贝伐单抗药含量

各位大咖：　　由中国蛋白药物质量联盟主办的“2016中国蛋白药质量与技术创新研讨会” 于2016年3月，在太仓召开。关于生物药前沿进展及发展趋势的报告引发了来自生物药研发、生产、检测及 CRO企业和科研机构等参会人员的热烈讨论。而作为生物药之中的明星，单抗药物更是引来高度关注。 仪器信息网行业应用栏目，对截止到2016年3月底，仪器厂商发布在本栏目的单克隆抗体药物解决方案进行了遴选，并根据厂商解决方案的数量和质量，评选出“单抗药解决方案”排行榜。希望此榜单能够为各位仪器用户在选购相关解决方案和仪器设备时提供一定参考。此项工作会持续进行，榜单每月定期更新一次，欢迎大家持续关注。同时，我们也会在相关合作学会、协会、联盟等举办的各种学术活动上对本活动进行宣传推广。 想知道谁排第一名么？请点击“单抗药解决方案”排行榜链接：http://www.instrument.com.cn/zt/dankangyaophb 欢迎各位大咖吐糟评论！http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09510.gif

[center]研究称贝伐单抗导致静脉血栓栓塞风险增加[/center]一项新的荟萃分析结果显示，一种目前正在广泛使用的新一代抗癌药物贝伐单抗（商品名Avastin），可能会导致患者腿部或肺部静脉血栓栓塞风险增加。 此项研究由美国纽约Stony Brook大学的Shobha Rani Nalluri博士及其同事完成，其结果发表在11月19日出版的《美国医学会杂志》上（JAMA，2008,300（19）：2277-2285）。 贝伐单抗是一种血管生成抑制剂类抗肿瘤药，它能阻止和延缓新生血管的生成，阻碍肿瘤的生长及转移。由于贝伐单抗具有较好的肿瘤靶向性，以及对许多类型的实体瘤，如结肠直肠癌、肾癌、乳腺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）等均有良好的治疗效果，因此这种新一代抗癌药物在临床上得到了广泛的应用。 静脉血栓栓塞是癌症患者的一种常见并发症和致死因素，同时，越来越多的证据表明，多种抗癌药均能够明显增加癌症患者血栓形成的风险。以往的一些临床研究显示，贝伐单抗也有增加癌症患者血栓形成的倾向，但是由于这些研究涉及的病例数较少，所以一直都无法得出具有统计学意义的结论。为此，Stony Brook大学的研究人员对目前已完成的共纳入7956名不同类型晚期实体瘤患者的15项随机对照临床试验数据进行了荟萃分析，以期解开贝伐单抗是否会导致静脉血栓栓塞风险增加这一谜团。 最终，此项研究的结果显示： 1. 接受贝伐单抗治疗的患者中，有11.9%出现不同程度的静脉血栓栓塞，其中有6.3%属于严重的具有临床意义的静脉血栓栓塞。 2. 与未接受贝伐单抗治疗的患者相比，接受贝伐单抗治疗的患者出现静脉血栓栓塞的风险相对增加33%。 3. 与未接受贝伐单抗治疗的患者相比，接受贝伐单抗治疗的患者出现各种类型静脉血栓栓塞的总风险以及出现严重静脉血栓栓塞的风险均有明显增加。 4. 大剂量（5mg/kg/wk）和小剂量（2.5mg/kg/wk）贝伐单抗治疗，均可导致静脉血栓栓塞风险增加。 5. 贝伐单抗导致各类型静脉血栓栓塞的风险高低与癌症种类有关。 6. 各类癌症患者应用贝伐单抗后出现静脉血栓栓塞的风险排序为：结肠直肠癌（19.1%），NSCLC（14.9%），乳腺癌（7.3%）和肾癌（3.0%）。 研究者得出最终结论，认为贝伐单抗可使癌症患者静脉血栓栓塞风险明显增加，这种风险不仅来自于严重程度较低的静脉血栓栓塞，而且还来自于更为严重的具有临床意义的静脉血栓栓塞。研究者同时认为，此项研究将有助于临床医生和患者进一步认清贝伐单抗导致静脉血栓栓塞的危险性。虽然临床医生和患者无须因此而停止使用贝伐单抗，但在今后的使用过程中应对可能出现的血栓形成症状保持更高的警惕性。信息来源:医药经济报

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单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望[关键词] 单克隆抗体 免疫偶联物 抗肿瘤药物 单克隆抗体 (简称单抗)药物用于治疗肿瘤的研究已获得重要进展。抗肿瘤单抗药物一般包括 单抗治疗剂与单抗偶联物。研究表明，单抗药物对肿瘤相关靶点显示特异性结合，对肿瘤细 胞有选择性杀伤作用并在动物实验有显著的疗效。单抗药物已开始应用于临床肿瘤治疗。抗 肿瘤单抗药物研究的发展趋势是继续寻求新的分子靶点、抗体人源化以及偶联物分子的小型 化。由于单抗有高度特异性，研制单抗药物有巨大的潜力，单抗药物将在肿瘤治疗中发挥重 要作用。　　生物技术药物(biotechnology medicines)近年来获得迅速发展。通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的单克隆抗体(单抗)药物是生物技术药物领域的重要方面。单抗作为诊断剂或检测剂，近20年来已在医学和生物学领域得到广泛应用；单抗作为治疗剂的研究也已获得重要进展。单抗药物(monoclonal antibody agents)可能用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用于治疗肿瘤，已显示出良好的前景。抗肿瘤单抗药物一般包括两类，一是抗肿瘤单抗；二是抗肿瘤单抗偶联物，或称免疫偶联物(immunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗与“弹头”药物两部分构成。单抗所针对的靶标通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素；其与单抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自80年代以已对抗肿瘤单抗药物进行了大量研究，特别是自1997年以来，Ritux an、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗，单抗药物的研究与开发有了新的发展势头，成为生物技术药物的新热点［1，2］。 单抗药物的研究进展　　抗肿瘤单抗药物研究已取得多方面进展，研究结果为应用于肿瘤治疗的可行性提供了重要依据［3，4］。　　单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用　研究结果表明，单抗与药物偶联物或与毒素偶联物对肿瘤靶细胞显示选择性杀伤作用，对表达有关抗原的肿瘤细胞作用强，对抗原性无关细胞的作用弱或无作用。研究还表明，单抗药物偶联物对肿瘤细胞的杀伤活性比无关抗体偶联物的活性强；药物与单抗偶联后对肿瘤靶细胞的活性比游离药物强。这种选择性杀伤作用是单抗药物用于肿瘤治疗的重要基础。免疫电镜观察可见单抗或单抗偶联物能结合到细胞表面，经过受体介导的内化过程进入细胞。结合到肿瘤靶细胞表面的数量多，到非靶细胞的数量少；进入靶细胞内的数量多，进入非靶细胞内的数量少。这种特异性结合和内化进一步阐明了单抗或单抗偶联物对靶细胞选择性杀伤作用的机制。　　单抗药物具有更高的疗效　由抗人体肿瘤的单抗与药物构成的偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。偶联物与相应的游离药物比较，一般具有更高的疗效或显示较低的毒性。曾与单抗进行偶联并在裸鼠进行疗效观察的抗癌药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲蝶呤、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、顺铂以及长春碱类衍生物等。使用的肿瘤模型包括肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、淋巴瘤和白血病等。来源于植物或细菌的毒素，由于有强烈毒性，很难作为治疗剂使用；但毒素( 或单链毒素)与单抗的偶联物可在动物模型显示疗效。研究表明，单抗药物在动物体内呈特异性分布。静脉内注射抗肿瘤单抗，在肿瘤部位的浓度较高，显示特异性定位。单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征，在靶肿瘤的浓度较高。确定单抗或单抗偶联物在体内具有靶向性，为进一步阐明其疗效提供了依据。 　　单抗药物对肿瘤相关靶点的特异性作用　特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20 分子为靶点的人鼠嵌合抗体，对非霍奇金B细胞淋巴瘤有疗效，是第一个获美国FD A批准用于治疗恶性肿瘤的单抗［5］。Herceptin 是抗HER-2/neu 癌基因编码蛋白的单抗，临床研究对乳腺癌有效，与化疗药物联合有更显著的疗效 ［6］，亦已获批准用于治疗肿瘤。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道，抗 EGFr 单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验显示良好的抗癌效果。抗 EGFr 的人鼠嵌合抗体已进入临床研究［7］。转铁蛋白受体在某些肿瘤有较高的表达。抗转铁蛋白受体单抗构成的免疫毒素对脑瘤细胞有高度细胞毒性；高度恶性的肿瘤对免疫毒素的敏感性更高［8］。在人体乳腺癌和卵巢癌常见HER-2 基因扩增而且相应的HER-2 蛋白含量增高。抗HER-2 蛋白单抗与抗 EGFr 单抗联合使用对卵巢癌细胞的作用增强，显示相加的抗增殖作用。CD30 受体在霍奇金淋巴瘤的肿瘤细胞高度表达，可以作为免疫毒素攻击的靶点。近年来，以血管内皮细胞为靶点的单抗药物受到广泛关注。实体瘤的生长与血管密切相关，肿瘤细胞增殖如果缺乏相应的血管新生成将不能发展为肿瘤。以内皮细胞为靶点的单抗药物，抑制血管新生成，可能达到抑制肿瘤生长的目的；而且静脉注射的单抗药物也易于到达靶部位(内皮细胞)，不需要穿越细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道，抗VEGF 的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用，对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效 ［9］。　　单抗药物对抗药性肿瘤细胞的杀伤作用　单抗偶联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞，单抗氨甲蝶呤偶联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗性(MDR)的肿瘤细胞，抗 P-170 糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用。说明单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。 存在的问题与解决途径 　　单抗药物的临床研究结果已为其应用于治疗肿瘤展示出良好的前景，但仍有些问题需要进一步研究解决［3］。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面问题主要是人抗鼠抗体(HAMA)反应。因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备，往往导致HAMA反应。此外，肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性，肿瘤细胞的抗原性调变等也可能影响单抗药物的疗效。药理学方面的问题主要是到达肿瘤的药量不足。单抗药物在体内运送过程受多种因素影响。由于它是异体蛋白，会被网状内皮系统摄取，有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓。单抗药物是大分子物质，通过毛细血管内皮层以及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。解决问题的主要途径包括：　　降低单抗药物的免疫原性　目前多数单抗药物使用鼠源性抗体制备，在临床使用可导致HAMA 反应。据报告，在黑色素瘤、结肠癌、乳癌和卵巢癌患者，HAMA发生率高达100%。 HAMA 对注入的单抗药物起中和作用，从而抵消其疗效。避免或减少 HAMA 反应的主要途径是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。单抗人源化主要通过基因工程技术制备嵌合抗体(chimeric antibody)或改形抗体(reshaping antibody)。嵌合抗体是将 Fc 段置换为人源性，其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外，其它部分均为人源性。临床研究表明，嵌合抗体的副反应轻，HAMA 反应率较鼠源性单抗低，在血中半衰期也较长。已获准在临床应用的抗肿瘤单抗药物 Rituxan 和 Herceptin 均属嵌合抗体。　　植物或细菌来源的毒素为大分子肽类物质，具有较强的免疫原性。在人体使用免疫毒素，不仅鼠源性单抗部分可引起 HAMA 反应，而且毒素部分亦可导致产生抗毒素的抗体。使用人源化单抗仍不能解决“弹头”(毒素)的免疫原性问题。使用化疗药物为“弹头”则可避免此部分的抗体反应。　　提高单抗药物在肿瘤组织的浓度　单抗药物具有体内分布特异性，但有研究表明，能到达肿瘤细胞的药物量仍属有限。据推算，肿瘤组织的单抗摄取量约为 0.005% (注入剂量/克组织)，说明可到达靶部位的药物量甚少。单抗药物在体内的运送过程受多种因素影响。首先与肿瘤局部的血供状况有关，动物实验表明，血管丰富、血流量较大的肿瘤，用单抗药物治疗的效果也较好。　　单抗及其偶联物均为大分子物质。以IgG型单抗为导向载体、以蓖麻毒素 A 链为“弹头”制成的免疫毒素，其相对分子质量约为 180 000；用 IgM 型单抗为导向载体，偶联物的相对分子质量更大。庞大的药物分子难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。用体外培养的多细胞球体观察表明，免疫毒素对多细胞球体的穿透性很差，培养1 h 仅到达球体外周的 2 至 3 层细胞。对在裸鼠移植的肿瘤进行观察，发现静脉注射免疫毒素 1 天后，瘤结外围部分与中心部分的浓度比为 2∶1；在注射后 5 天才达到 1∶1［ 10］。使用抗体片段，如 Fab、Fab′ 制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。为提高药物在肿瘤的浓度，单抗药物分子的小型化是研制的重要途径。　　提高单抗药物在肿瘤浓度的另一种办法是局部注射。据报告，在移植人

