中药中微生物相关检测方案

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实验研究 左金丸诱导人胃癌细胞 SGC- 7901凋亡的研究 彭求贤1.2 余惠旻 胡胜全1.2 刘塔斯²2杨大坚 陈新滋 (1.深圳市中药药学与分子药理学研究重点实验室，广东深圳518057；2.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410007) 摘 要 目的：探讨左金丸水提物(WEZP)对人胃癌细胞(SGC-7901)生长的活性抑制和凋亡诱导作用。方法：观观不同浓度的 WEZP 对 SGC-7901 的生长抑制情况，MTT比色法检测细胞活力，Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL 的 WEZP 作用 SGC-7901 细胞24h后，细胞存活率显著降低，且与时间、剂量呈依赖关系。Hochest 染色细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征。流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析，各剂量 WEZP 作用 SGC-7901 细胞24h后，细胞凋亡率分别为(8.96±0.88)%、(18.40±0.60)%和(29.90±0.58)%，与对照组(2.66±1.33)%比较差异均有统计学意义。结论：WEZP对 SGC-7901生长有明显的抑制作用并可诱导SGC-7901的凋亡。 关键词 左金丸 SGC-7901 细胞凋亡 体外实验 中图分类号 R735.2 文献标识码 A 文章编号 1672-397X(2009)04-0070-02 胃腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，源自胃黏膜上皮细胞。除手术外，有效的中药治疗已成为研究肿瘤治疗的热点问题。已发现左金丸对胃腺黏膜具有一定的保护作用及其保护机制"，但在抑制胃腺癌细胞活性及诱导细胞凋亡方面的研究国内尚未报导。本研究采用体外培养的方法从多角度探讨左金丸抑制胃腺癌细胞活性及诱导细胞凋亡，为左金丸治疗肿瘤提供理论依据。 实验材料 1细胞株 SGC-7901 胃腺癌细胞株，购于中山大学医学院 试剂 小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，1640培养基(Gibico 公司)，胰蛋白酶(Gibico 公司)，噻唑兰(sigma 公司)，二甲基亚砜 (sigma 公司)，Hoechst 33258(Fluka)。 1.3 试药 左金丸，每克干粉含生药 3.98g，水提物由香港理工大学深圳研究院中药制剂实验室提供。 1.4 主要仪器 超净工作台(ESCO公司)，CO培养箱(美国Shellab公司)，倒置显微镜(德国Leica 公司)，流式细胞仪(美国 Coulter公司)，酶标仪(德国BMG公司)，微量加样器，微孔滤膜(0.22p.m、0.45pm)，离心管，紫外灯，冰箱。 2 实验方法 2.1 细胞培养 SGC-7901 胃腺癌细胞株在10%小牛血清RPMI 1640 培养液中，于37℃条件下，在湿度为100%、含 CO，为5%(体积分数)的 CO培养箱中常规培养。 2.2 实验分组 左金丸水提物(water extracts of Zuojin Pill，WEZP)干粉浓度分别为 0、1、5、10mg/mL，其中 0mg/mL 为空白对照组，其余为干预 SGC-7901 细胞实验组。 ( 2.3 MTT测定细胞存活率 取对数生长期细胞，用RPMI ) ( 基金项目：973计划前期研究专项(2006CB708516) ) 1640培养基制成细胞悬液 (5×10/mL)加入96孔板，100uL/孔，培养24h后药药，实验组分别加入不同浓度药物使其终浓度为1、5、10mg/mL，分别培养20、44、68h，加入 MTT 10pL/孔培养4h，吸去培养基，加入 DMSO 150pL/孔，震荡 10min。波长 490nm 测吸光值(OD)。细胞抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD 值)x100% 2.4 荧光显微镜观察 将 SGC-7901 细胞(2×10/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜鲜制的4%多聚甲醛(pH为7.4)，于37℃固定细胞 30min，PBS液洗2次，加5mg/L， Hochest 33258染色液染色 30min，PBS 液洗后，用封片液(20mmol/L 柠檬酸，50mmol/L磷酸氢二钠，50%甘油，pH 5.5)封片后荧光显微镜观察、摄 流式细胞仪检测 调整细胞密度为2×10/mL，以 1.5mL/well 种入6孔板。每组6个复孔。药物作用72h后，细胞刮刮取细胞，1000r/min 离心 10min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中缓慢依次加入70%的冰乙醇固定，-20℃固定24h。固定后，1000r/min 离心 10min，去上清，PBS漂洗2次，调整细胞浓度为1x10/mL。