牛奶中喹诺酮类抗生素检测方案(液质联用仪)

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应用文集 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定牛奶中的喹诺酮类抗生素残留 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定动物源性食品中14种喹诺酮类抗生素的方法。样品经处理后，用超高效液相色谱LC-30A在7 min内实现快速分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8040进行定量分析。使用外标法内绘制14种喹诺酮类抗生素的校准曲线，线性良好，相关系数为0.999以上；对不同浓度的标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.437%和4.937%以下，表明仪器精密度良好。 关键词：喹诺酮类抗生素 三重四极杆质谱 牛奶 喹诺酮类(Quinolones)是一类含有4-奎诺酮母核的化学合成抗菌药，它的抗菌谱广、抗菌活性强，广泛应用于畜牧、水产等养殖业中。然而，喹诺酮类药物有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。美国FDA已于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。 高效液相色谱-串联质谱联用技术是近些年来发展很快的分析技术，具有很高的选择性和灵敏度，对复杂基质中的抗生素类残留具有很强的定性能力，准确度高，是目前超痕量残留分析的首选方法。本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定牛奶中14种喹诺酮类抗生素的方法。 1.实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A与三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用系统。具体配置为LC-30ADx2输液泵， DGU-20As在线脱气机， SIL-30AC自动进样器，CTO-30AC柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8040三重四极杆质谱仪， LabSolutionsVer. 5.41 色谱工作站。 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack XR-ODS II 2.0 mm I.D.x150 mm L.，2.2 um流动相： A-0.2%甲酸水溶液； B一甲醇-乙腈溶液(40/60， v/v) 流速：0.3 mL/min 柱温：40℃ 进样量：20pL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为20%，梯度洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 Time(min) Module Command Value 4.5 Pumps Pump B Conc. 40 4.6 Pumps Pump B Conc. 95 5.5 Pumps Pump B Cone. 95 5.6 Pumps Pump B Conc. 20 7 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI(+)加热模块温度：400℃离子喷雾电压：4.5kV扫描模式：多多反应监测(MRM)雾化气：： 氮气 3.0L/min驻留时间：20ms干燥气：：氮气 15 L/min延迟时间：3ms碰撞气： 氩气MRM参数：见表3 DL 温度：：250℃ 1.3标准品溶液的配制 标准物质：共14种，分别为依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹、吡呱酸、萘啶酸和西诺沙星。标准工作溶液配制：用甲醇配制20 mg/L的混合标准中间溶液，用含有0.2%甲酸甲甲醇水(20/80，v/v)溶液稀释成不同浓度的混合标准工作液。各标准物质的具体浓度见表2。 表2混合标准工作液中各标准物质的浓度(ug/L) 名称 浓度1 浓度 2 浓度3 浓度 4 浓度5 浓度6 依诺沙星 1 5 10 50 100 500 氧氟沙星 0.5 2.5 5 25 50 250 诺氟沙星 5 25 50 250 500 2500 培氟沙星 1 5 10 50 100 500 环丙沙星 1 5 10 50 100 500 洛美沙星 0.5 2.5 5 25 50 250 达氟沙星 1 5 10 50 100 500 恩诺沙星 1 5 10 50 100 500 沙拉沙星 1 5 10 50 100 500 噁喹酸 0.5 2.5 5 25 50 250 氟甲喹 0.5 2.5 5 25 50 250 吡呱酸 0.5 2.5 5 25 50 250 萘啶酸 0.5 2.5 5 25 50 250 西诺沙星 5 25 50 250 500 2500 1.4样品前处理方法 牛奶样品的前处理操作方法参照国标《GB/T21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》。 表3 MRM 优化参数 化合物名称 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bais(V) CE(V) Q3 Pre Bais(V) 303.1* -16 -20 -23 依诺沙星 321.2 203.9 -16 -48 -23 362.2 318.2* -30 -18 -24 氧氟沙星 261.1 -30 -28 -19 320.2 302.1* -16 -20 -23 诺氟沙星 231.1 -16 -46 -28 334.2 316.2* -13 -20 -24 培氟沙星 290.1 -13 -16 -22 332.2 314.1* -13 -16 -24 环丙沙星 231.0 -13 -44 -18 352.2 265.0* -18 -22 -20 洛美沙星 308.2 -18 -16 -23 358.2 340.1* -14 -20 -26 达氟沙星 255.0 -14 -42 -29 360.3 342.2* -29 -20 -26 恩诺沙星 316.2 -29 -20 -24 386.2 368.1* -15 -20 -28 沙拉沙星 299.1 -15 -25 -23 262.1 244.1* -30 -18 -30 噁喹酸 216.0 -30 -32 -26 氟甲喹 262.1 244.1* -30 -16 -18 202.0 -30 -36 -23 吡呱酸 304.2 286.1* -30 -18 -22 215.1 -30 -38 -24 萘啶酸 233.1 215.1* -30 -14 -26 187.0 -30 -28 -22 西诺沙星 263.1 245.1* -21 -16 -19 189.0 -21 -30 -22 *表示定量离子 2.