肾上腺素中毛细管电泳光导纤维发光二极管诱导荧光检测方案(毛细管电泳仪)

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第29卷第5期2010年5月分析试验室Chinese Journal of Analysis LaboratoryVol.29.No.52010-5 毛细管电泳光导纤维发光二极管诱导荧光检测法同时测定肾上腺素和多巴胺 甘 杰*1，赵书林，王盛才，万小卓，胡 军' (1.湖南省环境监测中心站，长沙410014；2.广西师范大学化学化工学院，桂林541000) 摘 要：采用自行设计、组装的毛细管电泳光导纤维发光二极管诱导荧光检测装置，建立了同时测定肾上腺素(EP)和多巴胺(DA)的方法。采用胶束电动色谱分离模式，通过优化分离电压、十二烷基硫酸钠(SDS)浓度、背景电解质浓度和pH等影响因素，在最佳实验条件下，EP和DA的线性范围分别为2.2×10~1.1x10~'mol/L和2.6×10-8~1.2 ×10mol/L， EP 和DA的检测限(S/N=3)分别为1.2×10° mol/L和1.1 ×10- mol/L。该方法可应用于人血浆中 EP和DA含量的测定。 关键词：毛细管电泳；荧光检测；肾上腺素；多巴胺 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：1000-0720(2010)05-093-05 多巴胺和肾上腺素都是非常重要的单胺类神经递质，也是重要的激素物质，对人体的心血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏等组织系统的生理活动和学习记忆、心血管活动的调节起着广泛的调节作用。因此，对其建立快速、简便的测定方法十分必要： 目前，对EP和DA的测定研究已有许多报道，但大都为单一组分的测定2，3]，由于EP和DA结构相似(图1和图2)，因此测定的选择性一般较差。而常用的检测方法有荧光法4，高效液相色谱法(HPLC)，电分析化学法，化学发光分析法(CL)。由于毛细管电泳(CE)的高效、快速、低消耗等优势，使得其在生物样品的痕量组分分离分析中具有更为广泛的应用，配备高灵敏的激光诱导荧光(LIF)检测器的 CE 装置更易于此类分析检测9，10]。但由于激光光源体积大、能耗高、使 图1 肾上腺素 Fig.1 Structure of epinephrine 图2 多巴胺 Fig.2 Structure of dopa mine 用寿命短以及可选激发波长有限，这又缩小了它的使用范围。 本文使用自组装的CE光导纤维LED诱导荧光检测装置，以高亮度的蓝色LED作为激发光源，FITC作为柱前衍生试剂，通过优化分离电压、背景电解质浓度和pH对分离的影响，建立了同时测定EP和DA的方法，并应用于人血浆中EP和DA含量的测定。 实验部分 1.1 CE 光导纤维LED 诱导荧光检测仪器 自组装 CE光导纤维LED 诱导荧光检测装置如图3所示。蓝色LED 作为激发光源，用一根直径40 pm，长20cm 的光导纤维传导激发光源。LED发出的光经100×的显微物镜聚焦收集后，通过光导纤维传输到毛细管检测窗位置进行衍生物 ( * 收稿日期：2009-08-25；修订日期：2009-09-14 ) ( 作者简介：甘 杰(1982-)，男，硕士研究生； E- mail： ganjie1982 @163. com ) 的激发。发射的荧光通过一个40×显微目镜收集后，依次通过狭缝(0.3mm)和橙色滤光片(最大波长 435 nm)到达 PMT。输出信号通过色谱工作站进 行数据处理。整个光学系统放置在暗室中，以避免外界光的干扰。 图3 仪器装置图 Fig.3 Schematic diagram of the instrument 1-光导纤维；2-毛细管检测窗；3-显微物镜；4-狭缝；5-滤光片；6-PMT；7-LED；8-三维平台；9-分离毛细管； 10-铂电极；11-储液池；12-高压电源；13-有机玻璃盒；14-计算机；15-黑色暗箱 LED(深圳世峰科技公司，工作电压+3.5V，强度约3mW，最大波长475 nm， 半峰宽约25 nm) ；显微物镜(Olympus，日本)；显微目镜 (Olympus，日本)； PMT(北京滨松光子技术公司)；未涂层石英毛细管63cm(有效长度55 cm) ×75 um I.D.(河北永年光导纤维厂)；高压电源(0~30kV，北京彩陆科学仪器公司)； PHSJ-4A型pH计(上海雷磁公司)；XW-80A 旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)， TCL-16GA型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；LS-55型荧光磷光发光光度计(美国PerkinElmer公司)。 1.2 试剂 硼砂(NazB4O， ·10HO，广州化学试剂二厂)；十二烷基硫酸钠(SDS，上海化学试剂采购供应站)；荧光素异硫氰酸酯(FITC，美国Sigma 公司)；肾上腺素(EP，美国 Sigma公司)；多巴胺(DA，美国 Sigma 公司)；实验所用其它试剂均为分析纯，实验用水为高纯石英亚沸蒸馏水。 