一种使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理的方法

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一种使用冷冻干燥技术对生物样品进行前处理的方法 技术背景 冷冻真空干燥也叫干燥，升华干燥或简称冻干。它是干燥方法之一，目的是为了贮存物品。 物品之所以会损坏、腐烂、变质， 主要是由于外因和内因二个因素引起的，外因者，空气、水、温度、生物等的作用；内因者，主要是生物物质自身的新陈代谢作用。如果能使外因和内因的作用减小到最低程度，则能达到物品在一定时间内保持不变的目的。 干燥法就是驱除物品内部所含的水份，因为水份是一切生物生长的必要条件之一。-。生物体水份减少到一定程度，则生物不易或不能生长繁殖。因而能较长时间的贮藏保存；另外，当有水份存在时，，一些酸碱溶解其内还会发生一些化学作用而使物品变质。 干燥的方法很多，如晒干、烘干、煮干、晾干、喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥等。其中唯有冷冻干燥法是干燥生物活性物质的最理想方法。 冷冻干燥技术是将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰直接转变为蒸气而除去的干燥方法。物料可先在冷冻装置内冷冻，再进行干燥。但也可直接在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。升华过程中所需的汽化热量，一般用热辐射供给。其主要优点是： (1)干燥后的物料保持原来的化学组成和物理性质(如多孔结构、胶体性质等)； (2)热量消耗比其他干燥方法少。主要用于干燥抗生素、蔬菜和水果等。 含水的生物样品，经过冷冻固定，在低温高真空的条件下使样品中的水分由冰直接升华达到干燥的目的，在干燥的过程中不受表面张力的作用，样品不变形。 冷冻干燥技术是在第2次世界大战期间，因大量需要血浆和青霉素而发展起来的。现在已广泛应用于化学、制药工业、食品工业和科学研究等方面，特别是应用于含有生物活性物质的生物药品方面最为普遍。 冷冻干燥属于边缘科学，它涉及到物理、化学、生物学等知识，包括制冷、真空、电工、仪表等技术。因此也是一门综合性的专业科学技术。 在临床医学、基础医学、法医学、药学等研究领域，生物样品中的药物浓度检测是一项十分重要的技术，广泛应用于毒物分析、药物分析等研究中。 传统的对于全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织勻浆液等生物样品的处理方法为有机溶剂沉淀蛋白离心后使用氮气或空气流在加热条件下吹干有机溶剂再定容后进行分析，或 者使用与生物样品不相混容的有机溶剂如乙酸乙酯、乙醚等进行液液萃取后使用氮气或空气流在加热条件下吹干有机溶剂定容后进行分析。 在基础研究或临床药物浓度监测的过程中，常常会有大量的待检测样品，使用传统的样品前处理方法，样品中的内源性成分容易汉目标药物的测定产生干扰，并且操作步骤较多，尤其是待测药物为热不稳定化合物时，处理过程需要在低温或室温条件下进行，这必然会增加样品处理所需要的时间。 传统的生物样品前处理方法存在操作步骤多、花费时间长、存在较多内源性干扰等弊端。 技术内容 本技术的目的在于提供一种将成熟的冷冻干燥技术应用到生物样品的前处理过程当中，能够同时处理大量生物样品，使对热不稳定化合物在生物样品中的测定更简便和可靠的生物样品进行前处理的方法。 为达到上述目的，采用的技术方案是：将生物样品进行冻干处理后，再使用有机溶剂对生物样品冻干粉进行目标化合物提取。 其具体步骤如下： 1)取待测生物样品移至容器中，冷冻干燥技术是指将含水物料冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。物料可先在冷冻装置内(冷阱)冷冻，再进行干燥。但也可直接在干燥室内经迅速抽成真空而冷冻。升华生成的水蒸气借冷凝器除去。升华过程中所需的汽气热量，，一般用热辐射供给。将装有待测物的容器置于冷冻干燥机的冷阱中预冻至_45°C并维持2~6小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵，经0.5~3小时使真空度达到0.3mbar以下，对物料盘进行加热，第一步根据待测生物样品的共熔点加温使待测生物样品的温度低于共熔点的温度，待生物样品内水份干完后进行第二步加温，加热至生物样品允许的温度并保持2~6小时，即可结束冻干； 2)冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前待测生物样品体积0.2~1倍的有机溶剂作为提取溶剂，涡旋混合1~2分钟后于12000~16000 Xg以上，离心10~30分钟或通过0.22um 的滤膜后，取上清液或滤液进行相关分析测试。 冻干结束后根据测定目标，也可以不使用溶剂萃取，而采用其他处理方法进行处理测定。 本技术的生物样品为全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织只浆液；萃取有机溶剂为乙醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮或乙腈。 生物样品的最高允许温度指的是保证生物样品活性的最高温度，其最高允许温度视生物样品而定，一般为10°C~40°C左右。病毒性样品的允许温度为25°C，细菌性羊品的允许温度为30°C，血清、抗菌素的允许温度为40°C. 将冷冻干燥技术应用到生物样品的前处理过程中，将生物样品(全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织匀浆液等)在冻干机中冻干后加入提取有机溶剂(甲醇、 乙腈等)混勺离心后即可进行含量分析，由于生物样品(全血、血浆、血清、尿液、粪便、组织或组织勾浆液等)的冻干粉中没有水分，有机溶剂中也不含水分，大部分水溶性的内源性物质不会进入提取有机溶剂中对目标药物的测定产生干扰，同时由于冻干粉的颗粒小，具有多孔性结构，比表面积大，提取溶剂对药物的提取率明显高于传统的样品前处理方法。