原子力显微镜在蛋白质晶体生长研究中的应用

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硅 酸 盐 通 报BULLETNOF? THE CHNESE CERAM IC SOCIETY第27卷第3期2008年6月Vo1 27 No 3June，2008 第3期耿利强等：原子力显微镜在蛋白质晶体生长研究中的应用513 原子力显微镜在蛋白质晶体生长研究中的应用 耿利强，尹大川，卢慧甍，叶雅静，郭卫红，李海生，罗慧敏，商 澎 (西北工业大学生命科学院，西安 710072) 摘要：原子力显微镜(AFM)的发明是二十几年来表面扫描和成像技术领域中重要的进展之一，由于具有原子级的分辨率，并可在液态环境中进行实时扫描，AM已成为蛋白质晶体界面研究的有效工具之一。本文将讨论AFM在蛋白质晶体研究中取得的成果，包括在晶体形核、晶体生长及晶体缺陷研究等方面的最新进展。 关键词：原子力显微镜；蛋白质晶体；形核；生长机制；缺陷 中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1001-1625(2008)03-0512-07 In vestiga tion s of Prote in Crystals Growth by A tom ic Force M icroscope GENG Li qiang， YIN Da-chuan， LU Huim eng， YE Ya-jing， GUO W ei-hong， LI Hai-sheng， LUO Huim in， SHANG Peng (Faculty ofL ife Sciences， Northwestem PolytechnicalUniversity， Xian 710072， China) Abstract： nvention of atomic force micm scope (AHM) is one of the most significant progresses ofsurface scan and imaging technology in recent years， with demonstrating resolution of a nanometer， andmanipulating sample liquid environments，it would be an efficient tool to study the surfaces of proteincrystals in real time This paper reviewed recent works and discoveries made by AlM on the studies ofprotein crystal grow th， including tho se on nucleation mechanism s， grow th mechanism s， and the influenceof defect on piotein crystals Key words： atom ic force microscope； protein crystals； nucleation； grow th mechanism； defect 1 引 言 随着“后基因组时代”的到来，蛋白质及其复合物的结构和功能研究已成为目前生命科学领域的前沿，在蛋白质科学研究中意义重大。获取蛋白质分子结构信息的主要手段是X射线衍射技术，然而蛋白质结晶一直是该技术的瓶颈问题：[1]。因此，蛋白质结晶是蛋白质结构与功能研究中的关键环节之一，开展蛋白质结晶研究对于制备高质量蛋白质晶体，进而保证高精细结构信息的获取，具有十分重大的意义。 蛋白质晶体在物化性质上有很多的特殊性。首先，它们尺寸较大、密度较低、极度柔软、杂质水平较高；其次，对过饱和度温度、pH值、析出剂浓度、压力等环境因素十分敏感；再次，蛋白质晶体需要维持完全水合状态，因此，晶体只能在其母液中研究。这些是一些高分辨率观察研究手段如电子显微镜难以克服的障碍。