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关于动物免疫，在多抗制备一部分里有一些讲解（点击这里查看），这里只简要讲述一下单抗制备中需要注意的几个问题。在概述部份已经讨论过，用来制备单抗的动物主要有小鼠、大鼠和兔，由于小鼠易饲养、小鼠单抗技术成熟、路线简单，因此是制备单抗使用的主流动物，这里主要以小鼠单抗制备展开讲述。免疫途径和周期：单抗制备中，免疫动物的方式一般第一针采用皮下免疫，后面的加强免疫采用腹腔免疫、腘内免疫、皮下免疫或者脾内直接免疫。首次免疫和加强免疫结束后，在融合前三天一般还要进行一次冲击免疫，以增加脾脏内浆细胞的数量。下面这张表列出了常见的免疫途径和周期：http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/11/A1384840870png_small.jpg 说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。关于操作的问题，这里只作一下简单的介绍，具体如何进行，需要在有相关经验的实验员指导下进行，也可以在网上找到相关视频进行学习。（1）皮下注射。皮下注射的操作有点像给人接种疫苗，即挑取动物的皮肤，将混好佐剂的抗原直接注射。一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。（有的资料上称这种方法为皮内免疫，造成这种概念上的混淆可能是由于早期工作者们的翻译过程出了问题），皮下操作一般由两人进行，一个协助固定小鼠，另一个进行免疫操作。（2）腹腔注射。腹腔注射比较简单，只需要一人操作，操作者由左手抓住小鼠尾巴和颈部皮肤，将小鼠翻转过来，腹部向上，将抗原直接注射到腹腔。如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。（3）尾静脉注射。个人觉得尾静脉注射是技术要求最高的一种注射方式，操作者需要固定小鼠，然后将抗原注射到小鼠尾部静脉（正中间那根血管）。小鼠尾静脉比较细小，一般新手很难操作成功，需要在其它小鼠身上多次尝试才可以进行免疫操作（站长自己尝试了十多次都未成功）。静脉注射抗原对抗原的要求更高，抗原必须不含去垢剂和其它有毒成份，否则极容易引起动物死亡，而且免疫剂量也不宜过大。（4）脾内注射。脾内注射是效果最好的免疫方式，因为这种方式使得脾细胞直接与抗原接触，所以很容易引起免疫应答反应。但是很多人都认为这种方式操作复杂，而且死亡率高，但是参考了一些文献，加上自已实践操作，站长自己总结出了一套比较好的办法，成功率基本上在百分之百。具体操作方法：先用乙醚或戊巴比妥钠进行麻醉，乙醚麻醉过程比较简单，技术含量低，对于初学者比较适用，推荐。事先准备一块棉花，将少量乙醚倒在棉花上，用一烧杯倒扣住，将小鼠也扣在烧杯下，一般在一分钟内小鼠就可以晕到，此时将小鼠取出，用胶带固定在木板或实验台上（腹部向下，背面向上。无需无菌），用手术剪刀剪开背部左侧皮肤（大至就是脾脏所在的位置，不要剪开内膜），剪开小口后，用手将剪口撕大看到腹膜内脾脏即可将用注射器刺穿腹膜，插入脾脏，直接注射抗原，抽出注射器。然后用胶水（推荐AB胶，五金店有卖的）将剪口周围的毛粘好，胶干后在伤口周围涂上抗生素即可，无需要无菌操作。由于需要用到胶水，所以手术前不要用酒精消毒。（5）小腿肌肉注射。这是康碧泉公司的Quickantibody佐剂独有的免疫方法，具体操作是：先抓紧小鼠，用无名指固定一只后腿，将小腿部分用酒精消毒，将混好佐剂的抗原（根据佐剂说明书抗原与佐剂等体积混合）直接注入到小腿肌肉，稍稍停顿后拔出注射器即可。完成首次免疫和加强免疫后，可以取出少量血清进行效价检测（参见多抗制备中的血清采集与检测），达到足够高的效价后即可进行冲击免疫，冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。在单抗制备过程中，除了通过免疫动物得到可分泌抗体的B细胞外，还可以将未免疫的小鼠脾脏取出，在体外进行免疫，从而大大加快制备周期，其基本方法是：取出未免疫小鼠的脾脏，处理成为单个细胞，然后在完全培养基中培养，同时加入一定浓度的抗原刺激其产生抗体。需要注意的是，这种方法由于不存在完整的免疫应答路径，所以只能产生出亲和力不成熟的IgM型的抗体，大部分实验中基本不能使用这种抗体（除非是专门研究IgM抗体特性）。

据新华社堪培拉4月15日电 （记者徐海静）氯喹原本是治疗疟疾的特效药，但由于疟原虫对其产生抗药性，这种药物在很多地方已经不再使用。澳大利亚和德国科学家发现，疟原虫的抗药性也有弱点，通过增加服药次数，氯喹仍然能够起作用。 澳大利亚国立大学15日发表一份声明说，该校生物学院研究人员罗伊娜·马丁和德国海德堡大学的同行共同发现，导致疟原虫产生抗药性的蛋白质也有“软肋”。 “我们研究了这种蛋白质的不同形式，在所有情况下，蛋白质将氯喹移出疟原虫体外的能力都是有限的。这意味着，能够继续使用氯喹治疗疟疾，只要每天服用两次，而不是一天一次。”马丁说。 她说，这种蛋白质能通过两种通道中的一种将氯喹移出疟原虫体外，但这一过程相当苛刻，发生任何错误，蛋白质就不起作用。这意味着该蛋白质处于相互矛盾的压力之下，这是它的弱点，在以后的新药开发中可以加以考虑。 研究人员建议，原先每天服用一个标准剂量的做法可以改成早晚各服用一个标准剂量，重点在于增加服药次数。但马丁不推荐增加单次服用剂量，因为一次大量服用会很危险。

对于未来单抗仿制药市场发展值得期许，主要原因包括：　　首先，仿制药相对于原研药价格较为低廉，市场竞争力强，尤其是在需求潜力巨大的当下，对于很多消费者来说，价格高企是导致单抗不能成为主流抗肿瘤或者抗自身免疫性疾病以及其他一些疾病的主要制约因素，随着专利到期（根据相关统计，2014-2019年，美国有四个、欧洲及其他国家有6个单抗产品专利将到期。），一大批仿制药的上市，单抗将走下神坛，虽然短时间内不能实现平民化，但市场规模的大幅增长已经可以基本确定。　　其次，随着我国医药企业研发能力的不断提升，单抗仿制药在临床应用效果上也将较原研药进一步缩小。价格相对低廉、较好的用药疗效将势必带来单抗用药比率的提升。　　第三，虽然目前国家还没有明确的生物仿制药研发指导原则和相关法规，但根据相关部门透漏，目前药品监管部门已经在加紧完善相关法规了，预计政策年内就会出台。另外，国家已经正式启动了生物类仿制药监管准则的编制，预计年内就将向企业发布技术指南。前瞻产业研究院认为，国产仿制药在专利解禁期来临后尽快上市，将极大提高生物药对普通百姓的可及性，从目前国内单抗仿制药的研发进展来看，更是如此。

从人类发明这个技术开始，单抗制备已经有37年的历史了，这37年以来，主流单抗制备的基本主线几乎没有什么改变，也就是下面这个流程： 抗原制备 动物免疫 细胞融合 克隆筛选 克隆化（亚克隆） Large-scale生产、纯化以及鉴定 但是不同的研究人员从不同的角度和细节对整个流程有了独到的视角，这里我简单地总结一下近十年以来的发展和前人的经验，基本都是站长自己道听途说，加上参阅一些文献总结出来的， 十年以前的技术革新择重点简要提一提。 抗原制备进展 抗原，基本上分三类： 蛋白、多肽和小分子化合物。 一般的制备过程没什么好说的了， 主要说多肽和小分子连载体的事。 多肽和小分子因为免疫原性弱，所以必须连接载体才能诱发免疫应答。 最常用的基本上就是KLH, BSA,OVA和GST， 但是觉得近几年以来，用多肽复合抗原肽（MAP）的比较多。其原理是把多肽或小分子连在多聚赖氨酸的骨架上，而多聚赖氨酸因为其结构具有高度重复性，所以不会像KLH等载体一样使动物产生抗体，这样就不会浪废有限的免疫系统资源。 毛病是这种形式的抗原在制备成本上贵许多，我记得一个MAP的制备报价大约在1500元人民币左右。 从获取方式来看，对于蛋白质类抗原，不仅可以重组表达（原核和真核）， 还可以直接从天然组织或细胞中分离。早期的时候人们经常干这种事，那是因为当时没有现在这么普及的分子生物学技术，很难得到重组蛋白。 但是最近20年以来，基本上都用重组蛋白了，重组蛋白生产技术非常成熟，而且生产也简单，容易扩大规模，但是慢慢地很多人意识到重组蛋白和天然的蛋白在结构上有时候有着极大的差异，所以不少人认为确实是天然蛋白免疫得到的抗体是最好的，有兴趣可以看看这篇文章：Generation and Characterization of a Panel of Monoclonal Antibodies Against Distinct Epitopes of Human CD146，一个典型的从天然组织中纯化出蛋白作为抗原制备单抗的例子。 在抗原的形式上，也是各式各样，根据自己的需要有不同的喜好，大部份人都推荐接近天然构象的蛋白，即使是重组蛋白，buffer 也尽量gentle， 另一些人则喜欢跑胶然后切胶打动物，还有的转膜后剪膜免疫动物（这一个通常和从天然组织中纯化的方法联用）。 还有人喜欢用过表达的细胞或转化的细菌作为免疫原（当然也有全细胞或者细胞组份裂解液作为免疫原的，此乃后话）。对于做免疫组化用的单抗制备，则还有更特殊的处理手段。 另一些人则认为，用DNA直接免疫也许更好。其方法是把cDNA连到真核表达载体中，然后直接注射动物，在佐剂的作用下载体就带着cDNA进入动物细胞，然后在动物细胞就有目的蛋白表达出来，这些蛋白从细胞释放出来后就可以引起免疫应答（整个理论还没有建立完整，一切都在YY中）， 这种方法免疫中，现在缺少有效的佐剂，所以免疫效果很难保证，不过在比较低的效价下，很多人也可以得到阳性克隆。 说了这么多，还是很沮丧，虽然看起来选择很多，但是能真正用到工作中的选择并不多，有时候是条件问题，有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。 动物免疫 动物免疫故事比较多，简单点说。 实验动物的选择： 做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论，epitomics对其有特殊的专利，这个基本上和咱们没关系。小鼠，用得最多的还是Balb/C了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0, X63, Ag8.653,FO和NSO）都来自于Balb/C小鼠，为了使hybridomas稳定，所以实验小鼠基本上还是Balb/C。 不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的，原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型，一般在5个月以下时基本不会发病，但是对自身的蛋白仍然有潜在的排斥反应。 免疫佐剂： 这一个方向在近十几年以来倒是发展得很快。 最开始的时候Sigma的弗氏完全佐剂和不完全佐剂一直是黄金组合（铝盐佐剂也用得比较多），但是后来人们发现CFA/IFA毛病很多，诸如不利于动物健康、刺激免疫应答周期过长等等，于是各种新式佐剂层出不穷，几乎每家试剂公司都有自己独特的佐剂。而且有效成份也多种多样，如脂质体，CpG，细胞因子，分子伴侣，特殊化学药物（如左旋咪唑）， 细菌或病毒的全部组份或部份（如LPS，肽聚糖），甚至还有一些是中草药提取物（如蜂胶、皂甙，当归多糖）…… 在形式上，大部份还是延用了CFA/IFA的油乳性质，但是这两年来免乳化佐剂在国内发展比较快，如我们现在使用的Quickantibody就是，武汉这边还有另一个产品叫赛弗诺的也与其类似，同时这些新型的佐剂对抗原的使用量要求很低，而且免疫周期也短，所以比较受欢迎，毛病是商家对机理保密，用户无法获知其可能潜在缺点。 总之最后就变成了一种根据个人喜好而选择的产品。 当然另外还有人说佐剂不是必须的，不加佐剂也可以免疫得不错，站长自己没尝试过。 免疫部位：这个没什么好说的了，也基本上是根据喜好来的，皮下、腹腔、脾内、肌肉、腋下、脚垫、静脉，各种地方免疫都说得过去，而且大家都能成功，所以这个就没什么好选择的了，不过大部份人还是认为皮下是最有效的，因为皮下含有大量的DC细胞，而DC细胞是重要的APC。 这里需要提出的是有一种叫作RIMMS的免疫方式极少人用到，但是据说效果不错。 RIMMS即多位点重复免疫（repetitive immunizations multiple sites），意思是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫，一般是在小鼠背上皮下选择四五个点，每三天左右在这些点进行低剂量免疫，一般十几天就可以完成免疫。 大家可以看这篇文献：Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS和这篇：Shorter development of immunoassay for drugs application of the novel RIMMS technique enables rapid production of monoclonal antibodies to ranitidine， 不过成功的实例中，很多人都是取小鼠的淋巴结而非脾脏进行融合的，淋巴结不好取啊。 免疫周期和间隔： 大部份人基本都同意免疫周期和免疫间隔尽量长一点比较好，这样得到的抗体亲和力更高（除了上述的RIMMS外）。 甚至有人打完第一针后，再过九个月才打第二针的，作者说效果很好，这个方法显然不适合大规模免疫，不然动物管理的压力咱们是承受不起的。另外，一些新型的佐剂则强调短周期也可以得到高亲和力的抗体的， 市场上有很多佐剂宣称两周内即可完成免疫并得到高效价的血清的，实在是太快了。另外最近有文献还对白天免疫动物还是晚上免疫动物更好这一问题作出了探讨，比如这篇：The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity ， 作者认为一些调控免疫的分子也有生物节律性，它们的表达水生是跟随生物钟有规律变化的，在这些调节分子表达水平比较高的时候进行免疫或许可以得到更好的免疫效果。

