蛋白质中使用3.5 μm亚乙基桥杂化(BEH)颗粒进行大分子 蛋白质分析的先进HPLC体积排阻色谱检测方案(液相色谱仪)

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「应用纪要THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「应用纪要1 Waters Stephan Koza， Susan Serpa， Hua Yang， Edouard Bouvier和Kenneth J. Fountain沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德市) 应用优势 2改善大分子蛋白质的SE-HPLC分离度 出色的色谱柱稳定性和可靠的柱间重现性 200A和450A孔径提供宽泛的蛋白质大小分离范围 与传统HPLC分离相比，样品通量提高了2倍，且对分离度的影响最小 XBridge@ Protein BEH SEC，200A和450A，3.5um色谱柱 Alliance@HPLC系统 Auto·Blend PlusM技术 BEH200和BEH450 SEC蛋白质标准品混合物 关键词 体积排阻色谱， SEC， HPLC，蛋白质， SE-HPLC，凝胶渗透色谱， lgG， IgM 简介 2010年，沃特世首次推出了基于UPLC技术的200A孔径的体积排阻色谱(SEC)1。这些体积排阻UPLC (SE-UPLC)色谱柱由亚2um直径的亚乙基桥杂化(BEH)颗粒组成，与纯硅胶基质颗粒相比，这种颗粒的结构和化学性质更为稳定。正是有了这些结构更加稳定的颗粒， SE-UPLC才得以问世。然而，小颗粒和窄内径4.6 mm SE-UPLC色谱柱并不适用于HPLC系统。因此，沃特世基于稳定耐用的BEH填料推出了兼容HPLC、颗粒直径为3.5 um、内径为7.8mm的体积排阻HPLC色谱柱(SE-HPLC)。从而让拥有HPLC仪器的实验室能够充分利用这一独特颗粒技术的优势，这些优势还包括与硅胶基质SEC颗粒相比BEH颗粒能耐受更高反压的能力。本应用纪要将重点介绍专为分离大分子蛋白质而设计的200A和450A孔径色谱柱的性能特征，内容涉及分离度、柱间重现性和色谱柱稳定性。此外，还将介绍在分离较大蛋白质时，这些亚4um色谱填料与更大粒径(5和8um)的标准HPLC颗粒相比在分离度和样品通量方面的显著优势。 沃特世解决方案 实验 样品描述 所有样品均用流动相稀释(除非另有说明)。蛋白质为单标或混标(购自沃特世和Sigma-Aldrich)。样品额定浓度为1.0 mg/mL(除非另有说明)。 方法条件柱温：室温LC条件样品温度：10CLC系统：Alliance HPLC或进样体积：10pl带30cm柱温箱的ACQUITY UPLC@H-Class Bio系统流速：0.84 mL/min检测条件：Alliance HPLC TUV检测器流动相：25mM磷酸钠，配备5mm钛合金流通池的150mm氯化钠，ACQUITY UPLC TUV测器pH 7.2(采用Auto·Blend Plus技术制备)波长：280或214 nm梯度：等度色谱柱：沃特世XBridge ProteinBEH SEC，200A， 3.5 um，标准品：BEH200 SEC蛋白质混标7.8x150mm(部件号：1186006518)(部件号176003595)和7.8x300 mmBEH450 SEC蛋贡质混标(部件号176003596)(部件号：186006842)XBridge Protein BEH SEC，450A，3.5pm，完整单克隆抗体(.8x150mm质量数检查标准品(部件号176003598)(部件号：186006552)和7.8x300 mm(部件号176006599)样品瓶：去活化透明玻璃12x32mm螺纹口全回比较器收样品瓶，配有瓶盖色谱柱：250A，5 um，和预切割PTFE/硅胶隔垫，Silica-DIOL SEC.1mL7.8x300 mm(部件号：1186000385DV)Silica-DIOL SEC， 450A，数据管理8pm， 7.8x300mm色谱软件：Empower@ Pro(第2版和第3版) 结果与讨论 过去的文献中介绍过有关BEH TechnologyM用于生产分析多肽和蛋白质所用的体积排阻UPLC (SE-UPLC)填料的优势23。但是，这些UPLC颗粒的直径限制了其在HPLC仪器中的使用。为了在HPLC仪器上对蛋白质和其它大分子化合物进行SEC分离时能够充分利用BEH颗粒技术的化学和结构性能优势，沃特世推出了填充有3.5 um BEH颗粒、孔径为200A或450A、内径为7.8mm的色谱柱。