氨基酸中蛋白酶活力检测方案(紫外分光光度)

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MAyTechnology-because you change 紫外分光光度法测蛋白酶酶活力 美析仪器有限公司 关键词：紫外分光光度法；蛋白酶；美析仪器； UV-1700 紫外分光光度计 1、原理 蛋白酶在一定的温度与 pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH 值条件下， 1min 水解酪素产生 lug 酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。 2、试剂和溶液 2.1 三氯乙酸c (CCL3·COOH) =0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 氢氧化钠溶液c (Na0H)=0.5mol/L按 GB601配制。 盐酸溶液c (HCL)=1mol/L及0.1mol/L 1 imol/LHCL：取90mL 酸盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 0.1 mol/LHCL：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6. 02g 和磷酸二氢钠(NaH2P04·12H20)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶 甲液 称取乳酸(80%~90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL. 乙液 称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000) mL。 使用溶液 取甲液8mL，加乙液1nmL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶 甲液 称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。 使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。 上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。 2.5 10g/L酪素溶液称取酪素 1.000g，；，精确至 0.001g， 用少量 0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷冷后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 2.6100ug/mL，L-酪氨酸标准溶液 a、称取预先于105℃干燥至恒重的L一酪氨酸 0.1000g， 精确至 0.0002g，用1mol/L盐酸60mL 溶解后定容至100 mL，即为 1mg/mL 酪氨酸标准溶液。 b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0. 1mol/L 盐酸定容至100mL，即得到100ug/nmLL一酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 3 仪器和设备 3.1 恒温水浴40±0.2℃。 3.2 美析斤外分光光度计UV-1700。 4 分析步骤 4.1 求K值 按下表配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度(A)，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)，根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值；(其K值应在(130~135)范围内)。 管 号 酪氨酸标准溶液的浓 度 (ng/mL) 取 100ug/mL 酪氨酸标准溶液的体积 mL 取水的体积 吸值Abs. 00 0) 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 74 40 4 6 5 50 光 4.2 测定 吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00mL， 其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度(A)。 a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min； b、按下列程序操作： 试管A(空白)试管B(酶试样，需作三个平行试样) 加酶液2.00 mL 加 酶液2.00mL40±0.2℃，2min40±0.2℃，2min加三氯乙酸4.00 mL(摇匀)加酪素2.00mL(已预热)(摇匀)40±0.2℃，10min(精确计时)40±0.2℃，10min(精确计时) 加酪素2.00mL(已预热)(摇匀)加三氯乙酸4.00mL(摇匀) 继续加热10min， 过滤或离心继续加热10min， 过滤或离心于275nm波长，测上清液吸光值于275nm波长，测上清液吸光值c、1.398和166蛋白酶，除反应与显色温度为30±0.2℃外，其掉操作同4.2。 标准曲线作同样处理。 5 计算 在40℃下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。 X=AXK×8/2×1/10×n×E=2/5×AXK×nXE 式中：X——样品的酶活力，(u/mL)； A—―试样溶液的平均吸光度； K——吸光常数； 8一一反应试剂的总体积，mL； 2—―吸取酶液2.00mL： 1/10—一反应时间10min，以1min 计； n——稀释倍数E―—紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0.50； 酸性蛋白酶系数 为0.77). 所得结果表示至整数。 6 结果的允许差 平行试验测定值之差不得超过 3%。 关键词：紫外分光光度法；蛋白酶；美析仪器； UV-1700 紫外分光光度计 http：//www.macylab.comTel： Tel： ttp：//www.macylab.com