贝伐珠单抗

采用TSKgel Boronate 5PW 亲和色谱柱建立了对贝伐珠单抗糖化组分测定方法。测试结果表明：样品中有5.1%的糖化组分。该方法可用于单抗糖化比例的检测和组分的收集。

岛津微流量液质联用系统Nexera Mikros系统建立了人血清中贝伐珠单抗的定量分析方法，同时考察了Nexera Mikros系统与超高效液相色谱质谱联用仪在贝伐珠单抗分析中的性能差异。血清样品经nSMOL试剂盒处理后，分别用Nexera Mikros和岛津超高效液相色谱LC-30A结合LCMS-8060三重四极杆质谱联用仪进行分析。

本文基于岛津LCMS-8060液质联用系统，通过Skyline设计，完成MRM通道的优化，完成抗体药物定量及定性肽段的初步筛选，进一步通过血浆样品的分析，筛选特异性的定量和定性肽段，完成LCMS方法结合nSMOL前处理技术定量分析血浆中贝伐单抗的方法开发工作。利用Skyline软件和nSMOL选择性酶解加速抗体药物定量分析方法的开发过程

圆二色谱法（CD）和荧光光谱法都是研究溶液状态蛋白质构象变化的简单而灵敏的技术。CD光谱测量左旋和右旋圆偏振光吸收的差异。本征荧光光谱法是研究蛋白质结构的一种补充技术。传统上，CD和荧光光谱是使用两种不同的仪器获得的。为了应对这些挑战，我们开发了一种CD和荧光光谱的自动测量系统。该系统由J-1500 CD光谱仪和HTCD-Plus自动CD测量单元以及荧光单色仪组成。使用该系统，我们通过改变尿素浓度和pH值，对曲妥珠单抗（赫赛汀）和利妥昔单抗（RIABNITM）进行了全面的稳定性评估。我们认为，该新系统对候选治疗性抗体的早期筛选特别有用。

本研究以曲妥珠、利妥昔、贝伐珠为例，从不同角度表征了这３种单抗的稳定性特点，展示了单抗分子稳定性评价的多种维度和思路。

本文利用岛津生物兼容液相色谱系统（Nexera Bio）和弱阳离子交换技术（WCX），建立了单抗样品的电荷异质性分析方法。贝伐珠单抗、曲妥珠单抗以及帕妥珠单抗酸性和碱性变异体与主峰分离度良好，方法简单、稳定、可靠，供相关行业参考。

本方法基于DGLC 液相色谱系统，一维使用MabPac ProtainA 亲和色谱柱对单抗溶液进行分离，通过阀切换将收集到loop 环（或者富集柱）中的单抗样品转移到二维，利用SEC 色谱柱将样品中的聚体和单抗进行分离（仪器连接图见图1 和图2），从而实现全自动在线二维液相分离单抗药物的目的。

本文采用岛津LCMS-9030高分辨Q-TOF液质联用仪对曲妥珠单抗进行二硫键分析，并结合岛津LabSolutions和Protein Metrics软件进行结果解析。结果显示，在使用胰蛋白酶的条件下，曲妥珠单抗所有9对非冗余的二硫键都得到了鉴定。

本文采用岛津LCMS-9030高分辨Q-TOF液质联用仪对曲妥珠单抗进行肽图分析，并结合岛津LabSolutions和Protein Metrics软件对肽图分析的结果进行解析。该方法快速、准确，分析精确度高，成功应用于曲妥珠单抗药物的检测，为单抗药物的肽图分析提供参考。

本文建立了在线二维液相色谱法同时测定单抗药物滴度和大小变异体含量的方法。一维采用Protein A亲和色谱柱分离单抗和杂质后测定单抗药物滴度，一维校准曲线范围为0.03~6 mg/mL，线性相关系数r为0.9999，线性佳。分析实际单抗样品，加标浓度为1 mg/mL时回收率为100.7%，准确度高。将一维分离得到的目标物经阀切换至第二维，通过SEC法分离单抗单体和大小变异体，单体与聚集体和碎片的分离度分别为1.77和1.41，分离度高。测得单体含量为91.69%，重复分析6次，保留时间RSD为0.014%，含量RSD为0.73%，重复性佳。

