组织中3H检测方案(液体闪烁谱仪)

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研究报告二CDO八年·第三期 二○○八年·第三期现代仪器(www.moderninstrs.org.cn) 放射性同位素标记法研究加替沙星在小鼠体内的吸收、分布和排泄 张恒军姜国华黄建华”文刘忠敏 (1.吉林农业科技学院动物科学学院 吉林 132101)(2.北京师范大学分析测试中心北京 100875) 摘 要 本文用H标记的方法研究加替沙星在小鼠体内的吸收、分布和排泄。小鼠静脉注射‘H-加替沙星三个剂量： 4mg/Kg、8mg/Kg、16mg/kg，用液体闪烁谱仪测定不同时间血药浓度，建立血药浓度一时间关系。结果显示：静脉注射°H-加替沙星在小鼠体内代谢符合二房室开放模型，分布相半衰期T1/2a分别为0.16h， 0.15h和0.19h；消除相半衰期 T1/2分别为 55.55h， 45.75h，和52.11h；表观分布容积V分别为0.77L·Kgg-10.62L·Kg和0.95L·Kg-1；曲线下面积 AUC分别为 74.08ug·h·L，，89.28ug·h·L和211.88ug·h·L。。H-加替沙星在小鼠体内分布很广，没有发现特异性组织积累。 关键词 加替沙星 吸收 分布 放射性 液体闪烁谱仪 加替沙星 (Gatifloxacin， GFLX)是临床广泛使用的广谱抗菌药。它是一种8-甲氧氟喹诺酮类外消旋化合物，属第四代喹诺酮类抗菌药物。与其它氟喹诺酮类抗菌药物相同，加替沙星通过抑制细菌DNA复制、转录和修复所必需的Ⅱ型拓扑异构酶中的 DNA 旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ发挥抗菌作用。其对革兰氏阳性和对革兰氏阴性需氧菌、厌氧菌、支原体和分枝杆菌等均有良好的抗菌活性；对革兰氏阳性菌和厌样菌的体外抗菌活性强于环丙沙星和氧氟沙星，与司氟沙星和妥舒沙星相似，对革兰氏阴性杆菌的活性与环丙沙星和司氟沙星相当。由于细菌和人类细胞均含有Ⅱ型拓扑异构酶，这使得氟氧喹诺酮类药物在抑菌的同时也抑制人体细胞正常生长，造成在人体内的毒副反应应~4。因此了解其在体内的吸收、分布和排泄规律对临床合理用药有着重大意义。本研究应用放射性同位素标记法研究加替沙星在小鼠体内的吸收、分布和排泄规律供临床参考。 1 实验材料和方法 1.1 药品与试剂 加替沙星：中国医学科学院生物技术研究所提供，纯度99.99%，H-加替沙星：由中国原子能研究院同位素所标记，放射性浓度14.8MBq/mL，比活度 18.5MBq/mg，放化纯度大于95%，2，5-二苯基噁唑 (PPO) E.Merck 产品，2，5-二苯基噁唑苯(POPOP) Koch-light产品，其余试剂为国产分析纯试剂。 1.2 实验动物 小鼠：昆明种(18~22g)购自北京市药品检定所。 1.3 仪器 美国 PACKARD 2250CA 液体闪烁普仪，H-无淬灭源效率60%，本底 20cpm。 1.4 实验方法 1.4.1 标准曲线的制备配制400pg(900KBq)/mL、200pg(450KBq)/mL、100pg(225KBq)/mL、50pg (113KBq)/mL、25pg(56.3KBq)/mL、12.5pg28.1KBq)/mL、6.25pg(14.1KBq)/mLH-加替沙星系列标准溶液，分别取100pL标准溶液加人到900uL 鼠全血中置于4冰箱中，分别于Oh、12h、24h取血 10pL 加甲酸、双氧水各50pL，50℃恒温水浴消化30min，加入8mL闪烁液隔夜暗适应后测量测定其放射性强度，确定标准曲线及回收率。 1.4.2 血样制备 小鼠静脉注射射H-加替沙星三个剂量组：低剂量组(L) 4mg(9.25MBq)/Kg；中剂量组(M) 8mg(18.5MBq)/Kg；高剂量组(H)16mg(37MBq)/Kg。给药后不同时间由眶静脉定量取血10pL，置于闪烁瓶中加入 50uL甲酸，双氧水50uL， 50℃恒温水浴消化30min，加入8mL闪烁液隔夜暗适应后测量其放射性强度。 1.4.3 组织样品制备 小鼠静脉注射'H-加替沙星8mg(18.5MBq)/Kg，分别于 0.5h、1h、3h、24h、72h，颈椎脱臼处死，取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、脂肪、肌肉、睾丸、卵巢等组织 100mg 加入甲酸、双氧水各 0.5mL，50℃恒温水浴消化2h，取消化液 50uL 置于闪烁瓶中加入8mL闪烁液隔夜暗适应后测量其放射性强度。 1.4.4 样品放射性测量 采用均相测量，闪烁液组成为 PPO 5g， POPOP 0.3g， 乙二醇独乙醚 300mL， 加甲苯至1000mL。测量仪器为美国 PACKARD2250CA 液体闪烁普仪，3H-无淬灭源效率60%本底20cpm。以 tSIE 为淬灭校正因子进行 DPM 复原。 2结果 2.1 标准曲线 实验表明在0.625~40pg/mL范围内放射性强度与加替沙星浓度呈现良好线性关系，回归方程为 y=0.0007x+0.2193，r=0.9999，以血药放射性信噪比为2时最小检出量为 0.04ug/mL，平均回收率为95.82(见表1)。 