植物中荧光成像检测方案(光合仪)

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易 科泰生态技术有限 公司Ecotech Ecological Technology Ltd. EcoTech易科泰生态技术易 科泰生态技术有限 公司Ecotech Ecological Technology Ltd. FluorCam叶绿素荧光成像技术：OJIP 快速荧光动力学曲线与QA-再氧化动力学曲线成像分析 PAM 荧光淬灭动力学曲线、OJIP快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线分析是叶绿素荧光技术的三大主要测量技术路线，分别对应光系统运行机理的不同方面。与 PAM 荧光淬灭分析主要针对光系统运行中较慢的光合稳态与荧光淬灭不同， OJIP 快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线分析都需要非常高的检测速度。 1600 oEo 从左至右： OJIP快速荧光动力学曲线、PAM荧光淬灭动力学曲线、QA-再氧化动力学曲线(Kalaji，2014) 目前，能够同时完成这三种荧光动力学曲线测量的仪器只有FL6000双调制叶绿素荧光仪、FluorCam 封闭式荧光成像系统和 FKM多光谱荧光动态显微成像系统。而由于 OJIP 快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线对技术的特殊要求，对这两种曲线的成像分析更是只有 FluorCam 封闭式荧光成像系统和 FKM 多光谱荧光动态显微成像系统能够实现。 上： FL6000 双调制叶绿素荧光仪下左： FluorCam 封闭式荧光成像系统下右： FKM多光谱荧光动态显微成像系统 OJIP快速荧光动力学曲线测量要求对样品经过暗适应后的最小荧光上升到最大荧光这一过程进行快速检测。这一个过程一般在1-2秒即可完成，仪器检测器的最高灵敏度要求达到100000次/秒以上。OJIP 快速荧光动力学曲线部分参数及其意义： Fo、Fj、Fi、P或 Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss、N(QA 还原周转数量)、Phi Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC(单位反应中心的吸收光量子通量)、TRo/RC(单位反应中心初始捕获光量子通量)、ETo/RC(单位反应中心初始电子传递光量子通量)、DIo/RC(单位反应中心能量散失)、ABS/CS(单位样品截面的吸收光量子通量)、TRo/CSo、RC/CSx(反应中心密度)、PIABS(基于吸收光量子通量的“性能”指数或称生存指数)、PIcs(基于截面的“性能”指数或称生存指数) 使用FluorCam 封闭式荧光成像系统获得的大麦OJIP 参数成像图和动力学曲线 (Jedmowski， 2015) QA-再氧化动力学曲线测量是运用 STF (single turnover flash，单周转光闪)测量光系统Ⅱ中 QA再氧化过程中荧光产额的衰减曲线，从而衡量 QA 传输电子的能力。通过曲线拟合可能将光系统Ⅱ分为快相 (Fast phase)、中间相 (Middle phase) 和慢相(Slow phase)， 同时获得各自的振幅(A1，A2，A3)和时间常数(T1， T2， T3)。这是用来深入研究光系统II变化异质性的必备工具，同样要求检测器的最高灵敏度达到100000次/秒以上。 igr2- igr2-14 左：使用 FKM 多光谱荧光动态显微成像系统测量紫菜显微QA-再氧化动力学成像图；右：拟南芥的QA再氧化动力 学曲线 (Ding，2016，中科院植物所) 这么高的检测速度在叶绿素荧光仪上是可以实现的，但由于成像 CCD 元件的成像速度限制，般叶绿素荧光成像仪器根本无法达到。国际上仅有 FluorCam 的两个型号——FluorCam 封闭式荧光成像系统和FKM 多光谱荧光动态显微成像系统通过泵浦成像技术分别实现了叶片层次与细胞层次的 OJIP 和QA-再氧化动力学曲线的拟合成像测量。 2019年，捷克科学院 Kipper 教授与 PSI公司合作，首次将超高灵敏度成像传感器与叶绿素荧光成像技术结合，实现了在640×512图像分辨率下高达4000 帧/秒的叶绿素荧光成像速度。这一技术实现了真正的 OJIP 快速荧光诱导动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线成像测量 中ET2o 通过超高灵敏度 FluorCam 获得的拟南芥和超积累植物 Noccaea ochroleucum 的 OJIP 快速荧光诱导动力学曲线成像图(左图、中图)与QA-再氧化动力学曲线(右图)(Kupper， 2019) 易 科泰生态技术有限 公司Ecotech Ecological Technology Ltd. 后续， Kipper 使用这一革新性的技术成果进行了大量关于重金属对光合作用抑制机理的研究。赫尔辛基大学等则利用这一新技术开展了拟南芥光系统对臭氧的响应机制等一系列研究。 超积累植物鼠耳芥在 Cd/Zn 处理后的 OJIP 成像图与 OJIP 动力学曲线(Morina，2020) 超积累植物鼠耳芥在 Cd/Zn 处理后的 PAM 荧光淬灭显微成像图与QA-再氧化动力学分析(Morina， 2020) 日 C D pET2o=1-(F /F) after 2 hours of light with ozone 0.10.20.330.40.5 (0.6 0.7 拟南芥在臭氧和光照处理后的 OJIP 成像图与 OJIP 动力学曲线(Morales，2021) ( 参考文献： ) 1.Jedmowski C， et al. 2015. Imaging of fast chlorophyll fluorescence induction curve (OJIP) parameters，applied in a screening study with wild barley (Hordeum spontaneum) genotypes under heat stress. Journalof Photochemistry and Photobiology B： Biology 151：153-160 ( 2.Ding S， et al. 2016. Glutathione reductase 2 m a intains th e function of photosystem II in Arabidopsisunder excess light. Biochimica et Biophysica Acta 1857：665-677 ) 易 科泰生态技术有限 公司Ecotech Ecological Technology Ltd. 3.Kipper H， et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kineticsby Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179： 369-381 4.Morina F， Kipper H， et al. 2020. Direct inhibition of photosynthesis by Cd dominates over inhibitioncaused by micronutrient deficiency in the Cd/Zn hyperaccumulator Arabidopsis halleri. Plant Physiologyand Biochemistry 155： 252-261 5.Morales LO， et al. 2021. Ozone responses in Arabidopsis： beyond stomatal conductance. PlantPhysiology 186(1)：180-192 北京易科泰生态技术公司提供光合作用研究全面技术方案： FluorPen/AquaPen 手持仪叶绿素荧光仪 FluorCam 叶绿素荧光成像系统 FL6000 双调制式叶绿素荧光测量系统 TL6000叶绿素热释光测量系统 FKM多光谱荧光动态显微成像系统 SL3500、FytoScope 智能 LED 光源与生长箱 SpectraPen/PolyPen、Specim 高光谱测量技术 PlantScreen 植物高通量表型成像分析平台 北京市海淀区高里掌路号院号楼单元(Tel.