。 　　展望未来 　　综上所述，21世纪的电子测量仪器随着芯片技术和DSP技术的发展将达到前所未有的高性能，随着计算机技术与仪器的进一步融合，仪器的易操作性，易升级性，测量能力，数据处理和分析能力，都得到了大幅度提高。与此同时，软件无线电正越来越多地被应用到各个领域，仿真技术将为用户的设计和验证提供了更加强大和方便的工具。自动测试系统经历了从GPIB系统到VXI系统，从VXI系统到VXI与GPIB混合系统的发展历程，越来越多的军工用户希望拥有一种长寿命且高性能的系统标准体系来承担日益复杂的测试压力和维护成本的压力，面对未来的挑战，LXI仪器将在继承现有测试技术的基础之上，为下一代测试技术和测试仪器，特别是ATS测试系统的革新带来新的希望。

芬太尼是一种强效的类阿片止痛剂，是医学中使用最广泛的合成阿片类药物。其适用于各种疼痛、外科手术后和手术过程中的阵痛；也可与麻醉剂合用，作为麻醉辅助用药。芬太尼作为近年来兴起的新精神活性物质（NPS），在其基础上衍生出大量的变种，因此被称为“实验室毒品”，是继传统毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品。2019 年 4 月 1 日，公安部、国家卫生健康委、国家药监局联合发布公告，宣布从2019 年 5 月 1 日起将芬太尼类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》。由于芬太尼及其变体药物的效力比海洛因强 10-1000 倍，致死量相当于数粒砂糖大小。类似的，部分 NPS 的活性剂量为数微克。世界范围内已经出现数起公务人员意外暴露于芬太尼或精神类药物下，引起严重医学后果的案例。这意味着在没有始终或不能穿戴全套个人防护装备的情况下发生接触，存在着发生危险性意外暴露的风险，因此要求样品识别定性的方法是快速、简单以及操作方便的。安捷伦为芬太尼及其衍生物的快速定性识别提供了两种解决方案，分别为 Cary4500 FTIR 红外光谱解决方案，以及 Resolve 拉曼光谱解决方案。方案一：Cary4500 FTIR 芬太尼及其衍生物定性测试解决方案图为：安捷伦Cary4500 FTIR 光谱仪红外光谱作为一种对未知物快速识别定性的手段，被许多检测机构选用。与传统红外需要苛刻的温湿度存储条件不同，安捷伦 Cary4500 FTIR 光谱仪采用硒化锌主机设计，其防水设计可以防止环境湿度对主机造成的影响；且自带电池，可带到任何户外和检测现场使用。仪器标配衰减全反射（ATR）探头，无论是液体、固体还是粉末类样品，无需样品制备，直接取少量置于钻石晶体上测试即可。Cary4500 FTIR 光谱仪的产品特点：仪器采用立体干涉仪设计，抗冲击，抗振动全密闭光学防水设计系统标配钻石晶体衰减全反射附件可连续使用时间4小时以上标配电池系统，也可外接电源操作温度：-10℃-50℃湿度：95% 以下安捷伦傅里叶变换红外光谱系统还配置了内含 142 种标准芬太尼类化合物的红外谱库，在对疑似芬太尼类物质进行检测时，仅需调用带有谱库的方法采集谱图，短短几十秒即可确认未知物是否为芬太尼类物质。该谱库严格按照《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》设计，能够满足公安、邮政、海关及相关司法部门的检测需求。且仪器体积小巧，在用户有特殊需求时，可作为移动测量设备置于测量现场；如在实验室内使用时，为保护测量人员的安全，也可将其置于通风橱或手套箱内使用。图为：调用谱库对测试的阿芬太尼样品进行定性分析结果方案二：Resolve 手持式拉曼芬太尼及其衍生物隔包装检测解决方案图为：安捷伦Resolve手持拉曼光谱仪手持式拉曼光谱仪可以作为与傅里叶变化红外光谱仪搭配使用的另一款仪器，用于芬太尼类样品的隔包装定性识别检测。安捷伦 Resolve 手持式拉曼光谱仪采用专利的空间位移拉曼光谱（SORS）技术，能够快速无损检定密封在单个或多个包装内的危险物质、爆炸物和麻醉剂等。与传统拉曼光谱仪仅能穿透透明包装不同，Resolve 手持拉曼可穿透有色和不透明的塑料、玻璃、纸盒、卡套、包装盒以及编织袋等。该系统采用 830 nm 激光光源，可减少荧光干扰，同时配置了不断更新的新型精神药物（NPS）的标准谱库，是一款检测和检定管制类药物的强大工具。可检测的物质包括：芬太尼、卡芬太尼及衍生物新型精神药物安非他命可卡因海洛因管制前体图为：检测密封在典型国际邮递包裹中的芬太尼变体药物Resolve 手持式拉曼光谱仪因其穿透包装无损检测样品的特性，非常适用于帮助执法人员及海关人员进行疑似样品筛查，在尽可能保护测试人员的前提下，获得准确的测试效果。综上所述，安捷伦分子光谱产品线的傅里叶变换红外光谱仪及拉曼光谱仪均可为用户进行芬太尼类化合物的定性分析提供快速检测方案。在未开包装时，可选择 Resolve 手持式拉曼光谱仪进行初步筛查，后通过取样的方式利用 Cary4500 FTIR 进行进一步的判定。关注安捷伦微信公众号，获取更多市场资讯

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2018年11月，TESCAN先后发布了三款扫描电子显微镜新品：S9000G超高分辨型镓离子源双束FIB系统，S9000超高分辨型场发射扫描电镜，S8000X高分辨型氙等离子源双束FIB系统！作为全球电子显微镜及聚焦离子束等设备的主要供应商，TESCAN一直致力于新产品、新技术的创新和研发，以满足客户需求。 截至目前，TESCAN已于今年发布了5款扫描电子显微镜新品，TESCAN第四代电子显微镜TESCAN S8000系列和TESCAN S9000系列产品线已发布齐全。 其中包括：TESCAN S8000高分辨型热场发射扫描电镜，S8000G高分辨型Ga-FIB，S8000X高分辨型 Xe Plasma-FIB；TESCAN S9000超高分辨型热场发射扫描电镜，S9000G超高分辨型Ga-FIB，S9000X超高分辨型Xe Plasma-FIB。 