细胞采集、培养、保存规程

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动物种质资源体细胞采集、培养、保存规程 本规程适用于动物种质资源体细胞采集、培养、保存及其相关操作。由于细胞培养技术内容非常丰富，本规程仅对其中最主要的部分做了基本的规范。在实际操作过程中，在此规程的基础上，一些实验技术的细节，还需参照相关的权威性的参考书，并根据本实验室的具体情况加以灵活运用。 培养室内的无菌操作 细胞培养实验所需的物品、器材应进行严格的灭菌或购买无菌的一次性物品。玻璃瓶可拧松瓶盖灭菌（指高压蒸汽灭菌，以下同）或用铝箔纸包住瓶口，和瓶盖分别灭菌。其它玻璃和金属器材用铝箔纸包裹进行灭菌。玻璃吸管应塞上棉花球灭菌，然后置于烘箱中烘干。不适于进行高压灭菌的瓶塞等其它物品，可浸泡在70%酒精中进行灭菌，然后在超净工作台上吹干。细胞培养液和其它不适于高压灭菌的溶液，应通过过滤（采用0.22μm的孔径的滤膜）灭菌。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖地面一次，并用紫外线照射灭菌30分钟。超净工作台每次使用前用70%酒精擦拭，然后紫外线照射30分钟。 进入无菌操作室要求穿着无菌工作服、工作帽、口罩。开始工作前用70%酒精对手、前臂及乳胶手套进行消毒。细胞培养等操作应在超净工作台或有空气过滤器的空间内进行。操作前点燃酒精灯，细胞培养的所有操作，如打开或关上试管或培养瓶盖等，都要靠近酒精灯并经过短时间的灼烧。烧过的实验器械，冷却后才能使用。已吸过培养液或其它有机液体的吸管不得再用火焰烧灼。不同液体分别用不同的吸管吸取，不能混用。开盖后的培养瓶尽量避免垂直放置，同时瓶盖应扣放在超净工作台上，以减少落入细菌的机会。细胞培养物在处理和使用前，不要过早暴露于空气中。在进行转移液体操作时，移液器不能触及瓶口以避免细菌污染或交叉污染。放置吸管时管口向下倾斜，以防止液体倒流引起污染。培养细胞的废弃用品，应放入可封装的容器内。 细胞培养样品的采集 器材与试剂：1.眼科剪，弯镊子、手术刀；2.装有无血清培养液或PBS（KCl,2.7mM;KH2PO4,1.5mM;NaCl 136.9mM;Na2HPO4, 8.1mM）的小瓶； 3.10ml、50ml小烧杯；4. 培养皿。 操作步骤： 1. 采样时应严格无菌操作。采样时应用已灭菌的器械、无菌包装的器皿和经过滤灭菌的缓冲溶液和培养液。采样过程中尽量避免紫外线照射和接触对细胞有毒害作用的化学试剂。在有污染因素存在的区域采样时，应将样品在含有500-1000U/ml的青、链霉素的PBS中漂洗3次，每次1-2分钟。 2. 在条件允许的情况下，宜采细胞易存活、增殖速度快的胚胎组织。 3. 采样时应用锋利的器械切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 4. 采样时应切除采样组织外的其它成份，如附着在采样组织上的血液、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织。修剪和切碎过程中，应将样品浸泡于少量培养液中，以避免组织干燥。 5. 采取的样品应尽快培养。因故不能立即培养时，应将样品切成1cm3以下的小块，浸泡于培养液内，置于冰浴或4℃冰箱中。时间不能超过2小时。 6. 采样的同时要留好组织学标本和电镜标本，以便于以后鉴别原代组织的来源和观察细胞体外培养后与原组织的差异性。对样品的来源、供体的一般情况（包括性别、年龄、健康状况等）要做详细的记录以备查询（见附表1）。 细胞的原代培养 器材与试剂：1.离心机，眼科剪，牙科探针;2.培养瓶（皿），吸管，小烧杯；3.PBS缓冲液，细胞培养液。 操作步骤： 1． 对于样品量较少的组织，采用组织块培养法。 即将组织剪成小块后接种于培养瓶（皿）。具体操作规程如下： 1.1 将样品切成1mm3左右的小块。在剪切过程中，向样品滴加少量培养液，以保持样品湿润。 1.2 将剪切好的组织小块，用眼科镊子送入培养瓶（皿）内，用牙科探针或弯头镊子将组织块在瓶壁上均匀摆置，小块间距0.5cm左右。