牛奶中黄曲霉毒素M1检测方案(液相色谱仪)

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HPLC与ELISA法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的比较研究 上海善福电子 HPLC与ELISA法测定牛奶中黄曲霉du素M1的比较研究 黄曲霉du素M1(AFM1)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，其基本结构为二呋喃环和香豆素［1］。 黄曲霉du素M1(AFM1)是哺ru类动物在摄入被黄曲霉du素B1污染的饲料和食品后，在体内经过羟化而衍生成的二次毒性代谢产物，存在于动物分泌的ru汁和产生的尿液中。黄曲霉du素M1的毒性主要表现为致癌、致畸、致ji因突变性，与lu化钾和砒双相比属特别剧毒物质，为强致癌剂，对人体健康危害大且不被巴氏消du所破坏［1］。牛奶及其制品是易受到AFM1污染的食品之一。在我国和其它多数国家规定了牛奶及奶制品中AFM1的含量不得超过0.5μg／kg［2–3］，而欧盟的要求则更加严格，含量不得超过0.05μg／kg。由于老人和儿童是牛奶消费的重要人群，因此加强对AFTM1的监测，对于保护人类健康十分重要。AFM1是食品检验的常规项目之一，也是牛奶产品中要点监控对象之一。目前，国内外黄曲霉du素xian制正在逐步加强，xian量标准也在不断降低，因此需要一种灵敏度高、特异性强、简便快速且易于普及应用的检测方法。AFM1的分析一般采用薄层色谱法（TLC）、酶联吸附mian疫法(ELISA)和gao效液相色谱法(HPLC)［4］。TLC所需仪器设备简单，具有较好的分离和专一性，在基层比较常用，但存在灵敏度低、试验步骤多、试剂耗费大、干扰因素多、荧光强度的目测准确性比较差等不足，且该法主要是半定量，难以普及；HPLC的灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠，但样品处理繁琐（前处理氮吹蒸发过干会造成AFM1损失）、净化柱消耗较多、检测成本较高等；ELISA方法灵敏度较高，快速、经济，但存在重复性较差、试剂寿命短，需要低温保存等缺点［4–6］。笔者利采用HPLC法和ELISA法同时测定牛奶中AFM1的含量，对两种方法的测定结果及优缺点进行了比较。   实验部分 1．1主要仪器与试剂 高肖液相色谱仪：Agilent1200型，附带荧光检测，美国Agilent仪器公司；酶标仪：MK3型，450nm滤光片，美国Thermo公司；离心机：TDL–5型，上海善福有限公司；黄曲霉du素M1(AFM1)标准品、PriboFast黄曲霉素M1mian疫亲和柱：北京泰乐祺科技有限公司；HELICA黄曲霉du素M1竞争性ELISA检查试剂盒：上海善福电子有限公司；甲醇、以腈：色谱纯，美国TEDIA公司；AFM1标准储备溶液：0.01mg/mL，分别称取标准品黄曲霉du素M10.10mg（精que至0.01mg），用三lu甲烷溶解并定容至10mL。 1．2实验方法 1.2.1HPLC法 样品前处理。 将100mL牛奶水浴加热至40℃，加入1.0glu化钠，以4000r／min离心15min；将50mL清澈液注入与mian疫亲和柱连接的50mL玻璃注射器中，以2～3mL／min流速缓慢通过mian疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体，用10mL水洗脱杂质，再用4mL以腈洗脱AFM1（洗脱时间不少于1min），供HPLC分析。 色谱条件。 色谱柱：ThermoScientificHypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速:1.0mL／min；流动相：以腈–水（体积比25∶75），流速为1.0mL／min；柱温：30℃；进样量：20μL；激发波长：365nm；发射波长：435nm；外标法定量。 1.2.2ELISA法 将牛奶冷藏过夜，称取2kg离心5min，下层脱脂样品用于检测。向微孔中加入200μL标准品和样品，室温孵育2h后，弃去微孔中内容物，用洗涤缓冲液洗涤微孔，洗涤3次后，轻拍微孔板，弃去残留液。向微孔中加入100μL酶标物，室温孵育15min后，洗涤微孔；向微孔中加入100μL底物试剂，室温孵育15～20min；添加100μL终止液；使用酶标仪在450nm下读取并记录每个微孔的OD值。以标准品的OD值为纵坐标，对应的AFM1浓度的对数值为横坐标，绘制曲线。 结果与讨论 2．1HPLC法工作曲线及检出限 利用AFM1标准储备液配制浓度为1，2，5，10，20ng／mL的系列AFM1标准溶液，在选定的色谱条件下进样分析。以色谱峰面积A对AFM1浓度c(ng／mL)绘制曲线，在1～20ng/mL范围内线性回归方程为A=0.288176c–0.066192，相关系数r=0.9997。对添加低浓度水平的AFM1样品进行测定，以3倍信噪比计算方法的检出限，检出限为0.5μg／kg。AFM1标准样品及样品的色谱图见图1。 2．2ELISA法工作曲线及检出限 利用AFM1标准储备液配制浓度为0.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0pg／mL的系列AFM1标准溶液，根据1.2.2以浓度的对数(x)为横坐标，以吸光度与空白吸光度之比(y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y=–7.673x+42.18，相关系数r2=0.9983，线性范围为5.0～100.0pg/mL。