鼠李糖乳杆菌中叶酸检测方案(培养箱)

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GB 5009.211—2014 中华人民共和国国家标准 G5B009.211—2014 食品安全国家标准食品中叶酸的测定 2015-09-21发布 2016-03-21实施 前 言 本标准代替 GB/T 5009.211 2008《食品中叶酸的测定》、GB 5413.16 2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中叶酸(叶酸盐活性)的测定》。 本标准与 GB/T 5009.211—2008相比，主要变化如下： -标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中叶酸的测定”； ——修改了菌种名称，由干酪乳杆菌改为鼠李糖乳杆菌； ——删除了培养基和用于叶酸盐降解的鸡胰腺供货信息； ——删除了附录B中酶解酪蛋白液的制备方法； -增加了检出限和定量限。 食品安全国家标准食品中叶酸的测定 1 范围 本标准规定了食品中叶酸的测定方法。 本标准适用于食品中叶酸的测定。 2 原理 叶酸是鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7469)生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌液接种至含有试样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率(或吸光度值)，根据叶酸含量与透光率(或吸光度值)的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。 3 试剂和材料 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 盐酸(HCl)。 3.1.2 氢氧化钠(NaOH)。 3.1.3 氯化钠(NaCl)。 3.1.4 十二水合磷酸钠(NaPO4·12H2O)。 3.1.5 七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)。 3.1.6 磷酸氢二钾(KHPO4)。 3.1.7 三水合磷酸二氢钾(KHPO4·3H2O)。 3.1.8 七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)。 3.1.9 七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)。 3.1.10 一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)。 3.1.11 三水合乙酸钠(CH，CooNa·3HzO)。 3.1.12 葡萄糖(C，H12O)。 3.1.13 抗坏血酸(C，HgO6). 3.1.14 甲苯(C，Hg)。 3.1.15 无水乙醇(CHO)。 3.1.16 鸡胰腺干粉：含Y-谷胺酰基水解酶。 3.1.17 木瓜蛋白酶：酶活力≥5 U/mg。 3.1.18 α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。 3.1.19 蛋白胨：含氮量≥10%。 3.1.20 酵母提取物(干粉)：含氮量≥10%。 3.1.21 琼脂。 3.2 试剂配制 3.2.1 磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH6.8)：分别称取4.35g十二水合磷酸钠和10.39 g七水合磷酸氢二钠，用水溶解并稀释至1L，混匀。加入2mL甲苯，室温保存。临用前按大约 5 mg/mL的比例加入抗坏血酸作为叶酸保护剂，加入量以 pH达到6.8为宜。 3.2.2 乙醇溶液(20%，体积分数)：量取200 mL 无水乙醇与800 mL水混匀。 3.2.3 氢氧化钠乙醇溶液(0.01 mol/L)：称取 0.4g氢氧化钠，用乙醇溶液溶解并稀释至1L，混匀。 3.2.4 氢氧化钠溶液(1 mol/L)：称取40g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L，混匀。 3.2.5 盐酸溶液(1 mol/L)：量取 83.3mL盐酸，用水稀释至1L，混匀。 3.2.6 盐酸浸泡液：量取100mL盐酸与50倍水混合。 3.2.7 鸡胰腺溶液：称取100 mg 鸡胰腺干粉，加入20 mL磷酸缓冲液，摇匀。现用现配。 3.2.8 蛋白酶-淀粉酶液：分别别取200 mg 木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，加入20 mL磷酸缓冲液研磨至匀浆，3000 r/min 离心5 min。现用现配。 3.3 培养基 3.3.1 甲盐溶液：分别称取25g磷酸氢二钾和25g三水合磷酸二氢钾，加水溶解并稀释至500mL，混匀。