： +nfo@eco-tech.com.cnhttp：//www.eco-tech.com.cnEmail： sales@eco-tech.com.cn 北京市海淀区高里掌路号院号楼单元 (Tel.：+nfo@eco-tech.com.cnhttp：//www.eco-tech.com.cnEmail： sales@eco-tech.com.cn PAM荧光淬灭动力学曲线、OJIP快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线分析是叶绿素荧光技术的三大主要测量技术路线，分别对应光系统运行机理的不同方面。与PAM荧光淬灭分析主要针对光系统运行中较慢的光合稳态与荧光淬灭不同，OJIP快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线分析都需要非常高的检测速度。目前，能够同时完成这三种荧光动力学曲线测量的仪器只有FL6000双调制叶绿素荧光仪、 FluorCam封闭式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统。而由于OJIP快速荧光动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线对技术的特殊要求，对这两种曲线的成像分析更是只有FluorCam封闭式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统能够实现。OJIP快速荧光动力学曲线测量要求对样品经过暗适应后的最小荧光上升到最大荧光这一过程进行快速检测。这一个过程一般在1-2秒即可完成，仪器检测器的最高灵敏度要求达到100 000次/秒以上。OJIP快速荧光动力学曲线部分参数及其意义： Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA还原周转数量）、Phi­­­_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（单位反应中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（单位反应中心初始捕获光量子通量）、ETo/RC（单位反应中心初始电子传递光量子通量）、DIo/RC（单位反应中心能量散失）、ABS/CS（单位样品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反应中心密度）、PIABS（基于吸收光量子通量的“性能”指数或称生存指数）、PIcs（基于截面的“性能”指数或称生存指数）QA-再氧化动力学曲线测量是运用STF（single turnover flash，单周转光闪）测量光系统II中QA再氧化过程中荧光产额的衰减曲线，从而衡量QA传输电子的能力。通过曲线拟合可能将光系统II分为快相（Fast phase）、中间相（Middle phase）和慢相（Slow phase），同时获得各自的振幅（A1，A2，A3）和时间常数（T1，T2，T3）。这是用来深入研究光系统II变化异质性的必备工具，同样要求检测器的最高灵敏度达到100 000次/秒以上。这么高的检测速度在叶绿素荧光仪上是可以实现的，但由于成像CCD元件的成像速度限制，一般叶绿素荧光成像仪器根本无法达到。国际上仅有FluorCam的两个型号——FluorCam封闭式荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统通过泵浦成像技术分别实现了叶片层次与细胞层次的OJIP和QA-再氧化动力学曲线的拟合成像测量。2019年，捷克科学院Küpper教授与PSI公司合作，首次将超高灵敏度成像传感器与叶绿素荧光成像技术结合，实现了在640×512图像分辨率下高达4000帧/秒的叶绿素荧光成像速度。这一技术实现了真正的OJIP快速荧光诱导动力学曲线和QA-再氧化动力学曲线成像测量后续，Küpper使用这一革新性的技术成果进行了大量关于重金属对光合作用抑制机理的研究。赫尔辛基大学等则利用这一新技术开展了拟南芥光系统对臭氧的响应机制等一系列研究。参考文献：1.Jedmowski C, et al. 2015. Imaging of fast chlorophyll fluorescence induction curve (OJIP) parameters, applied in a screening study with wild barley (Hordeum spontaneum) genotypes under heat stress. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 151: 153-1602.Ding S, et al. 2016. Glutathione reductase 2 maintains the function of photosystem II in Arabidopsis under excess light. Biochimica et Biophysica Acta 1857: 665-6773.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-3814.Morina F, Küpper H, et al. 2020. Direct inhibition of photosynthesis by Cd dominates over inhibition caused by micronutrient deficiency in the Cd/Zn hyperaccumulator Arabidopsis halleri. Plant Physiology and Biochemistry 155: 252-2615.Morales LO, et al. 2021. Ozone responses in Arabidopsis: beyond stomatal conductance. Plant Physiology 186(1): 180-192 北京易科泰生态技术公司提供光合作用研究全面技术方案：FluorPen/AquaPen手持仪叶绿素荧光仪FluorCam叶绿素荧光成像系统FL6000双调制式叶绿素荧光测量系统TL6000叶绿素热释光测量系统FKM多光谱荧光动态显微成像系统SL3500、FytoScope智能LED光源与生长箱SpectraPen/PolyPen、Specim高光谱测量技术PlantScreen植物高通量表型成像分析平台