婴幼儿奶粉中激素类物质多残留检测方案(液质联用仪)

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基于Orbitrap技术的LTQ-Orbitrap组合式高分辨质谱对婴幼儿奶粉中激素类物质多残留的快速筛选和确证 赵晓亚'，刘飞2，王鹏，付晓芳，李晶'，胡小钟' 1湖北出入境检验检疫局技术中心，武汉，430050。 2赛默飞世尔科技(中国)有限公司科学仪器部，上海，201206 随着环境雌激素的深入研究，不少学者开始研究食物 中雌性激素对人类健康的影响，尤其是牛奶。牛奶中 含有相当量的雌性激素， Ganmaa D等学者认为现在消费的牛奶中，雌性激素水平较100年前有明显增加。在奶牛生产中，雌激素可与孕激素等一起用于诱导奶牛发情和泌乳。因此，现代牛奶中的雌性激素包括内源性雌性激素，即奶牛本身产生的雌性激素，和外源性雌性激素，即应用于奶牛的雌性激素[1-2]。己烷雌酚(hexestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)和双烯雌酚(dienestrol)是结构相近的人工合成雌激素，均含有酚羟基，为弱酸性化合物，主要用于提高奶牛产奶量。由于其致癌作用，欧盟已禁止使用，美国和加拿大则限量使用。雌酮(estrone)、雌二醇(17β -estradiol)和雌三醇(estrio1)为人体和动物体内天然的雌激素。在奶牛生产中雌激素的应用非常广泛。临床上主要与其它生殖激素配合使用，用于诱导发情和泌乳，治疗胎衣不下、子宫内膜炎，催产，引产，人工诱导流产，排出子宫内容物等。人类通过食用这些被污染的奶粉就会使体内雌激素累计过量，导致发育异常、内分泌失调、生殖功能障碍、雌雄同体[3-4]。这不仅仅只是影响人类的健康，而且威胁着人类的进化以及物种的繁衍。因此建立婴幼儿奶粉中雌激素类物质科学、完善、高效的检测方法是十分必要的[5-11]。本文利用Thermo Scientific 基于Orbitrap技术的LTQ-Orbitrap组合式高分辨质谱仪配合全自动筛选软件ToxID对于高信息量、大量数据文件的高通量数据分析的特点，建立了婴幼 儿奶粉中激素类物质多残留的快速筛选和确证方法。 1.1试剂 雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚(纯度均大于99%，美国sigma公司)。甲醇(色谱纯，德国Merck)，乙腈(色谱纯，德国Merck)，氨水(优级醇， Merck)，乙酸(分析纯)，乙酸钠(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)，水 ((Millipore系统产生的超纯水)。ENVI-Carb 萃取柱 (Supelco公司)。β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液。乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH5.2). 混合标准储备液(100 pg/mL)， mL)：准确称量雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌 酚各5.0mg，用甲醇定容到50mL棕色容量瓶中，超声混匀，4℃下避光储存，即为储备液。标准使用液(1.0~200 pg/L)。 1.2仪器 LTQ-Orbitrap XL组合式高分辨离子回旋共振质谱仪，配置Surveyor液相色谱系统 (Thermo Scientific， USA))。oMilli-Q超纯水仪。涡旋振荡器。低温高速离心机。超声波清洗仪。 1.3样品处理 称取2g试样(精确至0.01g) 于50mL具塞塑料离心管中，加入2.5mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加入β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液50pL，于37℃±1℃振荡酶解6h。取出冷至室温，加入15mL甲醇超声提取30min， 0℃~4℃下10000 r/min离心10 min， 将上清液转专洁净100mL锥形瓶中，加水60mL，混匀后待净化。提取液以2 mL/min~3 mL/min的速度上样于活化过的ENVI-Carb (用6mL二氯甲烷-甲醇(7：3， v/v)溶液，6mL甲醇，6mL水活化)固相萃取柱，将小柱减压抽干，用10mL二氯甲烷-甲醇(7：3，v/v)溶液洗脱，收集洗脱液在N2下吹干，用1 mL乙腈-0.1%氨水溶液(30：70， v/v)溶解残渣，供仪器测定。 