表1 标准曲线及回收率 浓度 标准放射性强度 样品放射性强度回收率 CV (ug/mL) (DPM±SD) (DPM±SD) (%) (%) 40 54432±425 53731±692 98.7 20 26404±234 26402±53 99.9 10 13148±16 12989±158 98.7 1.2 5 6631±72 6277±106 94.9 1.6 2.5 3301±59 3169±51 96.0 1.6 1.25 1592±27 1473±17 92.5 1.1 0.625 857±50 772±29 90.1 3.7 2.2 H-加替沙星在小鼠体内血药浓度变化及药物动力学拟合 小鼠静脉注射不同剂量量H-加替沙星后，血药浓度与时间关系(见表2，图1)。小鼠静脉注射H-加替沙星后，血药浓度迅速下降，约1h后变慢，三种剂量呈平行关系。用3P87药物动力学计算程序对血药浓度-时间曲线进行拟合，所得药物动力学参数(见表3)。结果显示小鼠静脉注射'H-加替沙星，血药浓度-时间变化符合二房室开放模型。静脉注射'H-加替沙星 4mg(9.25MBq)/Kg、8mg(18.5MBq)/Kg、16mg(37MBq)/Kg三个剂量，分布相半衰期T1/20分别为 0.16h， 0.15h和0.19h；消除相半衰期T1/2B分别为 55.55h， 45.75h，和52.11h；表观分布容积V分别为0.77L·Kg ， 表2小鼠静脉注射不同剂量‘H-加替沙星 血药浓度-时间变化(n=6) 浓度 标准放射性强度 样品放射性强度回收率 CV (ug/mL) (DPM±SD) (DPM±SD) (%) (%) 40 54432±425 53731±692 98.7 20 26404±234 26402±53 99.9 10 13148±16 12989±158 98.7 5 6631±72 6277±106 94.9 2.5 3301±59 3169±51 96.0 1.25 1592±27 1473±17 92.5 1.1 0.625 857±50 772±29 90.1 3.7 0.62L·Kg 和0.95L·Kg；曲线下面积 AUC分别为74.08ughL， 89.28ughL和211.88 ughL，AUC 与给药剂量成正比。 图1小鼠静脉注射不同剂量‘H-加替沙星血药浓度一时间曲线 表3 小鼠静脉注射不同剂量H-加替沙星 药物动力学参数 时间 L组 M组 H组 (h) (4mg/Kg) (8mg/Kg) (16mg/Kg) 0.05 4.346±0.623 11.211±0.403 15.902±2.445 0.085 3.800±0.450 8.730±0.173 12.406±2.047 0.17 2.602±0.297 6.534±0.529 9.856±1.098 0.25 2.077±0.309 4.715±0.736 8.213±1.063 0.5 1.451±0.207 3.127±0.169 5.589±1.104 1.011±0.099 2.013±0.273 3.357±0.258 2 0.898±0.025 1.645±0.227 2.718±0.509 4 0.800±0.049 1.378±0.193 2.490±0.321 6 0.825±0.133 1.285±0.273 2.470±0.243 0.779±0.106 1.469±0.091 2.320±0.182 0.699±0.121 1.111±0.158 2.090±0.348 0.398±0.023 0.995±0.098 1.228±0.082 72 0.292±0.029 0.677±0.015 0.797±0.157 2.3 H-加替沙星在小鼠体内的分布 小鼠静脉注射加替沙星 8mg(18.5MBq)/Kg， 组织分布情况(见图2，表4)。在所测的12种组织中均检测到H-加替沙星，其中肝、肾、肠含量较高，心、脾、肺、睾丸次之，卵巢、体脂、脑较少。12种组织中的加替沙星均随时间延长而减少，未发现特异性组织积累。组织分布结果显示H-加替沙星具有分布广，无特异性积累的特点，组织分布特点与表观分布容积值相符。 图2 小鼠鼠脉注射加替沙星 8mg(18.5MBq)/Kg不同时间的组织分布 组织 0.5h(ug/g) 1h(ug/g) 3h(ug/g) 24h(ug/g) 72h(ug/g) 2.029±0.277 1.412±0.191 1.206±0.162 0.815±0.142 0.486±0.071 5.571±0.590 3.233±0.448 2.509±0.196 1.205±0.118 0.992±0.166 2.267±0.386 1.608±0.322 1.496±0.223 1.053±0.099 0.574±0.062 2.450±0.491 1.655±0.110 1.256±0.024 0.915±0.100 0.511±0.101 6.978±0.775 3.593±0.509 2.388±0.052 1.344±0.212 0.689±0.071 1.854±0.203 1.183±0.198 1.122±0.089 0.854±0.067 0.471±0.045 4.612±1.164 1.461±0.250 1.436±0.411 1.107±0.144 0.449±0.036 1.370±0.264 1.193±0.176 0.172±0.167 0.871±0.165 0.521±0.192 体脂 1.256±0.240 0.834±0.125 0.737±0.173 0.524±0.092 0.353±0.076 肌肉 1.735±0.190 0.941±0.256 0.910±0.140 0.753±0.153 0.396±0.032 睾丸 2.640±0.211 1.846±0.130 1.367±0.097 0.998±0.026 0.546±0.042 卵巢 1.077±0.045 0.964±0.123 0.964±0.313 0.666±0.077 0.348±0.007 3 讨论 利用放射性同位素标记法研究药物的吸收、分布、排泄规律，具有检测灵敏度高，所需样品量少，样品制备简单等特点。