本应用文献描述了采用Agilent AdvanceBio SEC 200 Å 1.9 µ m色谱柱对NIST 单抗进行尺寸排阻色谱方法的开发。采用Agilent 生物惰性四元泵系统和Buffer Advisor 软件可轻松筛选大量的流动相组合，快速开发出合适的分离条件。

采用TSKgel Boronate 5PW 亲和色谱柱建立了对曲妥珠单抗糖化组分测定方法。测试结果表明：样品中有1.4%的糖化组分。该方法可用于单抗糖化比例的检测和组分的收集。

生物分析对于生物大分子药物的早期研发，临床前研究乃至临床研究阶段都具有非常重要的意义。为了提供药代动力学（pharmacokinetics,PK）, 药效动力学（pharmacodynamics, PD）和毒动学（toxicokinetics, TK）所需的时间序列数据，我们对在生物基质中测定生物大分子药物浓度的准确性，灵敏度，选择性和通量均提出了非常高的要求。

本文采用岛津生物兼容液相色谱仪Nexera Bio联合多角度光散射检测器测定单抗药物主成分及聚集体分子量，为推断单抗药物聚集体状态提供依据。本实验采用体积排阻色谱对样品进行分离，紫外和多角度光散射检测器进行检测，通过色谱图得知，此曲妥珠单抗药物无聚集体，多角度光散射检测器测得主成分分子量为159,722 Da，与理论值偏差为0.17%。此分子量测定方法操作简便，快速，成本低，可用于单抗药物主成分及聚集体分子量的测定。

采用TSKgel Boronate 5PW 亲和色谱柱建立了对利妥昔单抗糖化组分测定方法。测试结果表明：样品中有9.4%的糖化组分。该方法可用于单抗糖化比例的检测和组分的收集。

一般N-糖链分析主要对蛋白质水解后糖链进行测试。传统方法测试的糖链是来自所有可能的糖蛋白和糖基化位点上糖链的平均结果，而岛津EreximTM应用技术则是分析糖基化位点上特定糖肽。该技术可在没有标准物质的情况下测算每种糖链的结构和糖链间的相对含量，对生物药物的多糖异质性进行定性结构表征，从而为研究者提供重要的单抗药物N-糖基化位点的相关信息。

本文采用岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪及单四极杆质谱LCMS-2020联用对曲妥珠单抗的胰蛋白酶酶解样品进行分析，配套使用多肽分析专用色谱柱进行分离，利用紫外检测器和质谱进行检测，质谱检测结果对关键色谱峰进行定位。该方法重复性实验中，各肽段的保留时间RSD为0.04-0.22%；峰面积RSD值为0.46-1.88%。实验结果表明，该方法方便快捷，具有良好的重复性。

BioCore WCX色谱柱创新性的微球技术保证了色谱柱的高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂的兼容性。先进的键合技术有效地阻绝生物大分子与疏水性基球的接触、最大限度地降低了生物大分子与固定相间不利的相互作用、确保单抗电荷异质体分离所需的选择性。对IgG4单抗中的电荷异质体具有优良的分离度，并在该缓冲体系中都显示出很好的选择性。

基于 Q-Exactive plus 质谱平台，主要优化了源内碎裂能量（SID）这一质谱参数和色谱洗脱梯度，从而实现了单抗轻重链有效的色谱分离和高信噪比的质谱测定，为药物开发、生产和质检过程中的单抗轻重链分析提供了直接的实验方法，同时相似的质谱参数也可以应用到其它基于 Orbitrap 类型的质谱仪器上，为广大的生物制药客户提供了单抗样品轻重链快速分析的参考依据。