结果与讨论 2.1标准样品一级质谱图和产物离子扫描质谱图 图1依诺沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE 值-48V) (右图) 图2氧氟沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V))((右图) 图3诺氟沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V)(右图) 334.2 24培氟沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE 值-25V)(右图) 图5环丙沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V)(右图) 352.2 图6洛美沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE 值-25V))(右图) 200.2 358.2 399.3 378.9 图7达氟沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值-25V)(右图) 图8恩诺沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值-25V)(右图) 386.2 图9沙拉沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V)(右图) 图10噁喹酸的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V)((右图) 图11 氟甲喹的 级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE值-25V) (右图) 345.2 304.3 286.2 217.1 243.1 图12吡呱酸的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V))((右图) 图13萘啶酸的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图 (CE 值-25V) (右图) 图14西诺沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(CE 值-25V) (右图) 2.2标准样品的 MRM色谱图 图15标准样品的 MRM 色谱图 (1：2.5 ug/L吡呱酸； 2：5 ug/L 依诺沙星；3：2.5ug/L 氧氟沙星； 4：25 ug/L诺氟沙星；5： 5 ug/L 培氟沙星； 6：5 ug/L 环丙沙星； 7：2.5 ug/L 洛美沙星； 8：5 ug/L 达氟沙星； 9：5 ug/L恩诺沙星；10：5 ug/L沙拉沙星； 11：25 ug/L 西诺沙星；12：2.5ug/L 噁喹酸；13：2.5 ug/L萘啶酸；；14：2.5 ug/L氟甲喹) 2.3线性范围 将不同浓度的混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线如图16~29所示；所得校准曲线线性关系良好，线性方程及相关系数见表4。 Area(x1，000，000) Area(x100，000) 图16依诺沙星的校准曲线 图17氧氟沙星的校准曲线 Area(x100，000) 图18诺氟沙星的校准曲线Area(x1，000，000) 图21洛美沙星的校准曲线 Area(x1，000，000) 图19培氟沙星的校准曲线 图22达氟沙星的校准曲线 Area(x1，000，000) Area(x1，000，000) 图20环丙沙星的校准曲线 图23恩诺沙星的校准曲线 图24沙拉沙星的校准曲线 图27吡呱酸的校准曲线 图25噁喹酸的校准曲线 图28吡呱酸的校准曲线 图26氟甲喹的校准曲线 图29西诺沙星的校准曲线 表4校准曲线参数 No. 名称 校准曲线 线性范围(pg/L) 相关系数r 1 依诺沙星 Y=(5210.26)X+(3090.70) 1.0~500 1.0000 2 氧氟沙星 Y=(3088.28)X+(4327.79) 0.5~250 0.9998 3 诺氟沙星 Y=(2499.58)X+(1672.78) 5~500 0.9998 4 培氟沙星 Y=(3370.81)X+(26856.7) 1.0~500 0.9993 5 环丙沙星 Y=(2189.90)X+(21093.5) 1.0~500 0.9992 6 洛美沙星 Y=(1382.09)X+(3417.15) 0.5~250 0.9995 7 达氟沙星 Y=(3207.19)X+(7670.04) 1.0~500 0.9999 8 恩诺沙星 Y=(2457.58)X+(12362.3) 1.0~500 0.9992 9 沙拉沙星 Y=(1453.99)X+(7474.59) 1.0~500 0.9994 10 噁喹酸 Y=(9946.96)X+(18523.3) 0.5~250 0.9999 11 氟甲喹 Y=(31449.4)X+(66461.2) 0.5~250 0.9998 12 吡呱酸 Y=(3955.87)X+(2805.99) 0.5~250 1.0000 13 萘啶酸 Y=(57834.6)X+(105320) 0.5~250 0.9999 14 西诺沙星 Y=(7624.15)X+(-8145.69) 5~500 0.9998 2.4精密度实验 对不同浓度混合标准工作液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表5所示。