加入1mL甲苯，2℃~4℃冰箱可保存1年。 3.3.2 乙盐溶液：分别称取10g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰，加水溶解并稀释至500mL。加5滴盐酸，于2℃~4℃冰箱可保存1年。 3.3.3 琼脂培养基：按表1称量或吸取各试剂，加水至100 mL，混合，沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1 mol/L 盐酸溶液和1mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH至6.8±0.1。尽快分装，根据试管内径粗细加入3mL~5 mL，液面高度不得低于2cm。塞上棉塞，121℃(0.10 MPa~0.12MPa)高压灭菌15 min。试管取出后直立放置，待冷却后于冰箱内保存，备用。 表1 菌种储备用琼脂培养基配制一览表 试 剂 用 量 葡萄糖/g 1.0 蛋白胨/g 0.8 酵母提取物干粉/g 0.2 三水合乙酸钠/g 1.7 甲盐溶液/mL 0.2 乙盐溶液/mL 0.2 琼脂/g 1.2 3.3.4 叶酸测定用培养液：可按附录A配制叶酸测定用培养液，也可直接由试剂公司购买效力相当的叶酸测定用培养基，用前按说明书配制。 3.4 标准品 叶酸标准品(C19H19N7O；)：纯度≥99%。 3.5 标准溶液的配制 3.5.1 叶酸标准储备液(20.0 pg/mL)：精确称取20.0mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解并转 移至1000mL容量瓶中，定容至刻度。 叶酸标准储备液浓度标定：准确吸取1.0 mL标准储备液至5mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液定容至刻度。用紫外-可见分光光度计，于比色杯厚度1cm，波长256 nm 条件下，以氢氧化钠乙醇溶液调零点，测定3次标准溶液吸光度值，取平均值按式(1)计算叶酸标准储备液浓度。 式中： Ci 标准储备液中叶酸浓度，单位为微克微毫升(ug/mL)； A ——平均吸光度值； E ——摩尔消光系数，数值为24500； M ——叶酸相对分子质量，数值为441.42； 5 ——稀释倍数； 1 000——由克每升换算为微克每毫升的换算系数。 标定好的叶酸标准储备液储存于棕色瓶中，于2℃~4℃冰箱可保存两年。 3.5.2 叶酸标准中间液(0.200 ug/mL)：准确吸取1.00 mL叶酸标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀后储存于瓶中2℃~4℃冰箱可保存1年。 3.5.3 叶酸标准工作液(0.200 ng/mL)：准确吸取1.00 mL叶酸标准中间液置于1000 mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀。现用现配。 4 仪器和设备 4.1 天平：感量为0.1 mg 和1mg。 4.2 恒温培养箱：37℃±1℃。 4.3 压力蒸汽消毒器：121℃(0.10 MPa~0.12MPa)。 4.4 涡旋振荡器。 4.5 离心机：转速≥3 000 r/min。 4.6 接种环。 4.7 pH计：精度为±0.1。 4.8 紫外-可见分光光度计。 4.9 超净工作台。 4.10 超声波振荡器。 5 菌种的制备与保存 5.1 菌种 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7469)。 5.2 储备菌种的制备 将菌种鼠李糖乳杆菌转接至琼脂培养基中，在37℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24 h，连续传种2代~3代。取出后放入2℃~4℃冰箱作为储备菌株保存。每月至少传代1次，可传30代。 实验前将储备菌株接种至琼脂培养基中，在37℃±1℃恒温培养箱中培养20 h~24h以活化菌株，用于接种液的制备。 注：保存数周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。 5.3 接种液的制备 试验前一天，取2mL叶酸标准工作液与4 mL叶酸测定用培养液混匀，分装至2支5mL离心管中，塞上棉塞，于121℃(0.10 MPa~0.12 MPa)高压灭菌15 min 后即为种子培养液。冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中，于37℃±1℃恒温培养箱中培养20 h~24 h。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下用无菌注射器吸取 0.5 mL转种至另两支已消毒但不含叶酸的培养液中，于37℃±1℃再培养6h。振荡混匀，制成接种液，立即使用。 