这两种类型色谱柱的SE-HPLC分离分子量范围较宽(大约从10kDa到接近2MDa)，涵盖了具有较大水化半径(radii of hydration：Rh)的生物大分子。作为评估的一部分，我们将展示与大粒径(5和8 um)HPLC填料相比，这种填料在分离效率方面的优势及其柱间重现性和寿命稳定性等关键性能特征。此外，本纪要还将确定这两种色谱柱的蛋白质大小分离范围。 较小BEH粒径的优势 与UPLC系统相比， HPLC系统的柱外扩散体积更大，压力限值更低，因此，目前使用HPLC仪器的实验室无法获得UPLC体积排阻颗粒提供的分离优势。为了给蛋白质SE-HPLC分离提供最佳分离度，沃特世推出了一系列基于BEH颗粒技术的色谱柱。为了证实这些色谱柱的性能，我们采用同一台Alliance HPLC系统和相同的水相流动相条件，分别在250A孔径硅胶基质SEC色谱柱(5 pm， 7.8x300mm)和200A孔径BEH基质SEC色谱柱(3.5 um， 7.8x300mm)上对蛋白质分子量标准品和单克隆lgG标准品进行了分离(图1)。 图1.图中展出了沃特世BEH200 SEC蛋白质混标(部件号：186006518)和完整单克隆抗体质量数检查标准品(部件号：186006552，稀释至1 mg/mL)在250A硅胶基质5 pm (图A和C)以及200A， BEH 3.5 pm(图B和D)SEC色谱柱上的分离对比。两根色谱柱的规格相同(7.8x300mm)， 分离时的流速(0.84 mL/min)和上样量均相同。色谱图A和B的谱峰归属为：1)甲状腺球蛋白(669kDa)， 2) lgG (150kDa)， 3) BSA (67kDa)，4)肌红蛋白(14kDa)以及尿嘧啶(112Da)。在色谱图C和D中，lgG单体和二聚体的分子量分别约为150kDa和300kDa。 所用的流速和进样体积相当。结果表明，在分子量标准品分离范围内，3.5um填充材料具有更高的灵敏度和更窄的峰宽。在3.5 um颗粒色谱柱上IgG单体(MW=150 kDa) 和二聚体(MW=300 kDa)之间所得的USP分离度(按半峰高处测值计算)，比5 um颗粒色谱柱所得分离值高40%以上。这一分离度的改善效果，，已达到将色谱柱长度增加一倍的预期效果(Rs√L)。同样，对比450A孔径、硅胶基质的SEC色谱柱(8 um， 7.8x300 mm)与450A孔径、BEH基质的SEC勺谱柱(3.5 um， 7.8x300 mm)的分离色谱图(图2)，所得结果类似。但是，在450A色谱柱对比中， lgG单体和二聚体之间的分离度相对提高了约75%。这是因为与小孔径的250A硅胶基质和BEH 200A颗粒相比，450A色谱柱对比中的两根色谱柱之间的粒径差异更大。总的看来，通过这些数据应该注意到BEH 450A SEC色谱柱能够为这个lgG样品的二聚体和多聚体形态提供出色的分离。 0.080.06 1b 50.040.02 1a 0.00 0.1810.16B0.140.120.100.0810.060.040.020.00 6.00 8.00 10.00 12.00 D IgG单体 IgG二聚体 IgG多聚体 缓冲液 图2.图中展示了沃特世BEH450 SEC蛋白质混标(部件号：186006842)和完整单克隆抗体质量数检查标准品(部件号：186006552，稀释至1 mg/mL)在450A硅胶基质5 pm (图A和C)以及450A， BEH 3.5 pm(图B和D)SEC色谱柱上的分离效果对比。两根色谱柱的规格相同(7.8x300mm)，分离时的流速(0.84mL/min)和上样量均相同。色谱图A和B的峰归属为：1a)甲状腺球蛋白二聚体(1.3MDa)， 1b)甲状腺球蛋白(669kDa)， 2) lgG (150 kDa)，3) BSA (67 kDa)， 4)肌红蛋白(14kDa)和尿嘧啶(112Da)。在图C和D中， lgG单体、二聚体和多聚体，分子量分别约为150kDa、300kDa和>450kDa。 BEH颗粒强度的优势 与硅胶基质颗粒相比， BEH SEC颗粒的机械强度更高。这一特征使得分析人员能够在比传统SE-HPLC色谱柱所能耐受的更高的流速和压力下运行分析。通过提高流速可成比例地缩短SEC分析时间，然而需要注意的是， SEC的分离度随流速的升高而降低。考虑到这些特征，如果必须提高SE-HPLC的样品通量，则只有3.5 um BEH SE-HPLC能满足这一要求。