元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素的含量检测方案

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毛细管电泳法同时测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素的含量^ 龚红全*，曾承辉，毋福海*(广东药学院，广州市510224) 中图分类号 R283.64；R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)15-1389-03 摘 要 目的：建立以毛细管电泳法同时测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素含量的方法。方法：以盐酸小檗碱为内标，采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱(55 cmx75 um ID，有效长度47 cm)，以20 mmol·L'磷酸二氢钠+100 mmol·L十二烷基磺酸钠+80%甲酰胺溶液(pH7.12)为运行缓冲液，分离电压为15kV，重力进样5s(高度15cm)，检测波长为254 nm。结果：欧前胡素、异欧前胡素检测浓度分别在8.0~40.0 ug·mL"'(r=0.9987)、4.0~20.0 ug·mL'(r=0.9990)范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系；二者平均回收率分别为101.3%和100.2%，RSD分别为 3.24%和1.44%(n=6)。结论：本法简便、快速、准确，可用于元胡止痛片的质量控制。 关键词毛细管电泳法；元胡止痛片；欧前胡素；异欧前胡素；含量测定 Simultaneous Determination of Imperatorin and Isoimperatorin in Yuanhu Zhitong Tablet by CapillaryElectrophoresis GONG Hong-quan，ZENG Cheng-hui， WU Fu-hai(Guangdong Pharmaceutical College， Guangzhou 510224， Chi-na) ABSTRACT OBJECTIVE： To establish capillary electrophoresis method for the determination of imperatorin and isoimperatorinin Yuanhu zhitong tablet. METHODS： The separation was performed on a uncoated fused silica capillary (55 cm×75 um ID，effective length of 47 cm) with 20 mmol·LNaHPO+100 mmol·L'SDS+80% formamide as buffer solution (pH=7.12). Theseparation voltage was 15 kV and the sample was injected by gravity (5 s， 15 cm). The detection wavelength was 254 nm.RESULTS： The linear range of imperatorin and isoimperatorin were 8.0~40.0 ug·mL'(r=0.998 7) and 4.0~20.0 ug·mL'(r=0.999 0). The average recovery was 101.3% for imperatorin (RSD=3.24%，n=6) and 100.2% for isoimperatorin(RSD=1.44%，n=6).CONCLUSION： The method is convenient， rapid and accurate for the quality control of Yuanhu zhitong tablet. KEY WORDS Capillary electrophoresis； Yuanhu zhitong tablet； Imperatorin； Isoimperatorin； Content determination 作6次，测定芍药苷的含量。结果，样品平均含量为0.979 mg·g，RSD=1.0%(n=6)，表明方法重复性良好。 3.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品6份，每份约0.5 g，分别精密加入低、中、高(50%、100%、150%)浓度的对照品溶液适量，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，依法处理，测定其含量，计算加样回收率，结果见表1。 