养正消积胶囊中齐墩果酸和乌苏酸检测方案(液相色谱仪)

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AN_C_LC-78 引言 养正消积胶囊为补益剂，具有健脾益肾、化瘀解毒之功效。主治不宜手术的脾肾两虚和瘀毒内阻型原发性肝癌辅助治疗，方剂组成为黄芪、女贞子、人参、莪术、灵芝等，其中女贞子中富含齐墩果酸 (oleanolic acid， 0A)和乌苏酸(熊果酸， ursolic acid，UA)。它们是五环三萜类化合物，广泛存在于自然界。据不完全统计，齐墩果酸以游离形式和与糖结合形式广泛存在于约60个科190种植物【2】，熊果酸以游离形式和与糖结合形式分布于约27个科46个属62种植物，0A和UA作为两个结构非常接近的三萜化合物，两者的分离一直是一个困扰化学工作者的难题。Cig色谱柱分离这两个组分时分离度达不到2.0，而且只有在色谱柱与仪器的状态都较好的情况下分离度才能达到1.5，这样对两者的准确定量造成影响。C3o色谱柱适合用来分析脂溶性的化合物，尤其适合三萜类化合物的分离，本实验采用 acclaim C30 色谱柱分离0A和UA，并与C1g的分离效果进行了对比，验证了Cgo色谱柱对三萜类化合物较强的分离能力。 图1.齐墩果酸和乌苏酸结构 仪器 Thermo U3000 高效液相色谱仪 (Thermo Scientific)，超声振荡器 (Thermo Scientific)， Thermo Scientific Chromeleon 6.80色谱系统控制软件。 试剂与标准品 醋酸铵为分析纯级别(国药集团)，甲醇、乙腈为色谱纯级别 (Fisher Scientific)。所有试剂均作空白实验，符合质量控制要求方可使用。水为超纯水机制备(ThermoScientific)。 标准溶液制备 精密称取齐墩果酸10.8mg、乌苏酸9.9mg，置100mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，得含齐墩果酸 0.108mg/mL， 乌苏酸 0.099mg/mL的对照品溶液。 供试品溶液制备 精密称取养正消积胶囊内粉末0.6g， 置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理40分钟，放冷后再称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液。 色谱条件 流动相： Cao分析条件A：1%醋酸铵，B：乙腈-甲醇(75：25)0min A： B (92：8)， 20min A： B (20：80)C18分析条件A：1%醋酸水溶液，B：甲醇·乙腈(70：20)A： B(10：90)流速 1.0mL/min。进样体积：10pL柱温：30℃ 检测器条件： ELSD：evap=65℃， neb=60℃， gas=1.6 SLM 分析柱1： Acclaim 120 C3o (150×4.6mm， 5pm)(PN 075719) 分析柱2： Acclaim 120 C18 (150×4.6mm， 5pm)(PN 059148) 结果与讨论 C30色谱柱测定谱图 图2.C30色谱柱测定谱图 C18色谱柱测定谱图 图 3.C18色谱柱测定谱图 方法的精密度、稳定性和重复性 精密吸取对照品溶液10pL，分别连续进样5次，经C30柱分离后测得0A 和UA2的峰面积 RSD 值分别为 1.43%和1.32%。精密吸取对照品溶液10pL， 分别在0、2、4、6、8和10h进样，测得0A和UA的峰面积RSD值分别为1.73%和1.83%。取养正消积胶囊按照供试品溶液制备项下方法制备供试液3份，注入液相色谱仪，进样量10uL， 0A 和UA的峰面积RSD 值分别为1.49%和1.53%. 方法的线性关系(含量与ELSD 峰面积的关系) 表1.测定结果的对数曲线方程与线性关系 曲线方程 相关系数R 线性范围 (mg/mL) 齐墩果酸 y=13.87x-1.717 0.999 0.02-0.50 乌苏酸 v=30.54x-6.067 0.999 0.02-0.50 以上结果表明 Cgo色谱柱在该含量范围内 ELSD 测定峰面积与含量成良好的线性关系。 样品测定结果 取3批养正消积胶囊囊分用C3o和Cg色谱柱进行测定，0A和UA在C o色谱柱上分离度3.56， Cig色谱柱上1.55。 表2.C30色谱柱测定样品含量结果 齐墩果酸(mg/粒) 乌苏酸 (mg/粒) 两者加和(mg/粒) 110702批 1.59 0.65 2.24 110301批 1.55 0.67 2.22 110102批 1.63 0.70 2.33 表3.C色谱柱测定样品含量结果 齐墩果酸(mg/粒) 乌苏酸 (mg/粒) 两者加和(mg/粒) 110702 批 1.55 0.66 2.21 110301 批 1.50 0.67 2.17 110102批 1.61 0.69 2.30 结论 本方法采用 acclaim Cgo色谱柱测定 OA和UA含量，两者分离度3.56，较C18色谱柱上1.54的分离度有较大改善，能够明确地对两化合物进行定量，本方法可应用于其他品种中0A和UA的含量测定，具有较强的推广意义。 ( 参考文 献 ) ( [1]中国药典，第一部[M ] .北京：中国医药科技出版社， 2015版：1277. ) ( [2 ] 王蓉；邹时英；李艳清；蒋涛；反相高效液相色谱法 同时测定车前草中熊果酸和齐墩果酸[]；光谱实验室； 2011年04期. ) ( [3]崔洪泉；蒋秀芳；高效液相色谱法测定山楂药材中齐 墩果酸和熊果酸的含量[J]；临床合理用药杂志；2011 年13期. ) 养正消积胶囊为补益剂，方剂组成为黄芪、女贞子、人参、莪术、灵芝等，其中女贞子中富含齐墩果酸(oleanolic acid, OA) 和乌苏酸 ( 熊果酸，ursolic acid, UA)。它们是五环三萜类化合物，广泛存在于自然界。OA 和UA 作为两个结构非常接近的三萜化合物，两者的分离一直是一个困扰化学工作者的难题。C18 色谱柱分离这两个组分时分离度达不到2.0，而且只有在色谱柱与仪器的状态都较好的情况下分离度才能达到1.5，这样对两者的准确定量造成影响。C30 色谱柱适合用来分析脂溶性的化合物，尤其适合三萜类化合物的分离，本实验采用 acclaim C30 色谱柱分离OA 和UA，并与C18的分离效果进行了对比，验证了C30色谱柱对三萜类化合物较强的分离能力。