4 ℃、10 ℃和15 ℃无水保活香港牡蛎（生蚝）中蛋白质和脂肪含量的检测

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不同温度无水保活对香港牡蛎微生物和基本营养成分的影响广东海洋大学学报Journal of Guangdong Ocean University第 40卷 第 5期2020年 9月Vol.40 No.5Sep. 2020 第5期高加龙等：不同温度无水保活对香港牡蛎微生物和基本营养成分的影响91 高加龙，章超桦，秦小明，等 .不同温度无水保活对香港牡蛎微生物和基本营养成分的影响 [J].广东海洋大学学报，2020，40（5）：90-96. 不同温度无水保活对香港牡蛎微生物和基本营养成分的影响 高加龙，章超桦，秦小明，曹文红，郑惠娜，林海生 （广东海洋大学食品科技学院 //国家贝类加工技术研发分中心（湛江）//广东省水产品加工与安全重点实验室 //广东省海洋生物制品工程 实验室 //水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心（大连 工业大学），辽宁 大连 116034） 摘 要 ：【目的 】研究温度对无水保活香港牡蛎（Crassostreahongkongensis ）存活状态、微生物以及营养品质的 影响。【方法 】对在 4 ℃、10℃和 15 ℃条件下保活不同时间的牡蛎存活率、菌落总数和大肠菌群数以及主要营 养成分含量进行测定。【结果 】4 ℃条件下保活 9 d 后牡蛎存活率仍可达到 95 %，高于 10 ℃和 15 ℃的存活率；在保活前期，牡蛎菌落总数与大肠菌群数变化不大，当 4 ℃保活 6 d 后，10 ℃保活 5 d 后和 15 ℃保活 4 d 后微 生物数量急剧上升，超过了国际微生物标准委员会新鲜双壳贝类的微生物限量标准；在保活过程中，牡蛎的水分 含量变化差异不显著（P > 0.05），随着保活时间的延长，蛋白质含量稍有下降，而脂肪含量和糖原含量则消耗较 多，乳酸含量逐渐上升；与 4℃相比，10 ℃和 15 ℃条件下保活的牡蛎脂肪和糖原的消耗更多。【结论 】4 ℃条 件下牡蛎保活时间更长，营养物质损失相对较低，更利于牡蛎保活流通。 关键词 ：香港牡蛎；无水保活；微生物；营养成分 中图分类号 ：TS254.4 文献标志码 ：A 文章编号 ：1673-9159（2020）05-0090-07doi ：10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.011 Effects of Different Temperatures Waterless Keep Alive on Total Number of Bacteria and Coliform Group, and Basic Nutritional Compositions in Crassostrea hongkongensis GAO Jia-long, ZHANG Chao-hua, QIN Xiao-ming, CAO Wen-hong, ZHENG Hui-na, LIN Hai-sheng （College of Food Science and Technology , Guangdong Ocean University , National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing (Zhanjiang ), Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety , Guangdong Province Engineering Laboratory for Marine Biological Products , Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Product of Guangdong Higher Education Institution , Zhanjiang 524088, China ; Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing (Dalian Polytechnic University ), Dalian 116034, China ） Abstract: 【Objective 】To assess the effect of temperatures on the survival status, microorganisms and nutritional quality of oyster Crassostrea hongkongensis . 