轻轻将培养瓶翻转，让放置样品的瓶壁朝上，向瓶内注入适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置入二氧化碳培养箱中。 1.3 放置3小时后，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，拧松瓶盖，静置培养。原代培养第4天时换液一次。 2 对大量样品的培养，宜采用组织分离的方法培养。 2.1组织的分离 2.1.2 培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，采用离心法分离。用小型台式离心机1000 rpm（约110-120G的离心力）离心5分钟（以下离心条件同），去除上清液。 2.1.3 对一些纤维成份很少的组织（如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织）进行分离处理时，在细胞培养液内用剪刀剪切后用吸管反复吹打分散细胞；或将样品挤压通过不锈钢网(孔径在80目以上)的方法进行分离。离心过滤液，收集细胞。去除上清液。 2.1.4 对于不适于上述两种方法分离的样品，采用消化分离方法，即将剪切成较小体积的组织块通过胰蛋白酶或胶原酶消化进行进一步的分散。对细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织宜使用胰蛋白酶。在进行消化时，用0.25%的胰蛋白酶，pH8的条件下在37℃消化20分钟。对胰蛋白酶耐受性差的样品，消化期间应通过显微镜随时观察消化情况，采用分次消化，及时把已消化分离下来的细胞与组织分开，放入含有血清的培养液中，更换消化液后再继续消化。对于纤维性组织、上皮及癌组织宜使用胶原酶进行消化分离。消化时采用0.2μg/ml的胶原酶溶液37℃条件下消化4-48小时，可根据细胞分散的程度而定。在消化分离法中，随时吸取少量消化液在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化。通过孔径适当的筛网，滤掉未消化的样品块。已过滤的消化液1000 rpm离心5分钟，去除上清，加含10%血清的培养液，轻轻吹打形成细胞悬浮液，再次离心，去除上清液。 2.2 加入含20%血清的细胞培养液，轻轻吸打离心后收集到的细胞，使之分散均匀。进行细胞计数，然后接种到含20%血清的细胞培养液的培养瓶（皿）中，松松盖上瓶盖，放入二氧化碳培养箱内培养。 2.3原代培养第4天时换液一次。 2.4对细胞原代培养所用试剂和主要参数进行记录（见附表1） 传代培养 器材与试剂：1.离心机、滴管、离心管、培养瓶（培养皿）、计数板;2.0.05% ～ 0.25% 胰蛋白酶消化液(溶液中含0.05% ～0.25%的胰蛋白酶,其它成份与PBS同)，细胞培养液*，PBS缓冲液。 * 根据细胞种类不同选择适当的细胞培养液。各主要类型的细胞培基（液）都已商品化，可在国内外生物制剂公司买到。有时需在商品化的细胞培基（液）中加入一些其它营养物质或生长因子以满足一些特殊细胞种类的生长需要。 操作步骤： 1．贴壁生长的细胞的传代培养 1.1 当原代培养后的细胞增殖至整个瓶（皿）壁被细胞覆盖时（贴壁生长的细胞），弃去旧培养液。加入适量PBS缓冲液（5ml培养瓶加入2ml缓冲液），轻轻摇动培养瓶（皿），使缓冲液流过所有细胞表面。倒掉缓冲液，加入适量0.25%胰蛋白酶溶液（5ml培养瓶加入2ml胰蛋白酶溶液）。 1.2 在37℃条件下消化3-5分钟，随时观察消化情况。当细胞质回缩、细胞间隙增大或有细胞悬浮时，加入含10%血清的培养液，终止消化。 1.3 用弯头吸管吸取瓶（皿）内的培养液，反复轻柔吹打瓶（皿）壁，使细胞脱离瓶（皿）壁后悬浮于培养液中。 1.4 离心，弃上清液，用含10%血清的培养液重新悬浮细胞。 1.5 计数，分别接种在新的含10%血清的培养液的培养瓶（皿）内。 1.6 当培养液的颜色呈黄色时（pH值下降），需要更换新的培养液。 1.7 当细胞增殖至整个瓶（皿）壁时，需再次传代培养。 