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·52中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs第41卷第1期2010年1月 高速逆流色谱分离制备广陈皮中多甲氧基黄酮类成分的研究 郑国栋，周 芳”，蒋 林1*，杨得坡'，杨 雪，林乐维 (1.中山大学药学院生药与天然药物化学实验室，广东广州 510006；2.湖南中医药大学药学院天然药物化学实验室，湖南长沙 410208) 摘 要：目的 采用高速逆流色谱技术(HSCCC)广广陈皮中制备分离高纯度多甲氧基黄酮类成分。方法 应用制备型高速逆流色谱仪，通过优化各分离条件，以四元两相溶剂系统石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水(1∶0.8∶0.7：0.8)，上相为固定相，下相为流动相，制备分离广陈皮醋酸乙酯萃取部分粗提物。结果 300 mg 粗提物经过260 min 一次制备分离，得到了3个多甲氧基黄酮类化合物，经EI-MS 及'H-NMR分析，鉴定为川陈皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七氧基黄酮及橘皮素，其质量分数分别为96.25%97.10%、99.22%。结论 该方法简便、经济，所得化合物既可作为广陈皮质量控制的参考物质，又可为柑橘属植物分类学研究提供一定的依据。 关键词：广陈皮；多甲氧基黄酮；高速逆流色谱 中图分类号：R284.2；R286.02 文献标识码：A 文章编号：0253-2670(2010)01-0052-04 Isolation and purification of polymethoxylated flavonoids from Pericarpium Citri Reticulataeby high-speed counter-current chromatography ZHENG Guo-dong， ZHOU FangJIANG Lin'， YANG De-po'， YANG Xue'， LIN Le-wei (1. Laboratory of Pharmacognosy and Natural Medicinal Chemistry， School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-senUniversity， Guangzhou 510006， China； 2. Laboratory of Natural Medicinal Chemistry， College of PharmaceuticalSciences of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China ) Abstract： Objective High speed counter-current chromatography (HSCCC) was applied to the pre-parative separation of polymethoxylated flavonoids (PMFs) with high purity from Pericarpium Citri Re-ticulatae. Methods After various parameters of preparative HSCCC were optimized preliminarily， thecrude extract of the EtOAc part of Pericarpium Citri Reticulatae was separated with a two-phase solventsystem composed of petroleum ether-EtOAc methanol -water (1：0.8： 0.7： 0.8). The upper phase waschosen as the stationary phase， while the lower phase was chosen as the mobile phase. Results ThreePMFs including nobiletin， 3， 5， 6， 7， 8， 3'， 4'-heptamethoxy flavone， and tangeretin could be obtainedfrom 300 mg crude extracts in one-step separation in 260 min with their purities as 96.25%， 97.10%， and99.22%， respectively. And their structures were identified by EI-MS and 'H-NMR. Conclusion The re-sults demonstrate that the adopted methods are simple， feasible， economical， and efficient for rapid pre-parative isolation of PMFs from species of Citrus L. The compounds obtained in the experiment could beused as reference substances for quality control of Pericarpium Citri Reticulatae. Furthermore， the adopt-ed methods may be used as strong research tools for taxonomy in botanical sciences of Citrus L. Key words： Pericarpium Citri Reticulatae； polymethoxylated flavonoids (PMFs)； high speed coun-ter-current chromatography (HSCCC)· 广陈皮是广东著名的传统中药材，位列十大广药之一。《中国药典》2005年版记载，陈皮为芸香科植物橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干 燥成熟果皮，其药材可分为陈皮及广陈皮，质量以广陈皮为优。