海洋样品中营养盐检测方案(流动分析仪)

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分光光度法和连续流动分析法对营养盐测定结果的比较 张利华 (华东师范大学河口海岸国家重点实验室，上海200062) 摘要 本文按《海洋监测规范》(GB17378-1998)和《海洋调查规范》(GB8538-1995)的测定原理，对不同浓度范围的营养盐分别使用分光光度法与连续流动分析法进行同时测定。结果显示，两种方法对营养盐测定的结果没有显著性的差异(P>0.05)， 而且两者的相对误差和相对标准偏差都在“规范”允许的范围内，但其中以连续流动分析法产生的误差和偏差更小，由此说明，连续流动分析法对营养盐测定的准确度和精密度优于分光光度法。 关键词 分光光度法 连续流动分析法 营养盐 Comparison of spectrophotometry and segmented flow analysis onnutrients determination ZHANG Li-hua (State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research， East China Normal University，Shanghai 200062， China) Abstract： According to the principles in “the specification for oceanographic survey observationsof chemical parameters in sea water”(Nos. GB17378-1998 and GB8538-1995)， nutrients ofdifferent concentrations are determined simultaneously by spectrophotometry and segmented flowanalysis. There is no significant difference between the results (P>0.05)， and both the relativeerrors and relative standard deviations of the nutrient data obtained by the two methods are withinthe allowable range by the“specification". Besides， segmented flow analysis shows lower errorsand standard deviations， indicating higher accuracy and better precision of segmented flowanalysis relative to spectrophotometry in nutrients determination. Key words： spectrophotometry； segmented flow analysis； nutrient 海水中的氮、磷、硅等元素组成的某些盐类，是海洋植物生长的必需营养盐，通常把这些盐称为“植物营养盐”“微量营养盐”或“生源要素”。海洋中的溶解态无机机化合物(包括硝酸盐(NOs-N)、亚硝酸盐(NO2-N)和铵盐)，可被浮游植物直接同化细胞内的氨基酸。溶解态的无机磷(磷酸盐， P04-P)可被利用合成为细胞内的遗传物质 (DNA、RNA)、高能化合物(ATP)、细胞膜的磷脂等。溶解态的硅酸盐(硅酸盐， SiOs-Si)是海洋植物， ( 张利华(1947.2-)、女，大学，高级工程 师 ，主要研究方向 ： 海洋生物地球求学和环境化学， ) ( E-mail：zhanglh03@msn.com ) ( 上海市重中之重学科建设项目资助 ) 尤其是硅藻用以构成自身的外壳所必需的营养盐盐。营养盐的分布和变化关系着海洋生物的生态平衡，造就了海洋生物的多样性。海洋中的富营养却会引发赤潮成为灾害。因此为了实现水资源的可持续利用和社会、经济、生态三大效益的统一，营养盐分布的研究正成为海洋环境研究项目中的一个重要指标。 分光光度法是研究者熟知的营养盐含量测定的方法。而随着科学技术的不断深入和发展，20年代末发展起来了一种定量、快速测定化学物质含量的方法——连续流动分析法。它可根据研究者的要求配置不同的化学反应模块，测定相应的化学物质。 本单位于2002年在国家重中之重项目的资助下，购入了一台荷兰 SKALAR 公司的连续流动分析仪(SANPUS SYSTEM， 荷兰)，配置有营养盐测定的化学模块。本文即使用分光光度计 (UV2102C 型，上海分析仪器厂)与连续流动分析仪对不同浓度范围的营养盐同时分别进行测定，并对两种测定方法获得的测定结果进行了比较。其中，分光光度法的测定由获得国家CMA 资质的单位承担完成。 1..材料和方法 分光光度法与连续流动分析法的测定项目及显色反应原理如表1。 