在本研究中，我们对传统250A， 5 um硅胶基质SE-HPLC色谱柱(7.8x300mm)和3.5 um BEH基质SE-HPLC色谱柱(7.8x300mm)进行了比较(图3)。5um硅胶基质SE-HPLC色谱柱的流速设为1.0 mL/min(最大流速：1.2mL/min)， 3.5 umBEH SE-HPLC色谱柱的流速设为2.0 mL/min(最大流速：2.7 mL/min)。结果显示，对蛋白质分子量标准品的分离效果相当，仅仅除了甲状腺球蛋白二聚体峰(1.3MDa)在具有较大孔径的250A，5 um硅胶基质颗粒色谱柱上分离度更佳(因料料孔径较大，对较大分子的分离度的改善可以预期)，除此之外，流速提高两倍可成比例地缩短分析时间，但是分离度会下降。例如，结果表明，当流速为1.0mL/min时， IgG和BSA在3.5 pm BEH基质色谱柱上的分离度为2.5，在250A5pm硅胶基质色谱柱上的分离度为2.0(数据未显示)。但是，当流速为2.0 mL/min时， 3.5 um BEH基质色谱柱上的分离度为1.9，下降约25%。 图3.图中展示了沃特世BEH200 SEC蛋白质混标(部件号：186006518)在250A硅胶基质5 pm SEC色谱柱(流速为1.0 mL/min) (图A)与200A BEH 3.5 pm(图B)SEC色谱柱(流速为2.0mL/min)上的分离对比。两根色谱柱的规格相同(7.8x300mm)，所用的上样量相同。已对色谱图的时间轴进行了归一化处理，实际分离时间见坐标。色谱图A和B的峰归属为：11)甲状腺球蛋白(669kDa)， 2) lgG (150 kDa)， 3) BSA (67 kDa)，4)肌红蛋白(14kDa)以及尿嘧啶(112Da)。 注：与200A，3.5 um BEH颗粒的结果相比，较大孔径的250A，5pm硅胶基质颗粒对甲状腺球蛋白二聚体峰 (1.3MDa)具有较高的分离度，除此之外，其它蛋白分子量标准品分离效果相当。沃特世推荐使用XBridge ProteinBEH SEC， 450A， 3.5um柱分析蛋白质，例如甲状腺球蛋白及其二聚体，两者的分子量均超出了XBridge Protein BEH SEC，200A， 3.5um色谱柱推荐的分子量分析范围。 XBridge Protein BEH SEC，200A和450A， 3.5pm色谱柱：重现性和稳定性 分析人员在选择用于方法开发或方法验证的SEC色谱柱时主要担心柱间和批间重现性，，1以及用于方法时所获得的色谱柱寿命。图4显示了一系列分子量标准品在200A和450A， 3.5 um SEC色谱柱(7.8x300mm)上的叠加色谱图。这些色谱图展示了填充3个不同生产批次填料的6根SEC色谱柱的重现性。对于这些标准品，在流速为0.84 mL/min时，图1中标出的所有组分在200A孔径的SEC色谱柱的保留时间标准偏差介于0.037 min至0.084 min， 平均标准偏差为0.064 min。而450A孔径的SEC色谱柱的保留时间标准偏差介于0.045 min至0.068 min，平均标准偏差为0.060 min。 图4.图中显示了沃特世BEH200 SEC蛋白质混标(部件号：186006518)和BEH450 SEC蛋白质混标(部件号：186006842)在200A以及450A BEH 3.5 um SEC色谱柱上的叠加色谱图。两种色谱柱(7.8x300mm)分别用3个不同生产批次的填料加以填装，以评估柱间和批间重现性。谱归属：：1a)甲状腺球蛋白二聚体(1.34MDa)， 1b)甲状腺球蛋白(669 kDa)， 2) lgG (150kDa)， 3)BSA (67 kDa)， 4)肌红蛋白(14kDa)和尿嘧啶(112Da)。采用ACQUITY UPLCH-Class Bio系统进行分离。 通过在整个600次进样过程中进样一系列标准品以评估200A和450A， 3.5 um SEC色谱柱(7.8x300 mm)的稳定性。考虑到硅胶基质SEC色谱柱的稳定性会受弱碱性pH值的不良影响，因此将流动相pH设为7.2(与磷酸缓(PBS)缓冲液的pH相当)。图5和图6显示了从研究开始到结束期间分子量标准品以及lgG标准品在两种色谱柱上的谱图对比。 文中测定了两对关键峰(lgG和BSA， lgG二聚体和lgG单体)在两种色谱柱上的分离度。两种色谱柱均表现出出色的稳定性，计算得到的分离度仅有轻度降低(如图标题突出显示所示)。这些数据表明，以3.5um颗粒填装的XBridge Protein BEH SEC色谱柱可提供出色重现性和稳定性，可满足开发可靠的分析方法以及质量控制环境下进行常规分析的需求。 