生物样品中DNA 的纯度检测方案(紫外分光光度)

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安捷伦 Cary 60紫外-可见分光光度计配置微光纤探头测定4℃下微量 DNA 的纯度 应用摘要医药/生物技术 作者 总结 *Fyfe， DJ 和 Comerford， JC** *Fyfe 科技公司， West LakesShore， SA 5020， 澳大利亚 安捷伦 Cary 60 紫外-可见分光光度计是在储存环境(如冰箱)下直接测定微量生物样品的理想仪器。本应用报告展示了如何使用 Cary 60 及其微光纤探头附件测定4℃下的 DNA纯度——结果表明，使用该仪器能够大幅节省时间和成本，同时数据精确度和重现性毫无损失。 **安捷伦科技公司， 不再需要比色皿 679 Springvale Road，Mulgrave 3179， 澳大利亚 直接测定4℃冰箱中的样品 节省每次分析的时间与成本 前言 多年以来，紫外-可见分光光度计一直是生物技术领域中测定 DNA 纯度和浓度的一项重要工具。该方法最早由 Warburg 和 Christian 在1942年开发1，随后由Sambrook 等人在1989年进行了优化，使其可用于实验室中简便、快速的测定2。分光光度法的主要优点在于测定过程：1)简便；2)准确；3) 不破坏样品。这一方法可以节省时间而不损失数据质量，并且在测定过程中无需使用大体积的样品或额外的耗材，从而带来经济效益。 Agilent Technologies 在之前的文章中，我们介绍了安捷伦 Cary 50 紫外-可见分光光度计配置 Hellma (德国 Hellma GmbH & Co.) 的Traycell 微量比色池紫外-可见在室温下准确、可重现地测定微量 DNA 的方法3。在本研究中，我们采用带光纤探头的Cary 60 紫外-可见分光光度计进行了方法扩展研究，在4℃以及普通实验室环境光照条件下测定了小体积样品。本方法使得用户可以将仪器靠近样品，而不是像传统光谱方法那样将样品放入仪器中，从而能够在很短的时间内完成分析。Cary 60独有的光学设计使这一优势得以实现，它主要凭借其独特的高强度闪烁氙灯以及最新型的电子器件，使系统能够有效地监控吸光度的微小变化而不受环境背景光的任何影响。本文深入讨论了这一方法的主要优点。 仪器与材料 部件号 说明 G6860AA Cary 60 紫外-可见分光光度计，配备 WinUV软件和HP电脑(台式机) 7910035600 微光纤探头 G6866A 光纤探头耦合器 6610000800 石英比色皿(光程1cm；两只装) D-4764 (Sigma 化学公司) 小牛胸腺 DNA： 1 方法与结果 将小牛胸腺 DNA 用纯净水 (MilliQ)稀释得到不同浓度的样品，浓度范围0-50 pg/ml。 配有光纤耦合器以及微探头的 Cary 60， 如图1所示。在Eppendorf管中加入150uL纯净水(MilliQ)，将其读数作为空白。 由于分子生物学试剂通常保存于冷藏条件下，因此所有样品直接从4℃冰箱中取出并进行分析。 图1.配有光纤附件的 Cary 60 测试 4°C 下Eppendorf 管中 150 pL DNA的示意图。 开始时，使用 WinUV 软件"扫描"模块在 340 到 240 nm 范围进行扫描以确认最大吸收峰以及所购买的按 50：50 稀释的 DNA 样品的可靠性(图2)。 图2.对4C 下两个浓度的150 pL DNA 样品的扫描表明特征吸收峰出现在260nm 处。注意：50 pg/ml DNA 最大吸光度值1.0Abs， 25 ug/ml DNA 最大吸光度值0.5Abs， 遵守 Beer Lambert 定律(A=Ecl)。 为了确认 DNA的纯度，使用 WinUV 软件专门的"RNA/DNA"模块测定 260/280比率，该模块可自动计算DNA 样品的纯度。如图3所示，这一模块使用非常简单，可以在一分钟内完成分析。 图3.简便、专用的Cary WinUV 自动计算 DNA的纯度、可靠性和浓度 最后，绘制浓度曲线以评估同一实验室条件下不同浓度DNA样品读数的线性和重现性(图4)。在两个 DNA 样品读数间隙使用 MilliQ 纯净水清洗微探头。 图4.使用微探头光纤附件在实验室常规光照条件下测定4℃下Eppendorf 管中 50 pL DNA 样品(0-50pg/mL) 得到的浓度曲线。校准方程： Abs =0.02393*浓度：相关系数=0.99126。 测定五个样品所用的时间不到两分钟。传统方法使用微量比色皿，需要等待样品加热至室温，而且在每两次测定间需要清洗微量比色皿。总之，使用 Cary 60 光纤系统可以显著降低大约80%的分析时间，同时采用光纤技术不易受到样品处理引起的潜在污染。使用微探头可以获得高精度的数据并大大缩短测定低温样品所需的时间，这表明 Cary 60是一种适于测定生物样品(如DNA)的简便、快速且高性价比的系统。本方法可以轻松地直接扩展到其其样品类型，例如可在 280 nm处测定蛋白质。 结论 Cary 60紫外-可见分光光度计是使用光纤采样的理想仪器，它独有的高强度闪烁氙灯可以提供卓越的灵敏度和重现性。本应用报告所展示的测定 DNA样品时的分析速度、结果重现性以及易用性证明了该仪器系统的强大优势。 使用带光纤的 Cary 60 分析生物样品还具有如下优点： 可以直接测定高温或低温样品(4℃-110℃)而无需考虑冷凝的问题，如果使用比色皿则由于冷凝可能导致结果不正确或重现性不好 样品体积不受限制，可以低至40 pL， 也可以无限大 无需购买昂贵的石英微量比色皿，更节省了清洗比色皿的时间 使用反射探头还可以分析固体、粉末或凝胶类样品 1. Warburg， 0. and Christian， W. (1942)Biochem Z.， 310；384. 2. Sambrook， J.， Fritsch， EF. and Manniatis， T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition， Cold Spring Habror Laboratory Press， Cold Spring Harbor. 3. Keighley， B. and Fyfe， D. (1995) 应用摘要#91.www.agilent.com www.agilent.com/chem/cn 安捷伦科技(中国)有限公司，2011 2011年5月19日出版 出版号5990-7863CHCN Agilent Technologies Cary 60 紫外-可见分光光度计是使用光纤采样的理想仪器，它独有的高强度闪烁氙灯可以提供卓越的灵敏度和重现性。本应用报告所展示的测定DNA 样品时的分析速度、结果重现性以及易用性证明了该仪器系统的强大优势。使用带光纤的Cary 60 分析生物样品还具有如下优点： •   可以直接测定高温或低温样品（4 °C – 110°C）而无需考虑冷凝的问题，如果使用比色皿则由于冷凝可能导致结果不正确或重现性不好•   样品体积不受限制，可以低至40 μL，也可以无限大•   无需购买昂贵的石英微量比色皿，更节省了清洗比色皿的时间•   使用反射探头还可以分析固体、粉末或凝胶类样品