TESCAN超高分辨型Ga FIB-SEM新品 S9000G TESCAN超高分辨型FE-SEM新品 S9000 TESCAN高分辨型Xe Plasma-FIB新品 S8000X TESCAN第四代电子显微镜S9000系列是TESCAN最新推出的超高分辨型电子显微镜系列，包括三款电子显微镜产品，而此次发布的是S9000超高分辨型FE-SEM和 S9000X 超高分辨型Xe Plasma-FIB。 S9000系列在软硬件方面均经过全新设计，配备了TESCAN最新的Triglav™ 电子镜筒技术和Orage™ 离子镜筒技术，并提供Ga离子源和Xe等离子源多种离子源可供选择。TESCAN第四代电镜还配置了全新立体设计的Essence™ 计算机处理系统，具有非常便捷的操作界面和面向应用流程的可定制化软件布局；针对FIB加工和电子束光刻应用，还提供先进的DrawBeam™ 功能。 TESCAN S9000G是一款超高分辨型的镓离子源FIB-SEM系统，适用于超薄TEM样品制备和其它具有挑战性的纳米加工任务。S9000G 配置了Orage™ FIB镜筒，不仅为纳米加工提供了最佳的精度，高达100 nA的大离子束流，还可以对生物样品和材料进行指定位置、大体积的三维逐层扫描，图像具有更出色的对比度。得益于低电压下离子束的出色分辨率和性能，TESCAN S9000www.tescan.com

安装篇2020年春节前夕，通过工程师的安装调试和细致的讲解培训，二代电导率-塞贝克系数扫描探针显微镜（PSM II）在杭州创新研究院顺利安装并完成验收。该系统是国内二套PSM II，也是国内六套PSM。PSM II将用于块体和薄膜热电材料的塞贝克系数、均匀度检测与新型热电材料的研究。这套设备的投入使用将帮助杭州创新研究院在热电材料领域取得更快的发展。 德国工程师Dieter Platzek（中）与用户老师合影 设备篇电导率-塞贝克系数扫描探针显微镜是由德国PANCO公司与德国宇航中心联合研发的一款可以测量热电材料Seebeck系数二维分布的设备。自推出以来，该设备获得全球多个实验室的一致好评，已经成为快速检测样品性能的重要手段。后经研发人员的进一步升，全新推出的二代电导率-塞贝克系数扫描探针显微镜-PSM II具有更高的位置分辨率和测量精度。 产品特点：● 可以测量Seebeck系数二维分布的全球商业化设备。● 的力学传感器可以确保探针与样品良好的接触。● 采用锁相技术，精度超过大型测试设备。● 快速测量、方便使用，可测块体和薄膜。主要技术参数：● 位置定位精度：单向 0.05μm；双向 1μm● 大扫描区域：100 mm × 100 mm● 测量区域精度：5μm (与该区域的热传导有关)● 信号测量精度：100 nV （采用高精度数字电压表）● 测量结果重复性：重复性误差优于3%● 塞贝克系数测量误差： 测量功能梯度材料的梯度● 观察材料退化效应● 监测 NTC/PTC 材料的电阻漂移● 固体电介质材料中的传导损耗● 阴材料的电导率损耗● 巨磁阻材料峰值温度的降低，电阻率的变化● 样品的质量监控电导率-塞贝克系数扫描探针显微镜-PSM II

▲4H-硅的可视化图片美国科学家在最新一期《物理学评论快报》杂志撰文指出，他们开发了一种新方法，合成出了一种拥有六边形结构的新型晶型硅，这种晶型硅有可能被用于制造新一代电子和能源器件，这些新设备的性能将超过现有“普通”立方形结构硅制成的相关设备的性能。硅在人类生活中扮演着重要的角色，它是地壳中含量第二丰富的元素。像所有元素一样，硅也可以采取不同的晶体形式，即同素异形体。硅常被用于制造计算机和太阳能电池板等。尽管普通形式的硅无处不在，但其并不适合制造高性能晶体管和一些光伏器件等设备。虽然从理论上来说，很多硅的同素异形体拥有更好的物理性能，但由于缺乏合成途径，因此很难发挥硅的最大潜力。卡内基大学的托马斯希尔和蒂莫西斯特罗贝尔领导的一个研究小组此前曾合成出了一种新型硅——Si24。在最新研究中，他们使用Si24作为合成起始点，合成出了一种新型晶体硅，其拥有4层重复的六边形结构。斯特罗贝尔解释说：“人们对六边形硅的兴趣可以追溯到20世纪60年代，因为其电子特性可以调谐，由此可获得超越立方体结构的性能。”以前曾有其他科学家合成出六边形硅，但最新以Si24途径合成出的六边形硅是科学家首次合成出高质量的此类大块晶体，可以用作未来研究活动的基础。希尔说：“我们的新研究除了可以更好地以可控的方式合成出新结构外，还为通过应变工程和元素替代来调节元素的光学和电子性质打开了大门。我们或许可以利用这种方法制造出种子晶体，让其生长出大量性能有望超过金刚石硅的新型晶体硅。”

&ldquo 现代电子显微镜及电镜在材料科学中的应用国际研讨会&rdquo 暨第四届郭可信电子显微镜和晶体学夏季培训会于7月11日至15日在沈阳中科院金属科学研究所举办，200多名从事电子显微镜研究及应用的科研人员参加了本届会议，40多名世界知名电镜领域的学者做了大会报告。 西安交通大学单志伟老师在会上介绍Hysitron PI系列纳米压痕仪 作为美国Hysitron纳米压痕仪在中国的独家供应商，德祥科技公司在此次会议上专门设立了一个场外展台，展出了Hysitron最新的纳米亚痕测试技术和产品，包括配合扫描电镜使用PI85纳米亚痕仪、配合透射电镜使用的PI95纳米压痕仪、TI950纳米力学测试系统，Hysitron先进的技术引起了许多参会者的兴趣。 与会人员在参观德祥公司制作的Hysitron纳米压痕仪Poster Hysitron纳米压痕仪采用*的三板电容传感器，大大降低仪器热飘逸，检测更准确，PI系列可做纳米线、纳米颗粒、薄膜、微柱的力学性能分析，可做压痕、压缩、弯曲和拉伸试验，TI系列可做压痕测试、划痕测试、模量成像、动态力学分析、声发射检测、接触电阻测量等，是新一代微纳米力学表征分析工具。 参会人员参观会场外的各种Poster 更多产品请登陆德祥官网：www.tegent.com.cn 德祥热线：4008 822 822 德祥邮箱：info@tegent.com.cn