单抗结合检测方法的发展大大提高了细胞及免疫磁珠的高通量，高内涵分析效率。这种不用冲洗，基于荧光微孔分析技术（fluorometric microvolume assay technology, FMAT）的方法可以快速的针对更少量的细胞进行筛选，而且在传统样本检测中由于多次洗板造成的细胞损失也完全可以避免。抗体的发现在诊断疾病，研发疫苗和治疗疾病的过程中起到重要作用。研究者们利用杂交瘤细胞或者形成克隆来筛选高表达克隆株，检测细胞表面的抗体结合效率，观测抗体或配体在细胞内的内化。在传统的FMAT检测方法的已有优点之上，利用ImageXpress? Micro 宽场高内涵分析系统进行操作的单抗结合检测方法可以让科学家们在同一个平板孔中检测多种不同细胞的表面抗体结合情况。这一系统也可以将检测规模提升到1536孔板，并且只需要2-3微升的样本。即使用更低的二抗浓度，其检测范围和灵敏度也不会下降，甚至有所提高。优点：?无需冲洗的检测方法提高效率，减小浪费?应用范围广，可用于贴壁细胞，悬浮细胞及免疫磁珠?可用任何波长的荧光标记?高敏感度可检测低丰度抗原

本文利用岛津超高效液相色谱仪Nexera LC-40XR连接荧光检测器RF-20A XS及四极杆飞行时间质谱LCMS-9030联用系统建立了单抗游离N糖的分离与鉴定方法，对曲妥珠单抗的N糖进行了定性与定量分析。该方法使用PNGaseF酶将N糖从单抗中释放出来，并利用2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行标记，之后使用荧光检测器RF-20A XS与四极杆飞行时间质谱LCMS-9030进行检测，荧光检测器的峰面积用于N糖的相对定量，高分辨质谱得到的精确质量数可对各峰进行定位。该方法稳定可靠，峰面积和保留时间的重复性及质量准确度均符合要求。

BioCore WCX色谱柱对IgG2 单抗中的电荷异质体具有优良的分离度，并在MES缓冲体系中显示出很好的选择性。

阿达木单抗（Adalimumab），商品名俢乐美（Humira）是由英国Cambridge Antibody Technology与美国雅培公司联合研制的一种TNF特异性重组单克隆抗体；目前销量高居全球药物销售榜首，成为最热门药物之一。临床研究表明，单抗药物的血药浓度与患者治疗效果、存活率之间存在显著关联。因此，开发血浆中阿达木单抗检测方法，用于日常监控阿达木单抗治疗的患者，有着重要临床意义。

采用纳谱分析BioCore SEC-300色谱柱对单抗中不同分子量聚合物进行分离，主峰与杂质峰可以达到良好分离，为该药物的质量保证提供检测依据，BioCore SEC适用于于生物制药中单抗和相关聚体检测。

Column:BioCore Glycan, 3 μ mDimension:3.0× 100 mmMobile Phase:A) 50 mM CH3COONH4, pH4.4B) MeCN

单抗稳定性研究是贯穿于整个药品研发、临床试验、药品上市及上市后研究的重要内容，是药品储存条件、有效期等的设定依据，也是对产品生产工艺、制剂处方、包装材料等的适用性进行判断的参考，同时也是产品质量标准制订的基础。 在单抗稳定性研究中，单抗分子往往会发生聚集，形成由小而大的不同粒径级别的聚体，这些聚体是产品相关杂质，具有潜在的免疫原性。

基于双三元液相色谱仪（DGLC），建立在线二维液相色谱方法，全自动实现单抗样品的滴度分析和聚体分离，提高单抗药物生产的工作效率。

采用纳谱分析BioCore SEC-300不同粒径的色谱柱对单抗中不同分子量聚合物进行分离，主峰与杂质峰可以达到良好分离，为该药物的质量保证提供检测依据，BioCore SEC适用于于生物制药中单抗和相关聚体检测。

Nexera Bio液相色谱系统和Shim-pack Bio SEC色谱柱在单抗SEC分析中，可以提供良好色谱峰型，带来快速有效分离，保证稳定可靠分析。

大部分mAb的等电点pI在6-10范围内，其电荷异质体的分离主要由阳离子交换(CEX)来实现。BioCore WCX创新性的微球技术保证了色谱柱的高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂的兼容性。先进的键合技术有效地阻绝生物大分子与疏水性基球的接触、最大限度地降低了生物大分子与固定相间不利的相互作用、确保单抗电荷异质体分离所需的选择性。