[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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[align=center]抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展[/align][align=center] [/align][align=center]摘　　要[/align][align=center] [/align]　通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物,已经成为生物制药领域的一个重要方面,特别是对抗肿瘤单克隆抗体药物的研究已获得了重要进展。多年来,许多研究证实了抗肿瘤单克隆抗体药物的作用,为其应用于肿瘤治疗提供了重要依据。这类药物的特异性强，疗效显著。本文主要就近年来抗肿瘤单克隆抗体药物的研究进展进行了综述，并对抗肿瘤单克隆抗体药物的发展前景进行了展望。[align=left] [/align][align=left]关键词：抗肿瘤；单克隆抗体；研究进展[/align][align=center] [/align][align=center] [/align][b]一 引言[/b]抗肿瘤单抗药物因与烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、铂类配合物、植物药等抗肿瘤药物相比,具有高效价、高特异性、血清交叉反应少等特点与优点,在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。单抗药物是当前生物技术药物领域甚为活跃的部分。针对特定的分子靶点(抗原),单抗有高度特异性。针对各种不同的抗原,可以制备为数众多的、各不相同的单抗；因此,作为药物来源,单抗又具有高度多样性。由于其特异性和多样性,研制单抗药物有巨大的潜力。单克隆抗体药物治疗恶性瘤主要机制有两种[sup][/sup]:一是利用单克隆抗体本身来阻断癌细胞生长的信号,单克隆抗体在癌细胞膜外与生长因子竞争结合受体,阻断信号传递过程,从而阻止癌细胞的生长和扩散,诱导细胞凋亡或者间接激活宿主的抗肿瘤免疫反应；二是利用单克隆抗体作为药物载体的靶向治疗,如将有细胞毒性的药物或有放射性的药物靶向性的运送到肿瘤细胞,从而杀伤肿瘤细胞。目前,国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞,利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。此外，研究表明静脉内注射抗肿瘤单抗,在肿瘤部位的浓度较高,显示特异性定位；单抗与药物的偶联物通常仍保留原来单抗的分布特征,在靶肿瘤的浓度较高[sup][/sup]。[align=center]二　　单克隆抗体药物作用靶点[/align]特定受体或特定的基因表达蛋白可能作为单抗药物的靶点。Rituxan是以B细胞的CD20分子作为靶点的人鼠嵌合抗体,对非霍奇金氏B细胞淋巴瘤有疗效,是第一个获美国FDA批准用于治疗恶性肿瘤的单抗。Herceptin是抗HER-2/neu癌基因编码蛋白的单抗,临床研究对乳腺癌有效,与化疗药物联合有更显著的疗效。Mylotarg是由抗CD33单抗与calicheamicin构成的偶联物,已获批准用于治疗急性复发性髓性白血病[sup][/sup]。表皮细胞生长因子受体(EGFr)在人的鳞癌、乳腺癌和脑胶质瘤等均有较高的表达。有报道,抗EGFr单抗与长春碱衍生物的偶联物在裸鼠体内试验,显示良好的抗癌效果。抗EGFr的人鼠嵌合抗体已进入临床研究。血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中有重要作用。据报道,抗VEGF的中和性单抗具有广谱的抗肿瘤作用,对移植于裸鼠的人体癌瘤有显著疗效[sup][/sup]。[b]三 单抗诱发肿瘤细胞凋亡[/b][align=left] 3.1 通过免疫细胞表面抗原的交联作用而诱导恶性肿瘤细胞的凋亡[/align]用于治疗血液系统恶性肿瘤的单克隆抗体药物大多是通过免疫细胞表面抗原的交联作用诱导恶性肿瘤细胞凋亡而起作用的,如目前用的抗-CD20的单克隆抗体——美罗华。其单克隆抗体的作用机制是通过诱导CD20分子在B细胞膜上的脂筏区聚集,再在一系列激酶的作用下使脂筏信号传导区域的CD20分子亲和性增强,从而形成CD20交联形式；交联的CD20分子启动了细胞内凋亡信号的传导通路,使线粒体释放出细胞色素C,激活下游的caspase级联反应,最终导致细胞凋亡[sup][/sup]。3.2 作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体而诱导细胞凋亡许多生长因子及其受体通过作用于细胞的存活途径、刺激细胞的有丝分裂、促进细胞的生长增殖来阻止细胞凋亡。与正常细胞中生长因子信号传导的严格调控相比,肿瘤细胞中的失控则导致细胞的恶性增殖,从而使恶性细胞获得“永生”。单克隆抗体通过作用于恶性肿瘤细胞膜上的生长因子及其受体可阻断存活信号传导通路,从而导致其凋亡,同时还能对化疗和放疗有正协同作用。目前主要集中在对血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、表皮生长因子受体(EGFR)等的研究。美国FDA于2006年批准了第一个用于治疗头颈部鳞状细胞癌的单克隆抗体药物——Cetuximab,它为一种IgG1单克隆抗体,主要通过干扰癌细胞表面EGFR的生长,从而减少癌细胞进入正常组织的概率,控制癌细胞的转移,达到抗癌目的[sup][/sup]。最初想到制备针对恶性肿瘤凋亡相关分子的单克隆抗体药物时,虽然从理论上来说无疑是给人们注入了一针兴奋剂,但在实际应用中则并不然,所以在通过单克隆抗体药物诱导恶性肿瘤细胞凋亡的研究和治疗中,还有待进一步开发新的、更经济、更有效地药物。[b]四　 单克隆抗体耦联物[/b]4.1 抗体与化疗药物耦联目前,国内外研究较多的与单克隆抗体耦联的化学药物有平阳霉素、柔红霉素、丝裂霉素、多柔比星(阿霉素)、顺铂以及长春碱类衍生物等。同时还可以通过脂质体靶向制剂作为化疗药靶向治疗肿瘤,利用脂质体制剂将药物导向靶标进行有选择性地杀伤癌细胞和抑制癌细胞的繁殖,以达到提高疗效和高度定向作用。目前已上市的脂质体有复方氟脲嘧多相脂质体、喜树碱多相脂质体、阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体等。4.2 抗体导向酶耦联利用抗体与肿瘤细胞表面抗原的特异性结合,将前体药物的专一性活化酶与单抗耦联,导向输入到靶细胞部分,再注入前体药物,使其在酶的作用下转化为活性药物,进而杀伤肿瘤细胞[sup][/sup]。目前这种用作前体药物的抗癌药有苦杏仁苷、氮芥、鬼臼乙叉苷、阿霉素、丝裂霉素等。而作为活化前体药物的导向酶有碱性磷酸酶、青霉素V或G酰胺酶、羧基酶肽、胸腺嘧啶核苷酶、β葡萄苷酶等。临床研究表明，单抗耦联物对于抗药性肿瘤细胞仍显示较强的杀伤活性。对由于长期使用氨甲蝶呤而出现抗药性的成骨肉瘤细胞,单抗氨甲蝶呤耦联物仍显示较强的杀伤作用。对于具有多药抗药性(MDR)的肿瘤细胞,抗P-170糖蛋白单抗构成的免疫毒素可显示选择性杀伤作用[sup][/sup]。这说明,单抗药物有可能用于克服肿瘤细胞抗药性。[b]五　　单克隆抗体靶向药物[/b]单抗靶向药物是利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物的疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。研究表明,单抗靶向药物具有很好的疗效,在免疫偶联物对移植于裸鼠的相应人体肿瘤生长有抑制作用。免疫偶联物与相应的游离物比较,具有更高更好的疗效和较低的细胞毒性[sup][/sup]。单克隆抗体体积小,能更有效地透入肿瘤；分子小、消除快、累积毒性小；所携带的弹头脱离后,可较快被清除 循环中免疫靶向结合物对靶细胞的竞争作用小；半衰期短；穿透性好；能穿过血脑屏障[sup][/sup],因而还可以作为新一代靶向载体。与化学药物、毒素、放射性核素、生物因子、基因、分化诱导剂、光敏剂、酶等物质构成单克隆抗体靶向药物,把杀伤肿瘤细胞的活性物质特异的输送到肿瘤部位,利用单抗对肿瘤表面相关抗原或特定的受体特异性识别,从而把药物直接导向肿瘤细胞,提高药物疗效,降低药物对循环系统及其他部位的毒性。近年来,随着医学、药学和生物工程学及技术的进步,临床对肿瘤的根治和对癌细胞的攻击锁定于表皮生长因子和血管内皮生长因子等靶位,使药物治疗的切入点由细胞水平提升到分子和抗体水平,从而提高了肿瘤综合治疗的效果。[align=center]六　　人源化单克隆抗体[/align]单克隆抗体是近年竞相开发的品种,自1997年第1个单克隆抗体rituximab通过食品与药物管理局(FDA)批准应用于临床以来,目前已经上市的单克隆抗体靶向药物的疗效令人瞩目,在抗肿瘤、类风湿性关节炎和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广,其以独特的作用优势,在肿瘤的治疗中不但能够选择性杀伤癌细胞,且在体内表现出特异的分布特性,具有高效、低毒的特点,从而在生物技术产品领域中占据了1/3的市场[sup][/sup]。目前用于治疗肿瘤的单克隆抗体药已有多个,包括伊珠单抗奥加米星、帕尼单抗、曲妥珠单抗等。伊珠单抗奥加米星又名CMC-544，是以人源化抗CD22的抗体伊珠单抗与 CalichDMH偶联形成的ADC药物，用来治疗复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤（B cell-NHL）和急性淋巴细胞白血病（ALL），目前已经进入临床 III期试验[sup][/sup]。帕尼单抗是一种IgG2单克隆抗体完全人源化可以与EGFR高度特异性地结合，进而阻断配体诱导的信号激活，从而抑制肿瘤生长。有临床研究选择既往未治疗过的ⅢB或Ⅳ期非小细胞肺癌患者比较卡铂(AUC=6，每3周)，加紫杉醇(200mg/m21次/3周) 联合或不联合帕尼单抗(2.5 mg/m2，1次/周) 化疗的疗效及其安全性。研究结果显示，单纯化疗组与帕尼单抗联合化疗组之间在PFS(5.3个月对比4.2个月、P=0.55)和总生存( Overall survival，OS)(8.0个月对比8.5个月，P =0.81)上均无显著差异。结果提示帕尼单抗联合一线化疗方案可能对晚期非小细胞肺癌无明显疗效[sup][/sup]。曲妥珠单抗是一种抗Her2的单克隆抗体，他可以和肿瘤细胞的HER2/neu特异性地结合，从而阻断细胞内生长信号的转导，同时曲妥珠单抗还可以诱导体内巨噬细胞以及自然杀伤细胞攻击肿瘤细胞，以达到抑制和杀伤肿瘤细胞的目的。比较用或不用曲妥珠单抗联合一线化疗方案用以治疗ⅡB/Ⅲ期HER2/neu阳性的 NSCLC患者差异的两项大型的随机Ⅱ期临床试验，其结果显示两个试验结论相似，曲妥珠单抗不能提高化疗的疗效,但也不加重化疗的不良反应。试验中HER2/neu值为3+的患者对曲妥珠单抗治疗的反应性较好，提示曲妥珠单抗对这一较少见类型的NSCLC效果要更好[sup][/sup]。在临床治疗中使用鼠派生单抗的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体(HAMA)反应,通过基因工程技术制备嵌合抗体的I-IPdVIA反应率较鼠源性单抗低,但完全的人源抗体才是单抗药物的发展目标。噬茵体抗体库技术和转基因小鼠技术是制备完全人源单抗的两种方法[sup][/sup]。因此,只有不断地完善单克隆抗体人源化的技术,才能更好地将完全人源化的单克隆抗体用于肿瘤分子靶向治疗中,从而使医学界迈向更高的台阶。[b]七　　问题与对策[/b]在限制单克隆抗体临床治疗效果的因素有:(l)循环免疫复合物导致的肝肾功能损害。(2)可溶性肿瘤抗原释放造成的体液中的封闭作用。(3)异种蛋白反应。(4)特异性还不够专一,引起了正常细胞的伤害。(5)天然免疫功能低下(如补体介异的细胞毒,网状内皮系统清除和ADCC作用等)。(6)主要的问题还在这种免疫疗法会导致靶细胞(肿瘤细胞)上抗原的转换。为了解决这些问题,今后的研究应着重:(1)制备对肿瘤抗原有高度特异性的单克隆抗体。(2)选择不易诱导抗原转换的单克隆抗体。(3)研究副作用较少,既安全疗效又高的偶联制剂。单抗（Mab）药物存在的一个最关键问题就是人抗鼠抗体反应（HAMA）。由于用于临床研究的Mab药物一般使用鼠源Mab,这不可避免地会引起HAMA反应,所以尽量避免HAMA反应这一副作用才是Mab药物能否真正适合治疗肿瘤性疾病的重点[sup][/sup]。近些年来,Mab药物的研究主要是向减轻宿主对外源抗体的排斥,促进抗体人源化,改变抗体的氨基酸序列而增加或降低该抗体的生物学效应,加抗体的亲和力,制备双特异性抗体,改造抗体重链恒定区以增强抗体功能,以及寻找新的分子靶点(相对特异的肿瘤抗原)等方向发展[sup][/sup]。Mab药物的不断更新,必将为全球的肿瘤患者带来更大的希望。[align=center]八　　总结与展望[/align]目前肿瘤治疗中使用最广泛的仍是化疗以及放射性疗法,其毒副作用较大。随着基因工程技术和DNA重组技术的兴起,利用单克隆抗体治疗肿瘤已经日渐取代副作用较大的传统疗法而成为新的发展趋向。所以,如何研制更多的单克隆抗体以及怎样更好的利用单克隆抗体治疗肿瘤,将成为肿瘤治疗研究中的又一艰巨任务。同时,生物技术以及抗肿瘤化学药物的发展也必将推动单抗药物的发展与进步,单克隆抗体药物将在各种肿瘤的治疗中发挥越来越重要的作用。在未来10年内,单克隆抗体药将成为国内、外生物药品发展的主旋律。此外，利用与肿瘤细胞相关抗原的特异结合力,相应的单克隆抗体可以用于肿瘤早期诊断和预后判定。例如用放射标记抗体能够确定肿瘤存在的位置,扩散的部位和范围,以便确定手术时机和化疗方案。通过测定抗体结合白血病细胞的增减,可以检查白血病的化疗效果[sup][/sup]。利用单克隆抗体检测某些癌的特异性产物,如前列腺癌产生的酸性磷酸酶,绒毛膜上皮癌产生的促性腺激素,结肠癌产生的癌胚抗原及肝癌产生的甲胎蛋白等,有助于癌肿的早期诊断[sup][/sup]。单克隆抗体在肿瘤的治疗中的作用功不可没，但同时也面临着巨大的挑战，例如如何选择优势人群、进一步提高疗效、降低不良反应的发生都是需要进一步解决的。如贝伐单抗的突出不良反应是出血，在NCCN指南中特别指出贝伐单抗仅适用非鳞癌的[sup][/sup]，既往无咯血史的患者，限制了贝伐单抗的临床应用。而其他大部分单克隆抗体均需与其他化疗药物联用，单独应用的疗效仍有限，选择合适的指标以及合适人群应用单克隆抗体仍任重而道远。[b]参考文献[/b] 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如题，用CE-SDS方法分析单抗，做了一段时间，也有了一些数据，但不知道该怎样准确理解这些数据。首先Becman提供的一个文献里（见附件），作者测了一个已知NG（non-glycosilation)含量为9%的IgG,分别在reduced和Non-reduced条件下测定。结果是，两个条件下测出的NG含量基本一致，接近理论值，并且重链和轻链的比例也是接近2.而我现在做的那个抗体，在reduced条件下和在non-reduced条件下测得的NG含量差异较大，reduced条件下的要明显低于non-reduced的。并且重链和轻链的比值不是接近2，而是2.5。我用PNG酶切过之后，NG出峰位置含量明显增加。另外我还做了几个stressed的样品，比如双氧水氧化的，比较明显的是在Intact-mAb(non-reduced条件）和重链前（reduced)出现很大的峰。下面是几个问题：1. 理论上，reduced条件下测得的NG含量应该是和Non-reduced条件下测得的接近（同文献）还是说其实这是CASE BY CASE的？因为是和UV吸收有关，如果几个有紫外吸收的氨基酸在轻重链上的分布不均衡，比如在轻链上更多，那轻链的响应值就会比较高，这样轻重链的比值就不是简单的1:2了。而NG的含量在两个条件下也就不一定相关了。2、双氧水处理之后产生了Mw不一样的峰，可能是什么东西，是破坏了什么键产生的？3.为什么单抗的CE-SDS分析通常都做还原和非还原的条件，二者所得的数据是怎样互补的？谢谢大家的答疑解惑，欢迎交流！补充一个疑问，是关于还原和非还原条件的。还原条件用的是巯基乙醇，打开二硫键；非还原条件用的是250mM的碘乙酰胺。我经常在文献上看到是这么说的：还原时先用巯基乙醇打开二硫键，然后再加烷化剂碘乙酰胺保护已生成的巯基，避免重新生成二硫键。然后我就很纳闷，那为什么再做CE-SDS的时候，还原时用了巯基乙醇后不再加烷化剂保护巯基，而非还原的时候为什么要加碘乙酰胺，是要保护单抗中的游离巯基么（没理由啊？？）