导读“风暴”新一代电子万能试验机是三思纵横独立研发于2016年闪耀问世。能最大化满足用户试样试验需求，是各类金属、非金属材料试样试验的首选。目前已广泛应用于各种塑胶、橡胶、金属、航空航天、船舰、建工、军工、商检、高等院校等相关行业的试验测试。随着全球科学技术的快速发展及工业生产要求不断提高，之前相对冷门的试验机行业也迎来了春天，不断炫耀着其市场潜力和蓬勃生机。有数据显示，中国试验机市场销售总额每年可高达40亿人民币。行业的发展也带动了试验机技术的革新，目前相关技术已在测量技术、控制技术、计算机应用技术、全数字化技术等多个领域取得突破性的进展，这也促使我国电子万能试验机、微机控制液压万能试验机、电液伺服动静万能试验机、高频疲劳试验机等试验机产品有了进一步提升和发展。而这些新技术新产品也反过来为我国试验机产业发展起到了推动作用，催生了众多试验机企业。本文介绍的是行业领跑企业三思纵横一款新型电子万能试验机——三思纵横风暴系列。三思纵横风暴系列新一代电子万能试验机于2016年闪耀问世，国内首家可记录各种力学性能式样试验数据的电子万能试验机，该试验机率先引进西方先进技术，采用进口最新科学高能配件，历经多年结合试验机新产品市场需求研制而成，与国际研发接轨，独家研创，外形精美，操作方便，低耗高能，性能稳定可靠，能最大化满足用户试样试验需求，是各类金属、非金属材料试样试验的首选。广泛应用于各种塑胶、橡胶、金属、航空航天、船舰、建工、军工、商检、高等院校等相关行业的试验测试。首创横梁位移显示屏及手控盒装置国内首家独创横梁位移显示屏，实时采集横梁的绝对位置，显示横梁移动方向操作简洁，便于观察与纪录；手持式控制操作系统手控盒，可定位控制横梁位移速度以及配套的电子夹具的夹持控制，控制盒手柄上还携带与位移显示屏同步的数据显示，使试样测试操作控制更加直观简单。率先发明设计测控系统机箱国内首次大胆创新的设计，将测控系统与减速系统外置合一为精巧的机箱盒；有效避免试样中电子万能机带来的震动干扰，极大的降低密封部件的损耗；试验稳定，延长各个部件的寿命，长效使用减少维修；500000码高分辨率数字控制器；高于1000Hz数据采样速率，试验数据更精确。国际一流伺服电机与减速器动力系统采用国际最先进的技术，最新进口伺服电机和伺服系统，以及德国行星减速机，配以滚珠丝杠副传动系统；实现试验机移动横梁的上下直线运动，比传统涡轮减速机声音更小，传动速率更高，传动平稳、噪音低（低于50db），测试性能更优异。精简外观，注重细节1.3×1.1×2.35的机身尺寸，外观精悍简洁；全封闭铝制防护罩，无缝焊接，精制抛光工艺，华丽中彰显霸气！相对外观，三思更注重细节处理，让试验机的横梁、围板等以新面貌面世；轮辐式新型设计，受横向载荷、非对称载荷、弯曲和扭转力矩的影响非常小；结合高要求的选材及精细的加工工艺，使得设备精度高（从满量程的0.4％ 开始，精度为0.5级）、刚性好（150%过载无变形（无机械损伤）高精度传感器，其稳定性好，抗侧向冲击能力强；在不违规操作的情况下，正常使用10年以上精度不变），产品质量更可靠。据悉，该设备由深圳三思纵横科技股份有限公司自主研发生产，“三思纵横”是中国试验仪器行业唯一的国家级高新技术企业，中国领先的材料试验设备和材料试验解决方案的服务商。公司集研发、生产、销售和服务四位一体，专业提供一流的材料试验设备与专业的材料试验解决方案。“三思纵横”公司总部位于深圳，生产基地分别设在深圳和上海。在中国的主要城市设有13个办事处和6个服务中心，为客户提供全面贴近和贴心的服务。近几年，合金材料、聚合物材料、陶瓷材料、超导材料等新材料的开发与使用，极大地拓展了试验机的应用领域。而试验机产业要想取得良性发展，未来就必须注重技术创新，掌握关键技术。未来试验机试验对象将会从材料、零部件扩展到整机、整车、系统、重大设施和各类工程项目。企业的中心实验室、质检部门、生产现场、工程项目的施工现场也将会逐渐应用试验机。线连续、实时、自动化实验方式成趋势，实验理论也会不断提升指导技术创新。未来模块化、系列化、共用化、特种、专业化、动化、智能化、网络化多方向发展试验机，将会成为试验机发展主流趋势。三思纵横将继续引领行业潮流，不断突破，不断创新，竭诚服务于客户！

核磁共振方法除可获得分子结构信息外，还可观测分子的动态特性，这些可为阐明蛋白质等生物大分子的功能机制提供重要信息。随着高速魔角旋转技术的发展，固体核磁谱分辨率大幅提高，从理论上突破了液体核磁观测的分子量的限制，逐渐被运用于研究磷脂膜环境中的膜蛋白等超大生物分子复合物体系的动态构象。但低信号强度和低分辨率限制了生物分子固体核磁研究的广泛开展。自然界中氢原子和氟原子的旋磁比大、NMR信号强，是比较理想的NMR观测对象。氟原子在生物分子结构中极少存在，无观测背景信号，是理想的NMR观测探针。因此，氢检测和氟检测方法的发展可能显著扩展固体核磁在复杂生物体系中的运用。 　　2023年8月23日，中国科学技术大学微尺度物质科学国家研究中心史朝为课题组在国际著名学术期刊ScienceAdvances上在线发表了题为“Fluoride permeation mechanism of the Fluc channel in liposomes revealed by solid-state NMR”的研究论文，研究团队以氟离子通道蛋白Fluc-Ec1作为研究对象，结合氘代和19F定点标记方法，发展并优化膜蛋白固体核磁氢检测及氟检测研究方案，为膜蛋白核磁研究提供新思路。环境中的氟离子可通过弱酸积累效应在细菌细胞内积累，产生毒害作用。微生物通过F-膜转运蛋白将F-运输至体外进而抑制其毒性作用。来自Fluc(fluoridechannel)家族的Fluc-Ec1蛋白是由130个左右的氨基酸组成的离子通道，具有独特的双重拓扑二聚体的结构，且对氟离子具有高度选择性。静态的F-通道蛋白的晶体结构难以描述F-渗透的具体机制，F-通道蛋白被抗体类似物固定在一种构象上。氟原子和氧原子相似的电子云密度以及分子动力学模拟数据使得晶体结构中极性轨道(polartrack)上的氟离子结合位点(F1and F2sites)引发争议，另外突变体功能保留或丧失的机制目前仍不清楚。 　　研究团队通过观测磷脂膜环境中的Fluc-Ec1在不同氟离子浓度中的构象，结合基因密码子扩展方法，在蛋白质前庭位置引入非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸(tfmF)，设计19F-19F自旋扩散实验，验证了Fluc-Ec1存在新的氟离子结合位点(F0site)。