大鼠血浆中内源性5-雄烯二醇含量及药动学检测方案(毛细管柱)

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超北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923药物分析杂志Chin J Pharm Anal2016，36(6)·961· 962· 代谢分析 GC-MS 衍生化法测定大鼠血浆中内源性5-雄烯二醇及药动学研究 胡秋菊1，2，杨代晓'，杨建云，肖炳坤2，黄荣清2* (1.江西中医药大学，南昌330004；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850) 摘要目的：采用SIM模模，建立一种快速、灵敏的 GC-MS 衍生化方法测定大鼠血浆中5-雄烯二醇。方法：以脱氢表雄甾酮-2，2，3，4，4，6-d，(DHEA-d ) 为内标，血浆样品经过甲基叔丁基醚(MTBE)提取，离心，取上清液氮气吹干，通过 BSTFA-TMCS(99：1)衍生化后进行 GC-MS 分析。RESTEK 色谱柱：Rxi@-5ms (30m×0.25区m×0.25mm)；程序升温：初始温度为60℃，维持 1 min，以40℃ ·min'速率升至220℃，再以5℃.min的速率升至300℃，维持5 min； 采用选择离子扫描模式(SIM)，5-雄烯二醇的定性离子为m/z 434、344，定量离子为 m/z 344， DHEA-d，的定性离子为 m/z 366、276，定量离子为 m/z 276。结果：血浆中5-雄烯二醇质量浓度在80~5 000 ng'mL'范围内线性关系良好(r=0.999 3)；低、中、高3个浓度的准确度在70%~103%之间；日内、日间精密度均小于5%；提取回收率(n=4) 在 75.96%~104.01%；低、高2个浓度的血浆样品在室温放置12 h，4℃冰箱中放置 24 h，-20℃保存30d、反复冻融4次，以及衍生化后的样品室温放置4、8、12、24h均能保持稳定。大鼠皮下注射5-雄烯二醇混悬液的药-时曲线符合二室模型，其药代学参数为Ty 为(26.45±8.40) h， AUC(0-1) 为(2887.46±1033.70) 区g.h·L。结论：本方法经方法学验证，可作为大鼠血浆中5-雄烯二醇含量的测定方法，适合药动学研究。 关键词：5-雄烯二醇；内源性激素；抗辐射药物；脱氢表雄甾酮内标； DHEA-d ；血药浓度；药动学研究；双(三甲基硅基)三氟乙酰胺； BSTFA； 三甲基氯硅烷； TMCS；衍生化；气相色谱-质谱法； GC-MS 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2016)06-0961-07 doi：10.16155/j.0254-1793.2016.06.03 Determination for endogenous 5-androstenediol by GC-MSin rat plasma and its pharmacokinetic study HU Qiu-jur， YANG Dai-xiao， YANGJian-yun ， XIAO Bing-kun， HUANGRong-qing2** (1. Jiangxi University ofTCM， Nanchang 330004， China； 2. Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China) Abstractct(Objective： To establish a rapid， sensitive method for the determination of 5-androstenediol in rat plasmausing capillary gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with selected ion monitoring ( 国 家自然科学基 金 ( NO.21375 1 47)； 北 京自然 科 学 基 金.(No.7142 125)； 十二 五 国 家 科技重大专 项 “重大新药创制”综 合性 新药研究技术大 平台 ( N O .2012ZX09301003-001-010) ) 通信作者 Tel：(010) 66931341；E-mail： hrongqing@163.com 第一作者Tel： 13146575710；E-mail： huqiuju1990@163.com 超北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923 药物分析杂志CChin J Pharm Anal 2016，36(6) (SIM) model. Methods： Dehydroepiandrosterone-2，2，3，4，4，6-d(DHEA-d，) was used as an internal standard， and the plasma samples were extracted by methyl tert-butyl ether (MTBE). The supernatant liquid aftercentrifugation was dried by nitrogen and the 5-androstenediol was derived by BSTFA-TMCS (99：1). The sampleswere injected into a RESTEK Rxi @_5ms column (30 m×0.25 um×0.25 mm). The initial column temperaturewas 60 ℃， maintained for 1 min， then raised to 220 C at a rate of 40 ℃ .min， and finally increased to 300 ℃ ata rate of5 C·min and maintained for another 5 min. The qualitative ions were m/z 434， 344 and the quantitativeion was m/z 344 of5-androstenediol， while the qualitative ions were m/z 366， 276 and the quantitative ion was m/z276 of DHEA-d， with the SIM model. Results： The method was validated over the concentration range of 80-5 000ngmLfor 5-androstenediol in rate plasma， and there was excellent linearity (r’=0.999 3). The accuracy