而20世纪80年代诞生的原子力显微镜技术，则完全可以解决上述问题，因此成为可以在纳米到微米尺度范围内 ( 基金项目：国家自然科学基金项目(30570384)；教育部新世纪优秀人才支持计划"项目(NCET-06-0885)；西北工业大学“基础科学研究项 目"资助 ) ( 作者简介：耿利强(1982-)，男，硕士研究生.主要从事蛋白质晶体生长过程及机理研究. ) ( 通讯作者：尹大川. Email： yindc@nwpu edu cn ) 直接观察蛋白质晶体的有力手段。更为重要的是，在原子力显微镜扫描过程中，针尖的移动对被研究样品影响甚微，因此它是一种近似的非侵入式研究手段。由于该特点，它除了观察形貌外，还可以研究各种正在发生的动态过程，通过研究这些动态过程中的变化，并与相关的动力学条件联系，即可研究动力学过程的机理。这种能力为研究蛋白质晶体生长动力学过程提供打前所未有的理想条件。利用该技术，甚至可以观察到蛋白质分子如何进入到晶体状态的过程。可见，它对于了解和研究蛋白质晶体生长过程具有重要意义。 20世纪90年代初 Durbin等首次将原子力显微镜应用到蛋白质晶体生长研究，此后，人们在这个领域开展了大量的研究工作。通过原子力显微镜，不仅实现了蛋白质晶体从单个分子到小晶体尺度范围内的可视化，还观察到了蛋白质晶体生长的各种生长机制，并研究了晶体生长的动力学过程，揭示了蛋白质晶体生长与小分子晶体生长的相同之处，同时也发现了一些与小分子晶体生长不同之处。此外，还开展了对蛋白质晶体缺陷的研究。由于蛋白质晶体的缺陷是导致X射线衍射分辨率低下的关键因素，因此该工作具有十分重要的意义。本文对近年来原子力显微镜研究蛋白质晶体生长的进展进行评述，并对其未来将在蛋白质晶体学领域发挥更加重要作用做了预期。 2 原子力显微镜(AFM) AFM利用针尖与样品表面原子间的范德华力(VanDerW aals Force)作为反馈信号，维持针尖样品间作用力恒定，同时针尖在样品表面扫描，从而得知样品表面的高低起伏。AFM的基本结构与 STM相似，原子间作用力的检测主要由光杠杆技术来实现。如果探针和样品之间有力的作用，悬臂将会弯曲。为检测悬臂的微小弯曲量(位移)，采用激光照射悬臂的尖端，探测器就可检测出悬臂的偏转。在扫描的同时，通过记录反馈信号即可获得样品表面的形貌。由于 AIM可以在蛋白质母液中进行扫描，因此是研究蛋白质晶体形核、生长、及晶体缺陷的有力手段。图1为AFM扫描蛋白质晶体实验的示意图。 图1 AM进行蛋白质晶体扫描实验的示意图 Fig 1 Schematic illustration of scanning experment ofprtein crystal by AFM’ 3 形核研究 研究形核的目的，一是让不易结晶的生物大分子形核；二是尽量减少易结晶的生物大分子形核的数量。这不仅可以满足 X射线衍射的要求，而且有重要的实际意义，例如等尺寸形核的晶体作为药物时，可稳定等速度释放药效。形核过程作为蛋白质结晶的第一个过程，由于其自发性和在时间和空间上的不可预见性，所以迄今为止研究还相对较少4。 3.1 形核机制 蛋白质晶体生长的母液复杂而且易变，其中除了大多数小而稳定的聚集物，还有较大的亚稳液相聚集物。而后者有快速形成多层聚集物或微晶的潜能，而且会对生长晶体长序结构有所贡献。利用 AFM，在晶体表面已观察到上述亚稳液相聚集物的存在。实验过程中先在衬底附着少量的含有蛋白质晶体的溶液，然后放入AFM液体池内，加入大量的蛋白质过饱和溶液。在最初阶段，AFM观察到了晶体表面聚集体的沉降。 Kuznetsov等认为沉降前的液相聚集物可能有两种趋势，一是形成规则的晶体，其发展取决于底层晶胞。二是形成不同于底层晶胞的微晶，并最终与底层晶体合并。从晶体分离的部分蛋白质分子可能没有溶解到溶液中，而是形成了可在晶体表面结晶的亚稳态液相聚集物， 3. 21取向形核 尽管蛋白质晶体在溶液中的形核是不可预见的，然而在衬底上的异质形核还是有一定的可控性。Rong 等利用AIM在涂有聚赖氨酸的玻璃底层上成功控制了溶菌酶晶体的形核方向。Kubo等利用AFM发现了溶菌酶晶体低温相(110)面倾向平行于厚的脂肪酸薄膜和空白的云母片底层，并发现其取向形核程度不但随醋酸钠浓度的增加而增加，而且显著地受 pH值和过饱和度的影响。 