【Method 】The survival rate, total bacterial count, number of coliform group and basic nutritional compositions of oyster during waterless keep 收稿日期：2020-01-21 基金项目：“十三五 ”国家重点研发计划重点专项（2019YFD0901601）；广东省科技计划项目（2015B020205003）；广东省应用型科技研 发专项资金项目（2016B020235002）；贝类产业技术体系（CARS-49）；广西科技重大专项（桂科 AA16380014）；广东普通 高等学校水产品高值化加工与利用创新团队项目（GDOU2016030503） 第一作者：高加龙（1983－），男，博士，讲师，研究方向为水产品加工与质量安全。Email: garonne@126.com 通信作者：章超桦（1956－），男，博士，教授，研究方向为水产品精深加工。Email: Zhangch2@139.com alive at 4℃, 10℃ and 15℃were determined. 【Result 】The survival rate of oysters was 95 %after 9 days keep alive at 4℃, which was higher than those observed at 10 ℃ and 15℃. At the early stage of waterless keep alive, the total bacterial count and number of coliform group in oysters changed little. After 6 days keep alive at 4℃, 5 days keep alive at 10 ℃and 4 days keep alive at 15 ℃, the number of microorganisms increased sharply and exceeded the limit of the International Committee on Microbial Standards for fresh bivalve shellfish. During the waterless keep alive period, the moisture content of oysters did not change much, the protein content decreased slightly, the fat content and glycogen content were consumed more with the extension of the keep alive time, while the content of lactic acid increased gradually. The consumptions of fat and glycogen in oysters during keep alive at 10℃ and 15℃were higher than those at 4 ℃. 【Conclusion 】 The keep alive time of oyster was longer and nutrient loss was relatively lower at 4 ℃，which is more appropriate for keeping alive and circulation of Crassostrea hongkongensis . Key words: Crassostrea hongkongensis ; waterless keep alive; microbiology; nutritional compositions 牡蛎是我国第一大养殖贝类，2018年总产量约 514万 t [1]。