富硒酵母中硒蛋白检测方案(二手分析仪器)

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返回目录 应用一种新的毛细管 HPLC-ICP-MS接口进行富硒酵母中含硒蛋白的鉴定 应用简报食品添加剂 作者 Juliusz Bianga 和 Joanna Szpunar Laboratoire de Chimie AnalytiqueBio-inorganique et EnvironnementPau， France 前言 饮食是人体硒 (Se) 的主要来源，该必需元素的摄入主要取决于食品中的硒含量和所消耗的食物量。由于许多国家农产品中硒的含量很低，所以硒缺乏成为了一个值得注意的问题。人们已经开发了许多提高人体硒摄入的食品添加策略；富硒酵母就是人和动物添加剂最常用的硒来源之一。 评估硒是否充分不仅需要了解硒总含量，而且还要了解各种形态硒的含量。但到目前为止，大部分研究都仅限于针对占总硒12-20%左右的水溶性酵母成分。酵母的不溶性硒组分很多尚未被发现，表征这类主要组分的工作非常少，其中Chassaigne 和 Chery [1]曾研究过酵母蛋白的硒特异性激光消融(LA-) ICP-MS 指纹谱， Tastet 等人[2]曾用实验室自制的 nanoHPLC-ICP-MS 接口对富硒多肽进行了硒选择性检测。在常规方法中，通过测定总硒代蛋氨酸含量(含硒蛋白含量)来评估富硒酵母的质量。 本研究提出了一个 ICP-MS 辅助的蛋白质组学方法， 用于鉴定富硒酵母中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离不溶性含硒蛋白。使用LA-ICP-MS 找出分离后的含硒蛋白斑点，经切割后，用胰蛋白酶消化；所得多肽通过毛细管HPLC-ICP-MS进行分析，然后用电喷雾离子化 (ESI-) MS/MS进行表征，鉴定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3。由于胰蛋白酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。 实验部分 样品硒含量为 2.3 mg/g的市售富硒酵母样品。 样品前处理 采用过去文献[3]所述的标准蛋白质组学方法进行蛋白质提取、双向凝胶电泳分离和目标斑点的胰酶裂解。 HPLC-ICP-MS 和ESI-MS/MS分析 ( 使用配备毛细管泵(部件号G1376A) 和手动进样阀(100nL 定量环) 的 Agilent 1100 LC。取 8 pL胰酶裂解产物加入 到 A gilent Zorbax 300 SB-C1 8 35 x 0.5 mm 5 pm 多肽卡 套柱上，采用流速 20 pL/min 的等度洗脱，流动相为 2%Z 腈(ACN)-0.1%甲酸(FA)。使用流动相冲洗样品2分钟， 然后反冲到 Agilent Zorbax 30 0 SB-C18 150 x 0.3 mm x 3.5 um 分离柱上。使用梯度洗脱分离多肽，A：水+0.1%FA； B： ACN+0.1%FA， 流速 4 uL/min。洗脱程序见表1。 ) 表 1. HPLC 洗脱程序 步骤 洗脱液 (%B) 时间(分钟) 1 2 0-2 2-5 2-5 3 5-25 5-35 4 25-40 35-40 5 40-97 40-45 6 40-97 45-50 97-2 50-55 分离柱的出口与 ICP-MS或 ESI-MS/MS义器连接。ICP-MS操作条件见表2。 表 2. Agilent 7700x ICP-MS操作条件 参数 值 光谱仪 雾化器/雾化室 毛细管LC接口套件(部件号G3680A) 炬管ID 1 mm 接口锥 铂 等离子体 RF功率 1560 W 取样深度 7.5 mm 载气流速 780 mL/min 可选气体(0，)流速 39 mL/min 透镜 提取电压1 3.2V 提取电压2 -200V 反应池 八极杆偏置电压 -100V 氦气流速 10 mL/min 动能歧视 7V 使用 20 ppb Y、Li、TI、Ce的2%硝酸溶液优化等离子体条件和检测参数。使用高能量氦碰撞池模式排除对硒同位素的多原子干扰。使用各250 ms 的驻留时间采集 "Se、Se、80Se。 ESI LTQ Orbitrap Velos 质谱仪采用正离子模式；加热器和毛细管温度分别为50°℃ 和280°C。采用碰撞诱导解离(CID) 在 MS SIM 模式下(15%标准化碰撞能量)对300-1100 m/z 质量范围进行测量；碰撞能量设置为55%时 HCD 池中产生子离子。 结果和讨论 蛋白质在凝胶上的分离结果如图1所示。选择用于证明ICP-MS 辅助蛋白质组学方法可行性的斑点用圆圈标出。根据 LA-ICP-MS哉量结果，该蛋白斑点在胶上所有斑点中硒含量最高。 对该目标蛋白斑点进行胰酶裂解后的分离色谱图见图2。毛细管 HPLC-ICP-MS检测了6个峰(图2a)，其中5个可以用 ESl Orbitrap MS/MS 进行鉴定。 ICP-MS检测对确定硒肽的保留时间非常重要，可帮助找到质谱图中较小的硒形态，如图2d所示。使用基线20点标准差的3倍计算检测限(LOD)。将该值与 1 ppm SeMet 信号进行比较。所得到的硒同位素 80的LOD (30%ACN， 0.1% FA条件下)为0.2 pg。氨基酸缩写列表见表3。 鉴定出的硒肽序列见表4。使用ICP-MS 检测所得信号与ESI Orbitrap MS 在已鉴定硒肽对应的m/z 值的选择离子模式(图2c)所得的保留时间完全匹配。