研究团队利用1H-1H自旋扩散实验直接检测水和蛋白质的相互作用，通过氘代来减少氢原子的非相干背景，结合water-hNH谱图以及自旋扩散传递和衰减规律，得到了主链酰胺质子和水分子的距离信息，证明了F1位点结合的是水，而不是氟。 　　此外，晶体学研究无法从结构的角度解释F80M突变体具有功能活性而F83M突变体丧失功能活性的现象，研究团队通过分别对比F80M、F83M和野生型蛋白脂质体样品的碳检测谱图，结合液体核磁共振技术验证loop 1突变体功能，发现loop 1是F83M突变体丧失通道活性的重要因素，进一步揭示了loop 1在F-渗透过程中的重要性。综上，研究团队更正了先前推测的氟离子通道离子配位位点，提出氟-水交替“water-mediated knock-on”的渗透模型，为全面理解Fluc通道中的渗透和门控机制提供科学依据。中国科学技术大学张瑾、宋丹、李娟以及德国亚琛工业大学的Florian Karl Schackert为该论文的共同第一作者，中国科学技术大学微尺度物质科学国家研究中心史朝为特任研究员为该文章的通讯作者。中国科学技术大学的龚为民教授、田长麟教授、项晟祺教授以及德国Jülich研究中心的Paolo Carloni和Mercedes Alfonso-Prieto教授团队也参与了该研究工作并给予了大力帮助。该研究得到了科技部、国家自然科学基金、中国科学院、中国科学技术大学以及德国科学基金会的经费资助。

p 　　摘 要：随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　关键词：抗体 下游工艺 纯化 技术进展 /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　表1 单抗特性及纯化策略 /span /p p style=" text-align: center " img title=" 11111.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e2693d21-e711-4b42-bb9c-53b5b7848f82.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" 2222.png" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5035b8d3-81f1-4e6b-96d7-3e12b347a344.jpg" / /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0 病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　 img width=" 450" height=" 374" title=" 1.jpg" style=" width: 435px height: 258px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/401b7d6a-ad5b-4c9a-9eee-2376ebef51fa.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /span /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 164" title=" 2.jpg" style=" width: 580px height: 159px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ce7191a4-3940-4315-8122-856bbbadbc24.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /span /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/4aa1c980-c9be-44e9-82b5-899ba9f7eec9.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /span /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07a79270-4b7d-4fe5-bc9a-125837562297.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /span /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/333de887-f92b-405d-9094-9ec89635f74d.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " 　　图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18] /span /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　(箭头示液体过柱时的流向) /span /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE 技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[17]整合发酵和下游纯化的新技术：扩张柱床吸附技术.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[18]余晓玲,米力，姚西英，陈志南.扩张柱床吸附层析与固定柱床层析纯化单克隆抗体的比较.中国生物工程杂志,2003,23(1):61-64. /p p 　　[19]High-throughput monoclonal antibody purification.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[20]抗体纯化手册.