香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis ）是我国南海海域主要养殖品种，主要分布在广东汕 头、江门、阳江、湛江，广西钦州、北海、防城港 以及越南沿海等地。在我国，牡蛎主要以鲜销为主，鲜活牡蛎在泡沫箱加冰包装后无水运输。相比有水 保活运输，水产品加冰无水运输不仅能够促进产品 的鲜度，防止运输和保活过程中失重，减少死亡率，还可以简化运输管理、降低运输成本 [2-3]。除运输外，双壳贝类的贸易链还包含捕获、净化和储存等环 节，在整个贸易过程中贝类会受到多种压力，包括 长时间的空气暴露和温度波动。这些应激源强烈地 降低动物质量，引起动物代谢发生重要变化，并造 成贸易链的重大经济损失，因此，监测保护双壳类 动物的生理状况对于避免死亡率和优化利益相关 者的盈利能力至关重要 [4-5]。 牡蛎自身带有很多微生物且处于可繁殖状态，如果在运输过程中发生死亡，会加速微生物的繁殖 并影响其他牡蛎的存活及品质，因此，牡蛎的保活 及运输过程中的微生物以及品质控制成为了鲜活 牡蛎销售的关键问题。本研究以香港牡蛎为研究对 象，探讨经过净化后的牡蛎在不同温度条件下无水 保活过程中存活率、体内菌落总数和大肠菌群数以 及主要营养成分含量的变化规律，旨在为牡蛎的低 温保活运输提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis ），壳长 8 ~ 10 cm ，购自湛江官渡牡蛎养殖场，1 h 内运到实 验室，清洗后置于水产品低温净化系统。净化 24 h 后挑选成活且壳无破损的牡蛎作为样品；将牡蛎样 品分为 3组，分别储藏在 4、10和 15℃条件下，在储藏期间每天统计存活率，储藏开始 0h 、12 h 以及 1 ~ 9 d 各时间段分别取 3个活牡蛎检测菌落总 数和大肠菌群数，0 ~ 9 d 每天分别取 5个牡蛎测定 基本营养成分及糖原和乳酸等指标含量。 所用成品微生物培养基干粉均购自北京陆桥 公司，按说明书配制灭菌后使用。糖原和乳酸测定 试剂盒，购自南京建成。其余化学试剂为分析纯。 1.2 仪器与设备 数显层析柜，上海浦西；VAP 450全自动凯氏 定氮仪，Gerhardt 公司；VarioskanFlash 全自动酶 标仪，ThermoScientific 公司；SZF-06A 粗脂肪测 定仪，上海洪记仪器设备有限公司；水产品低温净 化设备，广州创领水产科技有限公司。 1.3 方法 1.3.1 净化方法 牡蛎的净化工艺流程参照贝类 净化技术规范 SC/T 3013−2002[6]。天然海水取自湛 江东海岛龙海天海滨的海水井，在净化设备暂养池 中以 5 m3/h 流速循环制冷至 20℃，通臭氧至臭氧 浓度达到 0.15 mg/L ，循环海水紫外线（λ = 254 nm ）杀菌，牡蛎经海水清洗后在预冷灭菌海水中净化 24 h[7]。1.3.2 方案设计 净化后的牡蛎共 300个，在 50 cm × 30 cm × 30 cm 泡沫箱中分装，约 5 kg/箱，装箱前 在箱底铺一层约 1cm 厚的冰袋，加盖后分别放置 在温度设定为 4、10和 15℃的层析柜中储藏，每 个温度条件约 100个牡蛎，随之对牡蛎在无水保活 过程中各种储藏温度条件下的存活状态、微生物数 量以及主要营养成分进行研究。 1.3.3 检活方法 采用目测法，依据牡蛎的贝壳张 开情况，能自由闭合的为活贝，不能闭合的为死贝。存活率为活牡蛎占牡蛎总数的百分比。 1.3.4 微生物测定 取实验活牡蛎，在流水下将表 面冲洗干净，无菌取牡蛎可食部分 25 g ，加无菌生 理盐水 225 mL ，3 000 r/min 均质 5 min[8]。菌落总 数的测定按照 GB 4789.2−2016规定进行 [9]；大肠菌 群的测定按照 GB 4789.3−2016平板计数法规定进 行 [10]。每个时间节点分别测定 3个牡蛎的菌数，结 果取平均值。 1.3.5 主要营养成分测定 水分采用常压干燥法 测定；蛋白采用全自动凯氏定氮仪直接测定；脂肪 采用索氏抽提法在索氏抽提器中测定；糖原采用肌 糖原和肝糖原测定试剂盒测定；乳酸采用乳酸 （LacticAcid ）测定试剂盒测定。每个保活时间节 点各取 5个牡蛎，开壳取肉，在定性滤纸上吸干外 表水分，每个牡蛎匀浆后测定以上各指标，结果取 平均值。 1.3.6 数据处理 利用 SPSS 26.0软件对试验数据 进行方差分析，采用邓肯氏法进行组间多重比较，显著性水平设为 0.05。 2 结果与分析 2.1 不同保活温度对牡蛎存活率的影响 净化后的香港牡蛎，分别于 4℃、10℃和 15℃层析柜内无水保活，每天目测检活统计存活 率，结果如图 1所示。 