通过所得数据鉴定出了含硒的甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3(表5)。证明由于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒，存在于蛋氨酸(M)和半胱氨酸(C)残基中，后者在酵母样品中首次发现。 图1.含硒酵母蛋白的双向凝胶电泳分离(凝胶上显示了 LA-ICP-MS强度图像) 图2.图1标记的蛋白斑点胰酶裂解物中含硒多肽的毛细管 HPLC 分离。a)ICP-MS检测， b) ESI Orbitrap MS 检测 (TIC)， c) ESI Orbitrap MS 检测(选择离子色谱)，d)(小量)硒形态的 ESI 质谱图。峰的鉴定结果见表4 表3.氨基酸缩写 表4.图1标记的蛋白斑点胰酶裂解物鉴定出的含硒多肽序列 色谱峰序列 理论质量 实验质量 A质量 LVSeM(ox)R 582.2523 582.2513 -0.00104 2 LVSeMR 566.2573 566.2564 -0.00094 3 LTGSeM(ox)AFR 430.1793 430.1837 0.004395 4 LTGSeMAFR 422.1822 422.1859 0.00369 5 IVSNASCTTNSeCLAPLAK或 934.4278 934.4279 0.00013IVSNASSeCTTNCLAPLAK 表5.图1标记的蛋白斑点中所鉴定的含硒蛋白甘油甘-3-磷酸酯脱氢酶-3的序列。粗体标记的多肽对应于色谱图(图2)中检测到的和表4所列出的的硒肽 多肽MVRVAINGFG RIGRLVMRIA LSRPNVEVVA LNDPFITNDY AAYMFKYDST51 HGRYAGEVSH DDKHIIVDGK KIATYQERDP ANLPWGSSNV DIAIDSTGVF101 KELDTAQKHI DAGAKKVVIT APSSTAPMFV MGVNEEKYTS DLKIVSNASC151 TTNCLAPLAK VINDAFGIEE GLMTTVHSLT ATQKTVDGPS HKDWRGGRTA201 SGNIIPSSTG AAKAVGKVLP ELOGKLTGMA FRVPTVDVSV VDLTVKLNKE251 TTYDEIKKVV KAAAEGKLKG VLGYTEDAVV SSDFLGDSHS SIFDASAGIQ301 LSPKFVKLVS WYDNEYGYST RVVDLVEHVA KA 结论 本文建立了有效的 ICP-MS 辅助蛋白质组学方法，用于鉴定市售富硒酵母样品不溶性硒组分中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离含硒蛋白，并用胰蛋白酶进行裂解。采用LA-ICP-MS、毛细管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 组合方法对裂解产物进行鉴定、分析和表征。由于胰酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。采用本方法鉴定出了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3，这是富硒酵母中的主要含硒蛋白。证明由于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒，存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸(C)残基中，后者在酵母样品中首次发现。 ( 参考文献 ) ( 1. Chassaigne， H.， Chery， C. C.， Bordin， G.， Vanhaecke， F.& Rodriguez， A . R. (2004). J. Anal. At.Spectrom.， 19，85. ) ( 2. Tastet， L.， Schaumloffel， D. & Lobinski， R. (2008).J. Anal. At. Spectrom.， 23，309. ) ( 3. Von Hage， J. (2008). Proteomics Sample Preparation. Wiley-VCH， Weinheim. ) Agilent Technologies 本文建立了有效的 ICP-MS 辅助蛋白质组学方法，用于鉴定市售富硒酵母样品不溶性硒组分中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离含硒蛋白，并用胰蛋白酶进行裂解。采用LA-ICP-MS、毛细管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 组合方法对裂解产物进行鉴定、分析和表征。由于胰酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。采用本方法鉴定出了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3，这是富硒酵母中的主要含硒蛋白。证明由于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒，存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 残基中，后者在酵母样品中首次发现。