表1两种测定方法的显色原理 测定项目 分光光度法： 连续流动分析法 磷酸盐 磷钼蓝法(抗坏血酸-酒石酸氧锑钾) 磷钼蓝法(抗坏血酸-酒石酸氧锑钾) 亚硝酸盐 重氨-偶氮法 重氮-偶氮法 硅酸盐 硅钼蓝法(米吐尔还原法) 硅钼蓝法(抗坏血酸还原法) 硝酸盐 锌-镉还原法 铜-镉还原法 连续流动分析法按河口海岸国家重点实验室作业指导书 QR/SKLEC-07-2004中的实施细则。 互校样品名称为 a、b、c共3种(表2)，由上海市计量测试研究院中国上海测则中心提供的工作标准溶液(SB020205-0408、SB020210-0409、SB020207-0402 和 SB020103-0408)经当日制备的新鲜 Milli-Q水(18.2MQ·cm)稀释而成，每份样品各1000 mL。其中 50mL用于连续流动分析法，950mL用于分光光度法。每份样品5个平行样。 表2互校样品各组分浓度 样品名称 N02-N(Hg/L) SiOs-Si(Hg/L) P04-P(Hg/L) NO3-N(Hg/L) a 92.5 46.25 92.5 74.0 b 8.5 4.25 8.5 6.8 C 48.5 24.25 48.5 38.8 2. 测定结果 2.1 互校样的连续流动分析结果 图1连续流动分析仪测定的结果 从上到下四条曲线分别依次为磷酸盐、亚硝酸盐、硅酸盐和硝酸盐用连续流动分析仪测定后自动生成的实验结果。横坐标为测定时间(sec)纵坐标为电信号强度(DU，由吸光度经数模转换器转换为电信号)。标准工作曲线与互校样同时测定。每条曲线上的信号叉依次为：开始信号、Tracer(指示信号，不参加计算)Drift(质量控制的指标，本实验以 60ug/L 为质量控制指标)、Wash(清洗)，紧接着的6个信号叉依次为工作曲线的6个溶液(0~100Hg/L)、Drift、Wash、5个a互校样品的平行测定、Wash、5个b互校样品的平行测定、Drift、Wash、5个c互校样品的平行测定，最后一个为结束信号。 由图1可见，每种营养盐的工作曲线线性很好，硅酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和磷酸盐的线性回归相关系数依次为 0.99995， 0.99995， 0.99995，0.99970，r>0.999。平行样的相对误差的绝对值依次分别为<0.04、<0.04、<0.02、<0.06。相对标准偏差分别为<0.6%、<0.72%、<0.88%、<3.8%。其中低浓度(4.25Hg/L)硅酸盐相对吴差为0.14，相对标准偏差为10.63%。在测定的过程中引入了质量控制(Drift)的手段，可以监控跟踪测定的全过程。 2.2 互校样的的分光光度法测定结果 图2 不同浓度互校样品测定结果与工作曲线 图2为分光光度计测定的结果。横坐标测定样品的名称，纵坐标为吸光度。图中依次为5个a互校样、5个b互校样、5个c互校样和5个标准溶液5个a互校样品的平行测定、Wash、5个b互校样品的平行测定、Drift、Wash、5个c互校样品的平行测定。 工作曲的线标准溶液和互校样同步测定。工作曲线线性较好，硅酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和磷酸盐的线性回归相关系数依次为 0.99915、0.99875(图中可见，亚硝酸盐的工作曲线稍有弯曲)、0.99995、0.99985， r>0.99。相对误差的绝对值依次为<0.16、<0.29、<0.35、<0.22，其中低浓度(4.25Hg/L)硅酸盐未检出。相对标准偏差分别为<5%、<0.29%、<21.1%、<5.8%。 3讨论 3.1 两种测定方法对测定结果的影响 将所有的测定结果分为两组，第一组为分光光度法的3种浓度的测定结果，连续流动分析法的结果为第二组。SPSS数据统计分析软件进行95%置信度的T检验和F检验(表4)。 表4 独立样品T检验 Levene's方差检验 测定项目 F Sig. t T检验 Sig. 相对误差 95%置信度区间 (2-tailed) Lower Upper 硅酸盐 0.544 .468 1.018 .319 6.50493 -6.83277 20.08019 亚硝酸盐 .001 .981 0.105 .917 13.05541 -25.37162 28.11399 硝酸盐 1.494 .232 -.574 .571 9.19423 -24.14196 13.58805 磷酸盐 0.101 .753 -.107 .916 12.76326 -27.31337 24.60664 由表4可见，硅酸盐、亚硝酸、硝酸盐、磷酸盐的方差检验值(F值)依次为0.544、0.001、1.494、0.101，其相伴概率依次为0.468、0.981、0.232、0.753，全部大于显著性水准(=0.05)，说明两组数据的标准偏差没有显著性差异，满足T检验的条件。统计分析得到的t值依次为1.018、0.105、-0.574、-0.107，相伴概率依次为0.319、0.917、0.571、0.916。由相伴概率可知亚硝酸和磷酸盐的测定结果更一致(相伴概率>0.91)，这两种营养盐测定的显色反应完全一致，引起稍有差异的只是测定使用的仪器。