细胞培养基、培养液组分中定性定量分析检测方案(液相色谱仪)

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「应用案例]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用案例] 一种细胞培养基、培养液组分分析方案 王晓霞、刘艺、王晖、颊征伟沃特世科技(上海)有限公司 应用优势 一种快速通用的分析细胞培养基、细胞培养液组分的LC-MSMS方法； 即使在没有标准品的情况下，也可将该方法应用于细胞培养液的相对定量分析； 样本制备无需衍生化。 关键词 细胞培养基、细胞培养液、定量分析、UPLC、串联四极杆、Quanpedia数据库 简介 随着我国生物医药企业的高速发展，培养基作为生物制药的重要原料也逐步被一些生物医药、生物制品企业所关注。培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种，其作为抗体、重组蛋白类药物研发和生产中原材料之一，直接影响产物的质和量，对细胞培养基中个组分的含量以及细胞培养过程中培养液组分含量的变化进行监测，对细胞高效培养过程的建立具有重要意义。 为了快速全面分析细胞培养基、细胞培养液、胞内中的成分，开发了一种“细胞培养基、培养液组分分析方法法”，该方法包中包含上百种化合物，分两个液相方法分析测定。方法1主要分析氨基酸类、维生素类、核苷嘧啶嘌呤类、有机酸类，单磷酸核苷酸类、多胺类以及糖化合物，方法2主要分析核苷酸类化合物。由于化合物种类繁多，化合物性质差异较大，传统的检测方法过于复杂，需要使用不同的仪器、不同的样品前处理方法进行测定，已不能满足工业化高通量、标准化要求。而采用超高效液相质谱联用系统，为细胞培养基、培养液以及胞内组分分析提供一个快速、专属性强的检测手段。 实验流程 目 Quanpedia O000 数据库导入 样品前处理 分析检测 数据处理 方法包中包含的化合物列表，如表1所示： 化合物名尔 类别 化合物名称 类别 化合物名称 类别 化合物名称 类别 L-Tyrosine 氨基酸 D-biotin 维生素 Inosine 核苷嘧啶嘌呤 CTP 核苷酸 L-Aspartic Acid 氨基酸 Folic acid 维生素 Thymidine 核苷嘧啶嘌呤 CDP 核苷酸 L-Glutamic Acid 氨基酸 Riboflavin 维生素 Uridine 核苷嘧啶嘌呤 CMP 核苷酸 L-Alanine 氨基酸 Myo-inositol 维生素 Cytidine 核苷嘧啶嘌呤 UDP-glucsoe 糖-核苷酸 L-Arginine 氨基酸 Niacinamide 维生素 Adenosine 核苷嘧啶嘌呤 UDP-galactose 糖-核苷酸 Glycine 氨基酸 Calcium pantothenate 维生素 Guanosine 核苷嘧啶嘌呤 UDP-GlcNAc 糖-核苷酸 L-Histidine 氨基酸 Pyridoxine 维生素 Uracil 核苷嘧啶嘌呤 UDP-GalNAc 糖-核苷酸 L-Isoleucine 氨基酸 Thiamine 维生素 Cytosine 核苷嘧啶嘌呤 GDP-glucose 糖-核苷酸 L-Leucine 氨基酸 Choline chloride 维生素 Thymine 核苷嘧啶嘌呤 CMP-sialic acid 糖-核苷酸 L-Lysine 氨基酸 Vitamin B-12 维生素 Guanine 核苷嘧啶嘌呤 GSH 其他 L-Methionine 氨基酸 Ascorbic Acid 维生素 Adenine 核苷嘧啶嘌呤 GSSG 其他 L-Phenylalanine 氨基酸 Thioctic acid 维生素 Hypoxanthine 核苷嘧啶嘌呤 NAD+ 其他 L-Proline 氨基酸 4-aminobenzoic acid 维生素 Xanthine 核苷嘧啶嘌呤 NADP+ 其他 L-Serine 氨基酸 Sodium Pyruvate 有机酸 Spermine 多胺类 L-Threonine 氨基酸 Citric acid 有机酸 2-Aminoethanol 多胺类 L-Valine 氨基酸 Malic acid 有机酸 Putrescine 多胺类 L-Cystine 氨基酸 a-ketoglutaric acid 有机酸 ATP 核苷酸 Taurine 氨基酸 Fumarate 有机酸 ADP 核苷酸 L-Asparagine 氨基酸 Lactic acid 有机酸 AMP 核苷酸 L-Cysteine 氨基酸 Isocitrate 有机酸 GTP 核苷酸 L-Glutamine 氨基酸 Succinic acid 有机酸 GDP 核苷酸 L-Tryptophan 氨基酸 Glucosamine 糖类 GMP 核苷酸 N-Acetyl-L-cysteine 氨基酸 Sucrose 糖类 UTP 核苷酸 L-Ornithine 氨基酸 D-Gluconate 糖类 UDP 核苷酸 L-Citrulline 氨基酸 Mannitol 糖类 UMP 核苷酸 表1.