4 生长研究 一旦临界核形成后，蛋白质晶体就会以一定的生长模式进行生长，最终得到一定尺寸的晶体。但是晶体的3]生长方式、外力影响、生长过程的动力学和热力学参数、蛋白质传输过程都和生长机制相关 41 表面形貌的扫描 现已有关于过氧化氢酶91、、噬菌体[10]溶菌酶、、刀豆球蛋白12]铁蛋白13]长效胰岛素13]、甜味蛋白酶、杜仲抗真菌蛋白和L精氨酸三氟三酸盐14等晶体表面扫描的报道，也得到了较多的结果。 Malkin等对过氧化氢酶晶体的研究中发现二维螺旋生长和三维形核生长。前者台阶高度为其生长单元尺寸的一半，其形状的各向异性与台阶在各向的生长速度的各向异性相关；而后者会发展为完全规则的多层堆栈或不规则的微晶。在对噬菌体029晶体的研究中，Daniel等确定了其对称型为 P42 2；并发现其头、尾颈圈二维和三维的矩形生长单位尺寸都为16.5 nm ×16.5mm，颈圈高度至少为7.6mm。Li等在溶菌酶晶体低温相的(110)面的研究中发现大多数台阶为双分子高度的生长层，而 W iechmann等51认为是单分子高度的生长层。Christopher等对人、猪、牛的长效胰晶素晶体研究发现，这三种晶体均属于R3空间群，但是，人和猪的胰岛素晶体为较大的、包含 Zn离子的六聚体紧密排列的(001)面，而牛胰岛素晶体可能通过单个的六聚体结合到(001)面，或者是六聚体堆栈聚集到(010)或(110)面131。Kuznetsov等13]对甜味蛋白酶晶体研究发现，尽管其生长台阶的高度相当于8个分子的高度，台阶的延续是有序的单个甜味蛋白分子的附加，而不是由于分子聚集体的结合。Liu等[14]研究了L精氨酸三氟醋酸盐(LATF)晶体(101)面的形貌，发现其主要生长机制是螺旋位错，矩形位错生长长指向生长速度较快的{010}方向的长边，而微晶可能是晶体中较大缺陷形成的原因。总之，利用AFM对蛋白质晶体表面进行扫描，获取其表面的形形信息，已经成为一种日趋常规的研究手段， 4.2 生长机制 AFM对蛋白质结晶的研究：1，13，10显示蛋白质晶体表面平滑而且是逐层生长的，生长层的来源主要为二维形核和螺旋位错。当母液过饱和度较大时，膜蛋白等大多数蛋白质晶体主要的生长机制为二维形核19，11，16]，即在晶体表面上二维小岛的形核，最终和其他的二维小岛结合形成完整的生长层；当过饱和度较小时，生长机制主要为螺旋位错，即以位错为中心呈现螺旋梯状横向生长。 然而需要注意的是，由于单晶的各向异性，可能同时有几种机制在起作用，甚至同一表面也可能同时拥有不止一种生长机制，且机制的类型也会随着实验参数的变化而发生变化。因此，对某一特殊晶体的某种机制的几次观察并不意味着在其它的条件下其它的机制不会出现。大多数蛋白质晶体，会同时或不同时地利用所有的机制，尽管某种机制不是主要的17。 4.2.1二维形核生长 较大的过饱和度下，大多数蛋白质晶体会通过二维形核形成新的生长层。毋庸质疑，由于底层分子的导向，溶液中的分子会倾向于吸附并组装成和底层分子相同的排列，而它们也可能脱离晶体表面，但是当有规律的排列超过了某一临界尺寸，平衡就倒向结合，晶体持续生长181.首先二维形核，出现法向生长的二维小岛，然后进行切线方向的扩增。图2记录了二维形核的生长过程，在各个方向上，生长速度一般不同。这是台阶边缘的不同结构导致的，即分子从溶液结合到台阶边缘的位点对应于各位点结合的热力学能。 大多蛋白质晶体的生长台阶高度等于垂直于晶体表面的晶胞参数，然而一些有螺旋轴的晶体有些特殊。AM对过氧化氢酶晶体高温相91三三方方晶晶系的胰胰素晶体5、Bence-Jone蛋白晶体的低温相的研究表明在晶体结构中存在的 n次螺旋旋会导致在垂直于此轴的 hkl面形成厚度为 dnk/n的生长层。对分别拥有平行于c轴的2、3和4螺旋轴的过氧化氢酶、胰岛素和 Bence-Jone晶体，二维形核的台阶高度分别为11.5±0.2mm、 3.2±0.5mm和4. 6±0.2mm，分别对应于沿着c轴晶胞参数的1/2、1/3和1/4，这就表明二维形核小岛的各向异性和螺旋轴的各向异性相关，而且这种现象可推断没有其它对称元素的所有螺旋轴的情况1 图2溶菌酶晶体表面二维形核生长图像 Fig 2 Two-dimensional islands on the surface of lysozyme crystal 4.2.2螺旋位错生长 这是在某一位错处不断产生台阶的生长方式，如图3所示。