2. 悬浮生长的细胞的传代培养 2.1 将细胞同培养液一起转移到离心管内，离心。 2.2 弃上清液，加入新的培养液，用吸管吹打使之形成细胞悬浮液。 2.3 对细胞进行计数和重新接种, 细胞的接种数量可从5×104～8×105 个/ml。 2.4当培养液的颜色呈黄色时（pH值下降），需要进行换液。 2.5 当细胞增殖至覆盖培养液表面时，需再次传代培养。 3. 对得到的细胞系进行鉴定和命名。通过对所培养细胞的核型、同功酶、细胞表面抗原、细胞骨架、DNA的分析，以对细胞的物种、组织来源以及细胞是否发生转化、有无交叉污染、有无遗传不稳定倾向等进行鉴定。细胞系的命名宜采用4级命名法，即中文名由采样的物种、品种、采样组织、细胞系编号（用阿拉伯数字表示）组成；其缩写名则由物种英文名称的头两个字首、品种、采样组织的英文的字首及细胞系编号组成。如从丝毛乌骨鸡胚胎组织采样所建立的成纤维细胞系1，其中文名为“丝毛乌骨鸡胚胎成纤维细胞系1”，缩写名为“ChSE1”。 4．多种细胞同时分别传代培养时，操作时应小心仔细。为防止不同细胞系间的交叉污染，超净工作台中一次只进行一种细胞系的操作 5．培养箱中的细胞应经常置于显微镜下观察，每周至少两次，以检查细胞是否生长正常和有无污染出现。 6．细胞传代或更换培养液需要做记录（见附表2和附表3）。记录的内容包括组织的来源，生物学特性，培养液类型，传代、换液的时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态等。 细胞的保存（冻存） 器材与试剂：1.0.25%胰蛋白酶;2.含10% ～ 20% 的血清培养液；3.细胞冻存液（10% DMSO或经高压（15磅）灭菌的甘油，20%血清，70%细胞培养液）；4.吸管、离心管、冻存管。 操作步骤： 1. 选择培养至对数生长期的细胞（生长旺盛但尚未形成致密的单层细胞、长满培养瓶（皿）以前）进行冻存。在冻存前一天换一次培养液。 2. 按照传代的方法用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，计数，离心收集细胞。 3. 弃去上清液，加入配制好的细胞冻存液，冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml。用吸管轻轻将细胞吹打均匀，然后装入冻存试管中，每管冻存1-1.5ml。在冻存试管上注明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称。 4. 标准的冻存程序为，初期降温速率为-1～-2℃每分钟；当温度达-25℃以下时，可增至-5～ -10℃每分钟；至-100℃时，则可迅速浸入液氮中。装入冻存试管的细胞可置于细胞冻存器中，在-80℃过夜后迅速放入液氮容器内冻存。如无此设备，可以用下两种方法：一种是将冻存试管放入泡沫塑料盒或小纸盒中（用脱脂棉将其固定好）。放入-80℃冰箱中过夜，然后迅速放入液氮中；另一种是，将冻存试管缓缓放入液氮容器，按1℃每分钟的降温速度，在30-40分钟内使其达到液氮表面，再停30分钟后投入液氮内。低温冷冻操作时应戴厚手套，以防冻伤。 5. 用布袋盛放冻存试管冻存时，用结实的线绳一端扎住袋口，与布袋一起沉入液氮中，线另一端系一个标签，其上标明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称，垂于液氮容器外；当用铁架盛放冻存试管冻存时，铁架和铁架伸出液氮容器外的手柄上贴上标明细胞系名称、冻存日期和培养基的名称的标签。 6. 对首次冻存的细胞系，需在冻存后两周后复苏一次，观察细胞对冻存的适应性。对已建系的细胞每6个月复苏培养一次，检查其生长状况和是否存在污染，然后再继续冻存。 7. 细胞冻存应做记录（见附表4） 细胞的复苏 器材与试剂：1.水浴箱；2. 小型离心机；3. 吸管； 4.镊子；5.细胞培养瓶（皿）；6.细胞培养液。 操作规程： 1. 从液氮容器内取出细胞冻存试管，用镊子夹住在40℃水浴中不断摇动，使其快速融化。操作时应戴厚手套，以防冻伤。 