细胞中生长环境检测方案(培养箱)

智能文字提取功能测试中

LABO Life Sciences56www.hbo.co 为最佳的细胞生长考虑所有 CO2 培养箱参数 Mary Kay Bates，M.S. 细胞培养应用中的研究进展正在发生前所未有的变化。培养细胞被用于疫苗和药品生产，毒性测试，再生医学，细胞疗法，癌症新模型，免疫学，神经病学等。在这些日益敏感的应用中，细胞的完整性和健康相应的更重要。 12/2014 我们正在逐渐远离长期建立的突变细胞系，并使用更敏感的细胞，包括干细胞，原代细胞和3D 培养。这些细胞类型都更适合模拟体内环境，以对困难的生物学问题提供更好的答案，或充当治疗剂。细胞不断从其外部环境取样，通过打开和关闭转录，翻译，细胞分裂等进行反应。因此，对外部线索如何影响细胞生长和蛋白表达的理解和认识是至关重要的。 为了最好的支持这些敏感的细胞类型，并确保它们对体内环境的精确响应预测，新的 CO2培养箱为21世纪细胞培养提供更好的培养环境而设计。考虑您的敏感细胞，您应该注意培养箱的所有参数，因为所有参数共同提供完整的细胞培养成功的关键。 温度 培养的哺乳动物细胞对温度极为敏感。正如你发烧时觉得不舒服，你的细胞对较高的温度是最敏感的。细胞可以在4℃下生存存储数天，但它们在高于正常温度(通常37℃)2℃下不能经受超过几个小时[1]。寻找一个 CO2 培养箱，在开门后的恢复过程中，不超过设定温度，由两个温度传感器精确地控制温度和消除任何过热的机会。经常被忽略的是培养箱恢复到设定温度。大多数制造商提供的数据显示在30秒开门后，恢复到设定温度所需的时间。对于敏感的细胞类型，在30秒开门后，恢复到设定温度应该约5分钟。 气体浓度 在培养箱气氛中， CO2(CO2)气体被提供并与碳酸氢钠(或其它缓冲液)作用，在细胞培养基 中保持7.0...7.4的中性pH值。CO2 浓度是根据所选培养基的组成变化的，但一般为5%，等于血液中40毫米汞柱(0.05个大气压)，配对24毫米(2毫克/毫升)碳酸氢钠。因此，在体外使用创造了条件，例如， DMEM和 5%CO2， 是用于体内环境的良好模型。大多数细胞培养基含有pH指示剂如酚红，以指示培养条件下有问题的变化。从粉红色到黄色的变化，表示培养基太酸，紫色表示太碱。适当的 pH值对细胞的健康是至关重要的，从中性的变化会影响细胞形态和生长[2]。 一些培养箱除 CO2 之外还提供氧气(O2)或氮气(N2)。俗称“三气”培养箱，这些提供匹配具体培养目标的条件。02提供了高氧培养的应用，如对肺和视网膜组织的研究。N2提供以减少循环氧浓度，，以配合低氧的体内环境，用于培养许多原代细胞，，干细胞，或胚胎。氧不会像 CO2一样快的扩散或溶解到液体中，但它确实会影响几乎每一个细胞过程，包括细胞分裂和代谢，分化，免疫应答等[3]。培养箱在湿度蓄水池的顶部附近供给气体，进入腔室时立即加热并加湿它们，从而保持整个的理想条件。 湿度 在细胞培养中一个常常被忽视的参数是湿度。经由水盘提供的湿度是为了限制培养基蒸发。水的蒸发导致的痕量营养物如盐和矿物质浓缩，使得它们达到毒性水平。水在80%的湿度比在>93%蒸发快四倍[4]。较高湿度是开门后最难重新建立的参数。不同的技术提供湿度恢复的不同效率，如图2。寻找一个培养箱，恢复 1： 新的 Thermo ScientificTMHeracellTM VIOS CO2 培养箱为21世纪的细胞提供理想的培养环境。它已被证实所有参数和功能，包括但不限于温度，CO2，湿度，均一性，恢复和消毒。所有传感器都位于腔内，开门后可以立即对变化作出反应。多种功能每时每刻按需消除污染。 到>93%的湿度只需十分钟或更少，以使蒸发最小化，并确保细胞保持在平衡的生长培养基中。 均一性 对于任何在许多培养皿/烧瓶中同时培养的细胞，消除条件变化是对于清晰、易于理解的有意义的结果是十分关键的。细胞受到不同参数的微小差异的影响，并会作出回应。因此，21世纪的培养箱必须始终提供均匀的温度，气体浓度和湿度，以尽量减少细胞反应的变化，减少混乱的实验结果。这就是为什么在培养箱从上到下从一边到另一边的所有领域的均一性是至关重要的。 恢复 每次开门后，恢复到设置参数是 21世纪培养箱的重要组成部分。在考虑一个新的培养箱，查找恢 2： Thermo Scientific Heracell VIOS 采用了 THRIVETM保护加盖水库。