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[21]Purification Strategies to Process 5 g/L Titers ofMonoclonal Antibodies. BioPharm International技术资料. /p p 　　[22] T.Ishihara,T.Kadoya.Accelerated purification process development ofmonoclonal antibodies for shortening time to clinic:Designand case study of chromatography processes.J Chromatogr A,2007，1176(1-2)：149-156. /p p 　　[23] A.Cecilia,A.Roque,et al.Antibodies and Genetically Engineered RelatedMolecules:Production and Purification.BiotechnolProg,2004，20：639-654. /p p 　　[24] S.Flatman,I.Alam,et al.Process analytics for purification of monoclonal antibodies.JChromatogr B,2007，848：79-87. /p p 　　[25]ProcessChromatography:Five Decades of Innovation.BioPharmInternational技术资料. /p p 　　[26]双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估.BioProcessInternational技术资料. /p p 　　[27]Affinity Chromatography Media.Millipore公司技术资料. /p p 　　[28]ProSep Ultra Plus ChromatographyMedia.Millipore公司技术资料. /p p 　　[29]MEP Hypercel混合模式层析填料. PALL LifeScience公司技术资料. /p p 　　[30]Sartobind膜层析技术高效的蛋白纯化工具. SartoriusStedim公司技术资料. /p p /p

p 　　随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 br/ /p p 　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。 br/ /p p 　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。 /p p 　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。 /p p 　　1. 抗体药物纯化策略 /p p 　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。 /p p 　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略 /p p 　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。 /p p 　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1eb75a7d-0f0f-4f60-8224-a3984ccff0e3.jpg" title=" 表1.png" alt=" 表1.png" / /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f8ff0f67-6f0b-4295-ab81-05543e5efbd8.jpg" title=" 表2.png" alt=" 表2.png" / br/ strong 表1 单抗特性及纯化策略 /strong /p p 　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合 /p p 　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。 /p p style=" text-align: center " 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a804fe1c-9660-4ab2-8cc4-177870630ce5.jpg" title=" 图1.png" alt=" 图1.png" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " strong 图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6] /strong /p p 　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/3ef7b3a2-9f79-4e74-8a71-6a6cbcbea5ec.jpg" title=" 图2.png" alt=" 图2.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4] /strong /p p 　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展 /p p 　　2.1 样品澄清 /p p 　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术 /p p 　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。 /p p 　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。 /p p 　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。 /p p 　　2.1.2 深层过滤介质 /p p 　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。 /p p 　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。 /p p 　　2.2最新抗体捕获技术 /p p 　　2.2.1 MabSelect介质 /p p 　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。 /p p 　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到& gt 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。 /p p 　　2.2.2 MabSelect Xtra介质 /p p 　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。 /p p 　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。 /p p 　　2.2.3 MabSelect SuRe介质 /p p 　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少(& lt 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。 /p p 　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质 /p p 　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。 /p p 　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质 /p p 　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。 /p p 　　2.2.6 MEP Hypercel介质 /p p 　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。 /p p 　　2.3最新精细纯化技术 /p p 　　2.3.1 CaptoFamily系列介质 /p p 　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。 /p p 　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。 /p p 　　2.3.2 Captoadhere介质 /p p 　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/282961ea-e704-47d1-aabd-f044e108f59c.jpg" title=" 图3.png" alt=" 图3.png" / /p p style=" text-align: center " strong 表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15] /strong /p p 　　2.3.3膜层析技术 /p p 　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。 /p p 　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。 /p p 　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。 /p p 　　2.4终产品的浓缩洗滤 /p p 　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。 /p p 　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。 /p p 　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。 /p p 　　2.5终产品的除菌除病毒过滤 /p p 　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。 /p p 　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。 /p p 　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。 /p p 　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常& gt 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除& gt 4 log的PPV和& gt 6 log的逆转录病毒。 /p p 　　2.5扩张柱床吸附层析技术 /p p 　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。 /p p 　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。 /p p 　　 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/dba748ae-d64e-479c-8fb1-ea738ef437da.jpg" title=" 图4.jpg" alt=" 图4.