中药中有效成分含量分析检测方案

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CAMAG 中国技术支持中心 现代薄层色谱：植物药材和食品添加剂鉴别和质控的关键技术 Eike Reich， Anne Blatter CAMAG 应用实验室， Sonnenmattstrasse 11， 4132 Muttenz，瑞士 eike.reich@camag.com 介绍 薄层色谱(TLC)是一项常用的分析技术。几乎每个分析人员都“知道”它，某种程度来说全球几乎所有实验室都用到它。不幸的是大多数分析工作者所了解的 TLC 仍然是许多年前的样子：快速、简单、便宜、精度不高。 然而，当您了解了 TLC 最新的技术及方法学的发展后会明白，现代高效薄层色层(HPTLC)，也被称作平面色谱 (Planar Chromatography)，是一项可靠而有力的分析工具，能够满足动态生产管理规范(cGMP)要求。当需要分析许多样品，需要很强的灵活性，需要以最低花费实现快速定量与半定量分析时， TLC 是一个非常合适的选择。 药用植物的鉴别是 TLC 最早的应用领域之一。当质量和安全性成为普遍关注的问题后，用TLC指纹图谱鉴别草药迅速在全球所有药典中出现。目前美国药典(1)、欧洲药典(2)和中国药典都正在对其通用薄层色谱方法进行修订，以跟上现代技术的发展步伐。 最近几年草药工业的规范化有了长足的进步，对有助安全保障和质量控制的分析方法的需求也快速增长。本文主要阐述现代 HPTLC 在植物药材质量控制方面的应用，并着重说明了使 TLC 成为不可或缺的分析手段的技术优势。 HPTLC 的优势 植物药材含有许多化合物，从药用角度看，在考虑活性机理时要把药物当作整体来看。所以，针对合成药物的分析方法，如纯度分析、含量一致性测试等往往并不适用于植物药材。定量分析某一标示化合物只是植物药材质量控制的一小方面，对于大多数分析问题，采用色谱指纹图谱可以更好地解决问题，它尽可能广泛地表述了被分析物的复杂性。正因为如此，似乎分离能力最高的色谱技术及检测器能够进行更可靠的鉴别，是最佳的选择，所以人们更多考虑采用 GC/MS、GC/IR、HPLC/DAD/MS、HPLC/NMR 等技术。然而必须了解，植物药原料和成品由于自然因素会存在变异性，高分辨率的技技能够显示其差异，但很难着重于其相似性。所以需要根据实际情况来确定哪个方法最适合： HPTLC 能够以更低的花费和更简便的操作得到足够的结果。尤其在 cGMP环境下，避免矫枉过正非常重要；另外质量控制的花费也成为障碍。除了花费低， HPTLC 还有其它一些优点(见表1概述)。 表1， HPTLC 分析植物药材的优势 参数 优势 分析时间 相对较短，多个样品可方便地在同一块薄层板上并排比较。尤其适合对原料的监控、检查/选择和生产过程中的质量控制。 指纹图谱 可针对某种特定的目标化合物进行优化。甚至对某些随溶剂前沿迁移或保留在点样原点的化合物，指纹图谱总是能表述样品的整体特征。由于薄层板是一次性使用的，不像柱色谱，样品在固定相上不可逆吸附不是问题。针对复杂样品中不同的物质种类可以采用不同的色谱体系。 样品准备 大多数时候，很少或几乎无需样品清洁。 较低的分离能力 虽然这更象是缺点，但也可以是优点，因为可以不显示自然变异导致的细微的样品差异，所以更容易确定质量控制的验收标准。 检测的灵活性 可以方便的衍生化及无需重复色谱就可进行多重检测，对指纹图谱分析尤其有用。 视觉结果 HPTLC 结果不但有峰数据，还能方便地用图像表述。 植物药材质量控制的典型任务 鉴别：鉴别是 TLC 应用的主要工作，通过比较同一块薄层板上的样品和参比物来完成。 TLC 的一大优势是不但能看到整个样品，还能同时对多个样品进行比较。HPTLC指纹图谱最有价值的地方是视觉印象，能够用多重检测进一步扩展信息(衍生化前与后观测化合物)。可对各个组分进行全光谱检测和描述，而不必知道色谱上每个斑点的化学特性。 在 cGMP 环境下原材料的鉴别必须有文档记录。HPTLC 指纹图谱的电子图像很容易得到并保存。