它有助于防止微生物传入水，并在不到十分钟内恢复湿度。传入的气体被立即加热和加湿，有助于稳定、均一的环境。如图所示，30秒的门打开后，不同的技术提供了不同的湿度恢复速度。恢复到90%的湿度或以上。 复数据，不只是温度或 CO2 而且有湿度，因为所有参数共同提供最佳的生长环境。提供快速恢复部分是将所有的传感器放在腔室内部，与你的细胞体验和反应相同的条件。一些培养箱将它们的传感器放置在“旁路回路”，要求空气的样品从该室抽出，通过管道和泵，并在传感器通过。这种外部设备需要单独的加热器。空气然后回到腔室。旁路回路携带污染物留在外部零件的风险，意味着传感器与你的细胞正在经历不同的条件，从而导致传感器延迟和不理想的反应。 的循环。风扇不能直接吹在培养基，而是应该直接吹在两侧周围空气。这气流意味着风扇不会吹干培养基。基于直流电机的风扇意味着无振动。事实上，在许多实验室，培养物振动实际上是由于外力，包括设备如离心机或超低温冰柜或者建筑施工。位于外部护套的风扇不提供独立于护套的腔室内的快速恢复。 污染控制 空气循环 培养箱室的循环风扇提供了统一的条件和最大恢复速度。关于为什么风扇在 CO2培养箱是一个坏事有一些故事，但这些对于带循环风机的所有培养箱都不是准确的。只有带室内风扇的培养箱可以提供最大的均匀性和最小的恢复时间。这就是为什么欧洲药典要求干热灭菌有强制空气循环[5]。寻找一个培养箱，提供温和 人类皮肤表面带有10000个微生物/cm2[6]。室内的空气带有30-700个微生物/m3[7]。显然，微生物是我们永恒的同伴。按需，自动消毒过程是21世纪的CO2培养箱一个奇妙的功能，不同型号提供不同的版本和选项。了解和比较其差异可能会造成混淆。正因为如此，欧洲药典(EP)和美国药典(USP)现在要求使用“矫枉过正”的方法和经批准的指示生物，萎缩芽孢杆菌[5](又名枯草杆菌[8])，抗热和干燥内生孢子形成细菌，证明干热灭菌。EP 和 USP 要求证明消除至少一 百万这些抗性细菌，，导致小于 100万分之一的生命存活机会，为10-6的无菌保证水平(SAL)。美国药典进一步要求矫枉过正的方法达到12-log的减少。这里，6-log 的减少可以使用一半的致死率演示，例如，在给定温度下灭菌时间为标准时间的一半。Thermo Scientific Steri-Run TM高温灭菌周期已经经过独立测试[9]，证明在 180℃45分钟内消除6-log 的耐药细菌孢子。这是正常的90分钟的一半。周期使用干热证明符合 EP 和 USP 要求的12-log的减少，证明完全消毒。结果显示消除所有的A.巴西曲霉(在旧建筑物中常见的黑霉菌)，大肠杆菌(一种常见的研究实验室细菌)，M肺炎支原体(许多支原体物种的一个，一种常见的细胞培养物污染物)，B.枯草芽孢杆菌(用于测试干热灭菌的孢子形式)和G.嗜热脂肪芽孢杆菌(用于测试高压灭菌的强抗性孢子形式)。腔室的四个位置分别独立测试三次，结果取平均值(图3)。但按需周期是不够的。这些用于消除常驻微生物是理想的，并且可以通过简化清洁，无需卸下和高压灭菌部件而节省时间。然而，如上所述，微生物不断在空气循环和从我们的皮肤脱落。每次你打开培养箱门时，微生物都会进入。不管是否有从风扇的主动空气流通，培养箱内的条件与环境室条件是十分不同的，以至于空气急于平衡。而开门导致的小气流从可以扫除里面的灰尘和污染物。因此，一个21世纪的培养箱也应该提供一个随时的污染防治方法，阻止细菌和真菌的进入。目前提供恒定的污染防治的CO2培养箱只有几个选项。一个是 HEPA过滤器，需要一个风扇 来循环空气通过过滤器。H13 HEPA 过滤器具有主动空气循 环，每30秒的开门后5分钟内 可以提供 ISO 5/100级洁净室环境[10]，但达到 ISO 5 的速度取决于气流的设计，所以不同的培养箱需要寻找独立测试结果。ISO 5/100 级条件意味着装置中的空气是 4 logs 或比正常的室内房间空气干净10000倍[11]。关于 HEPA 过滤一个常见的误解是，它仅限于捕捉0.3微米或更大的粒子。这来自一个事实，由于涉及物理过程，0.3微米的颗粒是最难捕捉的大小。这就是为什么它被称为最易穿透粒径(MPPS)。H13 HEPA 过滤器0.3微米颗粒的额定效率是99.97%，更大和更小的粒子被发现具有更高的效率[12]。而研究表明，微生物无法生存或逃脱HEPA 过滤器[12]。