oflow， middle and high mass concentrations was between 70% and 103% and the intra-day and inter-day RSD wereboth below 5% and the recovery was 75.96%-104.01% over the four concentration levels were evaluated. All theanalytes of low and high concentrations in serum were stable at room temperature for 12 h， at 4 C for 24 h， at-20 C for 30 days ， after four-cycle freeze-thaw and at room temperature for 4， 8， 12，24 h after derivatization. Thepharmacokinetics behavior after subcutaneous injection of 5-androstenediol could be described by a two-compartmentmodel. The main pharmacokinetic parameters were as follows： the half-life was (26.45±8.40)h，AUC (o-t) was(2 887.46±1033.70) ug.h.L. Conclusion： The established method could be used as a quality control methodfor 5-androstenediol in rat plasma after methodology validation， which is also suitable for pharmacokinetic study.Keywords：5-androstenediol； endogenous hormones； antiradiation drug； dehydroepiandrosterone internalstandard；DHEA-d；drug concentration in plasma； pharmacokinetic study；bis (trimethyl silyl) three fluoroacetamide； BSTFA； trimethyl chlorosilane； TMCS； derivatization； GC-MS 随着核武器威胁的不断增加，核爆炸以及核泄漏等事故时有发生，辐射前防护及辐射后治疗显得尤为重要。在辐射剂量率大于 0.2 Gy min ，全身辐射剂量在2~8 Gy 之间的条件下，将会出现急性辐射损伤(ARS)，表现为骨髓抑制以及淋巴系统损伤2.电离辐射对造血系统损害较大，易引起出血，对胃肠道黏膜有一定的损伤，并且显著降低身体的免疫力，辐射引起的易感体质是造成军事伤亡和居民死亡率高的主要原因13-41。为了减轻核辐射对人体的危害，研究出有效的、无毒的抗辐射药物显得尤为重要5]。5-雄烯二醇是一种内源性的激素，主要由雌性动物肾上腺皮质内层的网状带分泌161，能够显著地提高出现急性辐射损伤的小鼠及非人类的灵长类的存活率，主要是提高辐射小鼠骨髓中的单核粒细胞集落形成，增加中性白细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板以及红细胞的数量对抗辐射导致的骨髓抑制[7-10]。本文建立了 SD大鼠血浆中抗辐射药物5-雄烯二醇的GC-MS 方法，为5-雄烯二醇的药动学研究奠定了科学基础。 1仪器与试药 1.1仪器 GCMS-QP2010 SE(日本岛津公司)；LDZ5-2 型台式离心机(北京医用离心机厂)； TGL-16B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；NV-15G 氮气吹干仪(成都塞斯特仪器仪表有限公司)； AdventurerAR1140分析天平(美国OHAUS 公司)； SartoriusBP211D 分析天平(德国 Sartorius 公司)；QL-901涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；SB-5200 DTDN 超声波清洗机(宁波新艺生物科技股份有限公司)。 1.2试药 0.9%生理盐水(石家庄四药有限公司)；双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS) (99：1) (Sigma-aldrich 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；乙腈(色谱纯，比利时 Fisher试剂有限公司)；DHEA-d，(含量≥98%，同位素含量≥97%， Sigma-aldrich 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)；肝素钠注射液(2 mL： 12 500 IU，江苏万 超北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923 邦生化医药股份有限公司)；甲基叔丁基醚(现代东方(北京)科技发展有限公司)；乌来糖(氨基甲酸乙酯，含量(C，H，NO，)≥ 98.0%，国药集团化学试剂有限公司)；普通氮气(纯度≥99.5%)；5-雄烯二醇混悬液(批号-20150823，规格为100 mg'mL，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供)；空白辅料混悬液(批号-20150823，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供)；5-雄烯二醇对照品(原料药，批号-20150303，纯度 99.90%，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供)；清洁级雄性 SD 大鼠，体重(260±20)g，由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号为 SCXK- (军)2012-0004。 2方法与结果 2.1 血药浓度测定 2.1.1 色谱条件色包谱柱：RESTEK Rxi@-5ms (30m×0.25区m×0.25mm)；载气：氦气；流速：1.0mLmin，不分流进样；进样口温度：280℃；进样体积：1区L；程序升温：初始温度为60℃，维持1 min，然后以40℃.min的速率升至220℃，再以5℃.min的速率升至300℃维持5 min。 