国药重大发现：德尔塔等变异毒株治疗或迎来特效药，单抗对德尔塔变异株有效；

1. 为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？答：可以从这几个方面一一考虑：（1）设计的抗原与被免疫的动物内源蛋白有极高的同源性或者抗原是免疫原性极差的小分子物质。对于前一种情况应该重新设计抗原，设计抗原时尽量选取目标蛋白特异性的序列，可以设计为短肽然后再与载体蛋白偶联之后免疫；对于后一种情况，首先确认小分子物质是否已经正确地和载体蛋白偶联，如果偶联没有问题，可以更换其它的载体蛋白，一般来说KLH是所有载体中较为优先考虑的蛋白。（2）免疫的周期不正确。免疫周期过长或过短，各免疫步骤之间的间隔过长或过短都有可能影响免疫效果，详细请参考本站有关动物免疫的部份，实际操作中的相关程序与本站推荐的程序相差尽里不超过50%的偏差。（3）免疫佐剂不合适。TiterMax等佐剂在免疫时，对于某些抗原可能效果不佳，弗低佐剂也不能保证完全有效，此时可以考虑更换佐剂尝试。（4）免疫剂量不合理。过大的免疫剂量可能导致免疫耐受，过少的免疫剂量可能无法激活免疫应答。一般来说，实际免疫剂量与本站所推荐的剂量不要相差两倍以上。（5）免疫途径不合理。对于有些免疫原性弱的抗原，可以考虑脾内免疫方法，具体操作本站上也有详细的讲解。（6）测效价的过程存在错误操作，尤其考虑包被是否成功或二抗使用是否正确。同时，一抗（即血清）稀释梯度尽量放宽，一般建议从1：500或1：1000开始作梯度稀释。对于小分子物质，效价达到1：2000仍可视为免疫成功。2. 为什么融合后细胞不长或者融合后克隆很少？答：可以从这几个方面考虑：（1）免疫用的动物品系不正确或者品系不纯。免疫用的动物一般应该与骨髓瘤来源的动物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤细胞时应该选用Balb/C小鼠，同时必须使用品系纯正的小鼠。（2）培养基中加入了过高浓度的HAT，或者仅A的浓度过高或HT的浓度过低，建议用纯的骨髓瘤和已有的杂交瘤作HAT浓度筛选。（3）培养基不正确或血清浓度不正确或使用了劣质血清。（4）未正确制备饲养层细胞。参见本站有关饲养层细胞制备的部份。（5）接种杂交瘤细胞的培养板过多。一般在5-20块96孔板为宜。（6）融合后，未及时转移或稀释细胞。有人在做融合后喜欢把融合的细胞先放在培养瓶中培养，然后再滴到96孔板上。如果在培养瓶中培养的时间过长，也可能出现克隆利率少的情况。（7）细胞被污染。在显微镜下仔细观察是否有明显的微生物污染。即使看不到有明显的微生物，也应该考虑是否有支原体污染，有条件的可以做支原体检测。（8）细胞培养条件不正确，确保细胞培养在恒定的37度较湿的环境，同时保证CO2浓度在4-5%左右。（9）其它与融合条件相关的不恰当的因素。详见本站有关细胞融合的部份。3. 为什么融合后得不到阳性克隆？答：可能的原因：（1）动物未免疫成功就进行了融合。具体解决方法参照本页面第1个问题。（2）融合后得到的克隆较少，故得到阳性克隆的机率也较小。具体解决方法，请参照本页面第2个问题。（3）筛选克隆手段不正确。例如有些小分子物质不可以直接包被到酶标板上，再如使用了不适当的二抗等诸多因素，也有人直接不使用ELISA作为筛选方法的，成功率也有待商榷。（4）抗原成份与细胞培养条件中的物质相同或类似，或者与筛选过程中有同抗原结构相同或类似的物质产生了竞争反应。举个简单的例子，如果需要制备抗BSA的单抗，则养杂交瘤的培养基中不可以使用牛血清，否则牛血清中的BSA直接与抗体相结合，最后做ELISA筛选的时候无法得到阳性结果。解决的办法只有使用其它的动物的血清或者使用无血清培养基。再如，如果需要制备酪蛋白的单抗，则做ELISA筛选时，二抗的稀释液不可以使用脱脂奶粉。（5）其它所有能影响ELISA等相关筛选手段的因素。这一部份详见本站有关ELISA实验的讲解与讨论。4. 为什么我的细胞生长很慢？答：可能的原因：（1）使用了劣质的培养耗材、培养基、血清、HAT或HT。建议新手使用知名厂商的试剂或耗材。对于血清，可能需要从多个厂家选用多个批次试用，选择出比较好的批次进行实验。在试用血清的时候，一般可以使用相对较低浓度的血清进行骨髓瘤细胞培养实验，根据骨髓瘤细胞的倍增速度确实血清质量。（2）使用的血清或培养基浓度不正确。仔细检查配方是否正确。（3）制备饲养层的方法不正确。参见本页面第二个问题。（4）其它问题，可以参考本页面第二个问题。5. 我的克隆原来是阳性的，为什么后来转为阴性了？答：首先要注意的是，正常情况下，杂交瘤也不是绝对稳定的，确实容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些办法尽量减少阳性变为阴性的办法。一般可以从这几个方面加以注意：（1）永远保证细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般来说，当细胞增长到一定密度的时候，培养基就开始变颜色，这个时候就要准备换培养基了，除了换培养基，同时应该控制好细胞的密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。（2）对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。（3）不要过于频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大的时候，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。（4）对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。（5）当细胞被支原体等微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。6. 为什么我做亚克隆后长不出克隆来？答：亚克隆失败的原因和克隆不长的原因类似，但是除此之外，也还有一些独特的原因。（1）亚克隆时，原始孔里的细胞状态不好，经过有限稀释或其它手段亚克隆的细胞活性很差，以至于长不出克隆。（2)亚克隆时，没有按照正确的数量取出细胞，在本站有关亚克隆操作的页面上提到过，亚克隆的过程服从泊松分布，如果取出的细胞远远低于平均每孔一个细胞，或有效细胞远远低于平均每孔一个细胞，则也可能出现长不出克隆的结果。（3）未添加饲养层细胞。单个细胞在完全培养基中极难培养，如果不添加饲养层细胞，则它们很可能很快就死亡，最终就长不出克隆。（4）使用的HAT中HT失效或A的浓度过高，或者未添加HT。 虽然HT对杂交瘤的生长并不是必须的，但是HT确实可以加快细胞生长，改善细胞生长状态。（5）使用无血清培养基。这一点是很冷僻的一个因素。虽然很少有人使用无血清培养基制备单抗，但是在某些血清可能干预筛选步骤的实验的时候，可能会选用无血清培养基来培养杂交瘤，但是需要注意的是，在很多种无血清培养基中，单个细胞是很难长成克隆的。最好的解决办法就是先用含有血清的培养基培养它们，等克隆长出后再把培养基彻底更换为无血清培养基。7. 为什么我冻存的细胞很难复苏或者复苏不活？答：这个问题要从两个方面来回答，一是冻存方面，二是复苏问题。 对于冻存过程，需要注意：（1）冻存液的配方。这个问题很关键，一个良好的冻存液配方可以使细胞保存得非常好，而一个不好的冻存液配方可能会让细胞倾刻死亡。目前认为比较好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%养过杂交瘤的培养基，不管是哪一种，冻存保护剂DMSO的含量非常重要，如果这个浓度过低，则起不到保护作用，冻存的细胞最终会死于冰晶形成时的张力，如果浓度过高，则细胞中毒而亡。如果使用第二个配方，注意一定要用养过杂交瘤的培养基，而尽量不要用一般的完全培养基，而且一定是配养需要冻存的那一株的培养基。文献中也有提到用甘油作为冻存保护剂的，站长自己没有亲自试过，不发表评论。如果新手确实对这个没把握，市场上也有商品化的冻存液，买回来按照说明书操作就OK了。（2）冻存过程中，不可用力过大，在冻存液中重悬细胞的时候更是要轻柔，因为在DMSO存在的条件下，细胞膜变得非常脆弱，如果用力过猛，则细胞膜很容易破，复苏成活的机会就明显会下降。（3）冻存的程序也非常重要。实践表明，以每分钟1 ℃的速度下降冻存细胞是最理想的。如果条件简易，可以把细胞放在4 ℃半小时左右，然后再在-20 ℃放置1-2小时，最后转入-80 ℃放置过夜，最终转入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。现在市场上有比较贵的冻存盒，把需要存放的细胞放进去，然后直接放-80 ℃就行，等时间够长后直接转至液氮中即可。（4）细胞需要保存在液氮的气相中，而不是泡在液相里。否则液氮很容易进入冻存管。这一点很多人都没有注意，大部份人都是直接往液相里放，其实这是错误的。有人认为，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，这些微生物或孢子就有机会进入冻存管，最终可能造成细胞污染。（5）保证被冻存的细胞处于良好的生长状态，并且没有被污染。对于复苏过程，需要注意：（1）快速。为了防止升温中细胞内产生冰晶，强烈建议加快融化过程。一般都要用用足够体积的37 ℃热水复苏，并不断晃动冻存管。（2）复苏过程不要把冻存管全部泡入水中，也不要把盖子弄湿，否则热水有可能污染管口，造成复苏的细胞被污染。（3）有的人复苏细胞时，没有去掉冻存液，

[align=left][/align]【作者】：崔靖 韩冬梅 徐隆昌 韦薇【题名】：曲妥珠单抗生物类似药质量"相似性评价标准"探讨【期刊】：药学学报【年、卷、期、起止页码】：2021-01-01【全文链接】：10.16438/j.0513-4870.2021-0998

治疗癌症药物价格有望降低一半以上2012年11月07日 来源： 中国科技网 作者： 周佳乐 王春 中国科技网讯 11月5日，上海交通大学对外发布消息，由教育部“长江学者”特聘教授、上海市领军人才唐克轩博士领衔的科研团队，历经8年，发明了长春花代谢调控、代谢工程技术，在国际上率先建立了长春花遗传转化再生植株体系，解决了困扰世界数十年的长春花遗传转化并再生植株的难题，培育出了用于治疗癌症的元素含量大幅提高的长春花。该成果有望使治疗癌症的药物价格降低一半以上。 长春花是在化疗阶段治疗癌症的药物提取源，被称为“生命花”。长春花体内有130多种生物碱，其中长春碱和半合成衍生物长春瑞滨是与肺癌、乳腺癌、睾丸癌和卵巢癌等作斗争的首选药物。但是由于长春花中文多灵和长春质碱含量仅占植物叶片干重的千分之一，1公斤的长春碱或长春瑞滨原料药价格均超过100万人民币，化学合成成本太高。 十多年来，国外一直在对这一属植物所含生物碱进行分离、结构测定、化学合成和药理研究，但都无法深入。唐克轩领衔的科研团队通过代谢技术，使长春花体内的文多灵和长春质碱的含量达到叶片干重的2.5‰—5‰，提高了1倍以上，长春碱含量也提高了近1倍。这意味着，改良之后的长春花体内抗癌生物碱的含量增加了1倍以上。此外，该团队还发明了喷洒技术，使长春花中抗癌“法宝”含量增加30%以上。（周佳乐 记者 王春） 《科技日报》（2012-11-07 三版）

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/news/optimizing-pk-assays-with-anti-idiotype-antibodies][b]抗独特型抗体[/b][/url]在生物医学领域中具有重要地位。作为一种高度特异的免疫分子，它能够精确识别并紧密结合其他抗体或抗原的独特型位点，进而在疾病诊断、治疗和生物标志物发现等多个方面发挥关键作用。因此，在药物研发过程中，对生物药的安全性和疗效评估显得尤为关键。尤其是在对原研药和生物仿制药进行药代动力学（[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]）分析和抗药抗体（[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]）测定时，抗独特型抗体更是衡量患者样本中抗体药物浓度的有力工具，并可用作抗药抗体（[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]）的阳性对照。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]一、药代动力学（[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]）分析[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]药代动力学（[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]）描述并表征了药物在人或动物体内的四个不同阶段：吸收、分布、代谢和排泄（也称为[/font][font=Calibri]ADME[/font][font=宋体]）。在药物开发中，[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]分析提供了药物与身体相互作用以及疗效强度和疗效持续时间的基本信息。在开发生物仿制药时，需要通过比较[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]分析来评价与原研药在生物活性的潜在差异。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]根据结合模式和性质的不同，抗独特型抗体可分为三种类型：抗原阻断型、抗原非阻断型和药物靶标复合物型。基于这些特点，可以建立不同形式的[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]检测，以测量血清中的抗体药物含量，包括游离型、结合型或总量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗独特型抗体可用于定量检测动物或人血清中的抗体药物水平，是[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]研究的关键检测试剂。抗体药物定量分析有多种分析方法，其中[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]为最常用的形式。在抗独特型抗体捕获[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]中，将抗独特型抗体包被在平板上，再将含有抗体药物的样本加入系统中，然后用特异性结合药物的标记抗独特型抗体定量抗体药物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]二、免疫原性[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]抗药抗体（[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]）检测[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫原性评价主要采用抗药抗体（[/font][font=Calibri]anti-drug antibody, ADA[/font][font=宋体]）分析的方法进行，这是治疗性蛋白药物（如单克隆抗体、[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]和融合蛋白）开发过程中的关键步骤。在这些情况下，通常采用多层次递进式进行（图[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）。该方法首先采用高灵敏的筛选试验鉴别阳性抗体样本，使用验证性试验尽量减少假阳性结果，然后使用表征试验评估抗体的中和能力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在整个过程中，抗独特型抗体是必要的试剂。检测[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]的检测方法有多种，包括[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、放射免疫沉淀法（[/font][font=Calibri]RIPA[/font][font=宋体]）、表面等离子体共振（[/font][font=Calibri]SPR[/font][font=宋体]）和电化学发光检测（[/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体]）。其中，桥联[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]是最常用方法，可用于检测所有[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]同种型（[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgA[/font][font=宋体]等）。在典型的桥联[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]中，将抗体药物预包被在平板上，并将标记的抗体药物与患者样本一起孵育，以检测是否存在[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]（图[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）。抗独特型抗体将用作阳性对照或参比标准品，用于样本中[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]的定性分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供为客户提供了从抗原制备、抗独特型抗体开发到检测方法建立和试剂盒开发的全方位、一站式的定制[url=https://cn.sinobiological.com/services/anti-idiotype-antibody-service][b]抗独特型抗体生产服务[/b][/url]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①抗独特型兔多抗制备服务：[/font][font=宋体]交付内容：[/font][font=宋体]? 纯化抗体[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]CoA[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]周期：[/font][font=Calibri]2-3[/font][font=宋体]个月[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②抗独特型鼠单抗制备服务[/font][font=宋体]交付内容：[/font][font=宋体][font=宋体]? 阳性克隆，[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]管细胞[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]克隆[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 纯化抗体，[/font][font=Calibri]10 mg/[/font][font=宋体]克隆[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]抗体对（可选）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]CoA[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]周期：[/font][font=Calibri]4~6[/font][font=宋体]个月[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：抗独特型抗体[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/news/optimizing-pk-assays-with-anti-idiotype-antibodies[/font][/font][font=Calibri] [/font]