1.4仪器条件 液相色谱条件：流动相为0.1%氨水溶液(A)和乙腈(B)， 梯度见表1；流速为0.2 mL/min； 进样量为10pL。质谱条件：质量分析器为FT Orbitrap； ESI负离子模式扫描；质量范围(m/z) 为100-600；分辨率为60000；喷雾电压为4.5kv；管状透镜电压为80v，鞘气压力为35arb，辅助气压力为6 arb。 表1流动相梯度 Table1 Optimal elution condition for six components Time /min A% B% 0 80 20 7 52 48 17 52 48 17.1 80 20 2.1提取条件的选择 由于婴幼儿奶粉基质蛋白含量高，添加成分复杂，对前处理要求高。参考文献和相关标准，我们对婴幼儿奶粉的前处理步骤进行了优化。奶粉中激素以游离或轭合物两种形式存在，仅检测游离部分可以不用酶解，检测轭合物或者总量时都需要用蛋白酶、β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解后测定，本研究先用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解释放激素轭合物再进行同时测定。用石墨炭黑小柱进一步去除杂质，结果提取回收率较高，可以达到70%左右。 2.2仪器分析条件的优化 流动相的优化：通过实验发现在水相中加入0.1%的氨水，可提高被分析物的离子化效率。由于己烷雌酚和雌酮的分子量很接近，因此调整流动相中有机相的比例，达到较好的分离度。 质谱条件的优化：优化鞘气电压和辅助气电压，使被测物的响应高。用ToxlD 2.1筛选软件建立化合物的分子式数据库信息表，并指定离子加合物类型和数量，这里设定了负离子模式下可能存在的-H、-0H两种离子。化合物筛选的离子提取窗口宽度为3ppm。结果显示6种雌激素化合物的脱氢负离子形式被检测到，分离度好，灵敏度高。 2.3线性关系及检出限 将一系列不同质量浓度(1，2.5，5，10，25，50， 100 pg/L)的基质混合标准溶液依次进样，以雌激素分子离子的峰面积Y对相应的质量浓度X(pg/L)做标准曲线，六种激素类化合物的质量浓度均与峰面积呈线性关系，其 表26种雌激素类物质的工作曲线 相关系数(r)均大于0.99，见表2。对相同浓度的标准试样在同一日内的不同时间进行5次重复试验，目标化合物峰面积的相对标准偏差为1.0%~1.8%；不同日期(10d)进行重复试验目标化合物峰面积的相对标准偏差为1.2%~2.3%，质量偏差小于3 ppm， 说明采用LTQ-Orbitrap组合式高分辨质谱测定具有很好的稳定性和重复性。 在经测定不含激素类物质的奶粉样品中添加不同量的混合标准溶液，添加水平分别为1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，5.0，10.0，50.0 pg/kg， 按上述实验条件处理后测定，得到雌酮、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚的方法定量限为1.0 pg/kg，雌二醇、雌三醇的方法定量限为1.5 pg/kg。图1给出了空白基质混合标样品溶液的色谱图，浓度为5.0 pg/kg；图2给出了空白奶粉样品的提取离子色谱图，图3给出了空白加标奶粉样品(添加浓度为5.0 pg/kg)的提取离子色谱图。 # OH 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 lable2 Linear Equations and Correlation of six estrogens Fig. 1 Chromatograms of 5.0 ug/L matrix standard solution Compound Structure Linear range Linear Equation Correlation ug/L X(ug/Kg) hexestrol .O.y 1.0-100 Y=146503X-125876 0.9907 diethylstilbestrol Ho 1.0-100 Y=126311X-104005 0.9906 dienestrol H 1.0-100 Y=93475.6X-74103.2 0.9905 H3 CHs estrone HO 1.0-100 Y=146807X-130039 0.9911 OH 17B-estradiol Ha 2.0-100 Y=49325.5X-45246.3 