碱性药物中毛细管电色谱分析检测方案

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毛细管电色谱分析碱性药物 摘要： 本研究应用毛细管电色谱(CEC)使用商业化的硅胶固定相和含水流动相分离一系列的碱性药物。流动相的组成、缓冲液的 PH值、电压、缓冲液的负离子对这些碱性药物的保留时间的影响都进行了研究。在PH为7.8时，得到了理想的图谱，但是发现重现性极差。然而，在PH为2.3时，获得了这些碱性药物的良好的、可重现的图谱。 我们先前证明了低的 PH值下，使用反相填充材料，在流动相中加入添加剂诸如磷酸三乙醇胺可得到极好的 CEC分析碱性药物的效果。在相同的条件下，使用硅胶固定相分离这些药物，是为了改善峰的形状，获得了极好的如苄胺、去甲替林和苯海拉明等碱性药物的图谱。 实验显示了用CEC分离碱性药物能很容易地获得极好的峰形和高达3.2万理论塔板数/米 关键词：毛细管电色谱，碱性药物，硅胶固定相，含水流动相 介 绍： 毛细管电色谱(CEC)结合了液相色谱(LC)和毛细管电泳(CE)的优势，是一种可用于复杂混合物分离的一种多功能的、高效的色谱技术。 到现在为止，已发表了许多CEC应用的研究结果，但这些都局限在中性和酸性化合物的范围内。然而，用反相填料分离碱性药物时，峰有严重拖尾，缘于疏水性作用和离子交换机制的共同作用。 一个成功的、可重复的方法是使用了诸如三乙胺或九胺的流动相添加剂。这些小的简单化合物被混入流动相，通过竞争的方式以避免分析物同硅烷基间的反应作用。这些添加剂的使用产生了高效分离，改善了峰形，并能同时分析酸性、简单的和中性化合物。过去，硅胶柱常在反相条件下同流动相添加剂一起被用于高效液相分离碱性药物，同使用标准的反相条件相比，使用这种条件明显地提高柱效和重现性。硅胶固定相和含水流动相用于碱性药物的分析未能得到广泛的接受，可能由于大量的反相固定相降低了硅烷基的活性和硅胶固定相缺乏反相特性。 表面硅烷基的酸性不同，或者说表面硅烷基的统一性不同导致了碱性物质严重的峰拖尾现象，因为不同的分析物/硅烷基间吸附/脱附的比例。因此使用非常纯的硅胶，，1可产生同性质的硅烷基，从而降低混合分离机制的影响，对硅胶和反相固定相均有利。最近，大家都热衷于在CEC分析碱性药物时使用硅胶固定相，且这些有限的报道都得到了预期的结果。 在这篇报道中，我们研究了使用商业的硅胶固定相，含水流动相，加入和不加入流动相添加剂两种情况下， CEC分析一系列碱性药物的效果。并在相同条件下，同毛细管电泳(CE)分析，最后对两种技术得出的结果进行比较。 另外，使用填充的CEC柱，用 u-LC 进行分析，以获得在相同条件下三种技术的选择性的比较。 实 验： 材料： 去甲替林、4-羟基苯酸、苯海拉明、羟甲基甲胺(TRIS )和2-(N-吗啉)-乙烷磺酸( MES ) 从 Sigma 化工公司( Poole， UK ) 获得，苄胺和普鲁卡因胺从 Fluka (Poole， UK)获得，咖啡因和硫脲从Aldrich 化工公司( Poole，UK ) 获得，叔丁喘宁和AZ 代表药物从 AZ 混合物库获得。这些碱性药物(由于保密的需要，代表药物的结构未给出)、4-羟基苯酸、咖啡因的结构和他们各自的pKa值已在图1中给出。 磷酸氢二钠、正磷酸、三氟醋酸、三乙胺和三乙醇胺由 Fisher 科技公司 (Loughborough，UK)提供，乙腈(试剂级)从Romil (Cambridge，UK)采购，水的纯化通过一台 Milli-Q Plus 系统( Waters SA，St Quentin， France)。所有流动相在使用前均通过一个0.2um过滤器过滤(Aerodisc， Gelman Science Ltd，Northampton，UK)，并经超声波超声脱气。 