位错的出现可能由于杂质或分子插入引起，使得晶体表面法线方向出现中断。在这些地方，台阶沿着这一位错螺旋延伸。螺旋位错和二维形核生长机制显著区别是前者更容易产生台阶，因为这种机制不需要新的二维形核来发展生长层。这种螺旋不断产生的台阶提供了新的生长层，晶体的生长只是分子在切线方向添加到台阶边缘而已1161 螺旋由于位错的本性而表现为左旋或右旋，而且单晶表面经常两种都会出现。螺旋可能在位错处是单旋或双旋的，一些复杂的螺旋可能两种都有。 图3 溶菌酶晶体表面螺旋位错生长图像 Fig 3 Screw dislcations on the surface of lysozyme crystal 4. 2.3法向生长 另一种生长机制是法向生长，生长层的延续不是通过层的附加，而是通过分子在表面任意位置的补充这导致在原子级上是“粗糙"的，而不是由生长层产生的“平滑”的表面。这种机制生长的蛋白质晶体已由AFM观察，其表面极度粗糙，而且无规律。此机制是在较高过饱和度下的紊乱生长，晶体质量较差，最终的晶体尺寸可能不受限制。如铁蛋白晶体，可长到很大的尺寸16] 4.2.4三维形核生长 这是生物大分子晶体独一无二的生长机制，一般发生在很浓的母液下。这些三维核可反映晶体的总体形态学，在高度上可达到10倍、百倍甚至更大的晶胞启度。每一层堆栈都有台阶边缘，因此，这都是新层形成和切线方向生长的来源：[20]。。值得注意的是，当晶体表面生长层的法线生长是几个多层堆栈同时生长，那么各个堆栈相应的生长层会相互遭遇、合合，如图4所示。 关于多层堆栈的起源，一种可能是在溶液中形成的微晶，沉降到晶体表面，然后开始生长。这种可能性不能解释这些堆栈和底层分子、及其相互之间的完美排列。另一有充实证据的解释是，他们来自大分子浓溶液的液滴”1211这种蛋白质液滴是具有短程有序的数以千计分子的集合，主要由相互间非特异性的疏水作用和随机分布的氢键调节。在某种意义上，他们是无序的，但是趋向于有序的蛋白质聚集物。由于液滴中分子浓度的特殊性，是局部过饱和的。当液滴接触到已存在的晶体表面时，底层分子作为一种取向指导和促进上层分子结晶， 图4 正生长的溶菌酶晶体表面三维形核生长图像 Fig4 These AFM mages show one small three-dimensional nucleation on the surface of a grow ing lysozyme crystal 关于生长机制之间转换关系 ， Kuznetsov等研究了析出剂(酒石酸钠和酒石酸钾)浓度对甜味蛋白晶体生长机制的影响。他们发现稳定的盐浓度梯度不会导致多晶的产生；而当蛋白质浓度恒定，盐浓度从0.8mol/L降低到0.085 mol/L会引起晶体生长机制从二维形核到混乱生长的变化。 5 缺陷研究 晶体质量越高，最终通过X射线衍射解析获得的结构信息也越详尽、丰富，意义和价值越大。而高质量的晶体就意味着更少的内部缺陷，所以对缺陷进行研究，并减少各种缺陷尤为重要。 AFM对生物大分子晶体的研究发现了大多类似无机物的缺陷111，包括零维缺陷(点缺陷)，如空位缺陷和替代缺陷；一维缺陷(线缺陷)，如位错；二维缺陷(面缺陷)如堆垛层层和孪晶；三维缺陷(体积缺陷)，常见的包括微粒的包埋、沉淀和组合。 生物大分子晶体对杂质很宽容，允许其结合。生物大分子晶体缺陷的数量和密度较大，数量级约约小分子晶体的2~4倍，这可能导致晶体的破裂和多晶的形成，进而降低晶体质量及衍射数据的可靠性，甚至阻止晶体生长。 5.1 晶体破裂及多晶的形成 生长液的纯度是影响蛋白质晶体生长重要因素之一。母液中可能有百分之几的杂质，这些杂质显著影响晶体的溶解性、生长速度和形态，甚至直接导致晶体的破裂。 杂质的结合有助于异质形核。在生长过程的早期，蛋白质溶液的过饱和度和生长速度都都大，如果杂质此阶段结合，很可能不脱离晶体表面。而随着晶体的生长，生长速度降低，杂质的结合也降低。 5.2 降低晶体质量及可衍射性 应用AFM研究杂质结合和晶体质量之间的关系，均得出杂质可降低晶体质量的结论。。