1.3 人血浆样品处理 取 500uL人血浆，置于1.5mL的离心管中，加入 1000匹L乙腈，旋涡振荡混合5 min，然后在1.2 ×10* r/min 下高速离心20 min， 取上层清液， 用N吹干，再用10 pL pH9.5 的 10 mmol/L 硼砂缓冲溶液溶解残留物，试液置于冰箱(4 ℃中保存。 1.4 柱前衍生 取5uL待测EP和DA标准溶液或人血浆样品溶液，加入40L浓度为1.0 ×10'mol/L 的 FITC丙酮溶液，再加入10 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH10.0)至50匹L，置于暗处，室温下反应14~16h。分析前用缓冲溶液稀释至所需浓度后进样测定。 1.5 毛细管电泳操作 新毛细管依次用1 mol/L的 HCl溶液，亚沸蒸馏水和1 mol/L 的NaOH溶液各冲洗30 min。每2次测定之间分别用亚沸蒸馏水，0.1 mol/L 的 NaOH和电泳缓冲溶液依次各冲洗2 min 。进样前电泳缓冲溶液和样品溶液均需用0.45 um的滤膜过滤，并超声脱气2 min。电泳缓冲溶液为含有50 mmol/LSDS 的15 mmol/L 硼砂溶液(pH9.2)，采用重力进样(抬高15 cm) 15s，操作电压为15kV。 2 结果讨论 2.1 LED 的选择 进行荧光检测时，光源的发射波长必须同荧光衍生物的激发波长相匹配，才能有效激发衍生 物，获得高的激发效率。通过荧光光度计获得了FITCEP、DA的荧光激发和发射光谱，从图4中可以看到， FITC-EP、DA的最大激发和最大发射波长分别为497 nm和515 nm。由于荧光化合物的最大激发和最大发射波长仅存在较小差异(em-ex=一22nm)，所以如果选用最大发射在490 nm或者495 nm的LED，将会造成同FITC-EP、DA的荧光发射光谱与LED 的发射光谱发生大约35%的重叠，从而导致较高的背景噪音，对检测产生较大影响。此外，在 FITC-EP、DA 的激发光谱中，在465~475 nm处有一个肩峰，当采用475nm的蓝色LED激发 FITC-EP、DA时，虽然其激发效率会低于495 nm的LED，但是由于低的背景噪音水平，仍然能够获得高的检测灵敏度，故在本实验中，采用最大发射在475 nm的蓝色LED作为激发光源。 图4 FITC-EP、AD 的荧光激发和发射光谱 Fig.4 Excitation and emission spectra of FITC EP and AD1-激发光谱；2-发射光谱 2.2 SDS 浓度对分离的影响 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在毛细管电泳中常用作分离中性分析物时的电泳缓冲溶液添加剂。当水溶液中表面活性剂的浓度高于临界胶束浓度(CMC)时，表面活性剂分子就会聚集形成胶束，疏水性分析物有可能会进入胶束的中心，与胶束一起在外加电压的作用下迁移。阴离子表面活性剂形成的胶束带负电，向阳极迁移。由于分析物在胶束相与水相中的分配存在的差异，导致了电泳迁移速率的差异，从而可实现分离的目的。本实验改变电泳缓冲溶液中 SDS的浓度，考察了其浓度分别为10、20、30、40和50 mmol/L时对EP和DA分离的影响。结果表明，随着 SDS 浓度的加大，EP和DA的分离度逐渐增大，但当 SDS浓度大于50 mmol/L时，峰形变差，且产生拖尾现 象。这可能是由于 SDS 浓度的增加引起离子强度增高，焦耳热增大，导致EP和DA的分离效率下降。故实验选择 SDS 的最佳浓度为50 mmol/L。 2.3 电泳缓冲溶液pH对分离的影响 由于电泳缓冲液的pH可以改变EOF及溶质的电荷，从而影响EP和DA的分离。因此实验考察了缓冲溶液pH分别为8.5，9.0，9.2，9.5和10.0时，对EP和DA分离的影响pH在8.5~9.2时，分离度随pH的升高而增大，pH>9.2后，分离度开始减小。故实验选择电泳缓冲液的pH 为9.2。 2.4 分离电压对分离的影响 电渗流与电场强度成正比，分离电压增大，电渗流也变大，衍生物的迁移速率加快，迁移时间缩短，但分离度下降。与此同时，电压增大产生的焦耳热也随之增大，使得峰扩张也会造成分离度降低。实验尝试了不同电压(10、12、15、18、20 kV)对EP和DA分离的影响，结果发现电压为15 kV时，分离效果最好。 2.5 实验条件的确定 综合考虑以上实验结果，确定了如下实验条件：运行缓冲溶液为含有50 mmol/L SDS 的15 mmol/L硼砂溶液(pH9.2)，分离电压为15 kV。在此条件下，对6. 5 ×10 mol/L的 EP和3.0×10mol/L的 DA 的分离结果如图5所示。 图5 电泳条件 Fig.5 Electropherograms of epinephrine and dopa mine 电压 15 kV， pH 9. 2 的 15 mmol/L 硼砂溶液， 50 mmol/L SDSEP和DA的浓度分别为6.5 ×10- mol/L 和3.0 ×10~'mol/L 2.6 工作曲线、线性范围和检出限 在最佳实验条件下，对一系列EP和DA的衍生物溶液进行CE分离，然后用峰高对浓度按最小二乘法，进行线性回归分析，得到线性回归方程 和相关系数： 式中c为EP或 DA的浓度(mol/L)，H为荧光强度(mV)，r为相关系数。