乳制品及特殊膳食中农兽药残留检测方案

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[应用纪要]THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] ■ Waters 使用Ostro样品制备板结合LC-MS/MS对牛奶中的兽药多残留进行筛查 Michael S. Young和Kim Van Tran 应用优势 ■快速、简单的样品制备可实现高效的多种类/多残留分析 ■从制备的样品中除去潜在的磷脂干扰物 快速、灵敏的UPLC-MS/MS分析 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC Xevo° TQ MS CORTECS UPLC 1.6um色谱柱 OstrolM样品制备板 关键词 牛奶， UPLC-MS/MS，兽药，磷脂 简介 Ostro样品制备板可对生物样品中的碱性药物和相关化合物进行简单、快速的LC-MS测定。Ostro样品板为液液萃取、蛋白质沉淀、过滤以及后续从最终萃取物中清除磷脂提供了方便。本文运用Ostro样品板对牛奶中的兽药多残留进行了筛查。使用此样品板只需简单的几个步骤即可有效沉淀蛋白质并除去潜在的干扰物质，从而完成牛奶样品的制备。萃取的样品通过样品板时，蛋白质通过过滤被去除，而磷脂干扰物则通过被保留在专利的吸附剂上被去除。完成简单的样品制备步骤之后，使用UPLC-MS/MS对复溶样品进行分析。为了证明本方法的适用性，我们从主要的兽药种类中选择了具有代表性的化合物，包括四环素、氟喹诺酮、磺胺类、大环内酯、β-内酰胺和β-肾上腺素能药物。 MS条件 质谱仪： Xevo TQ MS 离子源温度： 150℃ 脱溶剂温度： 500℃ 脱溶剂流速： 1000L/h 锥孔气体流速： 30L/h 碰撞气流速： 0.15mL/min 数据管理： Masslynx 4.1版 表1汇总了本研究中使用的MRM通道和仪器参数。 巧巧 66666 锥孔电压 碰撞能量(eV) 邓巧 332.3>288.0 28 18 332.3>314.0 28 22 金霉素 479.4>444.1 25 25 479.4>462.1 25 16 恩诺沙星 360.3>316.3 30 25 360.3>342.3 30 25 红霉素 734.5>158.9 25 30 734.5>576.2 25 20 林可霉素 407.4>126.2 30 25 407.4>359.4 30 20 苯唑西林 402.1>159.9 25 10 402.1>243.1 25 15 土霉素 461.4>381.0 22 22 461.4>426.3 22 20 青霉素 335.5>160.2 20 15 335.5>176.1 20 10 莱克多巴胺 302.4>107.0 22 25 302.4>284.2 22 15 沙丁胺醇 240.4>48.1 20 25 240.4>222.2 20 10 磺胺甲基嘧啶 265.3>92.1 25 25 265.3>155.9 25 20 磺胺甲嘧啶 279.3>92.0 32 30 279.3>186.1 32 15 四环素 445.5>154.0 25 25 445.5>410.0 25 20 泰乐菌素 916.5>174.1 55 35 916.5>772.4 55 35 (斜体MRM通道用于定量分析) 表1.用于本研究的MRM通道及相关锥孔电压和碰撞能量。 样品制备 将125uL牛奶转移至样品板孔中(样品体样不得大于125uL)。加入375pL0.2%甲酸的乙腈(ACN)溶液。抽吸几次以使其充分混合。洗脱至收集板中。加入100 pL 200 mM甲酸铵的甲醇/ACN(50：50)溶液，充分混合。蒸干并复溶于100 uL ACN/25 mM甲酸铵水溶液(25：75)中。图1展示了使用Ostro样品板时的SPE典型设置。 图1.Ostro样品板用于牛奶分析时的典型设置。 结果与讨论 多残留分析 Ostro样品板的结果与之前发表的方法相当。然而， Ostro样品板操作耗时更少，并且更适用于高通量分析。使用此方法，一般分析人员可在几分钟内制备10个甚至更多的样品，而采用之前的方法则需几个小时。图2显示了恩诺沙星(10ug/L)基质匹配标准品的典型LC-MS色谱图。尽管对于大部分其它化合物来说，使用该方法分析时表现出相似的分析性能，但仍然无法对10 ug/L浓度的金霉素、土霉素和林可霉素进行定量分析。