整个处理过程不需要加热处理，尤其适合对生物样品中热不稳定化合物进行分析。具体实施方式 实施例1：：以以血浆样品为例 分离待测测液样品中的血浆，移取0.1ml 至1.5ml 的^endoff 管中，置冷冻干燥机中预冻至-45°C并维持2小时，转移至冻干箱中，打开真空泵，经2小时后真空度达到0.3mbar，对物料盘进行加热并按照预定程序升温至10°C，冻干程序完成，恢复冻干箱压力为大气压后取出冻干后的血浆样品，迅速盖上印 endoff 管的盖子，恢复至室温后加入 0.1ml 甲醇作为提取溶剂，涡旋混合1分钟后12000Xg离心10分钟取上清液进行液相分析。 例如血浆和组织匀浆，进行冻干处理后，使用有机溶剂提取后进行临床治疗药物监测、药物代谢研究、药代动力学研究、法医学毒物分析等。 有些分析技术，如加速器质谱 (accelerator mass AMS)技术，，可以将冻干样品不经溶剂萃取直接进行其氧化、还原等前处理进行分析，应用于临床治疗药物监测、药物代谢研究、药代动力学研究、法医学毒物分析。 实施例2：以尿液样品为例 1)取尿液移至容器中，将装有尿样的容器置于冷冻干燥机的冷阱中预冻至45°C并维持4小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵，经1小时使真空度达到 0. 3mbar以下，对物料盘进行加热，第一步加热保持尿样的温度低于共熔点的温度，待尿样内水份被除去后进行第二步加温，至20°C保持3小时，即可结束冻干； 2)冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前尿液体积 1/2的乙醚作为提取溶剂，涡旋混合1分钟后于12000Xg 以上，离心10分钟取上清液进行相关分析测试。 实施例3：：以固体类样品为例 1)取组织移至容器中，将装有组织的容器置于冷冻干燥机的冷阱中预冻至45°C并维持5小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵，经1小时使真空度达到 0. 3mbar以下： 对物料盘进行加热，第一：步保持组织的温度低于共熔点的温度，待水份干完后进行第二步加温，加热至10°c保持5小时，即可结束冻干； 2)冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前组织体积1-5的乙酸乙酯作为提取溶剂，涡旋混合2分钟后于12000 Xg以上，离心20分钟，取上清液进行相关分析测试。 实施例3：：以组织均浆类样品为例 1)取组织勻浆液移至容器中，将装有组织匀浆液的容器置于冷冻干燥机的冷阱中预冻至45°C并维持6小时后将其从冷阱中转移至冻干箱中，打开真空泵，经3小时使真空度达到 0.3mbar 以下，对物料盘进行加热，第一步保持组织浆浆液的温度低于共熔点的温度，待产品内水份干完后进行第二步加温，加热至10°C保持4小时，即可结束冻干； 2)冻干结束后，取出样品恢复至室温后，加入冻干前组织匀浆液体积1/3的乙腈作为提取溶剂通过0.22 u m的滤膜后，取滤液进行相关分析测试。 美国 SP Scientific 公司旗下的 VirTis公司是著名的冻干机的生产厂家，其成立于1953年，是世界上历史最悠久的冷冻干燥机制造商之一。该公司被认为拥有世界领先的冷冻干燥技术，能完善的开拓和研究工业冷冻干燥所需要的技术。 VirTis 产品包括：实验室系列冻干机，制备系列冻干机，药品研发型冻干机，中试生产型冻干机，小型生产型冻干机，产业型冻干机，通用型冻干机七大系列，19大类，近52个机型，能满足用户的任何需求。其中实验室系列冻干机是 VirTis 专为生物技术，生化，农业科研，医药和生命科学产业需求而设计。VirTis 旗下所有冻干产品均通过 ISO 9001：2000质量管理体系认证， 并且满足最严格的现行良好制造规范(cGMP)标准，并可提供所有相关验证文档。 VirTis@AdVantage...台式原位冻干机 兼具样品预冻和干燥功能，整个冻干过程无需转移样品 世界上唯一一款既可以做样品预冷/加热，又可以外挂冻干瓶；既可以做样品真空冷冻压盖封装，又可以真空冻干散装样品；并且还可以满足摸索冻干条件，制作冻干曲线的要求，冻干曲线还可以用于中试、生产等；实验结果符合cGMP 标准。 VirTis@BenchTop Pro....台式岐管冻干机 紧凑设计，功能强大 > 高性能 PLC 控制系统-人性化的操作界面，提供的全彩触摸屏导航。 超低温冷凝温度选择一多种温度选择可处理各种样品(-55，-75，-85，和 -105℃) > -键式操作-冷却、真空和干燥步骤-一键式自动操作 > 冷冻/冷冻干燥一使用标配的预冻盘，可以在冷凝器内直接进行少量样品的冷冻和冻干 > 真空控制一“真空度设定”功能，使热传导最大化，提高冻干效率 热气除霜-可在10分钟甚至更短的时间内除去冷凝器上的凝霜，从而有效提高冻干效率 紧凑型机身-紧凑式设计使仪器体积更加小巧，有效节省实验室空间 > 节能控制功能一当到达使用者所设定的真空度后，真空泵将采用间隙工作模式来维持所需真空，以减少能源消耗，泵的磨损和真空油的损耗。 > 各式歧管可以互换使用一以满足您不同的应用需求 > 专利的快速密封阀-所有歧管统一标配 Vritis 冻干机由德祥科技有限公司独家代理。索取更多产品及应用资料，请与我们联系。 上海：021-52610122联系人：刘燕邮箱： ella liu@tegent.com. cn 北京：010-82327383 联系人：郑丽邮箱：li zheng@tegent. com. cn 广州：020-22273365 联系人：魏晓颖邮箱： wing wei@tegent. com. cn 成都：028-85356001 联系人：张爱丽 邮箱： aili zhang@tegent.com.cn