0.10 分子量标准品 4 mAb 标准品 IgG单体 进样#2 进样#6 0.08 2 0.010 3 IgG二聚体 0.06" 5 1t 0.005 0.04 0.02 E的N喙 1a 0.000E寸 0.c0 0.08 分子量标准品 mAb 标准品 进样#600 0.0100-进样#601 0.06- 0.04 0.005 0.022- 0.000 0.00- 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 10.00 12.00 Minutes Minutes 图5.图中显示了沃特世BEH200 SEC蛋白质混标(部件号：186006518)和完整单克隆抗体质量数检查标准品(部件号：186006552，稀释至1 mg/mL)在200A BEH3.5um SEC色谱柱(7.8x300mm)上进行分离的色谱柱使用寿命研究对比。色谱图A和B的峰归属：甲状腺球蛋白(669kDa)，lgG(150kDa)， 3)BSA (67 kDa)，4)肌红蛋白(14kDa)以及尿嘧啶AoAs(112Da)。在mAb标准品的色谱图中，lgG单体和二聚体的分子量分别约为150kDa和300 kDa。采用ACQUITY UPLC H-Class Bio系统进行分离。 图6.图中显示了沃特世 BEH450 SEC蛋白质混标 (部件号：186006842)和完整单克隆抗体质量数检查标准品(部件号：186006552，稀释至1 mg/mL)在450A BEH 3.5 um SEC色谱柱(7.8x300mm)上进行分离的色谱柱使用寿命研究对比。色谱峰归属：la)甲状腺球蛋白二聚体(1.34MDa)， lb)甲状腺球蛋白(669kDa)， 2) IgG(150kDa)， BSA(67 kDa)，4)肌红蛋白(14kDa)和尿嘧啶(112Da)。在mAb标准品的色色图中， lgG单体和二聚体的分子量分别约为150kDa和300 kDa。采用ACQUITY UPLC H-ClassBio系统进行分离。 分子量范围 本文对XBridge BEH SEC 450A和200A， 3.5 um蛋白分析专用柱分离一系列确定标准品的能力进行了比较。蛋白质分子量校准曲线如图7所示。对于蛋白质来说，200A孔径色谱柱的线性分子量范围预计约为10kDa至450 kDa， 而450A孔径色谱柱的线性范围预计约为50kDa至1.3MDa以上。范围上限取决于甲状腺球蛋白(669kDa)及其二聚体(1.3MDa)的色谱分离结果(图2)。lgM五聚体(900 kDa)和lgM双五聚体(1.8MDa) 在450A色谱柱上的分离如图8所示，图中展示了这两种形态的部分分离情况，结果表明，能够接触双五聚体的孔体积有限，因此1.8MDa超出了该色谱柱的线性分子量范围并且接近该色谱柱的实际分子量上限。在分析蛋白质多聚体形态、或是蛋白质与具有较大水合半径值的分子(如长链聚乙二醇)的共聚物、或是在变性SEC条件下分析蛋白质时，450A色谱柱所具有的更高的分子量分析范围可能比较有用。 图7.图中显示了BEH 200A和450A，3.5 um SEC色谱柱的蛋白质、多肽以及尿嘧啶的校准曲线。 图8.图中显示了IgM五聚体、IgM双五聚体和IgM多五聚体形态在BEH， 450A， 3.5 um SEC色谱柱上的分离情况。蛋白质的分子量为：lgM五聚体(900kDa)、lgM双五聚体(1.8MDa)，以及IgM多聚体(>2.7MDa)。采用ACQUITY UPLCH-Class Bio系统进行分离。 结论 参考文献 可靠、高分离度的体积排阻方法通常是蛋白质生物制药质量评估中不可缺少的一部分，同时在其蛇研究领域的蛋白质样品评估中也尤为重要。与传统硅胶基质5um颗粒的SEC色谱柱相比，新推出的HPLC兼容的3.5pm颗粒XBridge BEH SEC 200A和450A蛋白分析专用柱善善了组分在LC型SEC分离中的分离度。此外，由于BEH颗粒的结构强度高，，!因此可以获得更高的分析通量。这一关键的颗粒强度特征，配合稳定的二醇基键合相，赋予了色谱柱出色的使用寿命。作为沃特世质量生产原则的一部分，沃特世生产的这些色谱柱具有极强的耐受能力，并且经过了相关分析物的质量测试。虽然本报告中没有列出，但是这类HPLC分离却可直接转换到使用含1.7 pm或2.5 pm直径颗粒以及更窄色谱柱内径(内径4.6 mm)的ACQUITY UPLC BEHSEC蛋白分析专用柱的SE-UPLC分离上，这些色谱柱与UPLC系统联用时可提供更出色的分离度和样品通量4。 ( 1. F ountain KJ， H ong， P，Serpa， S， Bouvier， ESP and Morrison， D. A nalysis of Biomolecules by Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography. Waters C o rporation， Ap p lication Not e [serial on the Internet]. 20 1 0； (WA64226). ) ( 2. Paula Hong， Stephan Koza， and Kenneth J. Fountain. Advances in Siz e -Exclusion C hromatography for the Analysis of Small Proteins and Peptides：Evaluation of Calibration Curves for Molecular Weight Estimation. WatersCorporation，Application Note [serial on the I n ternet]. 2012；( 7 20 0 0 4 412EN) . ) ( 3. Stephan Koza， Matthew Lauber， and Kenneth J. Fountain. The Analysis of Multimeric Monoclonal Antibody Aggregates. Wat e rs Corporation， Application Note， [serial on the Interne t ]. 201 3；(7 2 0 0 0 471 3 E N ) . ) ( 44. Stephan Koza，and Kenneth J. Fountain. S u ccessful Transfer o f Size-Exclusion S eparations b etween HPLC and UPLC. Waters Corporation， Application Note， [serial on the Internet]. 2014；(720005193EN). ) XBridge@ BEH SEC蛋白分析专用柱(200A和450A，3.5 pm)的优势： ( 基于HPLC的SEC分离，蛋白质分子量分析范围为 10-1，500 k Da，具有更高的分析通量能力 ) 出色的SEC色谱柱寿命 与硅胶基质SEC色谱柱相比，减少了所不希望发生的蛋白质/色谱柱次级相互作用 全面测试以提供无以伦比的色谱柱一致性，为已验证方法提供更高的可信度 ■补充了基于ACQUITY UPLC的SEC色谱柱系列，从而实现基于应用需求的无缝方法转换 Waters THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 北京：010-52093866 上海：021-61562666 Waters， The Science of What’s Possible， UPLC， ACQUITY UPLC， XBridge， Alliance和Empower是沃特世公司的注册商标。AutoBlend Plus 和BEH Technology是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 用于分析大分子蛋白质的先进HPLC体积排阻色谱 2010年，沃特世首次推出了基于UPLC®技术的200Å孔径的体积排阻色 谱(SEC)1。这些体积排阻UPLC (SE-UPLC)色谱柱由亚2 µm直径的亚乙基 桥杂化(BEH)颗粒组成，与纯硅胶基质颗粒相比，这种颗粒的结构和 化学性质更为稳定。正是有了这些结构更加稳定的颗粒，SE-UPLC才 得以问世。然而，小颗粒和窄内径4.6 mm SE-UPLC色谱柱并不适用于 HPLC系统。因此，沃特世基于稳定耐用的BEH填料推出了兼容HPLC、 颗粒直径为3.5 m、内径为7.8 mm的体积排阻HPLC色谱柱(SE-HPLC)。 从而让拥有HPLC仪器的实验室能够充分利用这一独特颗粒技术的优势， 这些优势还包括与硅胶基质SEC颗粒相比BEH颗粒能耐受更高反压的能 力。本应用纪要将重点介绍专为分离大分子蛋白质而设计的200Å和 450Å孔径色谱柱的性能特征，内容涉及分离度、柱间重现性和色谱 柱稳定性。此外，还将介绍在分离较大蛋白质时，这些亚4 m色谱 填料与更大粒径(5和8 m)的标准HPLC颗粒相比在分离度和样品通量 方面的显著优势。