广陈皮药材来源较广，正品为茶枝柑Citrus reticulata ‘Chachi'的干燥成熟果皮，主产于 ( 收稿日期：2009-04-09 ) ( 基金项目：国家科技部“十一五” 支撑 项目(2006BAI06A11-02) ) ( 作者简介：郑国栋(197 9 一)，男，湖北省宜昌市人，博士，主要从事生药学与天然药物化学方向的研究与开发。 ) ( *通讯作者 蒋 林 Tel：(020)39943041 E-mail：linderson jiang@163. com ) ( T el：15918518120 F ra ax：(020)39943043 E - mail：gd200237@126. com ) 广东新会，具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效。广陈皮含有丰富的多甲氧基黄酮类成分，其可作为芸香科柑橘属分类的指标性成分。该类成分具有显著的药理活性，如抗癌11.2]、抗诱变[3]、抗炎4抗、抗氧化及心血管保护[6]等作用。故本课题拟采用高速逆流色谱(high speed counter-currentchromatography，HSCCC)技术制备分离广陈皮多甲氧基黄酮类成分，由于该技术不使用载体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点，并使常规提取分离无法分离得到的一些微量及死吸附成分的获得成为可能，现已广泛成功应用于天然产物有效成分的分离制备7~91。 1仪器与材料 高速逆流色谱系统：Mk5 QuikPrep 500制备型高速逆流色谱仪(英国 AECS Co. )，LC-Series Ⅱ 液相泵(美国 SSi Co.)，不锈钢线圈管路 PTFE pre-parative coil(直径 2.16 mm，总容积450 mL，选择容积230mL，转速0~860 r/min)，20 mL 定量环，SPD-10AVP 紫外检测器(日本岛津)；高效液相色谱系统：Waters 600E型高效液相色谱仪(美国Mil-ford)，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters 717plus 自动进样器，Empower 色谱工作站软件；Milli-Q plus system超纯水仪(美国Millipore)；电子轰击电离质谱仪(TraceDSQ， Thremo， USA)； BrukerAvance AV 400 超导核磁共振谱仪(瑞士Bruker)；Varian INOVA 500NB超导核磁振振谱仪(美国Varian)；EYELA旋转蒸发仪(日本东京)。 广陈皮药材于2007年12月采自广东省江门市新会区双水镇广东省水果良种苗木繁育场，经中山大学药学院蒋林研究员鉴定为茶枝柑C. reticulata‘Chachi'的干燥成熟果皮。乙腈、甲醇为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂，怡宝纯净水(怡宝食品饮料有限公司)，超纯水(自制)。 2 方法与结果 2.1 样品预处理：1kg干燥广陈皮打成粗粉、过20目筛，用80%乙醇回流提取3次、每每1.5h、合并提取液，提取液浓缩至无醇味并用水分散，依次用石油醚(60~90℃)、醋酸乙酯分别萃取6次，合并萃取液，醋酸乙酯萃取部分减压浓缩得醋酸乙酯浸膏样品10g。 2.2 HPLC样品分析：迪马Dikma Diamonsil Ci8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 pm)；流动相：乙腈-水(50：50)；进样量：10uL；体积流量：1.0mL/min； 检测波长：330 nm；柱温：25℃。样品经分离后，显示5个主要色谱峰，见图1. 图1 广陈皮醋酸乙酯萃取部分 HPLC色谱图 Fig.1 HPLC Chromatogram of EtOAc crude extractfrom Pericarpium Citri Reticulatae 2.3 溶剂系统筛选：以试管法结合高效液相色谱法测定高速逆流色谱溶剂系统的分配系数k值(k=C固定相/C流动相，0.5≤k≤2)[10]，以之为依据，对四元两相溶剂系统石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水进行筛选。结果表明，石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水(1：0.8：0.7：0.8)为最佳溶剂系统，除峰A外，峰B~E的k值均在0.5~2，见表1。 表1 广陈皮醋酸乙乙萃取部分 HSCCC溶剂系统筛选 Table 1 Selection of two-phase solvent system for EtOAccrude extract from Pericarpium Citri Reticulatae 溶剂系统 分配系数k 峰A 峰B 峰C 峰D 峰E 1.0：0.8：0.6：0.8 0.18 0.50 1.15 1.80 2.05 1.0：0.8：0.7：0.7 0.12 0.32 0.73 1.20 1.48 1.0：0.8：0.7：0.8 0.26 0.58 1.17 1.47 2.00 1.0：0.8：0.9：0.7 0.10 0.20 0.46 0.64 1.64 1.0：0.9：0.6：0.8 0.41 0.53 0.75 2.57 4.40 1.0：0.9：0.8：0.8 0.15 0.35 0.79 1.26 1.35 2.4 其他分离条件优化 2.4. 1 固定相及流动相选择：以所选溶剂系统下相为固定相，上相为流动相时，分离时发现基线不稳定，且在分离过程中一直伴随固定相的流失，固定相保留率较低、分离时间长，故选择溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。 2.4.2 样品质量浓度的选择：固定进样体积为20mL，逐步提高进样质量浓度分别为5、10、15、20mg/mL，发现以 20 mg/mL 为进样质量浓度时，会导致峰分离效果变差及固定相流失，故选择15 mg/mL为适宜进样质量浓度。 2. 