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17] /strong /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0f71d1a8-a218-43f5-8c1f-917bd4f432a5.jpg" title=" 图5.png" alt=" 图5.png" / /p p style=" text-align: center " strong 图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18](箭头示液体过柱时的流向) /strong /p p 　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。 /p p 　　3. 抗体最新下游技术应用实例 /p p 　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。 /p p 　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。 /p p 　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。 /p p 　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。 /p p 　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。 /p p 　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。 /p p 　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。 /p p 　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。 /p p 　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。 /p p 　　4. 展望 /p p 　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。 /p p 　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。 /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009. /p p 　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008. /p p 　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4). /p p 　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152. /p p 　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003. /p p 　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料. /p p 　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered 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大家好，本周为大家分享一篇发表在Chemical Science上的文章，Distinct Core Glycan and O-Glycoform Utilization of SARS-CoV-2 Omicron Variant Spike Protein RBD Revealed by Top-Down Mass Spectrometry1，通讯作者是美国威斯康星大学的Ying Ge教授。　　SARS-Cov-2的快速变异为全球抗疫带来了极大的挑战。Delta和Omicron等新变种的传染性更强、病症更严重、显著逃避康复者或疫苗的中和抗体，并且逃避检测的风险更高。与野生型(WT)毒株相比，Omicron变体具有数量惊人的突变(30)，包括棘突蛋白受体结合域(S-RBD)中的15个位点突变。S-RBD是中和抗体和其他疗法的主要靶点，病毒的细胞感染性、保护表位免受抗体中和及与人类受体ACE2结合的能力与S蛋白的糖基化密切相关。S蛋白O-聚糖具有巨大的微观异质性和结构多样性，因此对其O-糖基化的表征仍具是极大的挑战。作者在本文中报道了一种自上而下的混合质谱方法，能够同时表征分子结构、位点特异性、各种糖类的相对丰度，以及不同共现蛋白型的整体翻译后修饰(PTM)。　　与WT相比，Delta和Omicron变体固有的突变差异在其RBD中尤其明显(图1A)。为了阐明各种S-RBD的分子序列和O-聚糖，作者使用PNGase F从S-RBD中完全去除N-聚糖，以最小化N-聚糖异质性造成的干扰(图1B)。与完全糖基化的S-RBD相比，N-聚糖的去除产生了10 kDa的分子量损失。通过超高分辨率12T FTICR-MS可实现各种S-RBD的基线同位素分离。自上而下的MS分析显示，各种O-糖型的化学计量比和相对丰度存在显著差异，其中Omicron变体显示出最大的O-糖型结构异质性(图1C)。　　图1 由WT、Delta和Omicron变体产生的S-RBD的蛋白质突变图谱和高分辨率自上而下MS。(A)SARS-CoV-2基因组结构和S-RBD变体蛋白质序列变化的说明。(B)PNGase处理前(-)后(+)的S-RBD的SDS-PAGE。(C)在对WT、Delta和Omicron变体进行PNGase F处理后，完整S-RBD蛋白型的原始MS1。所有确定的O-糖型在插图中用红色圆圈注释。　　为了实现深入的糖型和糖位点分析，作者利用捕获离子迁移谱(TIMS)-MS，通过timsTOF Pro仪器分离和分析各种S-RBD O-聚糖结构(图2)。为了表征Omicron变体的聚糖结构和占比，作者对单个S-RBD O-糖型进行了特异性分离。以最丰富的O-聚糖(26+，1069.4.3 m/z)为例，从Bruker数据分析软件输出由CAD获得的MS/MS片段离子，并使用MASH Explorer16在靶向蛋白质分析模式下进行分析，以进行全面的蛋白型表征。