6 分析步骤(所有操作均需避光进行) 6.1 试样制备 谷薯类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5 mm)；肉、蛋、坚果等用匀质器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。于4℃冰箱可保存1周。 6.2 试样提取 6.2.1 直接提取法 形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养素补充剂或强化剂、预混料；以饮料为基质或叶酸添加量>100 pg/100 g 的食品可采用直接提取法。 准确角取固体试样0.1 g~0.5g或液体试样0.5g~2g，精确至0.001 g，转入100 mL锥形瓶中，加人80 mL氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡2h~4h至试样完全溶解或分散，用水定容至刻度。 6.2.2 酶解提取法 谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆及坚果类等食品试样宜采用酶解提取法。 准确称取适量试样(约含0.2 pg~2pg叶酸)，精确至0.001g.一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样2g~5g；蛋类、豆、坚果类、内脏、干制试样0.2g~2g；流质或半流质试样5 g~10 g。转入100 mL锥形瓶中，加30mL磷酸缓冲液，振摇 5 min 后，具塞，于121℃(0.10 MPa~0.12MPa)高压水解15 min。 试样取出后冷却至室温，加入1mL鸡胰腺溶液；含有蛋白质、淀粉的试样需另加加1mL蛋白酶-淀粉酶液，混合。加入3滴~5滴甲苯后，置于37℃±1℃恒温培养箱内酶解16 h~20 h。取出，转入100 mL容量瓶，加水定容至刻度，过滤。 另取一只锥形瓶，同试样操作，定容至100 mL，过滤。作为酶空白液。 注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量，可采用酶解法提取。 6.3 稀释 根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释，使试样稀释液中叶酸含量在0.2 ng/mL~0.6 ng/mL 范围内。 6.4 测定系列管制备 所用试管使用前洗刷干净，沸水浴 30 min，沥干后放入盐酸浸泡液中浸泡2h，经170℃±2℃烘干3h后使用。 6.4.1 试样和酶空白系列管 取3支试管，分别加入0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL试样稀释液(V)，补水至5.0 mL。加入5.0 mL叶 酸测定用培养液，混匀。另取3支试管同法加入酶空白液。 6.4.2 标准系列管 取试管分别加入叶酸标准工作溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL 和5.00 mL，补水至5.00 mL，相当于标准系列管中叶酸含量为 0.00 ng、0.05 ng、0.10 ng、0.20 ng、0.30 ng、0.40 ng、0.50 ng、0.60 ng、0.80 ng、1.00 ng，再加入5.0 mL叶酸测定用培养液，混匀。为保证标准曲线的线性关系，应制备2套~3套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。 6.5 灭菌 将所有测定系列管塞好棉塞，于121℃(0.10 MPa~0.12MPa)高压灭菌15 min。 6.6 接种和培养 待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，用预先高压灭菌的移液管向每支测定管加接种液20 pL，混匀。塞好棉塞，置于37℃±1℃恒温培养箱中培养20 h~40 h，直至获得最大混浊度，即再培养2h透光率(或吸光度值)无明显变化。另准备一支标准0管(含0.00 ng叶酸)不接种作为0对照管。 6.7 测定 将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用厚度为1 cm 比色杯，于540 nm 处，以未接种0对照管调节透光率为100%(或吸光度值为0)，依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0对照管有明显的细菌增长；或与0对照管相比，标准0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.1以上)，或标准系列管透光率最大变化量<40%(或吸光度值最大变化量≤0.4)，说明可能有杂菌或不明来源叶酸混入，需重做实验。 注：叶酸测定适宜的光谱范围540 nm~610nm。 6.8 分析结果表述 6.8.1 标准曲线：以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标，绘制标准曲线。 