100 图 1 不同保活温度下香港牡蛎的存活率 Fig. 1 Survival rate of Crassostrea hongkongensis keep alive at different temperatures 从图 1存活率数据来看，保活 2 d 内香港牡蛎 在 3个温度条件下均无死贝出现，存活率 100 %，之后随着保活时间的延长存活率有所下降。对比 3个保活温度，4℃下保活牡蛎的存活率最高，15 ℃下存活率最低；保活 9 d 后 4℃、10 ℃和 15℃条 件下保活的牡蛎存活率分别为 95 %、93 %和 88 %。4℃接近于牡蛎的生态冰温 [7]，在此温度下牡蛎处 于休眠或者半休眠状态，代谢活动比较微弱，可以 较长时间保持其生命活力；随着温度升高，牡蛎的 新陈代谢逐渐增强，能耗增大，在没有食物供给的 情况下，死亡率逐渐增大。本实验保活条件下香港 牡蛎的存活率远高于郭晓伟等 [11]对太平洋牡蛎冰 温条件下的存活率（保活 9 d 后存活率 50 %），该 研究中牡蛎外壳包裹保鲜膜可能影响到牡蛎的存 活。其他双壳贝类保活研究中，海湾扇贝 （Argopecten irradias ）在 4℃条件下无水保活 10 d 后存活率可以达到 91%[12]；菲律宾帘蛤（R. philippinarum ）4℃下半干保活可以存活 9d 以上 （以 LT50计），而在 22 ℃条件下只可存活 1 d （以 LT50计）[12]。可见，双壳贝类的存活率与保活温 度关系很大。因此，在实际生产过程中，牡蛎销售 商根据保活时间选择保活温度，对短途运输的牡蛎 只是加冰覆盖后常温运输，而运输时间较长的线路 宜采用恒温车低温运输。 2.2 不同保活温度对牡蛎菌落总数和大肠菌群的 影响 贝类净化是将滤食性的双壳贝类放在一个洁 净的水环境中，使之张壳，排除致病微生物和泥沙 的过程。一方面是使水产生物肠道排空，防止运输 途中产生有毒排泄物的积累而污染水质；另一方面 是对其进行驯冷化，使其降低新陈代谢，从而适应 低温运输 [14-15]。贝类净化的效果与其水泵运动 （water-pumping activity ）有关，有报道海湾牡蛎（C. virginica ）和太平洋牡蛎（C. gigas ）会随着净化温 度的提高而增加水泵运动次数，而且夏天采收的牡 蛎会比其他季节采收的牡蛎含有较少的副溶血性 弧菌 [16-17]。考虑以上原因及课题组前期研究结果 [7]，本试验采用 20℃杀菌海水进行牡蛎净化。 天然海水经紫外和臭氧杀菌，取 25 mL 杀菌海 水按 1.3.4方法测定大肠菌群数和菌落总数，结果 显示杀菌后海水中的菌落总数为 23 CFU/mL ，大肠 菌群未检出。在 20℃恒温条件下牡蛎在循环海水 中净化 24 h ，牡蛎肉的菌落总数由净化前的 4.2×105 CFU/g 降低为 2.2×104 CFU/g ，净化前后均符合国际 微生物标准委员会对新鲜双壳贝类的微生物限量 标准（菌落总数的限量为 5×105 CFU/g ）[18]。将净 化后的牡蛎分装在泡沫箱中于不同温度条件下进 行无水保活，不同保活温度和时间对牡蛎的菌落总 数和大肠菌群数的影响分别如图 2、3所示。 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05） 图 2 不同温度条件下无水保活过程中牡蛎菌落总数的变化 Fig. 2 Changes of total bacterial count in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperatures 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05） 图 3 不同温度条件下无水保活过程中大肠菌群数的变化 Fig. 3 Changes of the number of coliform group in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperatures 从图 2可见，牡蛎在 4 d 内所有组菌落总数变 化无显著性差异（P > 0.05），5 d 后 15℃下保活组 的菌落总数增长速率显著快于 4℃下保活组（P <0.05），6 d 后 10℃和 15 ℃保活组的菌落总数增长 速率均高于 4℃保活组（P < 0.05）。