2. 当冻存试管内的液体完全融化后，立即从40℃水浴中取出冻存试管，用70%酒精消毒，吸出细胞悬浮液，放入离心管中，并加入10倍体积以上的细胞培养液，混合后离心，弃去上清液，再用细胞培养悬浮，离心后用细胞培养液重新悬浮并计数。 3. 对复苏后的细胞进行接种，接种密度以5×105/ml为宜。然后放入二氧化碳培养箱中培养。 4. 冷冻细胞的复苏应做记录（见附表5） 细胞的运输 器材与试剂：1.液氮或干冰;2. 冻存试管或培养瓶；3.细胞培养液。 操作规程： 1． 短时间的运输可将细胞放入冻存试管冻存在液氮或干冰中运输。 2． 长时间的运输（达4～5天）可用以下方法： 2.1 选择生长至中或晚对数期的细胞，弃去培养液，加入新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，用防水胶带牢固地封好瓶盖和瓶颈的结合部，并用泡沫塑料包裹。 2.2 到达目的地后，弃去多余的培养液，只保留维持细胞培养的液培养液量，放入二氧化碳培养箱进行培养，次日传代。 附表1 采样和原代培养的记录 物种 品种 年龄 性别 动物的编号 健康状况 组织 采样部位 样品的存放地点 细 胞 的 原 代 培 养 分 离 试 剂 细胞分离所用酶试剂 酶试剂的浓度 酶试剂的溶剂成份 消化时间 细 胞 计 数 细胞悬浮后的密度（个/ml） 细胞悬浮后的总体积（ml） 细胞的总量（个） 每克样品的细胞产量（个/克） 接 种 培养容器的种类（培养瓶、培养皿或培养孔板）和数量 接种后细胞的密度（个/ml） 每个培养容器的培养体积 培 养 液 培养基类型 培养基的生产批号 血清的类型和浓度 血清的生产批号 其它添加的成份 二氧化碳的浓度 质细类胞型　间 网状纤维蛋白 基质胶 胶原蛋白 其 它 参 数 附表2 换 液 记 录 换液日期 细胞系的名称和编号 细胞系的代数 细胞系的生长周期 细胞的外形 细胞密度 培养液的大约PH值 培养液的澄清度 培养液的类型 培养液的生产批次号 血清的类型和浓度 血清的生产批次号 其它的添加试剂 二氧化碳浓度 其它参数 附表3 细胞系传代的记录 传代操作的日期 细胞系的名称和编号 细胞系的代数 胞 传细代状前态 的 细胞系的生长周期 细胞的外形 细胞密度 培养液的大约PH值 培养液的澄清度 壁细处胞理 脱 消化前预洗试剂 胰蛋白酶浓度（μg/ml） EDTA浓度 (mM) 其它酶试剂及浓度（μg/ml） 机械类方法种类 作用时间（分钟） 计细数 胞 悬浮后的细胞浓度（个/ml） 培养瓶的数量 (个) 每个培养瓶的培养液体积(ml) 接 种 接种的培养容器的种类和数量 细胞的终浓度（个/ml） 接种的培养容器的培养体积(ml) 接种细胞的稀释的倍数 培 养 基 和 血 清 培养基类型 培养基的生产批号 血清的类型和浓度 血清的生产批号 其它添加的成份 二氧化碳的浓度 间细质 胞 网状纤维蛋白 基质胶 胶原蛋白 参其数 它 附表４　　　　　　　　　细胞冻存记录 细胞系名称 冷冻日期 操作者 地冻点 存 冻存容器编号 冷冻架抽屉/冷冻袋号码 冻 存 信 息 每个冻存管的冻存量（ml） 冻存管的总数（个） 冷冻剂的成份 采用的冷冻方法 解冻时的注意事项 细 胞 系 信 息 细胞系所属的物种 细胞系的样本采样个体的年龄 细胞系的样本采样的组织 细胞系的样本采样的部位 细胞系的传代代数 培 养 条 件 传代培养频率 接种浓度 更换培养液的频率 培养基类型 血清类型 缓冲溶液类型 二氧化碳浓度 其它特殊条件 的胞特细性 系 生长方式 形态特征 其它特性 的支 检原 测体 检测日期 检测方法 检测结果 的胞鉴细定 系 鉴定日期 鉴定方法 鉴定结果 附表５　　　　　　　　细胞的复苏记录 细胞系名称 融化日期 操作者 冻存管号 剩余冻存管数量 接种浓度 接种体积 接种培养液 存活情况(24小时附着率) 实训二 MS培养基的配制与灭菌（3学时） 一、目的要求 通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。 