表1 加样回收率试验结果(n=9) Tab 1 Result of recovery tests(n=9) 芍药苷含量/pg 加入量/pg 测得量/pg 回收率/% 元/% RSD/% 352.7 180.0 531.3 99.2 353.0 180.0 536.7 102.1 352.4 180.0 529.7 98.5 352.8 360.0 722.6 102.7 353.0 360.0 726.2 103.7 99.4 1.5 352.4 360.0 714.9 100.7 353.1 530.0 859.0 95.5 352.8 530.0 857.2 95.2 352.6 530.0 868.8 97.4 3.10 样品含量测定 取4批样品，按上述色谱条件和方法测定样品，外标法计 ( △广 东 省自然科学基金项目(5002841) ) ( *硕士研究生 。 研究方向：现代分析方法在中药质量控制中的应 用。E - mail：gonghongquan@163.com ) ( #通讯作者：教授 。 研究方向：现代分析方法在中药质量控制中的 应用。E - m ail：fuhaiwu@16 3 .com ) 算芍药药含量。结果，4批样品含量分别为1.083、1.101、1.236、1.004mgg。 4 讨论 木香的TLC鉴别中，曾选用乙醚、乙酸乙酯作为提取溶剂，但TLC图中阴性干扰严重；后改用挥发油测定法提取处方中挥发性成分，可去除干扰。柴胡TLC鉴别的展开剂考察了三氯甲烷-甲醇-水(13：7：2)10℃以下放置的下层溶液和三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下分层的下层溶液。结果表明，后者作为展开剂时，待测成分斑点比移值合适，分离度较好，且阴性对照无干扰。 在芍药苷的含量测定过程中，考察了乙腈-水(18：82)、乙腈-0.07%磷酸水(18：82)等流动相。结果表明，以乙腈-水(18：82)作为流动相时，分离效果、峰形较好。研究过程中还考察了稀乙醇30%甲醇等提取溶剂，结果表明30%甲醇提取效率高，故采用30%甲醇为提取溶剂。 ( 参考文献 ) ( [1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2005 年版.北京：化学工业出版社，2005：603、附录57. ) ( [2] 陈华国，陈庆，周欣，等.HPLC法测定妇科得生丸中 芍药苷的含量[J].贵阳中医学院学报，2007，29(5)：70. ) ( [3] 张文清，叶 华，张怡评.肾宁片质量标准研究[].中国 药房，2008，19(30)：2366 ) ( [4] 严优芍，李卫民，高英，等.HPLC法测定益母草不同制 剂中 水 苏碱[J].中草药，2006，37(1)：70. ) ( (收稿日期：2009-05-02 修回日期：2009-07-20) ) 元胡止痛片为临床常用药，是由元胡(醋制)和白芷2味药材经提取制成的中药成方制剂，具有理气、活血、止痛之功效，临床用于治疗气滞血瘀引起的胃痛、胁痛、头痛和痛经等"。2005年版《中国药典》(一部)仅收载了薄层色谱扫描法测定元胡止痛片中延胡索乙素的含量。由于白芷中主要成分为香豆素类化合物，欧前胡素和异欧前胡素为其中主要2种成分，有文献13，4]报道采用高效液相色谱法测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素的含量。本试验首次采用毛细管电泳法同时测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素的含量，具有分离效果好、快速、简便、准确等优点，可用于该制剂的质质控制。 1 仪器与试药 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)；K-2501型紫外-可见检测器(德国KNAUER公司)；HW-2000型色谱工作站(2.17版，南京千谱软件有限公司)；MODEL 828型pH计(美国ORION公司)；DL-360型超声波清洗器(宁波石浦海天电子仪器厂，工作频率：4.5kHz±5%，输出功率：240 W)；未涂层弹性融硅石英毛细管柱(河北锐年永沣色谱器件有限公司)。 欧前胡素对照对(批号：110826-200511)、异欧前胡素对照品(批号：110827-200407，纯度：98.8%)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713-200609)均由中国药品生物制品检定所提供；元胡止痛片(佛山德众药业有限公司，规格：每片0.3g，批号：07007、07012、07016)；磷酸二氢钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、甲安胺、氢氧化钠、甲醇等均为分析纯，水为重蒸馏水。 2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 内标贮备液 精密称取盐酸小檗碱对照品一定量，加甲醇制成浓度为200 ug·mL'的内标贮备液。 2.1.2 对照品贮备液 精密称取欧前胡素对照品16.0 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为欧前胡素对照品贮备液(浓度为160 ugmL)；精密称取异欧前胡素对照品16.2 mg，置200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为异欧前胡素对照品贮备液(浓度为80 ug·mL) 2.1.3 供试品溶液 取本品20片，精密称定，研碎，取粉末约1.5g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇20mL，超声提取1h，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。