4 ℃保活组在 6d 后菌落总数急剧上升，超过了上述微生物限量 标准（5×105 CFU/g ），在 7 d 时达到 1.8×106 CFU/g 。图 3大肠菌群数数据显示，牡蛎在 10℃和 15 ℃条件下大肠菌群数均高于 4℃保活组，且在 3 ~ 7 d 时均呈现显著性差异（P < 0.05）。说明保活过程中 牡蛎的微生物含量与牡蛎保活温度和存活率有很 大关系。参考图 1存活率数据，牡蛎在 4℃、10 ℃和 15℃条件下分别保活 6 d 、4 d 和 3 d 后存活率 均低于 96 %，当死贝数量增加到一定程度会严重影 响同一包装箱内其他牡蛎的微生物数量，进而影响 其他牡蛎的存活状况，而冰温对有害微生物生长及 各种酶的活性具有明显的抑制作用，有利于贝类长 时间保活 [19-20]。 2.3 不同保活温度对牡蛎基本营养成分含量的影响 不同温度无水保活的牡蛎，在保活阶段每天取 样测定其水分、粗蛋白、粗脂肪、糖原、乳酸的含 量。由图 4可见，样品牡蛎含水量较高，保活之初 水分质量分数为 83.8%（以干基计），在保活前期保 持稳定，4 d 后稍有下降；保活 9 d 后牡蛎可食部分 的水分质量分数仍然高于 82.0 %，较保活之初下降 了 2.1%，而保活温度对牡蛎水分含量影响也不大 （P > 0.05）。研究报道，海湾扇贝在低温无水保活 20 d 后水分含量仅下降了 1.1%[21]。双壳贝类在在低 温密闭的保湿环境下水分含量损失较小，一是可能 因为加冰和加盖保持了相对恒定的湿度、温度和氧 气，导致贝类的代谢降低，有利于贝类在无水环境 中敞壳获得氧气 [22]；二是可能因为贝类在低温无水 保活过程中自身代谢消耗水分较少，随着保活时间 延长，死亡率增大，体液损失增多造成水分含量减 少 [23]。 85 图 4 不同温度无水保活过程中香港牡蛎体内水分含量的变化 Fig. 4 Changes of moisture in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperatures 图 5是保活过程中牡蛎粗蛋白含量（以干基计）的变化趋势。保活 2 d 内，粗蛋白含量无显著性变 化（P > 0.05），5 d 后粗蛋白含量平缓下降，10 ℃保活组蛋白质含量与 4 ℃、15℃存在显著性差异 （P < 0.05），保活 9 d 后粗蛋白含量下降约 10%。牡蛎在无水保活过程中没有食物来源，主要利用自 身供能物质来维持生命 [24]，但作为供能物质之一的 粗蛋白消耗并不大，由此推断香港牡蛎在保活过程 中的主要供能物质不是蛋白质。 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05）；以干基计 图 5 不同温度无水保活过程中香港牡蛎体内粗蛋白含量 的变化 Fig. 5 Changes of crude protein in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperature 随着保活时间的延长，香港牡蛎粗脂肪含量 （干基）呈下降趋势。在保活 2 ~ 9 d 内（除 5 d 时），10℃组牡蛎脂肪含量显著小于 4℃保活组（P <0.05）；在保活 6 ~ 8 d 内，10℃组牡蛎脂肪含量与 15℃保活组存在显著性差异（P < 0.05）。与保活前 相比，4℃组保活 9 d 后，牡蛎粗脂肪含量下降了 14.8%，10℃组和 15℃组分别下降了 40.4%和 34.1%（图 6）。说明粗脂肪是牡蛎在生态冰温保活 条件下的主要供能物质之一，温度越高，牡蛎代谢 越旺盛，能量需求越高，所以脂肪消耗越多。文蛤 和波纹巴非蛤均被证明以脂肪和碳水化合物为主 要供能物质 [25-26]。 糖原是贝类的主要能源贮藏形式，在没有食物 供给的条件下，为了维持其生命活动，糖原首先被 大量消耗，糖原的水平可反映贝类在胁迫条件下维 持其基本生存和应对持续的胁迫因素的能力 [27]。图 7是香港牡蛎无水保活过程中糖原含量变化趋势。在保活过程中牡蛎糖原含量逐渐下降，4℃条件下 保活 9d 后糖原由保活初期的 48.5 mg/g 降低至 36.1mg/g ，降低了 25.5%，而 10℃和 15℃条件 下则降低了约 41.0%；在保活 3 ~ 9 d 内，4℃保活 牡蛎的糖原含量显著高于 10℃和 15℃条件下牡 蛎糖原含量（P < 0.05），可见糖原是香港牡蛎在无 水保活条件下除脂肪外的另一主要供能物质，而 且，保活温度越高，牡蛎自身需要耗能也越高。 