6.8.2 试样结果计算：从标准曲线查得试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量(c，)，如果3支试样系列管中有2支叶酸含量在 0.10 ng~0.80 ng 范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10%，则可继续按式(2)、式(3)、式(4)进行结果计算，否则需重新取样测定。 试样稀释液叶酸浓度按式(2)计算： 式中： c——试样稀释液中叶酸浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； C，一-从标准曲线上查得试样系列管中叶酸含量，单位为纳克(ng)； V，——制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升(mL)。 采用直接提取法的试样叶酸含量按式(3)计算： 式中： x -试样中叶酸含量，单位为微克每百克(pg/100 g)； C ——试样稀释液叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)； 试样提取液定容体积，单位为毫升(mL)； f 试样提取液稀释倍数； m 试样质量，单位为克(g)； 1001000——由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(pg/100 g)的系数。 采用酶解提取法的试样叶酸含量按式(4)计算： 式中： 试样中叶酸含量，单位为微克为百克(ug/100 g)；fV _-试样稀释液中叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)； ——试样提取液稀释倍数； ——酶空白液中叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升(ng/mL)； ——试样提取液定容体积，单位为毫升(mL)； m 试样质量，单位为克(g)； 100——由纳克每克(ng/g)换算为微克每百克(ug/100g)的系数。1000 注：液体试样叶酸含量也可以微克百毫升(ug/100 mL)为单位。 以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 7 精密度 一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。 8 其他 果蔬类试样称样量为5g时，检出限为 0.2ug/100 g，定量限为0.4 pg/100 g；蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时，检出限为1.0 ug/100 g，定量限为2.0 ug/100 g；营养强化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为 0.5 pg/100 g，定量限为1.0 pg/100g。 附 录 A 叶酸测定用培养液的配制方法 A.1 试剂 A.1.1 无水乙醇(CH，O). A. 1.2 碳酸氢钠(NaHCO；)。 A.1.3 盐酸(HCl)。 A.1.4 氢氧化钠(NaOH)。 A.1.5 甲苯(C，Hg). A.1.6 冰乙酸(C，HO)。 A.1.7 活性炭：粒度为0.05mm~0.074mm。 A.1.8 硫酸腺嘌呤(CoH1oN1o·H，SO4)。 A.1.9 盐酸鸟嘌呤(C，H，N，Os·HCl) A. 1.10 尿嘧啶(CHN202)。 A.1.11 黄嘌呤(C，HN4O2)。 A. 1.12 氨水(NH，O)。 A.1.13 三水合乙酸钠(CHONa·3HzO)。 A.1.14 核黄素(C7H20N406). A.1.15 生物素(C1oH16N2O，S)。 A.1.16 对氨基苯甲酸(C，HNO)。 A.1.17 盐酸吡哆醇(CgHnNO3·HCl)。 A. 1.18 盐酸硫胺素(C12H17CINOS·HCl)。 A. 1.19 泛酸钙(C18H32CaN2O1o)。 A. 1.20 尼克酸(C，H，NO)。 A.1.21 聚山梨酯-80(吐温-80)。 A. 1.22 还原型型胱甘肽(CH7N，O，S)。 A.1.23 L-天冬氨酸(CHNO4)。 A.1.24 L-色氨酸(CnH12N2O2)。 A.1.25 L-盐酸半胱氨酸(C；H，NO，S·HCl)。 A.1.26 无水葡萄糖(C，H12O；)。 A.1.27 去维生素酪蛋白(vitamin free casein)。 A.2 试剂配制 A.2.1 氢氧化钠溶液(10 mol/L)：称取40g氢氧化钠，用100 mL水溶解。 A.2.2 氢氧化钠溶液(1 mol/L)：称取4g氢氧化钠，用100 mL水溶解。 A.2.3 酪蛋白液：称取50g去维生素酪蛋白于500 mL烧杯中，加200 mL 盐酸溶液，于121℃(0.10MPa~0.12 MPa)高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200 mL水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以除去盐酸。