最近研发了一种四环素的替代方法。表2示出了观察到的多残留牛奶分析的回收率数据。 图2.使用Ostro直通式样品板测定牛奶中的恩诺沙星(10ug/L)。 [应用纪要] RT 加标浓度 %回收率 化合物 (min) (ppb) (%RSD) 环丙沙星 0.87 10 100 81(9) 82(8) 金霉素 1.54 10 100 bdl 37(13) 恩诺沙星 1.00 10 100 74(9) 83(7) 红霉素 2.17 10 100 71(14) 50(16) 林可霉素 0.60 10 100 bdl 129(18) 苯唑西林 3.71 10 100 73(9) 71(6) 土霉素 0.97 10 100 bdl 44(5) 青霉素 3.36 10 100 54(14) 66(8) 莱克多巴胺 0.92 10 100 80(7) 87(3) 沙丁胺醇 0.60 10 100 94(13) 87(15) 磺胺甲基嘧啶 1.45 10 100 49(7) 54(9) 磺胺二甲嘧啶 1.61 10 100 51(14) 59(11) 四环素 1.06 10 42(15) 100 52(15) 泰乐菌素 2.39 10 70(14) 100 57(22) 表2.回收率数据(n=6，bdl=检测下限)。 磷脂去除 牛奶中含有大量的磷脂，约占其总脂肪含量的1%。在LC分离中，这些磷脂会直接干扰后洗脱的化合物。此外，结果表明磷脂残留的累积会使反相LC分离的性能变差差。图3展示了采用为鉴定磷脂而选择的MRM通道 (m/z 184>184)对牛奶样品进行分析的UPLC-MS/MS色谱图。下图展示了使用Ostro样品板处理牛奶样品获得的结果。上图为采用蛋白质沉淀(未经SPE纯化)获得的结果。Ostro样品板可有效去除超过98%的磷脂。 图3.使用Ostro样品板从全脂牛奶(3%脂肪)中去除磷脂。 结论 ■展示了使用Ostro样品制备板从牛奶中快速萃取多种兽药。 除四环素外，该方法对其它所有种类的被测化合物均表现出良好的筛查分析性能。 ■使用Ostro直通式样品制备板可有效去除牛奶萃取物中的几乎全部磷脂。 ( 参考文献 ) ( 1 . Optimized Extraction and Cleanup Protocols for LC-MS/MS Multi-Residue Determinationof Veterinary Drugs in Edible Muscle Tissu e s， Waters Application Note 720004144en ) ( 2. HPLC/UV Determination of Tetracyclines in Mil k Using Mixed-Mode SPE and eXtendedPerformance[XP] 2.5 pum Columns， Waters Application Note 720004582en ) ( 3 . Contarini， G a n d Povolo， M.， Phospholipids in Milk Fat： Composition， Biological and T echnological S ignificance， and A nalytical S trategies， Int. J. Mol. Sci ， 1 4(2)，2808- 2831(2013) ) ( 4. E liminating P h ospholipids in D r ug D i scovery E x tr a ctions U sing a F ast， Generic SampleClean-u M ethod， Waters Applicati o n No t e 720004046en ) THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. Waters， The Science of What’s Possible， CORTECS， ACQUITY UPLC， Xevo和MassLynx是沃特世公司的注册商标。Ostro是沃特世公司的商标。其所所有商标均归各自的拥有者所有。 免费售后服务热线：800(400)820 2676WWw.waters.com 使用Ostro样品制备板结合LC-MS/MS对牛奶中的兽药多残留进行筛查