图1 毛细管电色谱： CEC前面已描述过，由通微公司制造的CEC柱从 Hichrom 公司获得( Reading，UK )，用3um的硅胶颗粒填充33cm 长(有效长度25cm)， 内径100um。从 Hichrom 公司获得惠普公司制造的的CEC柱由3um的 Hypersil C18 和 Hypersil 固定相颗粒填充，柱长33cm(有效长度 25cm)， 内径100um。Hypersil C18 和 Hypersil 固定相填料仅用于对比的目的。使用前，填充柱先在柱子进口和出口间加上15KV的电压和8巴的压力，用合适的流动相冲洗一个小时，或者加入流动相添加剂冲洗两个小时。柱套保持在15℃，柱内压力保持在8巴。所有溶质( 10ug/ml 和100ug/ml的微量浓度)均溶在乙腈和水(1：1v/v)中.所有进样均在15KV 下进行，在214nm波长处检测。流动相组成包括乙腈混入不同比例的50mM缓冲液、水和改性剂。基线干扰用于测量流动相滞留时间，这些数字可用于计算电渗流(EOF)。 一台原装 HP3 CE 系统 ( Hewlett Packard， Waldbronm， Germany )用于使用CEC柱进行 u-LC 实验。在所有使用 u-LC 的实验中提供的电压是相同的。其他条件与CEC实验条件相同。 结 果 和 讨寸论： 流动相 PH 值对电渗流的影响： 图2显示了 PH 值对有硅胶固定相产生的电渗流的影响。EOF随着 PH 值的下降而下降。可以推断电渗流主要来源于被电离的表面硅烷基。因此从这些硅胶产生的低EOF，可以明显地看出表面的硅烷基的酸化程度不高。当把硅胶产生的EOF形状同被认为含有高比例酸性硅烷基的 CEC Hypersil C18 固定相产生的EOF形状相比较，证明了前面的推测。高酸性硅烷基在反相色谱中被认为是不利的，因为附带的离子交换机制。这些酸式硅烷基的减少，对CEC分析物质是有利的。产生的低电渗流对分析来说，不是问题，因为它们本身的电泳特性将会驱动它们通过毛细管。 流动相 PH 值对碱性药物分离的影响： 图3显示了流动相包含PH 值为7.8的缓冲液时碱性药物分析的结果，获得了对称的峰和高达20万理论塔板数/米，不幸的是，发现分析是不可重现的，并且有些时候会产生峰裂。这种现象同在SCX柱上分离这些物质得到的现象相似。在PH值为7.8时硅烷基的离子化程度最高，因此硅胶的离子交换能力也最强。我们也观察到随着重复进样，分析物的洗脱时间会增加。 Buffer pH 图2 图3 缓冲液的 PH 值被降到2.3以抑制硅烷基的离子化，发现碱性物质的分离是可重现的，图4显示了一个样品的分离图谱。尽管重现性增加了，但柱效和峰形同 PH为7.8时相比都差。重现性的增加可能由于在低的PH 值下，固定相的离子交换能力较差，离子交换机制对保留机制的影响很小。尽管PH值为7.8时比2.3时具有更高的EOF，因此长的洗脱时间是由于离子交换行为的影响。在 PH值为7.8和2.3时，洗脱次序是不同的，表明了在这两种不同PH值下的保留机制是不同的。由于所有的碱性药物均在t0前被洗脱，所以其他的保留机 图4 制，如电渗流和吸收起到了一个重要的作用，而离子交换机制被最小化了。 表1在50mM PO4，PH2.3和 150mM TEA-PO4，PH2.5条件下硅胶柱分离的色谱值 碱性物质 理论塔板数/25cm柱50mM PO4， PH2.3 理论仑板数/25cm 柱 150mMTEA-PO4，PH2.5 苄胺 1770 2061 叔丁喘宁 9305 19730 AZ 药品代表物 4596 41536 普鲁卡因胺 574 4657 苯海拉明 629 12161 去甲替林 1133 13384 表2不同流动相条件下用硅胶和苯基固定相CEC、CE 和u-LC分离碱性物质的洗脱次序 B-苄胺 P-普鲁卡因胺安TT-叔丁喘宁 D-苯海拉明 A-AZ 药品代表物 N- 去甲替林 10mM PO4， PH2.3 30mM TEA-PO4， PH2.5 10mM TEOA-PO4， PH2.5 