0.9939 HO estriol OH 2.0-100 Y=47846X-51340.9 0.9928 HO 6.11 Fig. 2 Chromatograms of blank matrix solution # Comp.Index CompoundName Formula Detectedm/z Delta(ppm) ExpectedRT ActualRT Adducts H OH 1 1 17β-estradiol C18H2402 271.17023 -0.5 0.00 11.46 Y* 一 2 2 estriol C18H240 287.16516 -0.4 0.00 6.99 Y* - 3 3 estrone C18H2202 269.15457 -0.5 0.00 13.46 Y* - 4 4 diethylstilbestrol C18H2002 267.13879 -1.0 0.00 14.88 Y* 5 5 hexestrol C18H2202 269.15457 -0.5 0.00 15.49 Y* - 6 6 dienestrol C18Hi8O2 265.12320 -0.8 0.00 14.93 Y* - Fig. 3 Chromatograms of spiked sample (10.0pg/kg) 2.4回收率与精密度试验 称取经测定不含有激素类物质的奶粉试样，各平行40份，分别添加5.0，10.0，25.0， 50.0 pg/kg浓度水平，充分混匀，按照本实验方法进行LTQ-Orbitrap测定，得到6种激素类化合物的回收率和相对标准偏差，结果见表3。 表3样品加标回收(n=10) Table 3 Recoveries of spiked samples and RSDs(n=10) Compound 5.0 ug/kg 10.0 ug/kg 25.0 ug/kg 50.0 ug/kg recovery% RSD% recovery% RSD% recovery% RSD% recovery% RSD% hexestrol 76.6 6.4 80.7 10.3 73.4 9.2 84.6 7.3 diethylstilbestrol 85.6 8.6 77.2 7.1 75.5 7.9 80.3 9.7 dienestrol 73.7 7.9 71.9 8.4 84.7 8.0 73.5 10.4 estrone 81.2 8.8 75.8 9.5 71.6 10.1 79.1 7.8 17B-estradiol 77.7 5.5 80.5 6.9 83.1 9.5 83.4 8.6 estriol 79.5 8.1 74.6 9.6 83.2 7.3 76.8 6.9 2.5实际样品的测定 应用所建立的方法，分别对市售48份婴幼儿奶粉中的6种激素类化合物残留量进行抽查检测。按本文建立的方法进行检测，结果表明，所抽检样品有5份检出微量雌酮，浓度范围为1.1~1.9 ug/kg，所抽检样品有1份检出微量雌二醇，浓度为1.8 ug/kg。 结论 基于Orbitrap技术的Thermo Scientific LTQ Orbitrap组合式高分辨质谱及Exactive台式高分辨质谱系统可以准确而可靠地应用于各种复杂样品的高通量分析。基于Orbitrap技术， LTQ Orbitrap及Exactive均具有极高的质量分辨率(高达10万)，从而保证了分析结果的高质量准确度(<3ppm)，并可以准确地区分复杂样品中同时洗脱出的具有相同质量数的化合物。高达3到4个数量级的动态线性范围，可轻松地在筛选确证的同时，定量检测复杂基质中的痕量化合物。 基于Orbitrap技术的Thermo Scientific LTQ Orbitrap组合式高分辨质谱及Exactive台式高分辨质谱系统，操作简单， 在全扫描模式下，即可同时实现高分辨率下的筛选及准确、高灵敏度的定量检测。在本试验中，应用液相色谱联用LTQOrbitrap组合式高分辨质谱仪配合ToxlD筛查软件，对婴婴儿奶粉中6种ppb级激素类组分进行快速筛查，在准确质量确证的同时实现了准确定量检测，结果表明，在奶粉复杂基质中，低至1ppb的添加浓度，可全部被准确筛选确证(质量准确度均在3ppm以内)。 ( 参考文献： ) ( 1袁丽君，徐庄剑，胡瑜，赵建伟。部分牛奶中雌 二 醇和孕酮的含量分析。中国食品卫生杂志[J]，2007， 19 ( 2)：139-141。 ) ( 2 GANMAA D， SATO A. 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