立应该先高压灭菌，然后丢弃在你的标准实验室生物垃圾容器。自然有利金属表面如固体铜是公知的可有效地控制微生物，铜是世界上最可回收的材料[13]。纯金属含量，较高的温度和湿度增 大作用[14]。不锈钢并非天生可对抗微生物[14]，但电解抛光不锈钢消除微观结构，可以帮助隐藏微生物。因此，有充分的理由 选的内胆之一。 紫外(UV)光被用于许多应用中，来控制微生物，，但不幸的是对CO2 培养箱这不是一个很好的选择，因为在其湿度高于70%时无效[15]-大多数 CO2培养箱在80%以上。此外，紫外线灯泡随着时间的推移失去强度，阴影区域无法不消毒，让幸存者传播。 结论 对于今天的专业培养细胞和应用， CO2培养箱需要结合21世纪的技术。这样的培养箱所有运行参数经过验证，提供的数据你可以仔细评估。应当提供足够的信息，使你可以理解现状，以同样的方式提出你需要的任何其他的实验结果。寻找主动气流循环提供的，整个室内条件的均匀性的证明。温度，气体浓度和湿度共同为您的细胞培养成功提供关键条件，而且你的细胞在最佳条件花费的时间将反映在您的下游流程和数据中。每次开门后快速恢复到设定条件将确保细胞在规定的条件生长，从而使研究和生产目标有明确的结果。室内传感器将持续监测和控制细胞周围的条件，旁路传感器不能达到此。而且，由于微生物是我们忠实的伴侣，请确保您的培养箱的选择 考虑 CO2 培养箱中使用这些可 不仅提供了一个独立的被证明的 微生物 ATCC# 平均积极控制 恢复数 对数减少 巴西曲霉 16404 2.98×10+ NG -4.5 大肠杆菌 25922 2.22×10* NG -4.3 肺炎支原体 15531 1.25×10° NG -6.1 嗜热脂肪芽孢杆菌A 12980 4.81×10° NG -6.7 萎缩芽孢杆菌 51189 2.16×10' NG -7.3 干热灭菌的批准指示生物 NG=不生长 高压灭菌的批准指示生物 杀菌，消除细菌孢子，也是一个有效的，恒定的，污染的预防方法。 ( 参考文献 ) ( [1]Freshney Rl. Culture ofanimalcells： a manual of basic techniqueand specialized applications，6th ) ( ed. John Wiley & Sons， Inc.，Hoboken NJ， UnitedStates.2010. ) ( [2] Gibco. Handbook for cell culture basics. Invitrogen Life TechnologiesB-087243 0110. ) ( [3] Bates MK. Culturing cells under hypoxic c onditionsfor biologicallyrelevant results. Am Lab 2012. ) ( [4] Esser P and Weitzmann L. Evaporation from cell cultureplates. Thermo Fisher Scientific TILSPNUNCBU02 0111， 2011. ) ( [5] European Directorate for theQuality of Medicines & HealthCare，Council of Europe. EuropeanPharmacopoeia，8h ed. Strasbourg France，2014. ) ( [6] Grice EA et al. A diversityprofile of the human skin microbiota.Genome Res. 1 8，2008. ) ( [7] Stryjakowska-Sekulska M e t al.Microbiological quality ofindoor air in universityrooms.Polish J Environ Stud 16(4)， 2007. ) ( [8] The United States ) ( Pharmacopeial Convention. TheUnited States Pharmacopeia， 37th Ed. Rockville MD，United States. ) 2014. [9] Public Health England.Anevaluation