结果表明，EP和DA的浓度在2.2×10~1.1×10mol/L 和2.6 ×10-8~1.2X10~°mol/L 范围内呈现良好的线性关系。在信噪比为3(S/N=3)时，EP和DA的检出限分别为1.2×10°mol/L 和1.1 ×10 mol/L。 图6 人血浆样品的电泳图 Fig.6 Electropherogram of the human plasma sample电泳条件与图5相同 2.7 样品分析 对6个成年人血浆中EP和DA的含量进行了测定，典型的电泳图如图6所示。为了考察图6中所标示 EP和DA峰的可靠性，本实验在人血浆样品中，加入了EP和DA标准溶液，然后重新对样品进行衍生、分离和检测，得到加标后的电泳图，见图7。在优化的条件下，测定样品中EP和DA的平均含量，所得结果见表1。 表1 人血浆中EP和DA的测定结果 Tab.1 Determination results of EP and DA in human plasma sa mples 序号 测定 人血浆样品浓缩后 RSD/% 加入量 测得总量 回收率 人血浆中原始 物质 测得值c/(nmol/L) (n=4) c/(nmol/L) c/(nmol/L) /% 含量 c/(nmol/L) 1 EP 17.4 4.2 20 37.8 102.0 3.48 DA 29.1 3.8 160 191.8 101.7 5.82 2 EP 16.2 3.1 20 36.9 103.5 3.24 DA 29.9 4.6 160 199.2 105.8 5.98 3 EP 19.3 3.5 20 38.8 97.5 3.86 DA 35.2 4.1 160 204.2 105.6 7.04 4 EP 20.6 3.8 20 41.4 104.0 4.12 DA 34.4 3.5 160 192.0 98.5 6.88 5 EP 20.1 4.1 20 39.0 94.5 4.02 DA 31.2 4.2 160 189.3 98.8 6.24 6 EP 19.4 4.0 20 40.3 104.5 3.88 DA 39.7 3.2 160 207.5 104.9 7.94 ( 1999 ) ( 参考文献 ) ( [1 ] 吕国蔚.医学神经生物学.北京：高等教育出版社. ) ( [2] Zhou M， Guo L P， Hou Y et al.E l ectrochim Acta ， 2008， ) ( 53(12)：4176 ) ( 31 S P B arrett ， R O Pihl， C Benkelfat et al. 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College of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi Normal University， Guilin541000)， Fenxi Shiyanshi ， 2010，29(5)： 93~97 Abstract ： A new analytical method based on capillary electrophoretic separation and optical fiber LED induced fluores-cence detection has been developed for the determination of epinephrine and dopamine. Using micellar electrokineticcapillary chromatography， the applied voltage， micellar concentration， pH and the concentration of the buffer were op-timized. Under the optimal conditions， the calibration curves of epinephrine and dopamine ranging from 2. 2 x10to1.1 x10’mol/L and from 2.6 ×10- to 1.2×10mol/L were shown to be linear， respectively. The limit of detec-tions (S/N=3) for epinephrine and dopamine were 2.6 ×10’ mol/L and 2.3 ×10-8 mol/L， respectively. The meth-od was applied to the determination of epinephrine and dopamine in human plasma with satisfactory results. Key words ： Capillary electrophoresis； Fluorescence； Epinephrine； Dopamine —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net