目前在做抗体和抗原复合，一直找不到复合物峰。看资料可能时SDS和加热会使其复合打散。看到AB-SECIX说明书上非还原型样品制备。那么碘代乙酰胺能保护抗原抗体使得他们复合物继续存在嘛？

[font=宋体][font=宋体]双特异性单克隆抗体[/font][font=Calibri]6ispecific Mcr'b[/font][font=宋体]即杂交的杂交瘤[/font][font=Calibri](hybrid hybridoma)[/font][font=宋体]是将杂交瘤与其他抗原免疫的脾细胞或另一种杂交瘤融合的结果。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]什么是双特异性抗体？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体（[/font] [font=Calibri]bispecific antibody[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]BsAb[/font][font=宋体]，简称双抗）是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。形象比喻，它就像一座连接[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个抗原（表位）的桥梁。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。除此之外，双特异性抗体还被应用于治疗骨质疏松、血友病等其他领域。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]双特异性抗体的作用机制[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体在抗肿瘤治疗中的主要作用机制是：[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）招募[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞或自然杀伤细胞，并将它们重定向至肿瘤细胞，增强其对肿瘤细胞的杀伤力；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）同时阻断发病进程中两个不同的信号传导通路而发挥独特或重叠的功能，影响肿瘤细胞的生长增殖及存活；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）同时靶向细胞表面不同的抗原或表位，增强其与肿瘤细胞的特异性结合并直接杀伤肿瘤细胞。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双抗[/font][font=Calibri]VS[/font][font=宋体]单抗，有何优势[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]与普通单克隆抗体相比，双特异性抗体具有同时结合两种特异性表位或目的蛋白的功能，因此可以发挥特殊的功能起到单抗药物难以达到的生物学功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]例如，将效应细胞直接靶向肿瘤细胞以增强其细胞毒性、提高抗体选择性和功能性、共刺激或抑制受体。相对单抗，双抗具备更强特异性、靶向性，可以降低脱靶毒性；相较单抗的组合疗法，也可有效降低治疗成本等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但双抗药物开发复杂性和技术壁垒更高，对于技术平台和靶点选择的适配性要求也有所提高。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体的制备方法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）化学偶联法：该方法于[/font][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年首次被使用，其原理是通过化学偶联剂将两个完全的单抗或[/font][font=Calibri]Fab2[/font][font=宋体]片段偶联成一种双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）双杂交瘤融合法：将两种杂交瘤细胞通过细胞融合的方法，合成双杂交瘤细胞株，筛选出具有两种抗体功能的稳定靶细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）基因工程法：利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州在重组抗体生产方面具有扎实的专业知识和经验，利用优化的成熟哺乳动物细胞表达平台，为您提供快速高效的[url=https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service][b]双特异性抗体表达服务[/b][/url]。从抗体序列开始，我们可以表达多种双特异性抗体形式，如[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CrossMab[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]DVD-IgG[/font][font=宋体]。更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service[/font][/font]

[center]近日英国NICE建议应用阿达木单抗治疗银屑病[/center]近日，英国国家卫生与临床评价机构(NICE)公布一份指南草案：对符合一定条件的严重银屑病成人患者，可以用阿达木单抗 (adalimumab )作为一种选择治疗方法。 该指南草案限制对标准全身治疗无应答或对这类治疗不耐受或有禁忌证的患者使用阿达木单抗。标准治疗包括环孢素(ciclosporin)、甲氨蝶呤(methotrexate)及补骨脂素(psoralen)加紫外线照射。NICE的指南草案建议，第16周仍对治疗无应答的患者应停止阿达木单抗的治疗。 在以往的相关指南中，NICE向同类人群推荐依那西普(etanercept)。在最近的评价中，该机构委员们称，不做出依那西普优于阿达木单抗的推荐建议，医生可根据临床情况在这两种产品中进行选择。 阿达木单抗治疗患者应是适用抗肿瘤坏死因子的治疗人群，此类患者病情严重，NICE定义为银屑病区严重指数(PASI)达到10或超过10，皮肤病生活质量指数(DLQI)超过10； 对阿达木单抗有明显应答的银屑病定义为，治疗期间PASI数值降低75%，或PASI值降低50%且DLQI减少5个点。卫生专业人员采用DLQI数值制定治疗方案时要考虑患者的身体残疾情况或者语言或沟通困难程度。 信息来源:中国医药123网

[font='calibri'][size=13px]融合蛋白[/size][/font][font='calibri'][size=13px]是什么？[/size][/font][font='calibri'][size=13px]融合蛋白和单抗的区别[/size][/font][font='calibri'][size=13px]及优势？[/size][/font]融合蛋白是指将目标蛋白与免疫球蛋白融合而产生的新型重组蛋白，其中，目标蛋白可以是细胞因子、受体、抗原肽或者其他具有生物学活性等功能蛋白质。融合蛋白具有较强的生物活性，还具有一些抗体性质，可以用于疾病治疗，可以通过延长血浆半衰期，加强其治疗能力，同时，降低肾小球清除率，可以提高药物在体内的药物浓度。单抗即单克隆抗体，是由单一的B细胞克隆产生的抗单一表位的抗体，具有多个优点，包括高度的特异性：能够特定的针对单一的抗原表位，选择性的杀伤靶细胞，具有更强的疗效；安全性：由于单抗只针对靶细胞，对机体的其他细胞影响不大，相比其他药物不良反应少；多样性：不同的单抗结合，不同的抗原表位作用机制各不相同，可以针对不同的疾病选择相应的单抗。融合蛋白和单抗具有各自的优点和作用特点，近年来，对这两种相关药物的研究越来越多，对于一些恶性肿瘤等相关性疾病的治疗得到了较大的提高。因此，融合蛋白和单抗具有上述区别，但用于疾病的治疗各自有优势。单克隆抗体定制服务推荐：义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。单克隆抗体定制服务：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services

药典上一些抗生素，有有关物的HPLC测定方法，但其含量用抗生素效价法测定，请问：可以用检有关物的方法来测定此抗生素的含量么？

做毛细管电泳的新手，求能够有效分离单抗轻重链并进行回收的实验方法，商品化的试剂盒最好。现在在做的一个单抗异质性很多，希望能将轻重链分离后再检测

大家说说单抗的杂质分析，该分析些什么，该怎么分析呢？[em0806][color=#DC143C][size=4]单抗是什么？请楼主说明，谢谢。[/size][/color]

[font=宋体]【作者】：[/font][font=&][size=16px][color=#5b616b][/color][/size][/font][font=&][font=BlinkMacSystemFont, -apple-system, &][size=16px][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#3e3e3e]李思鹏，张仲理，许圣昌，张磊[/color][/font][font=BlinkMacSystemFont, -apple-system, &][size=16px][/size][/font][/font][font=&][size=16px][color=#333333][/color][/size][/font][font=&][size=16px][color=#5b616b][/color][/size][/font][font=宋体]【题名】：[/font][font=&] [/font][b][b]单抗生物类似药与原研药质量相似性研究解析[/b][/b][font=宋体]【期刊】：[/font][font=&][size=16px][color=#333333][/color][/size][/font][url=https://jpharmsci.org/article/S0022-3549(22)00208-8/abstract][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=12px][color=#3e3e3e]《中国新药杂志》 2022 年第31 卷第6 期[/color][/size][/font][/url][font=&][size=16px][color=#333333][/color][/size][/font][font=宋体]【年、卷、期、起止页码】：[/font][font=&][/font][list][color=#0071bc][/color]2022[/list][font=宋体]【全文链接】：[url=https://jpharmsci.org/article/S0022-3549(22)00208-8/abstract][font=BlinkMacSystemFont, -apple-system, &][size=16px][/size][/font]单抗生物类似药与原研药质量相似性研究解析--《中国新药杂志》2022年06期 (cnki.com.cn)[/url][font=BlinkMacSystemFont, -apple-system, &][size=16px][/size][/font][/font]

百科名片http://b.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=ead8207cb2119313c343f8b255390c10/f2deb48f8c5494ee4984e1a72df5e0fe98257eee.jpg 黄芩别名山茶根、土金茶根。为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi），以根入药。有清热燥湿，凉血安胎，解毒功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。黄芩的临床应用抗菌比黄连还好，而且不产生抗药性。我们借助广谱抗菌作用强的特点，用在真菌培养杂菌感染特厉害，用黄芩提取液效果很好，它是农业病害防治最理想的一味药。产于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古、黑龙江等地。色谱柱：Ultimate xB-C18 4.6*250 PN:00201-31043 SN:211202195色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸（47:53:0.2）为流动相；检测波长为280nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于2500。对照品溶液的制备 取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。供试品溶液的制备 取本品中粉约0.3g，精密称定，加70％乙醇40ml，加热回流3 小时，放冷，滤过，滤液置100ml 量瓶中，用少量70％乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml,置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含黄芩苷(C21H18O11) 不得少于8.0％ 。1.对照品典型色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308161552_458030_2771408_3.gif2.样品1典型色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308161553_458031_2771408_3.gif3.样品2典型色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308161553_458032_2771408_3.gif3.样品3典型色谱图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308161553_458033_2771408_3.gif5.典型色谱图对比图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308161554_458034_2771408_3.gif6.结论：月旭色谱柱能满足含量测定分析要求。