这使得应用该方法可以得到近似生理条件下的实验数据。 小鼠静脉注射不同剂量的’H-加替沙星，分布相半衰期T12、和消除相半衰期 T1/2p 几乎不受给药剂量的影响，而曲线下面积AUC 则与给药剂量成正比。这表明静脉注射4~16mg/kg加替沙星范围内，药物在体内的处置符合线性药物动力学。 加替沙星在临床上广泛地用于呼吸道、泌尿系统、皮肤软组织、胃肠道等感染治疗[5.6。加替沙星组织分布结果显示：加替沙星在体内分布很广，我们所检测的12种组织中均有其分布，但未发现特异性组织积累，表观分布容积在0.62~0.95范围也反应该药物的分布特点。该药物在肺、肾、心 脏、胃、肠等靶组织有较高的分布，在生殖系统睾丸中的分布明显高于卵巢。 本研究为加替沙星的临床药物动力学研究和临床合理用药提供必要的参考资料。 ( 参考文献 ) ( 1 Hosak M， K i noshita S， Toyma A e t al. Antibacterial Propertiesof AM-1155， A N ew 8-methoxy Q u inolone. J A ntimicrobChemother， 1995，36(2)：293~301 ) ( 2 Ishida K ， K aku M ， Ir i fune K et al In v i tro and I n v i vo Acti-vity of A New Quinolone AM-1155 against MycoplasmaPneumonias. J Antimicrob Chemother，1994，34(6)：875~883 ) ( 3 Fish DN， North D S. Gatifloxacin ， An Advanced 8-methoxyFluoroquinolone. P harmcotherapy， 2001，21(1)：35~59 ) ( 4潘志平 . 氟喹诺酮类抗菌剂 Gatifluoxiacin，药学进展， 2000，24(1)：51~53 ) ( 5朱曼，王睿.第四代氟喹诺酮抗菌药-加替沙星，中国临 床药理理与治疗学.2001，6(4)：377~381 ) ( 6王循东.加替沙星临床应用及安全性评价， 天 津药学. 2007，19 ( 3)：53~54 ) Using radioactive isotope labeling method study absorption， distributionand elimination of Gatifloxacin in mice Zhang Hengjun Jiang Guohua Huang Jianhua’ Liu Zhongmin’ (1. Department of Animal Science Jilin Agricultral Science and Technology College， Jilin 132101)(2. Analytical and Testing Center Beijing Normal University， Beijing 100875) AbstractAbsorption， distribution and elimination of Gatifloxacin in mice are studied using H labelingmethod. After iv injection of 4mg(9.25MBq)/Kg， 8mg(18.5MBq)/Kg and 16mg(37MBq)/Kg H-GatifloxacinH-Gatifloxacin concentration in blood is determinated with liquid scintillation analyzer. The results show thatconcentration-time curve after iv injection are fitted to a 2-compartment open model， Distribution phase half lifeTi/2a is 0 .16， 0.15， 0.19h， respectively， elimination phase half life Tu2p is 55.55， 45.75， 52.11h respectively，the appearance volume of distribution V is 0.77， 0.62， 0.95 L·Kg respectively， area under curve AUC is 74.08，89.28， 211.88 ughL3H-Gatifloxacin is distributed extensively in various tissue and organ in mice but is notfound accumulation in special tissue and organ. Key words GatifloxacinAAbsorptionDistributionRadioactivityLiquid scintillation analyzer