水产及制品中农兽药残留检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

睿科全自动固相萃取仪应用文集文集编号 FD0003 采用睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取技术同时测定水产品中7种局部麻醉剂药物残留 摘要：曾查获一起用麻醉剂麻醉活鱼以求提高存活率的案件。目前，国内外对水产品局部麻醉剂测定比较少。本文采用 FotectorPlus SPE 净化，在HPLC-MS以正离子模式下检测，建立水产品中7种局部麻醉剂(苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、辛可卡因、普鲁卡因、普鲁卡因胺、氯普鲁卡因)测试的一种新方案。7种局部麻醉剂在0.1~10ug/L范围内均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99；在1.0ug/Kg 和 5.0ug/Kg 2 个浓度加标水平下的平均回收率为 73%~94%之间，相对标准偏差(RSD%，n=4)为2.11~6.09之间。满足水产品中局部麻醉剂的检测需要。 1前言 由于鱼在长距离运输过程中，应激反应强烈会受到不同程度的损伤，甚至导致死亡的现象，影响水产品销量。为了提高鱼的成活率及商业价值，国内外采用非化学麻醉和化学麻醉使鱼在运输过程中麻醉。 目前，国内外研究者对于渔用麻醉剂的作用机制、使用方法、影响药效的因素、血液成分和鱼的应激性关系等研究较多，对麻醉剂的安全性、反复麻醉对鱼类的危害性，残留麻醉剂对人体的风险和影响等则研究较少。近年来麻醉剂种类和应用规模剧增，特别是随着人们生活水平的提高对于动物产品的需求日益增加，对麻醉剂的检测分析呼声越来越亮。为此，本文应用全自动固相萃取仪来完成水产品净化，实现净化过程(活化，上样，淋洗，洗脱，浓缩)自动化，且减少人为操作带来的误差，是未来检测技 术的发展方向。 2试验部分 2.1仪器与试剂 睿科Fotector Plus 全自动固相萃取仪，Aglent1260 高效液相色谱仪， Agilent 6410四级杆质谱仪。MCX 固相萃取柱 (Waters60mg/3mL)，甲醇、甲酸、正己烷、乙腈均为色谱纯 (Sigma，美国)，氨水、三氯乙酸为分析纯(国药，上海)，超纯水(MerckMillipore Aquelix 5， 德国)。 麻醉剂固体标准品(山西食品药检所提供)。将上述混标组分以甲醇为溶剂配制成100mg/L 的混标储备液，置于-20℃冰箱保存。 2.2仪器条件 色谱条件： Fortis Xi C18 柱(1.7umx2.1mmx50mm)，柱温：30℃；流动相：A 为0.1%甲酸水，B为甲醇，流动相梯度洗脱程序见表1。流速量为0.2ml/min，进样量为10pL。 表1梯度洗脱程序 Tab.1 Program of gradient elution 时间/min A/% B/% 0.00 75 25 2.00 75 25 2.01 20 80 6.00 20 80 6.01 75 25 11.0 75 25 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)， 正离子模式，电喷雾电压：4000V；离子源温度：350℃；雾化器压力：25psi；气窗气流速：10L/min；驻留时间： 20min。 图1局部麻醉剂的二级质谱图 2.3样品制备 称取2.0g鱼肉样品(准确至0.01g)于离心管中，加入一定量标准品，振荡 1min；加入8mL三氯乙酸，2mL乙腈，振荡提取1min，超声 10min， 1000r/min 离心 5min，转移上层清液至分液漏斗中，加入5mL乙腈饱和正己烷溶液，下层溶液待净化。 2.4净化 用3mL 甲醇、5mL1%三氯乙酸分别活化 MCX 固相萃取柱，上样完成后，再用3mL1%三氯乙酸和3mL1%甲酸甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液；再用一定量5%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液。浓缩至干，用20%甲醇水定容至1mL 溶解解留物，经0.22um滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱测定。 仪器运行程序如下： Command Solvent Uutput Push speed Volume Time -1 Sample path wa.. CH30H Wastel 20 5 0.3 2 Syringe washing CH30H 20 2 0.1 3 Condi tion CH30H Wastel 1 3 3 4 Condition C2HF302 WasteZ 2 5 2.5 5 Sample loading WasteZ 1 10 10 6 Vials washing C2HF302 Waste2 60 2 0 7 Rinse C2HF302 Waste2 2 3 1.5 8 Air push Wastel 20 5 0.3 9 Rinse 1%HCOOH-CH30H Waste2 2 3 1.5 10 Air push Waste2 20 5 0.3 11 Dry 5 12Syringe washing 5%NH3-CH30H 20 3 0.2 13Elute 5%NH3-CH30H Wastel 1 6 6 14 End 2.5检出限、精密度、回收率 为了消除因基质而带来的离子抑制对定量测定的影响，需用空白样品提取液来配制所使用的一系列标准工作溶液，绘制标准曲线进行定量。7种麻醉剂在低浓度范围 0.1-10ug/L 线性良好，可以满足定量分析的需要。在空白鱼肉样品中添加不同含量的2个水平7种麻醉剂的混合标准溶液，按照2.3步骤进行加标回收率实验。每个添加浓度平行重复4次操作，测定精密度，结果见表2. 表2方法的回收率和相对标准偏差 名称 加标水平 平均回收率 RDS/% /Hg.Kg /% (n=4) 77.68 2.38 苯佐卡因 5 81.93 5.02 丁卡因 75.52 4.19 76.18 2.11 86.69 5.28 利多卡因 75.66 4.81 氯普鲁卡 76.41 6.09 因 83.66 5.23 普鲁卡因 80.78 4.31 5 88.43 3.43 普鲁卡因 89.89 4.21 胺 93.60 6.07 辛可卡因 80.04 5.69 5 73.82 2.45 由表2可以看出，7种麻醉剂在1ug/Kg~5pg/Kg浓度范围之间，加标回收率在73%~94%之间。相对标准偏差RSD(%)在2.11~6.09之间。方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。添加水平为5ug/Kg的鱼肉样品色谱图5。对鱼肉样品中7种麻醉剂残留量检测方法的检出限均为1ug/Kg，满足检测水产品需要。 3 结论 3.1从表2可以看出，应用全自动固相仪，能够满足水产品中7种局部麻醉剂在1ug/Kg~5ug/Kg浓度范围的净化，回收率在73%~94%之间，相对标准偏差RSD(%)在2.11~6.09之间。 3.2全自动固相萃取仪，提高工作效率，实现边净化边前处理样品过程；减少溶剂用量，减少有机溶剂对工作人员的伤害，减少人为 造成的误差。 3.3全自动固相萃取仪，扩大使用范围，不需要非常有经验的人员对样品进行净化，只要把方法导入仪器，可自动运行，保证样品的平行性；避免因手动固相萃取上样、洗脱流速不一致的现象。