方法包中包含的化合物。 样品制备 细胞培养基样本前处理方法：培养基样本用水(含有0.1%乙酸)稀释后直接进样分析测定(根据样本中化合物浓度确定稀释倍数)；细胞培养上清液样本前处理方法：用2倍体积乙腈溶液对样本进行蛋白沉淀，14000rpm离心5分钟，上清液用水(含有0.1%乙酸)稀释100倍后进样分析测定。 实验方法 LC条件 系统： ACQUITYUPLCI-Class LC方法1：LC方法2：色谱柱：ACQUITYUPLC HSS T3色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1x150mm、1.8 um)(2.1x100 mm、1.7pm)柱温：40°℃柱温：25°C流速：0.2mL/min流速：0.3mL/min1pL1pL流动相A：水-含有0.1%甲酸流动相A：ACN/H，0=95/5+10mM碳酸氢铵 pH9流动相B：流动相B：ACN/H，O=5/95+10mM碳酸氢铵 pH9 Time %A %B Curve 0.0 100 0 1.5 100 0 6 6.0 90 10 6 9.0 65 35 6 11.0 5 95 6 14.0 5 95 6 14.1 100 0 6 17.0 100 0 6 雾化气温度： 500°℃ 雾化气流速： 1000L/Hr 数据处理软件： MassLynx°v4.2 with TargetLynx"" 实验结果 方法包中化合物谱图，如图1所示： 050 100 1.50 200 250 3.00 350 400 4.50 5.00 5.50 600 650 760 图1.方法包中化合物谱图。 方法包中柠檬酸、异柠檬酸；亮氨酸、异亮氨酸两对同分异构体的谱图，如图2所示： 图2.柠檬酸、异柠檬酸；亮氨酸、异亮氨酸两对同分异构体的谱图。 线性结果： 对培养基中经常添加的化合物制作标准曲线，线性范围以及连续进样6针保留时间、峰面积的重现性结果见下表2： 表2.线性及重现性结果(未完续见下页)。 化合物名称 线性范围 R 类别 化合物名称 (ng/mL) 保留时间 RSD% 峰面积 RSD% Cytidine 0.1-1000 0.9951 0.0 1.8 Adenosine 0.1-300 0.9954 0.1 2.1 Guanosine 0.1-300 0.9946 0.1 1.3 Uracil 0.1-300 0.9954 0.0 2.9 Cytosine 0.1-1000 0.9954 0.0 2.3 Thymine 0.3-3000 0.9950 0.0 2.0 Guanine 0.3-1000 0.9959 0.1 0.9 Adenine 0.1-300 0.9944 0.0 1.1 Hypoxanthine 0.1-1000 0.9925 0.1 1.9 Xanthine 0.3-1000 0.9933 0.1 1.9 Sodium Pyruvate 30.0-3000 0.9947 0.2 1.9 Citric acid 500.0-30000 0.9901 0.1 2.6 Malic acid 30.0-3000 0.9902 0.2 3.7 a-ketoglutaric acid 5.0-3000 0.9971 0.2 3.1 Fumarate 5.0-1000 0.9961 0.1 0.0 Lactic acid 10.0-3000 0.9981 0.0 4.5 Isocitrate 500.0-30000 0.9902 0.0 0.9 Succinic acid 5.0-1000 0.9967 0.1 1.9 Glucosamine 1.0-300 0.9974 0.0 2.5 Sucrose 50.0-3000 0.9963 0.0 1.7 D-Gluconate 10.0-1000 0.9980 0.0 4.8 Mannitol 3.0-3000 0.9908 0.3 1.4 Aminoethanol 30.0--1000 0.9908 0.2 1.9 表2.线性及重现性结果(续)。 样本分析重现性结果： 采用此方法包对细胞培养基上清液进行相对定量分析，连续进样6针，6针峰面积RSD均在5%以内，如下图所示： 总结与优势 开发了一种用于细胞培养基、细胞培养液组分定量分析的LC-MSMS分析方法包，该方法包化合物种类覆盖面广，包含氨基酸类、维生素类、核苷嘧啶嘌呤类、核苷酸类、有机酸类、多胺类以及糖类等化合物，可从多方向对细胞培养基、细胞培养上清液进行研究分析；并且重现性佳，即使在没有标准品的情况下，也可将该方法应用于细胞培养液的相对定量分析； 该分析方法包的转移采用Quanpedia数据库的方式转移，该数据库包含化合物的保留时间、MRM信息、使用的流动相、洗脱梯度以及使用的色谱柱信息，方法导入时只需要三步即可将液相方法、质谱方法以及定量方法一并导入。