对添加低浓度水平的AFM1样品进行测定，以3倍信噪比计算得本方法检出限为0.005μg/kg。 2．3样品检测结果对照 用HPLC法和ELISA法分别对10份牛奶样品进行检测，结果见表1。 由表1可以看出，HPLC法和ELISA法测定结果之间的偏差为0.57～0.89μg／kg；HPLC法测定结果比ELISA法测定结果低，可能由于HPLC法的mian疫亲和柱回收率低造成的；10#样品HPLC法未检出，而ELISA法检测结果为0.59μg／kg，可能是牛奶样品中的复杂基质造成的假阳性，也可能是由于ELISA法使用的试剂（抗体和酶）失效而造成的假阳性；两种方法的检测结果同步性较好，即ELISA法测定结果高的样品，HPLC法测定结果也高。除了ELISA法鉴定为假阳性的样品外，HPLC法和ELISA法测定结果的相关性检验值为0.9986，由此可见两种方法之间具有良好的相关性。 由于ELISA法使用的试剂（抗体和酶），牛奶样品基质成分（糖分、脂肪、蛋白质及其其它营养物质）复杂，可能出现少量的假阳性和假阴性结果，故ELISA法可作为测定的初筛方法，适合缺乏大型分析仪器的质检部门应用。 2．4加标回收率和精mi度试验 加标回收试验的载体是牛奶，AFM1的本底值未检出。在牛奶样品中加入一定量AFM1标准溶液，使加标终浓度分别为1，2，5μg／kg，然后进行测定，测定结果见表2。 由表2可知对于已知加标样品（阳性对照），HPLC法的加标回收率为68～85，测定结果的相对标准偏差为2.73～4.55；ELISA法的加标回收率为97～109，测定结果的相对标准偏差为2.18～4.25。从表2结果可知，对于已知加标样品，尽管HPLC法加标回收率比ELISA法低，但其精mi度比ELISA法高；对于未知样品，HPLC法可以准确地对AFM1定性，ELISA法由于可能出现少量的假阳性和假阴性结果而不可能准确地对AFM1进行定性。 2．5HPLC和ELISA法特点比较 ELISA法比HPLC法样品前处理简单，特异性好，无需纯化浓缩，简便快捷，污染较小，灵敏度较高，适合批量样品的普检和筛选以及缺乏大型仪器设备的基层单位，但可能出现少量的假阳性和假阴性结果；HPLC法需要gao效液相色谱仪（荧光检测qi），设备投资大，操作技术要求高，mian疫亲和柱消耗较多，检测成本高，但无假阳性和假阴性现象。两种方法的特点比较见表3。 3. 结论 (1)对牛奶中的黄曲霉du素M1(AFM1)进行检测时，ELISA法可用于定性、定量分析，但可能出现少量的假阳性和假阴性结果，因为ELISA法使用的试剂及样品基质成分复杂，mian疫反应过程及显色系统精que机制不明确，易受诸多不确定因素影响，所以mian疫测定法需要与理化方法（如HPLC法）进行分析结果相关性试验。 (2)对于已知加标样品（阳性），HPLC法和ELISA法具有良好的相关性，ELISA法样品前处理比HPLC法简便，具有良好的灵敏度和特异性，但可能出现少量的假阳性和假阴性结果，故可作为初步筛选；而对于未知样品，HPLC法的密度和准确度均良好，是一种确证方法，但样品前处理较繁琐。对于批量牛奶样品的检测，若将HPLC法和ELISA法相结合，即先利用ELISA法快速检测出阳性样品，再经HPLC法准确定量分析，可大大提高检测效率。 HPLC与ELISA法测定牛奶中黄曲霉du素M1的比较研究 黄曲霉du素M1(AFM1)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，其基本结构为二呋喃环和香豆素［1］。黄曲霉du素M1(AFM1)是哺ru类动物在摄入被黄曲霉du素B1污染的饲料和食品后，在体内经过羟化而衍生成的二次毒性代谢产物，存在于动物分泌的ru汁和产生的尿液中。黄曲霉du素M1的毒性主要表现为致癌、致畸、致ji因突变性，与lu化钾和砒双相比属特别剧毒物质，为强致癌剂，对人体健康危害大且不被巴氏消du所破坏［1］。牛奶及其制品是易受到AFM1污染的食品之一。在我国和其它多数国家规定了牛奶及奶制品中AFM1的含量不得超过0.5μg／kg［2–3］，而欧盟的要求则更加严格，含量不得超过0.05μg／kg。由于老人和儿童是牛奶消费的重要人群，因此加强对AFTM1的监测，对于保护人类健康十分重要。AFM1是食品检验的常规项目之一，也是牛奶产品中要点监控对象之一。目前，国内外黄曲霉du素xian制正在逐步加强，xian量标准也在不断降低，因此需要一种灵敏度高、特异性强、简便快速且易于普及应用的检测方法。AFM1的分析一般采用薄层色谱法（TLC）、酶联吸附mian疫法(ELISA)和gao效液相色谱法(HPLC)［4］。TLC所需仪器设备简单，具有较好的分离和专一性，在基层比较常用，但存在灵敏度低、试验步骤多、试剂耗费大、干扰因素多、荧光强度的目测准确性比较差等不足，且该法主要是半定量，难以普及；HPLC的灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果准确可靠，但样品处理繁琐（前处理氮吹蒸发过干会造成AFM1损失）、净化柱消耗较多、检测成本较高等；ELISA方法灵敏度较高，快速、经济，但存在重复性较差、试剂寿命短，需要低温保存等缺点［4–6］。我们利采用HPLC法和ELISA法同时测定牛奶中AFM1的含量，对两种方法的测定结果及优缺点进行了比较。