结果显示：不同浓度标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.014%~0.437%和1.309%~4.937%之间，仪器精密度良好。 表5保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 样品名称 RSD% (5pg/L) RSD%(10pg/L) RSD% (50 ug/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 依诺沙星 0.437 4.576 0.272 3.315 0.152 1.309 培氟沙星 0.158 4.419 0.248 3.974 0.065 1.762 环丙沙星 0.273 4.706 0.163 3.438 0.085 2.810 达氟沙星 0.143 3.545 0.186 3.172 0.079 2.468 恩诺沙星 0.212 4.756 0.225 3.750 0.099 2.719 沙拉沙星 0.238 4.353 0.060 1.918 0.119 2.622 RSD% (2.5pg/L) RSD% (5pg/L) RSD% (25 pg/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 氧氟沙星 0.245 4.625 0.300 4.556 0.145 2.719 洛美沙星 0.188 4.937 0.140 4.052 0.119 2.916 噁喹酸 0.023 4.790 0.023 3.308 0.014 2.450 氟甲喹 0.018 2.934 0.014 2.184 0.019 2.251 吡呱酸 0.202 3.765 0.268 3.762 0.036 2.645 萘啶酸 0.057 4.633 0.010 2.592 0.046 2.738 RSD%(25 pg/L) RSD% (50 pg/L) RSD% (250pg/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 诺氟沙星 0.200 3.989 0.252 2.864 0.069 2.706 西诺沙星 0.046 4.384 0.075 1.782 0.040 1.344 2.5灵敏度实验 为考察仪器的灵敏度，将低浓度混合标准工作液按1.2中的分析条件下进行测定。通过LabSolutions Ver. 5.41 软件计算信噪比和检出限(以3倍信噪比计算)，依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、噁喹酸、氟甲喹、吡呱酸、萘啶酸和西诺沙星的信噪比和检出限如表6所示。 名称 浓度水平(ug/L) S/N LOD(ug/L) 依诺沙星 1.00 14 0.24 氧氟沙星 0.50 31 0.05 诺氟沙星 5.00 39 0.43 培氟沙星 1.00 47 0.07 环丙沙星 1.00 8 0.41 洛美沙星 0.50 51 0.03 达氟沙星 1.00 10 0.35 恩诺沙星 1.00 32 0.10 沙拉沙星 1.00 9 3.60 噁喹酸 0.50 40 0.04 氟甲喹 0.50 70 0.02 吡呱酸 0.50 27 0.06 萘啶酸 0.50 44 0.04 西诺沙星 5.00 30 0.56 2.6基质加标实验 选用不含14种喹诺酮类抗生素的牛奶为空白样品，进行基质加标实验，其中依诺沙星、培氟沙星、环丙沙星、达氟沙氟、恩诺沙星添和沙拉沙星的加标含量为2 ug/kg， 氧氟沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、吡呱酸和萘啶酸的加标含量为1 ug/kg， 诺氟沙星和西诺沙星的加标含量为10 ug/kg。牛奶样品的检测色谱图与加标样品色谱图如图30和图31所示。由表7结果可知该方法灵敏度高，对于牛奶样品中的喹诺酮类抗生素检测的测定达到了国标《GB/T21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》水平。 图30牛奶样品的 MRM色谱图(未检出) (x100.000) 图31牛奶加标样品的MRM 色谱图 (1：吡呱酸；2：依诺沙星；3：氧氟沙星；4：诺氟沙星；5：培氟沙星；6：环丙沙星；7：洛美沙星；8：达氟沙星；9：恩诺沙星；10：沙拉沙星；11：西诺沙星；12：噁喹酸；13：萘啶酸；14：氟甲喹) 表7加标样品信噪比(S/N) 名称 加标含量(ug/kg) S/N 依诺沙星 2.00 40 氧氟沙星 1.00 79 诺氟沙星 10.00 45 培氟沙星 2.00 10 环丙沙星 2.00 11 洛美沙星 1.00 7 达氟沙星 2.00 9 恩诺沙星 2.00 17 沙拉沙星 2.00 10 噁喹酸 1.00 16 氟甲喹 1.00 15 吡呱酸 1.00 11 萘啶酸 1.00 58 西诺沙星 10.00 11 3.结论 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定牛奶中14种喹诺酮类抗生素的方法。该方法在7.0 min 之内完成14种目标物的分离分析，且精密度高，线性范围宽，校准曲线的相关系数均在0.999以上。对不同浓度的标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.437%和4.937%以下，系统精密度良好。该方法具有超快速、高灵敏的特点，适合动物食品、水产品中喹诺酮类抗生素残留量的快速检测。 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定动物源性食品中14种喹诺酮类抗生素的方法。样品经处理后，用超高效液相色谱LC-30A在7 min内实现快速分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8040进行定量分析。使用外标法内绘制14种喹诺酮类抗生素的校准曲线，线性良好，相关系数为0.999以上；对不同浓度的标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.437 %和4.937%以下，表明仪器精密度良好。