[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法测定药品中抗坏血酸含量[align=center]黄选忠[/align][align=center]（湖北兴山县疾病预防控制中心，湖北兴山　443711）[/align]摘要　[color=black]建立[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url][/color][font=times new roman][size=18px][color=black]-[/color][/size][/font][color=black]抑制电导检测法测定抗坏血酸含量的新方法。以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以12.0 mmol/L NaHCO[/color][color=black]3[/color][color=black]溶液为淋洗液，流量为1.0 mL/min，柱温为30℃，采用等度洗脱的方式可将抗坏血酸与氟化物、氯化物、亚硝酸盐、溴化物、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，通过抑制电导检测，抗坏血酸的峰面积与其质量浓度在3.0～500.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数[/color][size=13px][color=black]r[/color][/size][color=black]为0.9993，方法应用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸的含量测定，加标回收率为95.1%～101.6%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）为1.55%～2.79%，抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸的含量测定。[/color]关键词　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法；[color=black]维生素C[/color]；[color=black]含量测定[/color]中图分类号：O652.63 文献标识码： 文章编号： 抗坏血酸(AA，药品名为维生素C)是维持机体正常生理功能的重要的维生素之一,它广泛参与机体内多种氧化还原等复杂的代谢过程,具有重要的生理功能，包括促进胶原蛋白合成、加速伤口愈合、促进铁的吸收和叶酸的利用，增加造血功能等，在临床上主要用于治疗坏血病、特发性高铁血红蛋白血症、肝硬化、急性肝炎和化学中毒所至的肝损伤等，也可用于传染病及紫癜的辅助治疗，因此准确测定药品中抗坏血酸的含量对保障患者治疗效果具有重要意义。目前测定抗坏血酸的主要方法有碘量法[1]、分光光度法[2-3]、电化学法[4]、高效液相色普法[5-7]、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法[8-10]等，其中,碘量法、分光光度法选择性差，电化学法、高效液相色普法需要专用仪器,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]-电化学检测法[8]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]-间接荧光检测法[9]虽然有较高的检测灵敏度，但均需要专用检测器不便推广应用。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]-电导检测法[10]线性范围为50～500mg/L,不适用于抗坏血酸含量在50mg/L以下的样品的检测。本实验研究用SH-AC-3型阴离子交换柱和CIC-100型色谱仪测定药品中抗坏血酸含量，结果表明，以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱、12.0mmol/LNaHCO3溶液为淋洗液，流量为1.0ml/min,采用等度洗脱的方式可使抗坏血酸与氟化物、乙酸盐、氯化物、亚硝酸盐、溴化物、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等常见阴离子和苯甲酸、草酸等完全分离，且抗坏血酸的峰面积与其质量浓度在3.0～500.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.9993，方法应用于维生素C针剂和片剂中等样品中抗坏血酸含量测定，加标回收率为95.1%～101.6%，5次平行测定的相对标准偏差（RSD）分别为1.55%～2.79%，按3倍信噪比（3N/b）计,抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L,方法适用于维生素C针剂和片剂中等样品中抗坏血酸含量测定。1　实验部分[color=black]1.1　[/color][color=black]主要仪器与试剂[/color][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱仪[/color][/url]：CIC-100，青岛盛瀚色谱公司。抑制器：SHY-2型自再生抑制器,青岛盛瀚色谱公司。定量环体积：25μL；自动进样器：SHA—15型，青岛盛瀚色谱公司。电子天平：万分之一，BT214D型，北京赛多利斯仪器系统有限公司。电子天平：千分之一，JA2003型，上海菁海仪器有限公司[font=times new roman]。[/font]0.45μm滤膜过滤器：13 mm，青岛盛瀚色谱公司。抗坏血酸（C6H8O6）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。抗坏血酸标准溶液：1000mg/L，称取0.1000g抗坏血酸，溶解于高纯水,定容至100ml。草酸（H2C2O42H2O）：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。草酸标准溶液：1000 mg/L，称取0.1401g草酸（H2C2O42H2O），用高纯水溶解，定容至100mL。磷酸二氢钾、溴化钾、 乙酸钠（CH3COONa3H2O）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。H2PO4-标准溶液：1000 mg/L，称取磷酸二氢钾(105℃烘烤2h)0.1402g用高纯水溶解，定容至100mL。Br-标准溶液：1000 mg/L，准确称取溴化钾(105℃烘烤2h)0.1489g，高纯水溶解定容至100ml。乙酸盐（AC-）标准溶液：1000 mg/L，称取乙酸钠（CH3COONa3H2O）0.2305g用高纯水溶解定容至100ml。NO3-、F-、Cl-、SO42-、NO2-、苯甲酸标准溶液：均为1000 mg/L，编号分别为GBW(E)080223、GBW(E)080549、GBW(E)080268、GBW(E)080266、GBW(E)080264、GBW(E)100006，中国计量科学研究院。碳酸氢钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。实验所用其它试剂均为AR级。实验用水为高纯水（电阻率为18.2ΜΩcm）。[color=black]1.2[/color][color=black]　仪器工作条件[/color]色谱分离柱：SH-AC-3型阴离子交换柱（250 mm×4.0 mm，青岛盛瀚色谱公司）；保护柱：SH-AC-3型（50 [color=black]mm×4.0 mm,青岛盛瀚色谱公司）；淋洗液:12.0mmol/LNaHCO[/color][color=black]3[/color][color=black]溶液，流量为1.0ml/min；柱箱温度：30℃；电流：75mA；检测器：电导检测器；自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之[/color]间），置换量70μL，取样量25μL，扎针深度4mm。1.3　实验方法[color=black]1.3.1[/color][color=black]　标准溶液配制[/color][color=black] [/color]抗坏血酸标准[color=black]应用液：临用前将[/color]抗坏血酸标准溶液稀释成含抗坏血酸为100.0mg/L[color=black]（A液）备用[/color]。[color=black]取[/color]抗坏血酸标准[color=black]应用液（A液）0.30、0.50、1.00mL及[/color]抗坏血酸标准溶液原[color=black]液（[/color]1000.0mg/L[color=black]）0.30、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10只10mL容量瓶中加纯水至刻度，混匀，配制成[/color]抗坏血酸的质量浓度为[color=black]3.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0和500.0mg/L的系列标准工作溶液。[/color][color=black]1.3.2[/color][color=black]标准曲线绘制[/color][color=black] 取1.3.1制备的系列标准工作溶液，各管取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样，分别测定，以[/color]抗坏血酸的峰面积(y)为纵坐标，以色谱峰面积对应的抗坏血酸的质量浓度(x)为横坐标，绘制工作曲线。1.3.3 样品处理取维生素C片剂（标称值0.1g/片）10片[color=black]用高纯水充分搅拌溶解后,定容至1000[/color]ml,滤去不溶物，取滤液经0.45μm滤膜过滤后供测试[color=black]。[/color][color=black]吸取[/color]维生素C针剂（标称值0.5g/2ml）1.00ml[color=black]用高纯水定容至100[/color]ml,取该样液经0.45μm滤膜过滤后供测试。1.3.4样品测定取上述样品测试液经适当稀释后[color=black]于样品瓶中，[/color]启动自动进样器进样测定抗坏血酸的峰面积，以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。2　结果与讨论2.1　色谱条件的选择2.1.1　淋洗液的选择在碱性条件下，抗坏血酸易发生降解反应生成草酸，影响抗坏血酸的准确测定，文献[11]曾报道在15.0mmol/LNaHCO3溶液(pH[font=arial]≈[/font]8.3)中抗坏血酸在80min内未降解为草酸，为尽量减少抗坏血酸的降解反应,试验选择pH值较低的NaHCO3溶液为淋洗液,并对NaHCO3溶液浓度进行了选择试验,结果见表1，从表1可见,NaHCO3[align=center]表1 NaHCO3溶液浓度选择试验结果(柱温30℃,流量1.0 mL/min)[/align][table][tr][td=1,2][align=center]组分[/align][/td][td=2,1][align=center]10.0mmol/L[/align][/td][td=2,1][align=center]12.mmol/L[/align][/td][td=2,1][align=center]15.0mmol/L[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]F-[/align][/td][td][align=center]5.702[/align][/td][td][align=center]3.96[/align][/td][td][align=center]5.463[/align][/td][td][align=center]3.72 [/align][/td][td][align=center]4.972 [/align][/td][td][align=center]3.28[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]抗坏血酸[/align][/td][td][align=center]8.431[/align][/td][td][align=center]3.34[/align][/td][td][align=center]7.938[/align][/td][td][align=center]3.17[/align][/td][td][align=center]7.045[/align][/td][td][align=center]2.88 [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cl- [/align][/td][td][align=center]10.908[/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][td][align=center]10.176[/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][td][align=center]8.932 [/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][/tr][/table]溶液浓度在10.0mmol/L～15.0mmol/L时,抗坏血酸均能与氟化物和氯化物完全分离,氟化物峰分离度分别为3.96、3.72和3.28，抗坏血酸的峰分离度分别为3.34、3.17和2.88，完全满足相邻组分完全分离R≥1.5的要求[12]，故本试验选择12.0mmol/L的NaHCO3溶液为淋洗液,在此淋洗条件下抗坏血酸与氟化物和氯化物等常见阴离子的分离色谱图见图1。[align=center]图1 抗坏血酸与氟化物和氯化物分离色谱图[/align]2.1.2　淋洗液流量的影响[color=black]考察了淋洗液流量分别为0.8、1.0、1.2 mL/min时各组分的分离情况，试验结果见表2，从表2可见，随着淋洗液流量的升高，[/color]各组分[color=black]的保留时间（T)逐渐缩短，[/color]氟化物的峰分离度（R）逐渐降低,抗坏血酸的峰分离度（R）变化较小。[color=black]在保证[/color]抗坏血酸[color=black]与其他离子良好分离的前提下，以使组分有较短的保留时间和较高的[/color]峰分离度、[color=black]系统有较低的压力，综合考虑，确定淋洗液流量为1.0mL/min。