通过参照同一块薄层板上的化学对照品或对照药材，根据斑点数目、颜色、顺序和相对位置进行评估。图1说明了原理。 使用的方法必须有专属性，意味着只有真实的样品才能符合标准，掺杂品会产生明显不同的指纹图谱。珠海应用实验室： 上海办事处： 北京办事处： TEL：0756-3399293 TEL： 021-63511828，6352 3826 TEL：010-6528 4659 FAX：0756-3399291FAX： 021-63511931FAX：010-65284679 图1，鉴别防己根：(a)UV 254nm 下的图像， (b) UV 366 nm 下的图像，(c)碘熏蒸后白光下的图像，(d)茴香醛衍生化后 UV 366 nm 下的图像。1：汉防己碱(化学对照品)，2-5：防己。 半定量评估：过程控制与稳定性测试。HPTLC 指纹图谱通常用于生产和过程开发，建立合适的提取参数、提取物定标及检测配方过程中原料的改变或降解。在cGMP 环境下，记录原料在生产过程的每一步中如何转换/保存、如何与成品比较、每一批产品的组分如何保持稳定等很有必要。利用 HPTLC 指纹图谱，通过比较斑点数目、顺序和相对强度(或者光密度扫描产生的峰)可以完成这些工作。可以用鉴定过的原料或有独立规范的成品作为参比物(图2). 稳定性测试是 HPTLC 比较新的一个应用，用以确定提取物和成品的保质期。测试是要确认产品在规定时间内能否保持稳定。另一方面，方法要能检测到所有的降解产物。倘若方法经过严格验证(3)，可用半定量检测进行稳定性测试，对被测的标示物无需测定其绝对量。 图2，半定量比较沙巴棕产品中的脂肪酸。红红曲线：新鲜的干燥果实，绿色曲线：干燥果实(3年)，蓝色曲线：干燥果实提取物。 标示化合物定量：标示化合物定量对 TLC 来说是最高要求。由于受到该技术分离能力的限制，象植物材料这样的复杂样品对其所有组分往往不能实现基线分离，因而大多数分析采用 HPLC。然而，人们往往忽视，如果采用合适的仪器和方法， HPTLC 实现定量分析也不难。图3是一个定量分析的例子，方法按照ICH指导进行验证，见参考文献4。 TEL：0756-3399293TEL： 021-63511828，6352 3826TEL：010-65284659 FAX：0756-3399291FAX：021-63511931FAX：010-65284679 图3，366nm 荧光模式测定姜黄的校准曲线(峰高)。 如何使 HPTLC 发挥最大功效 方法来源：由于市场上的植物药材种类繁多，目前还没有一个全面收集薄层色谱方法的材料。虽然采用的是传统的 TLC 方法，但“植物药分析-TLC图谱集(Plant Drug Analysis-A TLC Atlas)”仍是最有价值的信息来源。美国草药典 (American Herbal PharmacopoeiaTM)(6)是采用现代方法的良好开端。目前大多数药典正在修订和更新其植物和提取物专著，包括HPTLC 方法学。CAMAG 收集了大量 HPTLC指纹图谱，19可通过 http：//www.camag.com/l/herbal/herbal applications e.htm 查找。 表2提供了 HPTLC 薄层板和仪器的主要供应商。 表2， TLC 供应商 薄层板 Merck www.camag.com， www.vwrsp.com Macherey & Nagel www.macherey-nagel.com， www.camag-china.com Whatman www.camagusa.com， www.whatman.com Alltech www.alltechweb.com Analtech www.analtech.com 仪器 CAMAG www.camag.com Desaga Analtech www.analtech.com 固定相选择：普通薄层色谱(TLC)板还是高效薄层色谱(HPTLC)板?市场上有大量薄层板色谱预制板可供选择；几乎所有柱色谱固定相都有相应的薄层板。首先要确定使用 TLC板还是 HPTLC 板。HPTLC板有更高的分离度和重现性及高得多的灵敏度，所以强烈推荐使用 HPTLC 板。