加 RNase 至终浓度100ug/mL，37C水浴 30min。加PI至终浓度 50pg/mL，350目尼龙网滤膜过滤去除田胞团块，4℃避光染色 30min 后，上流式细胞仪检测各期细胞 DNA的含量(激激波长：488mm；发射波长：610nm)。定定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA 组方图出现低于 G1 期 DNA 含量的亚G1 峰的大小代表凋亡细胞的多少。 2.6 统计学处理 实验中采用 SPSS 14.0软件进行t检验、卡方检验。 3 实验结果 3.1 左金丸对 SGC-7901 细胞的抑制(n=3) 实验结果显示： 对照组细胞生长良好，经左金丸作用后的细胞，随着浓度逐渐增高，作用时间的不断延长，SGC7901 细胞的生长抑制程度增强。见图1。 3.2 荧光显微镜观察 结果如图2所示，空白对照组细胞生长良好，细胞大小均匀、完整、饱满，细胞器正常，密度一致(图2A)；而左金丸作用组72h后随着药物浓度的增加(1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL)，凋亡细胞逐渐增多，即核质浓聚成大小不等的多边形，细胞多出现固缩形成新月体(图2B、C、D)。 3.3 流式细胞仪检测(n=3) FCM定量分析为随左金丸浓度增加细胞凋亡率增高。浓度为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL 左金丸水提物作用SGC-7901细胞24h后细胞凋亡率分别为(8.96±0.88)%、(18.4±0.6)%和(29.9±0.58)%，与对照组(2.66±1.33)%比较差异均有显著性(P<0.01)，见图3。 4 讨论 现代医学研究表明，肿瘤组织内部存在细胞增生和凋亡的动态平衡，肿瘤的生长除了瘤细胞的无限增生外，细胞分化和凋亡失调与肿瘤的形成和发展密切相关。细胞凋亡是指一种由基因调控的细胞主动的、自身有一定程序的消亡过程。越来越多的研究表明，抗癌药物的效果与肿瘤细胞凋亡率有密切关系。 由于肿瘤细胞较正常细胞对药物诱 图1 不同时间不同浓度左金丸水提物对 SGC7901 细胞的生长抑制率 图2 各组 SGC7901 细胞荧光显微镜照片(×200) (A：空白对照组；B：WEZP 1mg/mL 组；C：WEZP 5mg/mL组；D：WEZP 10mg/mL组) 图3 不同浓度左金丸水提物对 SGC7901 细胞凋亡的流式细胞术分析 (A：空白对照组；B：WEZP 1mg/mL 组；C：WEZP 5mg/mL组；D：WEZP 10mg/mL组) 导的细胞凋亡更敏感，因此积极寻找特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的药物将有重要的理论和实际意义。形态学方法能定性检测出细胞凋亡的发生，流式细胞术使凋亡的研究由定性发展为定量检测，尤其为抗癌药物的研究提供了理想的分析方法. 随着肿瘤诊断治疗技术的不断完善，治疗水平不断提高，中医药在肿瘤治疗中的地位和综合优势愈显重要要。胃癌是消化道肿瘤中最常见的一种疾病，在我国发病率很高，死亡率占恶性肿瘤的第一位，全国胃癌平均死亡率高达20/10万。《丹溪心法·火篇》中左金丸由黄连六两(姜汁炒)和吴茱萸一两(盐水泡)组成，共为末，做成水丸或蒸饼为丸，有清泻肝火、降逆止呕之效，现常用于胃炎、食道炎、胃贵疡等属肝火犯胃者。 本研究证明左金丸对胃腺癌 SGC-7901细胞有明显的抑制作用，且左金丸的作用浓度、时间与抑制率正相关，其中 10mg/mL 作用72h的抑制率为68%。荧光镜下中药组作用72h，部分细胞失去其正常生长状态，变成卵圆形、圆形，培养液中悬浮聚集成团的细胞增多，而贴壁细胞数量减少，核染色质浓密、有的呈新月状，且凋亡率与对照组有显著差异。综上所述，左金丸有诱导人胃腺癌细胞凋亡的作用，与左金丸传统的组方用药相符，为中医复方治疗胃腺 癌提供可靠的实验依据。但左金丸引起细胞凋亡的药物成分是什么，是调控何种基因引起胃腺癌细胞凋亡，尚有待进一步研究。 ( 5 参考文献 ) ( 1] 陈艳芬，陈蔚文，李茹柳，等.左金丸和反左金对大鼠胃粘膜保护机制的比较研究.广州中医药大学学报，2003，20(2)：133 ) ( [2] DENG X u -kun. Comparison of mo r phological feature and u ltrastrutu r e chang e s of apopto s is of SGC-79 0 1 an d HEPG-2 cell lin e s induced by cisplatin . Acta anatomica sini c a，2006，37 (5)：538 ) ( [3] 刘海兴.中医药治疗胃癌的研究进展.辽宁中医药大学学报， 2007，9(2)：153 ) ( [4] 石雪蓉，顾健，熊平，等.左金丸生物碱抗急性胃粘膜损伤作用研究.中药药理与临床，2001，17(4)：11 ) ( 第一作者：彭求贤(1983-)，硕士研究生，主要研究方向为中药资源与质量研究、中药抗肿瘤活性成分筛选。 ) ( 通讯作者：余惠旻，yuhuiming72@yahoo.com.cn ) ( 收稿日期：2008-10-14 ) ( 编辑：乔 婧 吴 宁 ) 总第第期江苏中医药 江苏中医药总第第期