用10 mol/L 氢氧化钠调节 pH 至3.5±0.1。加20 g活性炭，振摇约20 min，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至1000 mL，加1mL~3mL甲苯，于2℃~4℃冰箱可保存1年。 注：每次蒸发时不可蒸干或焦糊，以避免所含营养素破坏。也可直接购买效力相当的酸水解无维生素酪蛋白。 A.2.4 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液。分别称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤以及尿嘧啶各0.1 g于250mL烧杯中，加75mL水和2mL盐酸，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如此反复直至冷却后无沉淀产生为止，加水至100 mL。加3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，于2℃~4℃冰箱可保存1年。 A.2.5 黄嘌呤(C，HN4O2)溶液：称取0.4g黄嘌呤，加10mL氨水，加热溶解，加水至100 mL。加3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，于2℃~4℃冰箱可保存1年。 A.2.6 Z乙酸缓冲液(1.6mol/L，pH4.5)：称取63g三水合乙酸钠，用200mL水溶解，加大约 20 mL冰乙酸至pH 4.5±0.1，混合后，用水稀释至500 mL。 A.2.7 维生素液：称取100 mg核黄素用400 mL 乙酸缓冲液溶解。取25 mg碳酸氢钠溶解于500 mL水中，加入2 mg生物素，200 mg 对氨基苯甲酸，400 mg 盐酸吡哆醇，40 mg 盐酸硫胺素，80 mg泛酸钙，80 mg 尼克酸溶解。将上述两种溶液混合，加水至1000 mL。加入3滴~5滴甲苯，贮存于棕色试剂瓶中，于2℃~4℃冰箱可保存1年。 A.2.8 聚山梨酯-80溶液(吐温-80)：将10 g聚山梨酯-80溶于无水乙醇中并稀释至100mL，于2℃~4℃冰箱保存。 A.2.9 还原型谷胱甘肽(C丫oH17NO，S)溶液：称取0.1g还原型谷胱甘肽，加100 mL水溶解，贮于棕色瓶中，现用现配。 A.2.10 磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH6.8)：按3.2.1配制。 A.2.11 盐酸溶液(1mol/L)：按3.2.5配制。 A.2.12 甲盐溶液：按3.3.1配制。 A.2.13 乙盐溶液：按3.3.2配制。 A.3 叶酸测定用培养液 配制1000 mL 叶酸测定用培养液，按表A.1吸取液体试剂，混合后加水300 mL，依次加入固体试剂，煮沸搅拌2 min。用1 mol/L氢氧化钠溶液、1 mol/L盐酸溶液调节pH至6.8±0.1；加入乙盐溶液20 mL，用磷酸缓冲液补至1000mL。制制时可根据用量按比例增减，现用现配。 表A.1 叶酸测定用培养液配制一览表 试 剂 用 量 液体试剂 酪蛋白液/mL 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液 黄嘌呤溶液/(mol/L) 维生素液/mL 聚山梨酯-80溶液/mL 甲盐溶液/mL 200 20 mL 5 10 1 20 固体试剂 还原型谷胱甘肽溶液/mL L-天冬氨酸/g L-盐酸半胱氨酸/g L-色氨酸/g 无水葡萄糖/g 三水合乙酸钠/g 5 0.6 0.4 0.4 40 40 中 华 人民共和国发布国家卫生和计划生育委员会 所需配置试剂和仪器如下：1、试剂盐酸(IIC 1) 。氢氢氧化钠(NaO II) 。氯氯化钠(NaCl。十十二水合磷酸钠(Na：PO.·12I1O)。3.1.5-七七水合磷酸氢二钠(Na?I IPO， ·7II.O) 。3.1.6磷磷酸氢二钾(KzI IPO， ) 。三水合磷酸二氢钾(KI IPO， ·3II.O) 。3.1.8七水合硫酸镁(MgSO.·7IIyO) 。七水合硫酸亚铁(Fe SO：·711：O) 。一水合硫酸锰(Mn SO， ·IIO) 。三水合乙酸钠(CI：CooNa·3IIzO).3.1.12葡萄糖(CE IIi zO) 。抗坏血酸(C， II gO， ) 。甲苯(Cy II) .无水乙醇(Cz II sO) 。鸡胰腺丁粉：含Y-谷胺洗基水解酶。木瓜蛋白酶：酶活力三5U/mg.a-淀粉酶：酶活力三1.5U/mg。蛋白胨：含氮量10%。酵母提取物(下粉)：含氮量10%。琼脂。2、仪器和设备天平：感量为0.1mg和1mg。恒温培养箱：37℃士1℃。斥力蒸汽消毒器：121℃(0.10MPa~-0.12MPa) 。4.4涡旋振荡器。离心机：转速3000r/min。接种环。pH计：精度为±0.1。紫外-可见分光光度计。超净工作台。超声波振荡器。