Yoshizaki等”发现当加入5%的杂质，溶菌酶晶体(101)面变得粗糙，B因子显著降低；当加入10%的杂质，生长台阶消失。对比商业用和再提纯后的溶菌酶晶体的(101)面，发现前者出现了大量由共价溶菌酶二聚物才能形成的小颗粒，后者表面平滑，从而得到商业用晶体质量低于再提纯晶体的结论。Plomp等22把杂质质度较高的母液换为净化后的母液，发现生长台阶极度粗糙的刀豆球蛋白晶体的表面杂质密度降低，而且螺旋位错附近的螺旋生长台阶变成带直边的多边形，X衍射分辨率从大于2.8A提高到2.0A。 5.3 阻止晶体生长 杂质阻止台阶生长，进而导致晶体生长的停止。对一些大分子和病毒晶体的AFM研究表明，此机制导致了大分子晶体不可挽回的生长停止。若停止生长的小晶体接种到“新鲜"的过饱和溶液，通常不会长大；然而，如果在接种之前把晶体切片，新鲜表面就会继续生长。AFM观察结果表明杂质结合的出现是籽晶播种到新鲜溶液时常失败的主要原因，[24] 这种机制如何使大分子晶体生长停止呢?当一开始，在溶液中形成(3D)形核，过饱和度很大，不稳定的生长速度很高。只要杂质结合时间比生长层暴露时间长，少数结合的杂质就会埋入到生长层中。长大的晶体逐渐消耗大分子浓度，溶液的过饱和度降低，生长层的暴露时间增加，那么，杂质的覆盖面积也就会增加。 最终，结合的杂质达到足够的覆盖密度，生长停止 5.4 刻蚀斑的观察 在较高的未饱和度下，较大的杂质附近开始溶解，形成无杂质的刻蚀斑；若恢复过饱和状态，在无杂质的刻蚀斑内重新形核、生长[23] Hondoh等利用AFM观察了溶菌酶晶体表面的刻蚀斑，发现当过饱和度6<0.08时，不会形成刻蚀斑；当0.08<0<0.14时，出现平底刻蚀斑(Flat-dips，深度约6 mm)，而且他们的数量随着「的增加而增加；在过饱和度r>0.3时，除了平底刻蚀斑，还出现了深底刻蚀斑(Deep Flat- dips，深度大于100 nm)，如图5所示。他也还发现 F-dips和 DF-dips的位置独立、形成随机。在较完美的溶菌酶晶体中，F-dips的底部在分子水平上是平整的；而含有杂质的溶菌酶晶体中刻蚀斑密度比纯度高的溶菌酶晶体更大，而且在F-dips的底部，出现了长度超过100 mm，由绳状物组成的条纹。这些条纹可能是 F-dips的起源之一。 图5 溶菌酶晶体表面深底刻蚀斑高度图(A)和横截面分析图(B) Fig 5 A deep flat-bottomed pit on the surface of lysozyme crystal 6 结 语 2006年，我国正式启动了《国家中长期科学和技术发展战略规划纲要》重点部署的四项重大基础科学研究计划之“蛋白质科学研究计划”，把蛋白质研究提到了一个很高的位置；而且还是科学家的前沿攻关方向，迄今为止，世界已有五十多位科学家因在此领域做出卓越贡献而获诺贝尔奖。作为蛋白质科学的重要分支，进一步研究蛋白质结晶过程非常迫切。在众多研究手段中，由于AIM可实时原位地反映“活"晶体信息的成像方式和具有纳米水平的分辨率，因此在蛋白质晶体的研究中取得了很大的成果，主要集中在晶体表面形态的扫描，生长机制的确认及完善，生长过程的动力学研究，以及杂质对蛋白质晶体的影响等方面，由于AFM扫描价格相对于 X射线衍射要低的多，而且可以直接得到表面形貌数据，因此不仅可单独进行蛋白质晶体的研究，也可作为X射线衍射实验的补充。 随着低温 AFM，高速AM，碳纳米管探针等技术的发展，AFM的分辨率和动力学性能将进一步提高，未来的研究可能集中在以下几个方面：(1)继续晶体生长机制研究，包括分子间相互作用机制研究，如蛋白质和 DNA、蛋白质之间、蛋白质和固体衬底间的相互作用，以及在各种衬底上生物大分子纳米结构的吸附，而这正是生物材料、生物加工、生物薄膜研究的基础；(2)缺陷的深入研究及相关理论的发展，为提高晶体质量提供理论指导；(3)对X射线衍射解析晶体结构的辅助作用，例如可以观察到单个分子，其精细结构有助于结构模型的构建，而单层生长台阶的高度，则提供给我们分子尺寸的精确信息。 ( 参 考 文 献 ) [1]1McPherson A. 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