取续滤液4.0mL，置5mL量瓶中，加内标贮备液0.5 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 um滤膜过滤，即得。 2.1.4 阴性对照溶液 取处方组成中除白芷外的其余成分制成阴性样品，按“2.1.3”项下方法制成阴性对照溶液。 2.1.5 电泳介质 精密称取0.78g磷酸二氢钠、7.21gSDS，置250 mL量瓶中，加80%甲酰胺溶解，超声15 min，0.45 um滤膜过滤，测其pH值为7.12，作为电泳介质。 2.2 电泳条件 未涂层弹性融硅石英毛细管柱(75 um ID，总长55cm，有效长度47cm)；电泳介质：20mmol.L'磷酸二氢钠+100mmol·L'SDS+80%甲酰胺溶液(pH7.12)；室温下15kV恒压电泳分离；紫外检测波长：254nm；重力方式进样，高度15 cm， 进样时间5 s。毛细管柱在使用前依次用0.1 mmol·L'氢氧化钠溶液、水、电泳介质各冲洗约5 min；每2次进样间用电泳介质冲柱2 min；当基线不稳、出现小杂峰时更换缓冲液，换后电平衡5 min左右。色谱见图1。 图1 毛细管电泳色谱图 A.对照品；B.元胡止痛片；C.阴性对照；1.内标；2.欧前胡素；3.异欧前胡素 Fig11 (Capillary electrophoresis chromatogramsA. reference substance； B. Yuanhu zhitong tablets； C. negative control；1. internal standard； 2. imperatorin； 3. isoimperatorin 2.3 方法学考察 2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取一定量的欧前胡素、异欧前胡素、内标贮备液，加甲醇稀释成含欧前胡素浓度为8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 pg·mL，异欧前胡素浓度为4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 ug·mL，内标浓度为20 ugmL'的溶液。依次重力进样5s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，对照品溶液浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得回归方程分别为Y欧=0.060 6C+0.098 3(r=0.9987)Y异=0.057 3C+0.029 7(r=0.999 0)。结果表明，欧前胡素、异欧前胡素的检测浓度分别在8.0~40.0、4.0~20.0ug·mL'范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。 2.3.2 精密度试验 取浓度分别为24.0、12.0 ug·mL"'的欧前胡素、异欧前胡素对照品溶液，重力进样5s，连续测定5次，记录峰面积并计算RSD。结果，欧前胡素的RSD=2.20%，异欧前胡素的RSD=2.65%，表明仪器精密度良好。 2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：07007)，在0、2、4、6、8、10、12h分别重力进样5s，记录峰面积。结果，欧前胡素的RSD=1.67%，异欧前胡素的RSD=2.76%，表明供试品溶液在12h内稳定。 2.3.4 重复性试验 取同一批(批号：07007)样品6份，分别按“2.1.3”项下方法提取并测定。结果，欧前胡素的平均含量为0.48 mgg'，RSD=2.58%(n=6)；异欧前胡素的平均含量为0.19 mg'g'，RSD=2.64%(n=6)，表明方法重复性良好。 2.3.5 加样回收率试验 精密称取元胡止痛片(批号：07007)6份，加入相应量的欧前胡素和异欧前胡素对照品，分别按“2.1.3”项下方法提取并测定，计算加样回收率，结果分别见表1、表2。 2.4 样品含量测定 取元胡止痛片样品3批，分别按“2.1.3”项下方法提取并测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中欧前胡素与异欧前胡素的含量，结果见表3。 3 讨论 检测波长的选择 用甲醇配制的对照溶液进行紫外扫描，可得欧前胡素在 表1 欧前胡素的加样回收率试验结果(n=6) Tab 1 Recovery of imperatorin(n=6) 称样量/g 样品含量/pg 加入量/pg 测得量/pg 回收率/% x/% RSD/% 0.8562 411.0 400.0 811.4 100.1 0.8604 413.0 400.0 796.5 95.9 0.8484 407.2 400.0 822.6 103.8 101.3 3.24 0.7728 370.9 400.0 777.4 101.6 0.7662 367.8 400.0 771.5 100.9 0.8326 399.6 400.0 821.1 105.4 表2男异欧前胡素的加加回收率试验结果(n=6) Tab2Recovery of isoimperatorin(n=6) 称样量/g 样品含量/pg 加入量/pg测得量/pg回收率/% x/% RSD/% 0.8562 162.7 150.0 315.3 101.7 