10mM TeOA-TFAc ， PH2.5 CEC u-LC CE 苯基CEC CEC u-LC CE 苯基CEC CEC u-LC CE 苯基CEC CEC u-LC CE B A B B B T B B B B B B B N B N N N T D B D T N N N D A D D T D P N P T P D D D D N D N A D P A T A N A A A P A A T T T B A D A D A D T T A T T&P B A P P T N P N P N P P T P P P 表3在甲甲：50Mm TEOA-PO4， PH2.5：水(70：20：10)条件下碱性药物的电泳淌度 碱性物质 电泳淌度u.cm *V *s 苄胺 3.17×10 叔丁喘宁 2.56×10 AZ 药品代表物 2.73×10 普鲁卡因按 2.87×10 苯海拉明 3.09×10-4 去甲替林 2.95×10 流动相中竞争物质的使用： 在 PH值为2.3时出现的峰拖尾现象表明了原碱性物质同酸性硅烷基间的反应仍旧存在。为了减少这种反应，竞争物质被加入流动相中。先前的研究表明了 PH为2.5时，磷酸三乙胺(TEA)在浓度为150mM是最有效的添加剂。 PH为2.3时，磷酸三乙被被用于流动相中以取代磷酸二氢钠缓冲液。流动相添加剂的使用能改善色谱的效果(表1显示了它们的比较)。当使用磷酸三乙胺时同非有机缓冲液相比，电渗流降低了，各自的值为0.33mm/s、0.46mm/s。使用流动相添加剂获得的改善的峰形表明了甚至在PH 为2.3时，产生一些酸性硅烷基是有可能的。在使用流动相添加剂时，观察到大碱性物质的洗脱时间比较短。 同时分析酸性、碱性和中性化合物： 图5显示了用CEC同时分析一个酸性、中性和碱性成分。在 PH为2.5时，碱性(去甲替林)、中性(咖啡因)和酸性(4-羟基苯酸)成分的分离获得了极高的柱效和对称的峰形。使用这种方法，酸性组分由于在离子抑制方式条件下，于EOF后面洗脱。中性组分也于EOF后洗脱，中性组分通过他们在流动相和固定相间的分配不同而分离。与之相反，碱性组分由于他们的带电特性，先于EOF洗脱出。可 图 5 以预见的是，， PH为2.5时，使用磷酸三乙胺会导致EOF的降低，因此在适合的时间内很难分离这些成 分，因为酸性和中性组分均在EOF后被洗脱。在 PH为2.5、使用反相材料和磷酸三乙醇胺条件下进行流动相添加剂的研究，发现使用磷酸三乙胺会产生少的硅烷基。因此磷酸三乙醇胺的使用会产生更大的电渗流，容许分离在一个更适合的时间内进行。 实验发现 PH为2.5时，分离去甲替林使用50mM 低浓度的磷酸三乙醇胺比150mM 磷酸三乙胺得到更好的对称峰和更高的柱效。这表明了磷酸三乙醇胺和磷酸三乙胺的使用同游离硅相比会产生大量的同质的硅烷基。然而这两种添加剂所产生的活动的表面不同，导致了他们用于分离碱性物质时洗脱次序的不同(表2示)。 磷酸三乙醇胺流动相中乙腈浓度的影响： 在用CEC分析碱性物质时，发现使用磷酸三乙醇胺会得到极好的谱图。然而更进一步的研究表明，使分离碱性物质， 用60%的乙腈流动相不能为了提高碱性物质的分辨中乙腈的含量以保持电离了分离碱性物质，洗脱时的关系。随着乙腈浓度的的保留时间增加，表明了制的作用。数据的分析得乙腈浓度的增加会增加分的研究表明，当乙腈浓度 图6 率，改变流动相强度。图6显示间同乙腈浓度间降低，碱性物质一个反相分离机出了在流动相中辨率。然而后来大于70%时，不 溶于磷酸盐缓冲液。我们观察到改变乙腈浓度产生的选择性的改变，但未能获得五种物质的基线分离。正如所预见的， EOF也会随着乙腈浓度的降低而降低，但幅度较小。 所加电压的影响： 正如所预见的，选择性不变时， EOF也会随着电压的降低而降低(从25KV时的0.45mm/s到5KV时的0.09mm/s)，且碱性物质的洗脱时间也会相关地下降，在20KV时获得最大的柱效和分辨率。