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液相色谱法测定螺旋霉素发酵液中有机酸 螺旋霉素为大环内酯类抗生素。其分子组成含有1个十六元内酯环,该内酯环的生物合成需要8个前体:5个乙酸,1个丙酸,1个丁酸和1个未知前体(二碳单位)。在螺旋霉素链霉菌中,螺旋霉素的生物合成是由初级代谢供给的活化的乙酸、 丙酸、丁酸等前体单元缩合而成。文献指出,在培养基内加入这些脂肪酸前体可提高螺旋霉素的产量。关于前体的添加时间、添加量及前体的利用度对螺旋霉素发酵的影响都有报道。因此,研究螺旋霉素生物合成中有机酸的种类和变化趋势,对了解螺旋霉素代谢网络,进而指导其工艺优化,提高发酵产量有着极其重要的意义。 在测定发酵液中有机酸的方法中,GC和HPLC是目前最精确和直接的方法。而采用HPLC测定螺旋霉素发酵液中有机酸的含量,样品制备简便,分离效果好,方法的精密度和回收率都很高,速度快,适于大批量发酵液的分析。本方法的建立对研究螺旋霉素生物合成中的有机酸种类和变化趋势,了解螺旋霉素代谢网络提供了一个可靠、快捷的分析手段。 实验部分 仪器 LC-600B智能全控液相色谱仪 (http://www.kj17.com/html/kjcp/yexiangsepuyi_1179_440.html" \t "http://www.kj17.com/html/_blank)1套(包括P600泵2台,UV600检测器1台,进口原装7725i进样阀1只, Zorbax 300-SB C18(150mm×4.6mm i.d.,5μm)色谱柱1根,100μL进样针1根,色谱工作站(反控主机)1套,混合器1只)(南京科捷分析仪器有限公司)、超声波清洗器1台(南京科捷分析仪器有限公司)、溶剂过滤器1套(南京科捷分析仪器有限公司)等。 试剂 流动相的配制:取1.15mL85%的磷酸,用超纯水稀释并定容至1000mL(用NaH2PO4调节PH至2.32),用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空超滤,超声波脱气后备用。 标准溶液配制:精确吸取0.38mL乙酸、0.41mL丙酸、0.42mL丁酸于100mL容量瓶中,用超纯水溶解并定容(稀释成梯度进样分析绘制标准曲线)。 样品处理 取发酵液30mL,滤纸过滤去除菌体,将滤液冷冻保存备用。分析检测时取1mL滤液离心(10000r/min,10min),上清液用0.22μm的膜过滤,待测。 分析条件 色谱柱:Zorbax 300-SB C18(150mm×4.6mm i.d.,5μm) 流动相A:0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节PH至2.32) 流动相B:甲醇 线性洗脱程序:70%A 100%B 流速:0.6mL/min 柱温:35℃ 检测波长:210nm 进样量:20μL 色谱图 有机酸标准液的色谱图 1 乙酸;2 丙酸;3 丁酸 螺旋霉素为大环内酯类抗生素。其分子组成含有1个十六元内酯环,该内酯环的生物合成需要8个前体:5个乙酸,1个丙酸,1个丁酸和1个未知前体(二碳单位)。在螺旋霉素链霉菌中,螺旋霉素的生物合成是由初级代谢供给的活化的乙酸、 丙酸、丁酸等前体单元缩合而成。文献指出,在培养基内加入这些脂肪酸前体可提高螺旋霉素的产量。关于前体的添加时间、添加量及前体的利用度对螺旋霉素发酵的影响都有报道。因此,研究螺旋霉素生物合成中有机酸的种类和变化趋势,对了解螺旋霉素代谢网络,进而指导其工艺优化,提高发酵产量有着极其重要的意义。在测定发酵液中有机酸的方法中,GC和HPLC是目前最精确和直接的方法。而采用HPLC测定螺旋霉素发酵液中有机酸的含量,样品制备简便,分离效果好,方法的精密度和回收率都很高,速度快,适于大批量发酵液的分析。本方法的建立对研究螺旋霉素生物合成中的有机酸种类和变化趋势,了解螺旋霉素代谢网络提供了一个可靠、快捷的分析手段。实验部分仪器LC-600B智能全控液相色谱仪1套(包括P600泵2台,UV600检测器1台,进口原装7725i进样阀1只, Zorbax 300-SB C18(150mm×4.6mm i.d.,5μm)色谱柱1根,100μL进样针1根,色谱工作站(反控主机)1套,混合器1只)(南京科捷分析仪器有限公司)、超声波清洗器1台(南京科捷分析仪器有限公司)、溶剂过滤器1套(南京科捷分析仪器有限公司)等。试剂流动相的配制:取1.15mL85%的磷酸,用超纯水稀释并定容至1000mL(用NaH2PO4调节PH至2.32),用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空超滤,超声波脱气后备用。标准溶液配制:精确吸取0.38mL乙酸、0.41mL丙酸、0.42mL丁酸于100mL容量瓶中,用超纯水溶解并定容(稀释成梯度进样分析绘制标准曲线)。样品处理取发酵液30mL,滤纸过滤去除菌体,将滤液冷冻保存备用。分析检测时取1mL滤液离心(10000r/min,10min),上清液用0.22μm的膜过滤,待测。分析条件色谱柱:Zorbax 300-SB C18(150mm×4.6mm i.d.,5μm)流动相A:0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节PH至2.32)流动相B:甲醇线性洗脱程序:70%A100%B流速:0.6mL/min柱温:35℃检测波长:210nm进样量:20μL色谱图有机酸标准液的色谱图1 乙酸;2 丙酸;3 丁酸
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南京科捷分析仪器有限公司为您提供《螺旋霉素发酵液中有机酸检测方案(液相色谱仪)》,该方案主要用于螺旋霉素发酵液中有机酸检测,参考标准《暂无》,《螺旋霉素发酵液中有机酸检测方案(液相色谱仪)》用到的仪器有科捷仪器LC600C 梯度液相色谱仪。
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