0.8604 163.5 150.0 313.3 99.9 0.8484 161.2 150.0 313.4 101.5 100.2 1.44 0.7728 146.8 150.0 297.3 100.3 0.7662 145.6 150.0 295.9 100.2 0.8326 158.2 150.0 304.7 97.7 表3样品含量测定结果(n=3) Tab 3Results of content determination(n=3) 批号 欧前胡素含量(mg/片) RSD/% 异欧前胡素含量/(mg/片) RSD/% 07007 0.14 2.71 0.06 2.64 07012 0.12 2.19 0.07 2.97 07016 0.10 2.79 0.06 3.06 248、217 nm波长处有最大吸收，异欧前胡素在309、267、259、249、220 nm波长处有最大吸收，但电泳介质中甲酰胺截止使用波长为250 nm，又考虑到欧前胡素含量高于异欧前胡素，故本试验选择254 nm 作为检测波长。 3.2 内标的选择 为克服毛细管电泳重现性差的缺点，本试验采用内标法定量。因为欧前胡素、异欧前胡素均为中性的香豆素类成分，所以尝试采用尼莫地平、尼群地平等中性物质作为内标，但它们与异欧前胡素分离度太低，且随着时间的推移分离度越来越小，最后重叠成一峰；后尝试采用黄体酮为内标，但其与欧前胡素峰太接近，分不开，可能因其同是中性物质，性质接近难以达到满意的分离度；再后尝试以在本电泳介质中为阴离子的厚朴酚与和厚朴酚为内标，但它们与异欧前胡素的分离度太低，且随着时间的推移分离度越来越小，最后重叠成一峰；最后尝试以对硝基苯甲酸、对氨基苯甲酸为内标，但其保留时间长达50 min，使本方法失去时间优势。上述试验结果证 明中性物质和阴离子都无法充当内标，所以选择在254 nm波长处有吸收的盐酸小檗碱作为内标。 3.3 电泳条件的选择 鉴于目标检测物都为中性的香豆素类成分，无法用毛细管区带电泳法进行分离检测，故尝试采用胶束电动毛细管色谱法。因为香豆素类成分难溶于水，所以试验中加甲醇、乙腈、甲酰胺等各种有机溶剂来改剂性。试验中发现加甲酰胺分离效果较好，所以初步选定为 SDS+甲酰胺的非水胶束体系；试验中发现，使用不同厂家、不同批号的甲酰胺对结果的影响非常大，只有使用pH<9.5的甲酰胺方得满意结果。再考察各种无机盐对分离的影响，发现在该体系中加磷酸二氢钠能达到更好的分离效果。最后分别对磷酸二氢钠、SDS、甲酰胺的比例进行考察，发现当磷酸二氢钠浓度为20 mmol·L、SDS 浓度为100 mmol.L、甲酰胺比例为80%时分离效果最佳。 在上述缓冲体系下，考察分离电压在12~24 kV范围内对分离度的影响，综合基线平滑度、峰展宽、柱效、分离度、保留时间等因素"，最后确定分离电压为15kV。 ( 参考文献 ) ( [1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S]. 2005年版.北京：化学工业出版社，2005：362. ) ( [2] 王梦月，贾敏如.白芷的化学成分研究进展[J].中药材， 2002，25(6)：446. ) ( [3] 王晓炜，熊 英，陈丽英.元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素含量的 HPLC测定[].药物分析杂志，2005，25 (8)：927. ) ( [4] 王洪志，李惠芬，周 静，等.HPLC法测定元胡止痛片中 欧前胡素和异欧前胡素[J].中草药，2007，38(7)：1018 ) ( [5] 贾敏如，王梦月，金曲曲，等.HPLC测定13种白芷中欧前胡素和异欧前胡素的含量[J].华西药学杂志，2003，18 (5)：361. ) ( [6] 黄 锐，穆小静，阴永光，等.非水胶束电动色谱分离邻苯 二 甲酸酯类化合物[].色谱，2006，24(6)：597. ) ( [7] 陈 义.毛细管电泳技术及应用[M].北京：化学工业出 版社，2000：47. ) ( (收稿日期：2009-06-26 修回日期：2010-03-20) ) 中华健康快车2010光明行发车仪式在北京举行 本刊讯 2010年3月22日，中华健康快车2010光明行发车仪式在北京西客站举行。十届全国政协副主席、中华健康快车基金会名誉理事长王忠禹、卫生部部长陈竺、健康快车创会主席方黄吉雯、中央国家机关有关部门的负责同志、中华健康快车基金会理事及长期支持健康快车工作的内地和香港的捐款单位代表，约50多人出席了发车仪式。 卫生部部长陈竺在发车仪式的致辞中充分肯定了健康快车工作取得的成绩，称赞健康快车项目是政府支持、民间组 织、社会参与开展慈善活动的典范，是香港和内地各界携手组织卫生扶贫的榜样，希望社会各界继续关心贫困地区人民群众的健康，大力支持农村地区卫生事业发展。健康快车创会主席方黄吉雯、中国石化集团公司领导也分别致辞，感谢首都医务工作者对健康快车工作的无私奉献，表示将继续支持健康快车项目。北京大学第三医院代表2010年即将上车开展服务工作的医护人员宣誓，表示坚决完成任务。 ·o粤药房第第 Journal Electronic Publishing House. All rights reseinaChina Pharmacy Vol. No. ：//WWw.cnk.net o iina.Pharasy Yobuanalelectronic Publishing House. All rights reS reservec 出国药房第