4.3 转速、柱温及流动相体积流量的选择：预试验结果表明，转速越快，固定相保留率越高；柱温过低，会带来固定相的流失，柱温过高，则溶剂系统在分离过程中易出现大量气泡，从而影响分离；流动相体积流量过低会导致分离周期延长，过高则会导致固定相流失且分离效果变差。故经综合考虑，转速、 柱温及流动相体积流量分别设定为860 r/min、35℃及2mL/min。 2.5 HSCCC制备分离：溶剂系统为石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水(1：0.8：0.7：0.8)；固定相：上相；流动相：下相；线圈容积：230mL；进样量：300 mg；进样体积：20 mL；转速：860 r/min；流动相体积流量：2mL/min；检测波长：330 nm；柱温：35℃；固定相保留率：78%。300 mg样品经260 min 一次制备分离，得到A~E5个组分，见图2。其中，A、B未能完全分离，C、D、E则得到了良好的分离。组分A~E经浓缩干燥后，称定质量，分别为20、16、22、3、8 mg。 图2 HSCCC制备离离广陈皮醋酸乙酯萃取部分色谱图 Fig.2 Preparative HSCCC separation of EtOAc crudeextract from Pericarpium Citri Reticulatae 2.6 HPLC-PDA 对质量分数的分析：组分A~E经HPLC-PDA分析(色谱条件见2.2)、按峰面积归一化法计算质量分数。结果表明，组分A、B不纯，其主要成分质量分数分别为 86.03%、86.41%，尚需进一步纯化处理，组分C、DE则较为纯净，其质量分数分别为96.25%、97.10%、99.22%，结果见图3. 2.7 化合物结构鉴定 化合物C：无色针状结晶(甲醇)，mp 133~134℃，分子式C2H2208。EI-MSm/x(%)：402(M+)、387(M+-CH，100)、371(M+-OCH)、357、344、326、255、197、182、162、149、131、111、97、83、69、57。H-NMR (400 MHz，CDCl；)8：7.56(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz， H-6’)、7.41(1H，d，J=2.0 Hz， H-2)、6.99(1H，d，J=8.4 Hz，H-5’)、6.61(1H，s，H-3)、4.10(3H，s，OCH)、4.02(3H，s，OCH；)、3.97(3H，s，OCH；)、3.95(9H，m，3×OCH；)。其光谱数据与文献报道对照基本一致，故化合物C 鉴定为5，6，7，8，3，4-六甲氧基黄酮(川陈皮素)。 化合物D：黄色针状结晶(吉醇)，mp 130~131℃，分子式 C22 H24O，。EI-MS m/z(%)：432(M+)、417(M+-CH：，100)、401、387、374、359、225、209、202、197、187、173、165、149、137、119、107、83、77、69。H-NMR(400 MHz，CDCl)8：7.83(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6’)、7.81(H，d，J=2.0 Hz，H-2')、 图3 化合物 C~E的 HPLC-PDA 纯度分析色谱图 Fig. 3 HPLC-PDA Purity analysis of compounds C-E 7.06(1H， d， J=8.4Hz， H-5')、4.09(3H， s，OCH；)、4.00(3H，s，OCH；)、3.98(3H，s，OCH)、3.97(6H，m，2×OCH；)、3.95(3H，s，OCH)、3.89(3H，s，OCH)。其光谱数据与文献报道对照基本一致12]，故化合物D 鉴定为3，5，6，7，8，3'，4-七甲氧基黄酮。 化合物E：无色针状结晶(甲醇)，mp159~160℃，分子式 C20 H20 Or。 EI-MS m/z： 372(M+)、357(M -CHs， 100)、329、314、296、268、225、197、182、179、157、153、135、132、117、89、83、69。H-NMR(500MHz， CDCl，)8：1；7.87(2H，d，J=9.0Hz，H-2，6')、7.02 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')、6.60(1H，s，H-3)、4.10(3H，s，OCHs)、4.02(3H，s，OCH；)、3.95(6H，s，2×OCH；)、3.89(3H，s，OCH)。其光谱数据与文献报道对照基本一致131，故化合物E鉴定为5，6，7，8，4-五甲氧基黄酮(橘红素)。 化合物 C~E的结构式见图4. 3 讨论 在应用 HSCCC技术制备分离天然产物化学成分的过程中，良好溶剂系统的选择是关键。可根据需要选用二元、三元或多元溶剂系统，并控制上下两 图4 化合物C~E的结构式 Fig.44Structures of compounds CE 相分层时间在30s以内，且不能出现乳化现象，通过简单试管法结合薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳等方法计算k值，尽量控制其值在0.5~2，从而确定最佳溶剂系统。另外，固定相及流动相的选择、样品进样量、转速、流动相体积流量、柱温等亦是考察的重要指标。 在选择最佳溶剂系统系，Itol10认为应控制α值≥1.5(分离度， α=k2/k1，ke>k)。笔者认为在进行多组分分离时，该条件不仅难以实现，且并无太大必要，适当控制k值在0.5~2即可。本实验选用的溶剂系统，AB、BC、CD、CDE经计算分别为2.23、2.02、1.26、1.36，化合物C、D、E依然得到了良好的分离。 在薄层色谱预试验中，发现在采用各种不同展开剂的条件下(如石油醚-醋酸乙酯，石油醚-丙酮等不同比例溶剂系统)，化合物D(3，5，6，7，8，3，4-七甲氧基黄酮)及E(橘红素)其Rf值总相同，且由于其相对分子质量接近，难以通过常规分离手段分离。实验采用 HSCCC技术，经一次制备分离，得到了高纯度的两种化合物，该方法简单、可行，其结果不仅可 作为参考物质进一步应用于广陈皮的质量控制研究，又可为柑橘属的植物分类学研究提供一定的依据。 致谢：新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果苗木繁育场及新宝堂陈皮有限公司等单位在样品采集及基地建设方面对本项目工作的大力支持和协助。 ( 参考文献： ) ( [1] Thomas W . Me t hoxylated fla v ones，a superior ca n cer chemo-preventive flavonoid subclass [J]. Semin Cancer B i ol， 2 0 07， 17(5)：354-362. ) ( [2] 小 Li S M， P an M H， La i C S， et al. I s olation and syntheses of p olymethoxyflavones a n d h y droxylated polymethoxyflavonesas inhibitors of HL-60 cell lines [J ] . Bioorg Med Chem， 2007，15(10)：3 3 81-3389. ) ( [3] Mustafaev O N， A b ilev S K， Melnik V A ， et a l. St r ucture- activity relationships of antimutagenic flavonoids [J]. Ekologicheskaya Genetika， 2005， 3 (4)：1 1 -18. ) ( [4] LiS M， S ang S M， P a n M H， et a l. An t i-inflammatoryproperty of t he u rinary m etabolites of nobiletin in mouse [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2007， 17(18)：5177-5181. ) ( [5] Miyake Y. Characteristics of flavonoids i n N iihime fruit - a new sour citrus fruit [J]. Food Sci Technol Res， 2006， 12 (3)： 1 86-193. ) ( [6] Guthrie N， Kurowska E M， M a nthey J A， et al. Composi- tions and methods of treating，reducing and preventing cardio-vascular diseases and disorders with p olymethoxyflavones [P]. US：US 06987125，2006-01-17. ) ( [7] Liu R， L u Y B， WuT X， et a l . Simultaneous iso l ation and p urification of mollugin and two anthraquinones f r om Rubiacordifolia by HSCCC [J]. Chromatographia， 2008， 68(1- 2)：95-99. ) ( [8] Wang X ， Liu J H ， Zhang T Y， et al. Ra p id and simple meth-od for quality control of raw materials of herbs by HSCCC [J ] . JLiq Chromatogr R T， 2007， 3 0(17)：2585-2592. ) ( [9] Yang C J， Li D X， Wan X C. Combination of HSCCC andSephadex LH-20 methods-An approach to iso l ation and pu r i-fication of the main individual t heaflavins from black te a [J]. J Chromatogr B，2008，861(1)：1 4 0-144. ) ( [10] Ito Y. Golden rules and pitfalls in selectin g optimum condi- tions for high speed counter-current chromatography [J]. J Chromatogr A， 2005， 1065(2)： 1 45-168. ) ( [11] Li S M， L o C Y， Ho C T. Hy d roxylated polymethoxyfla- vones and m ethylated f l avonoids in sweet o r ange (C i trus sinensis) peel [J ] . J Agri Food Chem， 2006， 54(12)：4176-4185. ) ( [12 Weber B， H a rtmann B， Stockigt D， et a l. Liquid chromatog-raphy m ass spectrometry and liquid c h romatography/nuclear magnetic r esonance as c o mplementary ana l ytical techniques for unambiguous i d entification of polymethoxylated flavonesin residues from molecular d i stillation of orange p e el o i ls (Citrus sinensis) [J] . J Agr Food Chem， 2006， 5 4 (2)： 274278. ) ( [13] Wang D D， Wang J， Huang X H， e t a l . Ide n tification of polymethoxylated flavones f rom green tangerine p eel ( Peri- carpium Citri R eticulatae V iride) b y chromatographic an d spectroscopic technique s [J] . J Pharm B iomed， 2 0 07， 44 (1)： 6 3-69. )