[/color][align=center]表2 淋洗液流量的影响（12.0mmol/LNaHCO3溶液）[/align][table][tr][td=1,2][align=center]组分[/align][/td][td=2,1][align=center]0.8ml/min[/align][/td][td=2,1][align=center]1.0ml/min[/align][/td][td=2,1][align=center]1.2ml/min[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][td][align=center]T/min[/align][/td][td][align=center]R[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]F-[/align][/td][td][align=center]6.746[/align][/td][td][align=center]3.70[/align][/td][td][align=center]5.480[/align][/td][td][align=center]3.72[/align][/td][td][align=center]4.635 [/align][/td][td][align=center]3.18[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]抗坏血酸[/align][/td][td][align=center]9.775[/align][/td][td][align=center]3.19[/align][/td][td][align=center]7.950[/align][/td][td][align=center]3.18 [/align][/td][td][align=center]6.692 [/align][/td][td][align=center]3.15 [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cl- [/align][/td][td][align=center]12.473[/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][td][align=center]10.163[/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][td][align=center]8.571 [/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][/tr][/table]2.1.3　柱箱温度的选择试验了柱箱温度为25℃、30℃、35℃、40℃时各组分的分离效果，结果显示，随着柱温的升高，抗坏血酸的[color=black]保留时间稍微延长，峰面积逐渐降低，[/color]峰分离度也[color=black]逐渐降低[/color]，分别为3.25、3.17、2.95和2.81，这与邻苯二甲酸根[13]、草酸[14]、对氨基苯黄酸和巴比妥酸的试验结果正好相反，这是否与温度较高时抗坏血酸稳定性降低加速其降解有关，则有待进一步研究。考虑到较高温度时抗坏血酸更容易发生降解反应，同时便于柱温的控制，本试验选择较低的柱箱温度为30℃。2.1.4　色谱柱的选择[color=black]以[/color]12.0mmol/L的NaHCO3溶液为淋洗液[color=black]、流量1.0 mL/min等度洗脱，考察了SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对[/color]抗坏血酸与其他常见阴离子[color=black]的分离效果。结果表明，SH-AC-1型阴离子交换柱虽然能将[/color]抗坏血酸与氟化物、[color=black]氯化物等[/color]常见阴离子完全分离，但抗坏血酸的检测灵敏度明显偏低[color=black]，[/color]试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。2.2[size=12px][color=black]　[/color][/size][color=black]共存物质的影响[/color][color=black] 分别取1.1所列各种标准溶液配制成含[/color]抗坏血酸[color=black]100mg/L，硝酸盐、亚硝酸盐各10mg/L，氯化物5mg/L，溴化物、苯甲酸、草酸各20mg/L，硫酸盐、乙酸盐、[/color]H2PO4-[color=black]各40mg/L，氟化物2mg/L的混合标准溶液，取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样测定，以考察[/color]抗坏血酸[color=black]与前述8种常见阴离子和2种有机酸的分离效果，[/color]结果表明，在本试验条件下，抗坏血酸[color=black]与前述8种常见阴离子和2种有机酸[/color]可以完全分离，但H2PO4-、硫酸盐和[color=black]草酸的保留时间分别长达55min、110min和152min多钟[/color]，其余组分的色谱图见图2，从图2可知，[color=black]氟化物和乙酸盐[/color]的出峰顺序均在抗坏血酸之前[color=black]，[/color]其余8种组分的出峰顺序均在抗坏血酸之后，其中[color=black]苯甲酸[/color]与[color=black]硝酸盐[/color]完全不能分离二者合并为一个峰，可见所考察的10种物质均不影响抗坏血酸的测定。[align=center]图2　抗坏血酸与常见阴[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]图[/align][color=black]2.3　[/color][color=black]线性方程、线性范围与检出限[/color]按照1.3.1配制标准系列，测定抗坏血酸的峰面积，[color=black]以[/color]抗坏血酸的峰面积(y)为纵坐标，以色谱峰面积对应的抗坏血酸的质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。测定仪器30min的基线噪声[15]，以3倍基线噪声除以标准曲线的斜率（3N/b）计算抗坏血酸的最低检出限。其标准曲线的线性范围、线性方程、相关系数r（回归方程的截距、斜率和r均由仪器软件自动生成）、检出限如下：线性范围：3.0～500.0mg/L，线性方程：y=11820x-52060，相关系数r为0.9993，检出限为2.7mg/L。其中，50.0mg/L的抗坏血酸的色谱图见图3。[align=center]图3　50.0mg/L的抗坏血酸标准色谱图[/align][color=black]2.4[/color][color=black]　样品测定及加标回收试验[/color]按1.3.3、1.3.4的步骤操作，对维生素C针剂和片剂中抗坏血酸含量各平行测定5次，计算测定结果的相对标准偏差（RSD）。并在样中分别添加25.0、50.0、100.0mg/L的抗坏血酸测定方法的回收率，方法的加标回收率及测定结果的相对标准偏差（RSD）结果见表3。由表3可知，加标回收率在95.1%～101.6%，RSD为1.55%～2.79%，方法的回收率较高、重现性良好。其中维生素C针剂及加标样品色谱图见图4。[align=center]图4　维生素C针剂及加标样品色谱图[/align][align=center]表3 样品测定及加标回收试验结果[/align][table][tr][td][align=center]样品名称[/align][/td][td][align=center]样品中抗坏血酸含量[/align][/td][td][align=center][color=black]本底值／（mgL[/color][color=black]-1[/color][color=black]）[/color][/align][/td][td][align=center]加入量／（mgL-1）[/align][/td][td][align=center][color=black]测得量／[/color][/align][align=center][color=black]（mgL[/color][color=black]-1[/color][color=black]）[/color][/align][/td][td][align=center][color=black]回收率[/color]/%[/align][/td][td][align=center]RSD/%[/align][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center]维生素C针剂[/align][/td][td=1,2][align=center]0.498g/2ml[/align][/td][td][align=center]243.4、245.7、249.4、249.8、253.3[/align][/td][td][align=center]50.0[/align][/td][td][align=center]299.1[/align][/td][td][align=center][color=black]101.6[/color][/align][/td][td][align=center]1.55[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]24.36、25.06、24.63、24.96、25.82[/align][/td][td][align=center]25.0[/align][/td][td][align=center]49.94[/align][/td][td][align=center][color=black]100.6[/color][/align][/td][td][align=center]2.21[/align][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center]维生素C片剂[/align][/td][td=1,2][align=center]0.10g/片[/align][/td][td][align=center]103.0、102.7、99.91、98.33、96.53[/align][/td][td][align=center]100.0[/align][/td][td][align=center]195.2[/align][/td][td][align=center][color=black]95.1[/color][/align][/td][td][align=center]2.79[/align][/td][/tr][tr][td][align=center][color=black]24.91[/color][/align][/td][td][align=center]25.0[/align][/td][td][align=center]48.96[/align][/td][td][align=center][color=black]96.2[/color][/align][/td][td][align=center]/[/align][/td][/tr][/table]3　结语 建立了以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以12.0 mmol/L NaHCO3溶液为淋洗液，流量为1.0 mL/min等度洗脱，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]-抑制电导检测法测定抗坏血酸的新方法。方法应用于维生素C针剂和片剂中抗坏血酸含量测定，加标回收率为95.1%～101.6%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）小于3%，抗坏血酸的最低检出限为2.7mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于维生素C针剂和片剂等样品中抗坏血酸含量测定。参考文献1）武汉大学.分析化学实验[M].第三版.北京:高等教育出版社,1997:1672）陈燕清，曾桂生，倪永年.催化动力学光度法测定抗坏血酸的研究[J]，食品科学，2009，30（8）：2043）李冰冰，周晓光，朱泮民.紫外光度法测定药品中抗坏血酸的研究[J]，光谱实验室，2005，22（1）：1524）陈霖进，熊惠之，喻湘华，等.聚吡咯纳米管对抗坏血酸的电化学检测[J]，武汉工程大学学报，2018，40 （2）：1325）[url=https://s.wanfangdata.com.cn/paper?q=%E4%BD%9C%E8%80%85:%22%E5%88%98%E7%9C%9F%E7%9C%9F%22%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]刘真真[/url]，[url=https://s.wanfangdata.com.cn/paper?q=%E4%BD%9C%E8%80%85:%22%E9%BD%90%E6%B2%9B%E6%B2%9B%22%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]齐沛沛[/url]，[url=https://s.wanfangdata.com.cn/paper?q=%E4%BD%9C%E8%80%85:%22%E7%8E%8B%E6%96%B0%E5%85%A8%22%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]王新全[/url]，等.[url=https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/sp201611005%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定果蔬中维生素C[/url][J]，[url=https://www.wanfangdata.com.cn/perio/detail.do?perio_id=sp%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]色谱[/url]，2016，34(11)：1048刘胜辉，藏小平.[url=https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/sp201611005%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]高效液相色谱法测定水果中抗坏血酸[/url][J]，生命科学仪器，2005，3(4)：387）刘 慧，姜伟化，贺 霞，等.[url=https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/sp201611005%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]离子交换色普法测定复方维生素咀嚼片中维生素C[/url]含量[J]，中国新药杂志， 2013，22(8)：971虞爱旭，曾文芳，王小芳，等.碳纳米管修饰安培检测抗坏血酸[J]，中国卫生检验杂志，2007，17(11)：19369）陈巧珍，胡克季，三浦恭之.间接荧光检测离子色普法分析维生素C亚硫酸根硫代硫酸根[J]，[url=https://www.wanfangdata.com.cn/perio/detail.do?perio_id=sp%22 \t %22https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/_blank]色谱[/url]，1999， 17(5)：4810）[color=#333333]丰 航，陈德妙，李 荣，等. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法测定葡维氨糖胶囊中盐酸氨基葡萄糖和维生素C的含量[J]. 西北药学杂志,2018,33(2):185[/color][color=#333333]11）[/color]杭义萍，卢祝靓子，杨春英[color=#444444].抗坏血酸存在下[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法直接测定尿液中草酸含量的研究[J].分析测试学 报,2014,33(11):1307[/color][color=#444444]12）[/color]许春向，邹学贤.现代卫生化学[M].北京：人民卫生出版社，2000:49113）李红江.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法测定实验室废水中邻苯二甲酸根[J]，化学分析计量，2021，30（6）：3114）张丽，黄选忠，杜宏山.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐[J]，化学分析计量，2021，30（2）： 4615）JJG823-2014 中华人民共和国国家计量检定规程 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱仪[/color][/url][s][/s]