HPTLC板还能明显节省试剂和分析时间。传统方法在 TLC板上展开需要30分钟到1小时，采用 HPTLC 板只需5到10分钟就可达到相同或更好的分离(图4)。 图4，不同薄层板分离黄酮类：(a)20×20 cm TLC板， (b)20×10 cm HPTLC板。天然产物试剂衍生化。采用HPTLC板分离时间减少到原来的1/4，条带更清晰。 珠海应用实验室： 上海办事处： 北京办事处： TEL：0756-3399293 TEL：021-63511828.6352 3826 TEL： 010-65284659 FAX：0756-3399291 FAX：021-6351 1931 FAX： 010-6528 4679 Email：info@camag-china.com 按照表3可以很方便地将原来采用TLC 板的方法转换到使用 HPTLC 板。 表3， 从TLC 转换到 HPTLC TLC HPTLC 点样体积，pl 10-20(50) 1-5(10-20%) 条带长度， mm 10-20 8 展开距离， cm 10-15(18) 6 流动相选择： TLC分离通常在硅胶固定相上进行，以吸附色谱作为分离方式。反相色谱只有少量可与水混合的有机试剂可用，而采用硅胶正相分离的 TLC 的一个优势是有大量流动相可供选择。如果在文献中查不到合适的方法，可以尝试用表4(5，7)中的流动相分离感兴趣的不同类别物质。 表4，使用硅胶固定相分离植物药材的常用流动相(5，7) 物质类别 流动相 生物碱类药物 甲苯、乙酸乙酯、二乙胺或氨水 (70：20：10) 嘌呤类药物 乙酸乙酯、甲醇、水(100：13.5：10) 蒽类衍生物 乙酸乙酯、甲醇、水(100：13.5：10)或正戊醇、乙酸乙酯、水、乙酸(40：40：29：1) 精油 不同浓度乙酸乙酯或甲醇和甲苯或正己烷，或纯二氯甲烷 黄酮类药物 乙酸乙酯、甲酸、乙酸、水(100：11：11：26)或不同浓度甲酸、水、乙酸乙酯，含或不含乙基甲基酮 熊果苷、对苯二酚衍生物 乙酸乙酯、甲醇、水(100：13.5：10) 甲酸、水、乙酸乙酯(6：6：88) 皂角苷类药物 氯仿、甲醇、水(70：30：4)，乙酸、水、正丁醇(10：40：50)或氨水、水、乙醇、乙酸乙酯(1：9：25：65)或乙酸乙酯、水、正丁醇(25：50：100) 丹宁酸 不同浓度甲酸、水和乙酸乙酯，含或不含乙酸，或乙酸乙酯、甲苯(2：98)或乙酸、醚、己烷、乙酸乙酯(20：20：20：40) 糖类 水、乙腈(10：85)或1.6%磷酸二氢钠、正丁醇、丙酮(10：40：50) 氨基酸 正丁醇、水、乙酸、甲酸(28：8：9：2) 衍生化：可以方便地进行色谱后化学衍生化是 TLC/HPTLC 的一个很大优势。对于分析植物药材，有许多衍生化试剂可供选择(表5；8)，通常化学衍生化需要包括加热步骤。 表5，最常用的衍生化试剂(详见参考文献8) 试剂 物质类别 硫酸 类别试剂(炭化反应)。萜类、皂角苷类、甾醇类、鸢尾苷、黄酮类、大多数亲脂性化合物 茴香醛/香草醛，含硫酸或磷酸 同硫酸，但通常用于显色的条带 蓝色盐B 酚类、丹宁酸、香豆素、黄酮醇、芳香酸、大麻碱、胺类 天然产物试剂 黄酮类、碳水化合物(糖)、花色素 氨蒸气 生物碱、类黄酮、鸦片制剂、霉菌毒素、番泻叶甙、缬草三酯、蒽 碘溶液德雷根道尔夫试剂 类黄酮、杂环氮化合物、共轭双键类、类胡萝卜素 苯胺一联苯胺一磷酸 糖类、苷类 氯化铁 酚类、黄酮类、丹宁酸、植物酸、麦角生物碱、蛇麻亚硫酸氢盐、金丝桃素 色谱评估：根据分析任务，有多种 HPTLC 评估方式(9)。鉴别实验中最常用的是目视观测和与标准品比较。通常在衍生化前和/或后在紫外光(短波长254 nm， 长波长366 nm)和可见光(白光)下检视色谱。 光密度扫描为 HPTLC 提供更准确的评估，尤其对标示化合物的定量。对分离后的化合物采用吸收或荧光检测并与已知量的对照品比较从而进行评估，具体细节请查看参考文献10。光密度扫描很大的一个优势是光谱选择性。对于灵敏的测定，通过单色器可从190 到800 nm 间选择目标化合物有最大吸收/荧光的波长。