10 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05）；以干基计 图 6 不同温度无水保活过程中香港牡蛎体内粗脂肪含量的变化 Fig. 6 Changes of crude lipid in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperature 60 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05）；以干基计 图 7 不同温度无水保活过程中香港牡蛎体内糖原含量的变化 Fig. 7 Changes of glycogen in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperature 由图 8可知，牡蛎在三种温度保活过程中乳酸 含量呈上升趋势，除 4 d 时外，保活 1~9 d 内 4℃保活牡蛎的乳酸含量均显著低于 15℃条件下牡蛎 乳酸含量（P < 0.05）。4 ℃下保活 9 d ，乳酸含量由 10.08 μmol/g 上升到 24.31 μmol/g ，增加了 141.2%，15℃下则增加了 176.2%。由此可见，相比于蛋白 质的消耗，香港牡蛎在无水保活过程中消耗更多的 脂肪和糖原。波纹巴非蛤在 15℃条件下保活 5 d 后，粗蛋白、粗脂肪和糖原分别下降了 10.5%、20.0%和 31.0%，而乳酸含量上升 50.1%[26]。 凡含一个相同字母表示差异不显著（P ＞0.05）；以干基计 图 8 不同温度无水保活过程中香港牡蛎体内乳酸含量的变化 Fig. 8 Changes of lactic acid in Crassostrea hongkongensis during waterless keep alive at different temperature 将乳酸含量的变化曲线与糖原含量的变化曲 线相比较，可以看出，乳酸含量的变化曲线与糖原 含量的变化曲线呈负相关，即随着糖原含量的下 降，乳酸含量上升。在低温无水保活过程中，牡蛎 进行无氧呼吸，糖原代谢产生大量乳酸，因此在体 内的含量呈上升趋势 [28]。 3 讨论与结论 香港牡蛎是华南地区的主要养殖品种，其营养 丰富，具有高蛋白低脂肪等特点。近年来随着消费 模式的改变，越来越多的人通过电商途径购买鲜活 牡蛎，本研究模拟了当前国内电商运输及短途运输 温度（4℃、10℃和 15 ℃）条件，并对该条件下 无水保活过程中香港牡蛎的存活率、微生物数量以 及主要营养成分含量的变化进行研究。 在 3种实验温度条件下，香港牡蛎保活 2 d 内 均无死贝出现，4℃下保活 9 d 后存活率仍然达到 95%，存活率高于其他 2个温度。在保活前期，牡 蛎菌落总数与大肠菌群数变化不大，在 4℃保活 6d ，10℃保活 5 d 和 15 ℃保活 4 d 后微生物数量急 剧上升，超过了国际微生物标准委员会对新鲜双壳 贝类的微生物限量标准，可见，牡蛎保活过程中微 生物数量与存活率有很大关系。 在无水保活过程中，牡蛎的水分含量变化不 大，随着保活时间的延长，蛋白质含量稍有下降， 而脂肪含量和糖原含量则消耗较多，与 4℃相比，10℃和 15℃条件下保活的牡蛎脂肪和糖原的消 耗更多，可见，脂肪与糖原是牡蛎更重要的供能物 质。在牡蛎无水保活过程中，伴随着无氧呼吸，脂 肪与糖原含量逐渐降低，乳酸上升，随之造成牡蛎 风味的变化，因此在食用放置较久的牡蛎时会感觉 到肥美度、鲜甜度以及口感均低于新鲜牡蛎。 本研究可为牡蛎保活运输提供一些基础数 据，根据牡蛎的存活率、微生物数量以及营养物 质等的变化可以选择更加合适的运输条件及保活 时间。 在实际运输过程中会有颠簸与磕碰等现象，造成牡蛎死亡率上升，从而引起牡蛎微生物及其 他生理生化物质的变化，为更客观反映牡蛎冷链 流通过程中品质特征，建立牡蛎品质评价及安全 控制体系，现实生产运输条件下牡蛎的存活率、微生物数量、营养物质以及风味物质的变化有待 进一步研究。 参考文献 [1] 农业农村部渔业渔政管理局 ,全国水产技术推广总站 ,中国水产学会 .中国渔业统计年鉴 -2019[M].北京 :中 国农业出版社 , 2019: 23 [2] SKUDLAREK J G, COYLE S D, BRIGHT L A, et al. 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