应符合中国药典2000年版附录V D高效液相色谱法及附录XIX A药品质量标准分析方法验证的有关规定。若另有规定者应于正文中写清楚，如拖尾因子，附录中规定应在0.95~1.05，某品种若不能达到，可另制订合适指标。 一. “含量测定”可按下述格式表述 多数抗生素类药品的含量测定采用的是HPLC-紫外检测器法，其书写格式包括以下内容： （一）照高效液相色谱法（附录V D）测定。 （二）色谱条件与系统适用性试验：包括以下内容：色谱柱填料种类，流动相组成及配制方法，流速，检测波长，柱理论板数，拖尾因子，分离度测定溶液配制方法及分离度要求，进样量，数次进样对照品溶液应达到的精密度等。 注：1. 如果理论板数对分离度及定量测定结果影响不显著时可省略。 2 如果色谱峰的对称性较好，可不规定拖尾因子，但对称性差的品种应规定拖尾因子。 3. 考核分离度的方法有： （1）用已知杂质对照品，测定其与主组分峰的分离度，如头孢克洛含量测定时规定头孢克洛与d-3异构体对照品混合溶液的分离度应符合规定。 （2）杂质对照不能获得的情况下，可通过样品的适当处理使降解，测定降解物与主组分峰的分离度，如头孢呋辛钠含量测定中，取对照品溶液在60℃水浴中加热10分钟，冷却，使部分头孢呋辛转变为去氨基甲酰头孢呋辛后，测定头孢呋辛峰与去氨基甲酰头孢呋辛峰的分离度。 （三）对照品溶液的制备：应写清楚对照品溶液制备所用溶剂及溶液浓度。若储备液与测定液溶剂（稀释液）有差异时，应分别写清楚配制方法。 （四）测定法：应写清供试品溶液的配制方法。对于制剂若由于辅料会影响取样均一性者，还应规定合适的取样量。对于溶液稳定性差的品种，应写清“临用前配制”或“供试液应冷处保存”等。含量测定溶液浓度的确定，除了应在线性范围内外，应以规定的进样量测定的峰面积积分值在6位数以上为宜。 另外，也有一些无特征紫外吸收物质，例氨基糖苷类抗生素，可以采用HPLC-蒸发光散射检测器（Evaporative Light-Scattering Detector, ELSD）法测定含量。当采用该法测定含量时，书写格式可参考上述HPLC-紫外检测器法，但应注意以下几点： （1）“色谱条件与系统适用性试验”项：液相色谱条件中应注明流速，因为流速大小直接影响ELSD的检测器条件；检测器条件中应注明漂移管温度，载气流速。系统适用性试验一般要包括数次进样对照品溶液应达到的精密度（RSD），以确保检测器的稳定性（一般来说，该法要求RSD不得过2%）。 （2）“对照品溶液的制备”项：由于ELSD的响应值（A）与进样浓度（C）间呈指数关系（A=aCb，a，b均为常数），在采用该法测定含量时，计算方法宜采用随行校正曲线法（lgA=algC+b，a，b分别为校正曲线的斜率、截距），故对照品溶液的浓度至少应包括高、中、低3个不同浓度，浓度设计以能覆盖供试品溶液浓度为宜。 （3）“供试品溶液的制备与测定”项：同HPLC-紫外检测器法，但计算方法采用的是随行校正曲线法，即供试品浓度是根据供试品溶液中主峰峰面积和随行校正曲线（lgA=algC+b）来确定的，具体计算方法可参见“3 项撰写细则”一章中的“1.7 组分检查或纯度检查”部分。 二. 有关物质测定* （一） 有关物质测定的色谱条件与含量测定相同者，可参照中国药典2000版中头孢呋辛钠有关物质检查法表述。但其中有如下几点不完美： 1. 供试品溶液浓度低于含量测定时供试品浓度，有可能影响杂质的检测，应适 当提高。 2. 结果评价应以加校正因子或不加校正因子的主组分自身对照法计算出单个最大杂质或表观含量大于0.1%含量以上的杂质总和的含量或表观含量，而不以单个最大杂质或杂质峰面积总和不得大于对照品溶液主峰峰面积的多少倍表示。 （二） 有关物质测定的色谱条件与含量测定不同者，可参照中国药典2000年版中头孢克洛有关物质检查法表述，但其中有如下表述方法需作修改。 1. 流动相梯度洗脱方式以列表方式表述如下： 流动相A与流动相B按下表变换方式进行洗脱： 时间（分） 流动相A（%，V/V） 流动相B（%，V/V） 0~30 95%®75% 5%®25% 30~45 75%®0% 25%®100% 45~55 0 100% 55~56 0®95% 100%®5% 56~71 95% 5% 2. 结果评价方式同上，应计算出单个最大杂质含量或表观含量大于0.1%以上的杂质总和的含量或表观含量。 （三）有关物质测定中明确规定对照品溶液数次进样后相对标准偏差的限度，并以数次进样的平均值计算出各有关物质的量。 （*注：最低检出限或最低定量限的确定应按照中国药典的要求进行验证，以保证结果的可*性。）