检测限为低纳克级(吸收)或中皮克级(荧光)。光密度分析可在衍生化前或/和后进行。 只有“好”的色谱才有光密度评估的意义，例如， HPTLC 的前期操作步骤必须严格按照标准化的方法认真进行。 TEL： 021-63511828.6352 3826 T EL： 010-6528 4659 FAX： 010-6528 4679 注：本文发表于2004年5/6月INSIDE LABORATORY MANAGEMENT°AOAC INTERNATIONAL，需要了解更多细节请查看参考文献11和12或与CAMAG 公司及作者本人联系。 ( 参考文献： ) (1) Pharmacopoeial Forum (2004) 39，618-628 (2) Pharmeuropa (2003) 15，649-650 (3) Koll， K.， Reich， E.， Blatter， A.， & Veit， M. (2003) J. AOAC Int. 86， 909-915 (4) Blatter， A.， & Reich，E.(2004) J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. (in press) (5) Wagner， H.， & Bladt， S.， (1995) Plant Drug Analysis-A Thin Layer Chromatography Atlas， 2nd Ed.，Springer， Berlin， Germany (6) American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium， R. Upton (Ed)， Scotts Valley，CA， www.herbal-ahp.org (7) The European Pharmacopoeia 4 (2002) Council of Europe， Strasbourg Cedex， France (8) Jork， H.， Funk， W.， Fischer， W.， & Wimmer， H.， (1990) Thin Layer Chromatography， Volumes 1aand 1b， VCH Verlagsgesellchaft GmbH， Weiheim， Germany (9) Hahn-Deinstrop， E.， (2001) in Planar Chromatography： A Retrospective View for the ThirdMillennium， Sz.Nyiredy (Ed.) Springer， Budapest， Hungary， pp 446-463 (10)Dammertz， W.， & Reich， E.， (2001) in Planar Chromatography： A Retrospective View for theThird Millennium， Sz. Nyiredy (Ed.) Springer， Budapest， Hungary， pp 234-246 (11)Reich.E.， & Blatter. A.， (2003) in Handbook of Thin-Layer Chromatography， 3"d Ed.， J. Sherma &B. Fried (Eds)， Marcel Dekker， New York， NY， pp 535-564 (12)Reich. E.， Blatter， A.， & Meier， B. (2003) Pharmeuropa 15， 424-430 TEL：0756-3399293 FAX： 0756-3399291 ( 北京办事处： TEL： 010-65284659 FAX： 010-65284679 ) Email：info@camag-china.com Email：info@camag-china.com 北京办事处：珠海应用实验室：上海办事处：Email：info@camag-china.com