of the effectiveness ofthe sterilization cycle of theThermo ScientificTM CO2incubator with the ThermoScientific Steri-Run TM cycle. Report No. 14/036， 2014. [10] Importance of Class 100 air ina CO2 incubator. Thermo FisherScientific， WPCO2Class100 1109，2009. [11] Enterprise and IndustryDirectorate-General，EuropeanCommission. EudraLex： The rulesgoverning medicinal productsinthe European Union.Volume 4： EUguidelines to good manufacturingpractice， medicinal productsforhuman and veterinaryuse. Annex1： Manufacture of sterile medicinalproducts， 2008. [12] National Institute for Occupational Safety and Health，Centers for Disease Control andPrevention，Department ofHealthand Human Services.Guidance for filtration andair-cleaning systems to protectbuilding environments fromairbornechemical，biological， orradiological attacks.2003. ( [13] JollyJ. The U.S. copper-basedscrap industry andits by-products.12th ed. Copper Development ) Association Inc. New York，NY， ( United States， 2012. ) [14] Grass G et al.M etallic copperas an antimicrobial surface.Appl Environ Microbio/77(5)，2011. [15] BurgenerJ. Position paper onthe use ofultravioletlightsinbiological safety cabinets. ApplBiosa fety 11(4)， 2006. Mary Kay Bates， M.S. 全球细胞培养专家， Thermo FisherScientific. marykay.bates@thermofisher.com 我们正在逐渐远离长期建立的突变细胞系，并使用更敏感的细胞，包括干细胞，原代细胞和3D培养。这些细胞类型都更适合模拟体内环境，以对困难的生物学问题提供更好的答案，或充当治疗剂。细胞不断从其外部环境取样，通过打开和关闭转录，翻译，细胞分裂等进行反应。因此，对外部线索如何影响细胞生长和蛋白表达的理解和认识是至关重要的。为了最好的支持这些敏感的细胞类型，并确保它们对体内环境的精确响应预测，新的CO2培养箱为21世纪细胞培养提供更好的培养环境而设计。考虑您的敏感细胞，您应该注意培养箱的所有参数，因为所有参数共同提供完整的细胞培养成功的关键。1. 新的Thermo Scientific™Heracell™VIOS CO2培养箱为21世纪的细胞提供理想的培养环境。它已被证实所有参数和功能，包括但不限于温度，CO2，湿度，均一性，恢复和消毒。所有传感器都位于腔内，开门后可以立即对变化作出反应。多种功能每时每刻按需消除污染。2. Thermo ScientificHeracell VIOS采用了THRIVE™保护加盖水库。它有助于防止微生物传入水，并在不到十分钟内恢复湿度。传入的气体被立即加热和加湿，有助于稳定、均一的环境。如图所示，30秒的门打开后，不同的技术提供了不同的湿度恢复速度。恢复到90％的湿度或以上3.Steri-Run结果表