Quanpedia数据库为开放型数据库，可根据您的需求随时进行扩展。 ( 参考文献： ) 1. Giuseppe Paglia1， James Langridge2， and Giuseppe Astarita3， Development of a Metabolomic Assay forthe Analysis of Polar Metabolites Using HILIC UPLC/QTof MS Center for Systems Biology， University ofIceland， Iceland；2-3. Waters Corporation， Manchester， UK and Milford，MA， USA. 2. Sunil U. Bajada， Wenyun Lua， Elizabeth H. Kimballa， Jie Yuana， Celeste Petersonb， Joshua D.Rabinowitza， Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interactionchromatography-tandem mass spectrometry aLewis-Sigler Institute for Integrative Genomics andDepartment of Chemistry， Princeton University， Princeton University， Princeton， NJ 08544， USA； bDepartment of Molecular Biology， Princeton University， Princeton， NJ 08544， USA Received 13 January2006； received in revised form 8 May 2006； accepted 10 May 2006； Available online 6 June 2006. 扫一扫，关注沃特世微信 Waters 沃特斯中国有限公司 沃特世科技(上海)有限公司 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 广州：020-28296555 香港：852-29641800 免费售后服务热线：800(400) 820 2676www.waters.com 细胞培养基、培养液组分分析方案 细胞培养基、培养液组分分析方案 应用优势1）一种快速通用的分析细胞培养基、细胞培养液组分的LC-MSMS方法；2）即使在没有标准品的情况下，也可将该方法应用于细胞培养液的相对定量分析；3）样本制备无需衍生化。简介 随着我国生物医药企业的高速发展，培养基作为生物制药的重要原料也逐步被一些生物医药、生物制品企业所关注。培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素， 但确实是最重要的一种，其作为抗体、重组蛋白类药物研发和生产中原材料之 一，直接影响产物的质和量，对细胞培养基中个组分的含量以及细胞培养过程中培养液组分含量的变化进行监测，对细胞高效培养过程的建立具有重要意义。为了快速全面分析细胞培养基、细胞培养液、胞内中的成分，开发了一种“细胞 培养基、培养液组分分析方法包”，该方法包中包含上百种化合物，分两个液相方法分析测定。方法1主要分析氨基酸类、维生素类、核苷嘧啶嘌呤类、有机酸 类，单磷酸核苷酸类、多胺类以及糖化合物，方法2主要分析核苷酸类化合物。 由于化合物种类繁多，化合物性质差异较大，传统的检测方法过于复杂，需要使用不同的仪器、不同的样品前处理方法进行测定，已不能满足工业化高通量、标准化要求。而采用超高效液相质谱联用系统，为细胞培养基、培养液以及胞内组分分析提供一个快速、专属性强的检测手段。总结与优势1）开发了一种用于细胞培养基、细胞培养液组分定量分析的LC-MS MS分析方法包，该方法包化合物种类覆盖面广，包含氨基酸类、维生素类、核苷嘧啶嘌呤类、核苷酸类、有机酸类、多胺类以及糖类等化合物，可从多方向对细胞培养基、细胞培养上清液进行研究分析；并且重现性佳，即使在没有标准品的情况下，也可将该方法应用于细胞培养液的相对定量分析； 2）该分析方法包的转移采用Quanpedia数据库的方式转移，该数据库包含化合物的保留时间、MRM信息、 使用的流动相、洗脱梯度以及使用的色谱柱信息，方法导入时只需要三步即可将液相方法、质谱方法以 及定量方法一并导入。Quanpedia数据库为开放型数据库，可根据您的需求随时进行扩展。