使用CP-NX超速离心机和P40ST转子纯化膜筏

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在本文中，我们展示了搭配使用CPNX 系列超速离心机与P40ST 水平转子（图2），通过密度梯度离心法从发育中的小脑组织中纯化抗去污剂膜(Detergent-resistantmembrane，DRM) 筏的方法。搭配使用CPNX 系列超速离心机与P40ST 水平转子以及13 PA 离心管，通过蔗糖密度梯度离心法完成膜筏的分离。‍eppendorfSHORT PROTOCOL No.52 eppendorfSHORT PROTOCOL I No.521 Page 2 使用 CP-NX 系列超速离心机和 P40ST 水平转子纯化抗去污剂膜筏 Kohj i Kasahara ， Shuichi Kani， Jan Knop， Martin Armbrecht 1Tokyo Metropolitan Institute of Mecical Science， Tokyo， Japan； 2Eppendor f Himac Technologies， Tokyo， Japan；3Eppendorf SE， Hamburg ， Germany 本文中，我们介绍了 一 种使用密度梯度超速离心法分离细胞 膜特殊区域—“脂筏”的方法(图1)。脂筏不同于细胞膜 的其余部分，其脂质和蛋白质组份发生了改变。它们在信号 转导和调控过程中发挥着特殊作用。此外，脂筏也可能成为 细菌和病毒感染的入口。1.2 “脂筏 ”(l ipid raft)一词来源于漂浮在水面上的木筏形象，而整个细胞膜可以形象地比喻为水面。 脂筏不溶于表面活性剂，可以使用非离子型表面活性剂处 理，并在蔗糖密度梯度溶液中进行离心，从而从细胞膜上去 除。然后，可以在中密度和低密度介质液区域对其进行回收。超速离心法是对细胞膜微结构域内的目标分子进行定位的 标准方法之 一 。 在本文中，我们展示了搭配使用 CP-NX 系列超速离心机与 P40ST 水平转子(图2)，通过密度梯度离心法从发育中的小 脑组织中纯化抗去污剂膜 (Detergent-resistant membrane ， DRM) 筏的方法。3，4 图1：脂筏及其在膜中的典型组分概述5 (TAG-1=瞬 时轴 突 糖蛋白； Goa= GTP 结合蛋白的亚基家族； Lyn=Src 家族激酶； Cbp= CREB 结合蛋白)。 图2：CP-NX系 列 超速离心机(A)和P40ST水 平 转子(B) 方法 膜 筏 组 分 的 分离共分 两 步 进 行 ： 第一 步，制备 蔗 糖密度梯度 离 心的样品： *原 代培养大 鼠 小 脑 颗粒神经 元 /分 离自 7日 龄大鼠 离心机和配件： > CP-NX系列超速离心机 > P40ST 转子和 13PA离心管 参数： >转速：40，000 rpm (RCF： 最大 284，000xg) >时间：17h >温度：4℃ >加速模式：8 >减速模式：8 >样品体积：4mL >密度梯度溶液：6mL 试剂： > TNE 缓冲液 (25 mM Tris-HCI， 150 mM NaCl， 1 mM EGTA， pH 7.5) >含5% (w/v) 蔗糖的 TNE 缓冲液 >含 30% (w/v) 蔗糖的 TNE 缓冲液 Protocol： >将 4mL 样品置于 13PA 离心管底部 >向样品中加入一层6 mL 含TNE 缓冲液的连续蔗糖密度梯度溶液(5%-30%[w/v]) >将离心管放入 P40ST 转子中，并在40℃下以 40，000rpm(最大284000xg)的速度离心17小时 >离心后，按如下方式进行分馏：从顶部到底部依次收获1mL 组分，共10份，命名为1-10 >脂筏 DRM 位于 3-5号组分中(见图3) >使用 SDS-PAGE/免疫印迹分析法进行组分鉴定 完整的膜筏分离方法 图3概述了完整的膜筏分离方法： 溶解→离心→分馏 图3：通过 一 系列非连续蔗糖梯度 离 心步骤分离膜筏组分 结果验证 如此前文 章 所述4，可以使用 SDS-PAGE 和免疫印迹法，通过 以下蛋 白 质标记物来检查是否成功纯化膜筏组分： 1)Csk-binding protein (Cbp) 和 Flot i llin (FIt)：鉴定脂筏组 分(第3-5号组分)2)Calnexin (Cnx) 和 Transferrin receptor (TfR)：鉴定非脂 筏组分(第7-10号组分) 结论 在本方案中，我们展示了如何将 CP-NX系列超速离心机与 P40ST 水平转子以及13 PA离心管搭配使用，通过密度梯度 离心法完成膜筏的分离。 该方法也发表在“I nvolvement of Gangliosides i n the Process of Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in Developing Cerebellar Growth Cones.”一 文中。4 参考文献 [1] Hartlova et al .，"Membrane Rafts： A potential Gateway for Bacterial Entry into Host Cells，"Microbiol Immunol 54 (2010)：237-245. [2] Chazal et al .， "Virus Entry， Assembly， Budding， and Membrane Rafts，" Microbiology and Molecular Biology Reviews 67，no. 2 (June 2003)：226-237. [3] Kohei Yuyama et al.， "Translocation of Activated Heterotrimeric G Protein Gao to Ganglioside-Enriched Detergent-Resistant Membrane Rafts in Developing Cerebellum，" Journal of Biological Chemistry 282， no. 36 (2007)：26392-26400 [4] Naoko Sekino-Suzuki et al.， "Involvement of Gangliosides in the Process o f Cbp/PAG Phosphorylation by Lyn in Developing Cerebe l lar Growth Cones，"Journal of Neurochemistry 124 (2013)：514-522. [5] Kohji Kasahara， "Physiological Functions of Glycosphingolipids in Transmembrane Signaling，" Tokyo Metropol i tan Institute of Medical Science website： https：//www.igakuken.or.jp/biomembrane/english.html. www.eppendorf.cn Eppendorf China Limited 艾本德 中国有 限 公 司 上 海：021-38560500 北 京：010-8836 0998 广州 ：020-83754160 服 务 热线：400885 6070 电子 邮件 ： marketinfo@eppendor f .cn