二、仪器与用具 1、仪器：酸度计或pH试纸、电磁搅拌器、电炉 2、用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签 3、试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1 N 、0.5N NaOH，0.1 N 、0.5N HCl 三、方法步骤 （一）MS固体培养基的配制 1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。 2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。 注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。 3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。 如配制1000ml培养基： 需：MS大量元素母液 100ml MS微量元素母液 10ml MS铁盐母液 10ml MS有机物母液 10ml 4、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。 5、加入蔗糖（30g/L），溶解。 6、定容：用容量瓶。 7、调pH值：一般pH=5.8。 用0.1 N 和0.5N 的NaOH和HCl 将pH调至所需的数值。 注意：①经高温高压灭菌后，培养基的pH值会下降0.2—0.8，故调整后的pH值应高于目标pH值0.5个单位。 ②pH值的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pH大于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂就不能很好地凝固。 ③如果pH值与所需的数值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl调节，至接近时，再用0.1N的酸、碱调节。以免加入过量的水溶液，导致溶液体积增大，培养基不能很好地凝固（因加入的琼脂量一定）。 8、分装到大三角瓶中（500ml、1000ml）。 9、加琼脂（6-10g/L）。常用6.6--7 g/L 10、封口：用棉塞或锡箔纸、牛皮纸。注明培养基名称、配制时间。 或者：5、加入蔗糖。 6、加琼脂，煮沸1-2分钟（熔化琼脂）。 7、定容，pH值。 8、分注到培养瓶中。100-150ml培养瓶每瓶装入20-35ml左右的培养基。 （二） MS固体培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） 1、洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 2、包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。 3、装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。（切忌干烧！） 4、装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。 5、灭菌：将排气阀开着，加热，直至锅内释放出大量水蒸气（此时水蒸气横向喷出），再关闭阀们；或者当锅内压力升至49.0KPa时，开启排气阀，将锅内的冷空气全部排出。当锅内压力达到108KPa时，温度为121℃时，维持15-20分钟，即可达到灭菌的目的。（若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。）切断电源，让灭菌锅自然冷却。 注意：①先打开放气阀，再打开锅盖。（以免锅内压力大而爆炸！） ②开盖后应尽快转移培养瓶，使培养瓶冷却、凝固。一般应将灭菌后的培养瓶储藏于30℃以下的室内，最好储藏在4-10℃的条件下。 ③某些生长调节剂如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。 采 样 记 录