获得了自上而下的MS/MS谱以及各种O-聚糖结构的离子迁移率分离，以克服O-聚糖分析固有的质量简并性和微观异质性(图2B)。足够软的TIMS淌度池活化参数能够对分离的S-RBD蛋白型进行详细的中性缺失图谱绘制，并揭示了具有GalNAcGal(NeuAc)2结构的核心1(Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr)O-聚糖(图2C)。这种TIMS-MS方法允许对聚糖结构进行直接表征，以揭示在三种S-RBD变体中具有核心1和核心2(GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3) GalNAc-Ser/Thr)O-聚糖结构的多个S-RBD糖型。　　图2 S-RBD O-糖型的TIMS-MS分析。(A)经PNGase F处理后的特定S-RBD糖型(z=26+， 1069.4 m/z)的TIMS-MS分离示意图。插图为前体离子分离后对应的离子迁移率热图。(B) 分离的蛋白型经CAD碎裂后，Omicron S-RBD O-聚糖的自上而下MS/MS。(C) Omicron S-RBD蛋白型中性缺失O-聚糖图谱。　　随后，作者进一步描述了S-RBD WT、Delta和Omicron O-糖基化模式，以揭示变体之间的所有O-糖基化结构改变(图3)。有趣的是，与WT或Delta变体相比， Omicron中主要的O-聚糖微观异质性发生变化。特别是Omicron的核心2 O-聚糖结构丰度显著增强，多重唾液酸化GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalNeuAc)和岩藻糖基化GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalFuc)结构显著表达。表1总结了Omicron与WT或Delta变体相比所观察到的显著分子丰度差异。　　图3 S-RBD变体的O-糖型表征。S-RBD蛋白型的去卷积谱显示了WT(绿色)、Delta(蓝色)和Omicron(粉色)变体的所有主要O-聚糖分配。理论同位素分布由红点表示。聚糖结构在用插图所示的图形表示。　　表1 S-RBD变体O-糖型相对丰度总结　　Omicron变体的核心1与核心2 S-RBD O-聚糖结构的相对丰度比约为71:29，核心1 GalNAcGal(NeuAc)2是最丰富的O-糖类(~69%相对丰度)。有趣的是，WT和Delta变体显示出对核心1型O-聚糖结构的强烈偏好，其O-糖型丰度的80%以上对应于核心1结构 含核心2 GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalFuc)结构的O-聚糖占其总O-糖型组成的13%以上。在WT和Delta S-RBD变体中也发现了这些特殊的核心2结构，但相对丰度要低得多(5-7%)。图3所示的高分辨率完整S-RBD糖型表征表明，与基于糖肽的自底向上MS方法相比，这种自上而下的MS方法具有明显的优势。　　作者进一步研究了S-RBD变体之间的糖基化位点及其微观异质性。对S-RBD O-糖型的详细自上而下MS/MS分析显示，存在一种新的O-糖位点(Thr376)，这是Omicron变体所特有的(图4A)。令人感兴趣的是，所有检测到的WT和Delta变体的S-RBD O-聚糖都被自信地单独分配给Thr323(图4B-C)，这与之前关于WT S O-糖基化的研究一致。鉴于Delta上的突变数量比Omicron少，因此O-糖位点Thr323在Delta和WT变体之间保持保守也就不足为奇了。另一方面，Omicron变体产生了熟悉的Thr323 O-糖位点和一个新的Thr376 O-糖位点(b6012+和b525+)，对应于核心1 O-糖型(图4D)。该Thr376 O-糖位点在残基373处与脯氨酸相邻，这与先前关于脯氨酸附近O-糖基化频率增加的报道一致。这种特殊的Pro373是Omicron变体特有的位点特异性突变，很可能是产生这种新O-糖位点的原因。实验还发现，与T323相比，Thr376位点的占有率较低(30%)，并且仅被可靠地分配给丰富的核心1 O-糖基。此外，尽管为变异体指定的O-糖型是HEK293细胞表达的S-RBD特有的，但已知HEK293表达模型可反映病毒体预期的糖基化位点。　　图4 通过自上而下的MS/MS进行S-RBD O-糖定位。(A)对应于WT、Delta和Omicron S-RBD变体的核心1型聚糖的片段映射。蓝色N表示PNGase F处理后的脱酰胺作用。特定的Omicron残基突变用粉红色表示。(B-D)代表性的自上而下MS/MS CAD片段离子，包括完整的(B)WT(b71+和b17311+)、(C)Delta(b71+和b22312+)和(D)Omicron(b51+、b182+、b71+、b17311+)变体。WT和Delta变体在Thr323处显示完全的O-糖苷占据。发现Omicron变体同时具有Thr323(b51+和b182+)和Thr376(b71+和b17311+)。　　本文首次阐明了SARS-CoV-2 Omicron和Delta变异体中发现的O-糖型结构异质性。与WT或Delta相比，Omicron变体的核心2型O-糖型的利用率显著提高。此外还鉴定了一种新的Omicron S-RBD特有的Thr376 O-糖位点。这种自上而下的MS方法是对传统结构方法的补充，并为SARS-CoV-2 S-RBD蛋白形式的表征提供了无与伦比的分辨率。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：D.S. Roberts, M. Mann, B.H. Li, et al., Distinct core glycan and O-glycoform utilization of SARS-CoV-2 Omicron variant Spike protein RBD revealed by top-down mass spectrometry, Chemical Science (2022).