食用菌中转基因成分检测方案(离心机)

智能文字提取功能测试中

主要食用菌(如杏鲍菇、红菇、姬松茸、香菇、草菇、牛肝菌、鸡腿菇、金针菇、双双蘑菇、猪肚菇、凤尾菇、小平菇、秀珍菇、猴头菇、金顶侧耳、茶树菇、竹荪、黑木耳、白木耳等)中转基因成分的检测。 一、实验原理： 样品经过提取 DNA后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过 PCR技术，对外源基因的DNA片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。 二、仪器配置 1、电子天平：感量为0.001g与0.0001g. ?2粉碎机。3：鼓风干燥箱。45678 微量移液器：体积范围是0.20pL~2.0pL， 2pL~20pL， 20p L~200pL， 200pL~1000pL， 枪头用前应高压灭菌处理。 旋涡振荡器。 恒温水浴锅：恒温范围为室温~100℃，精度为±0.5℃。 台式高速高心机，低温冷冻高速速心机，小型瞬时高心机。 DNA浓缩仪。 9、核酸蛋白分析仪。 10、PCR仪。 11、电泳仪。 12、电泳槽。 B凝胶分析成像系统。佰 PCR超净工作台或生物安全柜。 微波炉。 高压灭菌锅。 17、PH计.18、31、制冰机。 19、纯水机。 20、低温冰箱(-20℃以下)。 21、真菌NDA提取试剂盒。 三、测定方法： 1、DNA提取 称取100 mg烘干后研磨成粉的样品，于1.5mL的离心管中，加600 pL 2%CTAB缓冲液，5 pL蛋白酶K(20mg/mL)， 5pL Rnase A (10pg/mL)， 剧烈振荡30 s以上，65℃温浴1h，期间定期振荡。加600pL水饱和酚：三氯甲烷：异戊醇 (25：24：1)，剧烈振荡，12000 g离心15 min。取上清液，再加等体积的水饱和酚：三氯甲烷：异戊醇 (25：24：1)，振荡混匀，12000 g 离心15 min。取上清液，加0.8倍体积异丙醇，混匀，12000 g 离心10 min。取沉淀，加入400uL氯化钠 (1 mol/L)于65℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚：三氯甲烷：异戊醇(25：24：1)，振荡，12000 g离心15 min。取上清液，加2倍体积的无水乙 醇，轻微振荡，12000 g离心10 min。 取沉淀，70%乙醇清洗2次，干燥， 加100 pLTE (pH8.0) 溶解。每个样品设2个重复。 2、DNA 浓度与纯度测定 DNA用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm 处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度， DNA 纯度等于 OD260/OD 280 ， 比值在1.7~2.0之间较为理想。双链DNA 浓度 (pg/mL) 等于50倍 OD260值。 3、定性PCR检测 (1)PCR反应体系 食用菌中的内源 18 Sr DNA 基因与外源基因采用的PCR 检测体系见表1。每个样品反应体系设2个重复(同时做2管)。 表1 定性PCR检测参考反应体系 试剂名称 储备液浓度 25pL反应体系加样量/pL 50L反应体系加样量/pL 10XPCR缓冲液(含25mmol/L氯化镁) 一 2.5 5.0 dNTPs 2.5 mmol/L. 2.5 5.0 Taq 酶 5U/pL 0.2 0.4 正向引物 10 jmol/L 0.5 1.0 反向引物 0.5 1.0 DNA模板 100 ng/pL~2 000 ng/pL 1.0 2.0 双蒸水(ddH，O) 补至25 补至50 (2) PCR反应体系对照的设置 PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。 阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的 DNA。 阴性对照：非转基因食用菌中提取的DNA， 空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。 (3) PCR反应热循环参数的设置 94℃预变性2min。94℃变性30s，54℃退火40s， 72℃ 延伸1 min ， 40个循环。72℃延伸5min。4℃下保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。 (4) PCR扩增产物的电泳检测 用0.5xTBE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶。将8 pL~10 pL 的 PCR扩增产物 分别与1 pL~2pL的6x加样缓冲液(电泳前沿指示剂)混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子量大小适当的 DNA Marker 做分子量标记。选择合适的电压(3V/cm~5V/cm)，电泳时间为 5o min~60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。 5、结果判断 (1)样品DNA抽提质量判断 按照真核生物共有的核糖体18 Sr DNA基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的DNA 提取液进行PCR扩增。均应扩增出137 bp的片段，否则，说明提取的 DNA 质量有问题，或者是DNA 溶液中存在 PCR 反应的抑制因子，应该重新纯化或提取DNA，直至扩增出该DNA片段，防止检测中产生假阴性结果。 (2)外源基因的检测 阴性对照与空白对照未扩增出DNA片段，阳性对照扩出预期的 DNA片段，待测样品未扩增出预期的 DNA片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的 DNA片段，则可初步判定待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。 (3)结果确证实验与结果表述 1)采用实时荧光PCR检测方法或者委托有资质的生物技术公司进行委托确证。 2)结果表述：确证为阳性的，表述为：检出xxxx基因；确证为阴性的，表述为：未检出xxxx基因。 5、样品保存 (1)保存条件 燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于-20℃下。 (2)保存期限：3个月. 一、实验原理： 样品经过提取 ＤＮＡ 后，针对转基因食用菌所导入的常见外源基因的基因序列设计引物，通过 ＰＣＲ技术，对外源基因的 ＤＮＡ 片段进行特异性扩增，根据实验结果，判定该食用菌样品是否含有外源基因成分。 二、仪器配置：1、电子天平：感量为0.001ｇ与0.0001ｇ。2、粉碎机。3、鼓风干燥箱。4、微量移液器：体积范围是0.20μL～2.0μL， 2μL～20μＬ， 20μＬ～200μＬ， 200μＬ～1000μＬ，枪头用前应高压灭菌处理。5、旋涡振荡器。6、恒温水浴锅：恒温范围为室温～100℃ ，精度为±0.5℃ 。7、台式高速离心机，低温冷冻高速离心机，小型瞬时离心机。8、 DNA 浓缩仪。9、核酸蛋白分析仪。10、PCR 仪。11、电泳仪。12、电泳槽。13、凝胶分析成像系统。14、PCR超净工作台或生物安全柜。15、微波炉。16、高压灭菌锅。17、PH 计。18、制冰机。19、纯水机。20、低温冰箱(-20℃以下）。21、真菌NDA提取试剂盒。 三、测定方法： 1、DNA提取       称取100 mg烘干后研磨成粉的样品，于1.5 mL的离心管中，加 600 μL 2％CTAB缓冲液，5 μL蛋白酶K（ 20 mg/mL） ，5 μL Rnase A（10 μg/mL ） ，剧烈振荡30 s以上， 65℃温浴1h，期间定期振荡。 加600 μL水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，剧烈振荡， 12000 g离心15 min。 取上清液，再加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，振荡混匀，12000 g 离心 15 min。 取上清液，加0.8倍体积异丙醇，混匀，12000 g 离心10 min。 取沉淀，加入400 μL氯化钠（1 mol / L）于65℃温浴中溶解，加等体积的水饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25:24:1） ，振荡， 12000 g离心15 min。 取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻微振荡， 12000 g离心10 min。取沉淀， 70％乙醇清洗2次，干燥，加100 μL TE（pH8.0）溶解。每个样品设2个重复。2、DNA 浓度与纯度测定       DNA 用核酸蛋白分析仪测定260nm和280nm 处吸收值，分别计算DNA纯度与浓度，DNA 纯度等于 OD260/OD 280 ，比值在1.7~2.0之间较为理想。 双链 DNA 浓度（μg/mL）等于50倍 OD260值。 3、定性PCR检测 （1）PCR反应体系         食用菌中的内源 18 Sr DNA 基因与外源基因采用的PCR 检测体系见表1。 每个样品反应体系设2个重复（同时做2管）。表1 定性PCR检测参考反应体系 （2）PCR 反应体系对照的设置         PCR检测时设立置阳性对照、阴性对照和空白对照。         阳性对照：转基因食用菌的阳性质粒或转基因食用菌中提取的 DNA。         阴性对照：非转基因食用菌中提取的DNA。         空白对照：用配制反应体系的实验用水代替模板。（3）PCR反应热循环参数的设置         94℃预变性2min。 94℃变性30ｓ ，54℃退火40ｓ ，72℃ 延伸1 min ，40个循环。 72℃ 延伸 5min 。 4℃下保存。 也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应热循环参数做相应的调整。（4）PCR扩增产物的电泳检测        用0.5×TBE 电泳缓冲液制备2 ％ 的琼脂糖凝胶。 将 8 μL～10 μL 的 PCR扩增产物 分别与1 μL～2 μL的6×加样缓冲液（电泳前沿指示剂）混合后，在凝胶板上的孔中点样。 用分子量大小适当的 DNA Marker 做分子量标记。 选择合适的电压（ 3V/cm ～5 V / cm），电泳时间为 5o min～60min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。5、结果判断（1） 样品DNA抽提质量判断          按照真核生物共有的核糖体18 Sr DNA基因的序列设计的引物，对食用菌阴性样品与待测样品的DNA 提取液进行PCR 扩增。 均应扩增出137 bp的片段，否则，说明提取的 DNA 质量有问题，或者是DNA 溶液中存在 PCR 反应的抑制因子，应该重新纯化或提取DNA，直至扩增出该DNA片段，防止检测中产生假阴性结果。（2） 外源基因的检测          阴性对照与空白对照未扩增出DNA 片段，阳性对照扩出预期的 DNA 片段，待测样品未扩增出预期的 DNA 片段，可以断定待测样品中不含有外源基因，如果扩出预期的 DNA 片段，则可初步判定待测样品中含有可疑的外源基因，应进一步进行确证实验。（3）结果确证实验与结果表述         1）采用实时荧光PCR检测方法或者委托有资质的生物技术公司进行委托确证。         2）结果表述：确证为阳性的，表述为：检出 × × × × 基因；确证为阴性的，表述为：未检出××××基因。 5、样品保存（1） 保存条件          燥样品保存在常温下，新鲜样品保存于－20℃下。（2）保存期限：3个月。联系人：孙庆磊 17615852702