图7给出了包含六种碱性物质组分的混合物的电色谱图谱。苄胺相比于其他的药物成分，峰形很小，可能由于它的高的电渗流。 图7 三氟醋酸三乙醇胺流动相中乙腈浓度的影响： 正如前面所描述的，降低乙腈浓度和电压不能使所有碱性物质基线分离。然而，先前的研究也表明了增加流动相中有机物的浓度会增加分辨率。三氟醋酸 (TFA)被用来代替正磷酸调节 TEOA溶剂的 PH值，由于高浓度的乙腈不溶于正磷酸。 增加流动相中乙腈浓度可减少洗脱时间，表明了可能存在一个反相机制。当使用磷酸三乙醇胺时， 选 择性随着乙腈浓度变化而变化(图8)。在含有75%或80%的乙腈流动相中加入TFA会得导六种药物成分完整的基线分离，如图9示。 →+-Benzylamine 一番- Terbutaline -AZ drug candidate .·Procainamide -xDiphenhydramine +- Nortriptyline 图8 图9 苄胺的峰仍旧很小，可能由于它相比于其他组分的更高的电渗流。 在相同的条件下，仅仅缓冲液的负离子不同，这些组分分离洗脱的次序也不同。而且整个分离的时间也更短。需要说明的是，由缓冲液中离子的变化导致选择性的不同在 CE 中也是一个值得注意的现象。 药物组分的毛细管电泳分离： 为了证明在相同条件下用CEC和 CE 分离药物组分是否能获得相同的洗脱次序，我们使用三氟醋酸三乙醇胺作为流动相添加剂进行了实验。。 CE 分析使用了和CEC分析相同浓度的乙腈，结果如图10所示。总 之，所有的组分在使用CE 分析时均存在峰拖尾现象，除了苄胺，它存在严重的前峰。分离的柱效非常低，为2000-26000理论塔板数/25cm。当使用CEC时，柱效为200-85000 理论塔板数/25cm。先前的研究表明了在PH值为2.5 (线性流速-0.28mm/s)，磷酸三乙醇胺作为流动相添加剂，用 CE 分离可以测得to。最近，研究人员使用TFA作为流动相添加剂，发现 CE 比CEC的to更小。 图10 表2显示了CEC、CE 和 u-LC 三种技术分离药物组分时的洗脱次序的不同( u-LC得出的洗脱次序仅用于比较)。在CEC中，被分析物质同固定相间存在吸附作用，因此药物组分并不仅仅是由他们的电渗流不同而分离。 硅胶上的保留机制： 从这篇报道可以很清楚地知道CEC硅胶柱分析药物组分的机制是复杂的，正如最初魏提出的。比较CEC、CE 和 u-LC 得出的结果(表2)，可以假设包含以下的机制：反相、离子交换、吸收和电渗流。在不加入流动相添加剂时，从分离的低柱效来看，保留机制可能包括阳离子交换，另外外有吸收和电渗流。 在加入流动相添加剂时，电渗流在保留机制中起到一个重要的作用，因为酸性硅烷基导致了更快的分离。随着加入如TFA等流动相添加剂。分离机制被认为是电渗流、吸收和反相的共同作用。随着加入更多的流动相添加剂，如TEOA， 分离机制被认为同硅胶本身相同。当替换缓冲液的负离子时，选择性发 生改变，这可能由于缓冲液负离子改变了各个分离机制间的平衡。CEC分析药物组分时，无论是用反相柱，还是硅胶柱，改变缓冲液的浓度都不会引起洗脱次序的改变。现在的研究主要集中在不同分离机制的相对重要性以及对整个分离机制的贡献，发现将会在晚一点时间发表。 ( 结 论： ) 这项研究描述了用商业化的CEC硅胶柱成功地分离药物组分。PH为2.5时，在流动相中加入竞争物质可获得极好的色谱图谱，优于商业的反相填充材料，即使也加入流动相添加剂。 如先前所描述的，这种方法能够在一次运行中分析酸性、碱性和中性化合物，并得到极好的结果。也能获得六种药物组分快速的基线分离，并有很好的分辨率和极高的柱效。 药物组分在硅胶上的保留是很复杂的，且很多机制被认为对整个保留机制都有影响。结果证明药物组分仅仅依靠电渗流是不能洗脱的，还有固定相的作用。这篇论文研究了流动相添加剂和硅胶的使用，用CEC分析药物组分也能获得极高的柱效和对称的峰形。