而硅酸盐和硝酸盐就不同了，它们不仅存在测定仪器的不同，还存在显色反应不一致的影响，在这两重控制变量的影响下，造成这两种营养盐测定结果之间的一致性较差些。尽管存在着这些差异，但所有的相伴概率全部大于显著性水准(a=0.05)，证明两种测定方法对测定结果没有显著性的影响 (P>0.05)。 3.2两种测定方法的平均值与标准值的比较 图3不同浓度互校样品测定结果的平均值(n=5)与标准值 横坐标为不同浓度的营养盐测定项目，纵坐标为测定值与标准值的比值，误差棒为相对标准偏差。图中100%处的直线为标准值，两条虚线为标准值±5%误差的比值区间。分光光度法低浓度的硅酸盐在图中缺省。 由图3的统计分析可以清楚地发现连续流动分析法的准确度相对较高，除了低浓度的硅酸盐外其他各浓度范围的营养盐测定结果都在标准值±5%误差的置信区间。同时根据图3中各测定结果误差棒的大小可知，尽管都在《海洋调查规范》允许的相对标准偏差的范围内，但连续流动分析法的精密度更高，重现性更好。 同样将所有的测定结果分为两组，分别与标准值进行“SPSS”的T检验(表5，图4)。 表5平均值与标准值的T检验 测定方法 Levene's方差检验 T检验 Sig. 测定项目 95%置信度区间F Sig. t(2-tailed) 相对误差 分光光度法 LOwer Upper 硅酸盐 .565 .460 1.127 .271 6.49585 -6.11436 20.76102 亚硝酸盐 .000 .995 .201 .842 12.97185 -23.96496 29.17830 硝酸盐 1.417 .244 -.590 .560 9.20351 -24.31429 13.45381 磷酸盐 2.805 .105 2.780 .010 9.98579 7.30505 48.21495 硅酸盐 .000 .995 .108 .915 6.48917 -12.59284 13.99209 连续流动 亚硝酸盐 .000 .986 .095 .925 13.04998 -25.49619 27.96715 分析法 硝酸盐 .000 .987 -.015 .988 10.36544 -21.38592 21.07935 磷酸盐 4.021 .055 2.755 .010 10.56832 7.46515 50.76159 两种测定结果与标准值的T检验 图4两种测定方法的结果平均值与标准值的显著性水准比较 图中直线为显著性水准α=1，当检验检方的相伴概率<显著性水准0.01时(α<0.01)，为极显著性差异，大于0.05(>0.05)时无显著性差异。相伴概率越接近1时检验双方越趋于一致。 由表5可见，由Levene's 方差检验得到的相伴概率大于显著性水准(α=0.05)，说明进行检验的两方总体方差相等，符合T检验的条件。从表5和图4中T检验的相伴概率可知，连续流动分析法测定硅酸盐、亚硝酸盐和硝酸盐测的相伴概率依次为0.915、0.925、0.988，可见用连续流动分析法测定这三种营养盐的结果与标准浓度十分一致，说明该方法的测定准确度很高。分光光度法测定这三种营养盐的结果与标准浓度虽然没有显著性的差异(P>0.05)，但准确度不如连续流动分析法，尤其是硅酸盐相伴概率为0.217，可能是受分光光度法对低浓度硅酸盐检测下限的限制，未检测到 4.25mg/L浓度的硅酸盐，使得统计时该组数据的平均值高于标准值，标准偏差低于标准值的标准偏差。表5和图2中还可见磷酸盐的相伴概率为0.010，小于显著性水准(α<0.01)，说明磷酸盐的测定值与标准值之间存在显著的差异，两者方法对磷酸盐的测定都存在着系统误差，这种误差可能来自于磷钼蓝法更 适合于低浓度磷酸盐的定量分析。 3.3 两种测定方法采样量和显色反应时间比较 表6两种测定方法采样量和显色反应时间 测定项目 分光光度法 连续流动分析法 采样量(mL) 显色反应时间(min) 采样量(mL) 显色反应时间(min) 硅酸盐 50 180 1.4 3 磷酸盐 25 10 1.4 3.5 亚硝酸盐 25 20 1.4 3 硝酸盐 25 20 1.4 3.5 由表6可见分光光度法测定需要的样品量是连续流动分析法样品量的25倍以上，显色反应所花的时间也远远地大于连续流动分析法。可知连续流动分析法既省时又节约成本，适于完成大批样品的测定工作。 4 结语 从以上的分析可知，连续流动分析法和分光光度法对营养盐测定的结果没有显著性的差异(P>0.05)，但连续流动分析法对测定结果的准确度和精密度优于分光光度法。而且连续流动分析法取样量少，可同时快速测定多种营养盐；全部操作都由电脑控制定时定量，故减少人为因素造成的偶然误差，使得精密度、准确度、重现性较分光光度法有很大提高。要完成大批量样品的营养盐测定，在实验室选用连续流动分析法更为合适。但是，该类仪器目前还没有国产化，相对价格昂贵，而分光光度计价格便宜，性能也都很稳定，更适于进行野外现场营养盐含量的观测。 ( 5参考文献 ) ( [1]李凤岐李少菁.海洋科学导论冯世论[M].北京：高等教 育 出版社， 1999.133~142 ) ( [2]《海洋监测规范》(GB17378-1998) ) ( [3 ] 《海洋调查规范》(GB8538-1995) )