2.1.2 质谱条件 接口温度：280℃；离子源温度：230℃；电离方式：EI；电子轰击能量：70eV；溶剂延迟时间：3 min；倍增器电压：1.0kV；扫描方式：选择离子扫描(SIM)，5-雄烯二醇的定性离子为 m/z 434、344，定量离子为 m/z 344， DHEA-d，(内标)的定性离 子为 m/z 366、276，定量离子为 m/z 276。 2.1.3 标准溶液和内标溶液的配制 精密称取5-雄烯二醇对照品 10 mg 于10 mL量瓶中，加约5 mL乙腈超声(功率150，频率50kHz)溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到5-雄烯二醇标准储备液(1mg*mL')，并以乙定定量稀释配制成质量浓度分别为0.2、0.5、1、2、3、5、7.5、10、12.5ug'mL'的标准溶液。 精密称取内标 DHEA-d， 1 mg 于10 mL量瓶中，加约5 mL 乙腈超声溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，得到 DHEA-d， 内标储备液，并以乙腈定量稀释配制成1ug'mL的内标溶液，4℃冰箱中保存。 2.1.4 血样处理和测定方法 取大鼠血浆200 区L于5 mL玻璃离心管中，加入质量浓度为1区gmL'的内标溶液20区L，涡旋 10s，加入甲基叔丁基醚600区L，涡旋 2 min， 3 000 r. min'离心10 min，重复萃取2次，合并2次萃取所得上清液，用氮气吹干，加入衍生化试剂 BSTFA-TMCS (99：1)50区L，密封，在70℃水浴条件下反应 45 min，取出，放置至室温，进样1L. 2.1.5 专属性5-雄烯二醇与衍生化试剂 BSTFA-TMCS (99：1)反应式见图1。取大鼠空白血浆、大鼠给药后血浆、空白血浆加入-一定量的5-雄烯二醇和内标各20区L，按“2.1.4”项下方法操作，比较三者的5-雄烯二醇和内标的提取离子流图，见图2、3。 图1 5-雄烯二醇与 BSTFA 反应式Fig. 1 The reaction equation of 5-androstenediol and BSTFA 图22大鼠皮下给药3小时血浆的 GC/MS 提取离子流图 Fig.G2as chromatography /mass spectrometric selected ion monitoring (GC/MS) chromatogram of plasma from SD rats administered with 5-androstenediolby subcutaneous for 3 hours. 药物分析杂志cChin J Pharm Anal 2016，36(6) A.空白血浆中的5-雄烯二醇(5-androstenediol from blank plasma)B.大鼠皮下给药3h后血浆中的5-雄烯二醇(5-androstenediol fromplasma of SD rats administered with 5-androstenediol by subcutaneous for 3 h)C.空白血浆中加5-雄烯二醇(5-androstenediol was added to blankplasma) D. 空白血浆中的DHEA-d， (DHEA-d， from blank plasma)E.空白血浆样品中加 DHEA-d， (DHEA-d， was added to blank plasma) 图3SIM模式下提取的离子流图 Fig. 3The extracted ion chromatograms from SIM model 在上述色谱条件下，5-雄烯二醇的保留时间为 14.801min，内标 DHEA-d 的保留时间为 14.211 min，可见血浆中内源性物质不干扰5-雄烯二醇的测定，该方法具有良好的专属性。 2.1.6空白血浆中5-雄烯二醇浓度测定取空白血浆200区L，按“2.1.4”项下方法操作，平行3份；另取0.2区gmL'的5-雄烯二醇标准溶液20区L，加 入1区gmL'的 DHEA-d，内标溶液20区L，吹干，按“2.1.4”项下方法衍生化，进样1区L，平行3份。采用内标一点法计算空白血浆中5-雄烯二醇的浓度。结果空白血浆中5-雄烯二醇的质量浓度为 5.58 ng.mL. 2.1.7线性关系精密移取空白血浆200区L，分别加入20区L不同浓度的标准溶液 20区L，配制成相当于5-雄烯二醇质量浓度分别为80、200、400、800、1200、2000、3000、4000、5000 ngmL的标准含药血样，按“2.1.4”项下方法操作，进行 GC-MS分析。以5-雄烯二醇与内标峰面积的比值减去空白血浆中 5-雄烯二醇与内标的比值为纵坐标，以5-雄烯二醇的质量浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程： 2.1.8精密度、准确度考察 精密移取空白血浆200区L，分别加入0.2、2、10区g*mL的标准溶液各 20区L，配制成低(200 ng*mL')、中 (800 ngmL')、高(4 000 ng mL ') 3个浓度的标准含药血样，每个浓度平行5份，按“2.1.4”项下方法操作，连续制备，并测定3d，将5-雄烯二醇的峰面积与内标峰面积的比值，代入标准曲线求得5-雄烯二醇的浓度。以测得浓度减去空白血浆中5-雄烯二醇的浓度与理论浓度的百分比作为准确度，结果低、中、高3个浓度的准确度在70%~103%之间，日内、日间精密度均小于5%，符合方法学验证要求。 2.1.9 提取回收率精密移取空白血浆 200区L，分别加入0.2、2、10区g'mL'的标准溶液各20区L，配制成低(200ngmL ')、中(800 ngmL')、高(4000 ngmL')3个浓度的标准含药血样，每个浓度平行5份，记录5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积比值(A)；精密移取空白血浆200区L，平行5份，按“2.1.4”项下方法操作，记录空白血浆中5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积比值(B)；另取相应浓度的标准溶液和内标溶液直接进行衍生化，同法进行 GC-MS分析，记录5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积比值(C)。以(A-B)/C×100%计算血浆中5-雄烯二醇上述4个浓度的提取回收率分别为(75.96±4.71)%、(104.01±7.17)%、(98.03±3.04)%和(101.80±3.13)%，说明提取回收率良好。 2.1.10 基质效应精密移取空白血浆200区L，按“2.1.4”项下方法进行液-液萃取后吹干，分别加 超北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：18911849923 JPA 药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2016，36(6) 入0.2、2、10区g'mL'的标准溶液各20区L，以及1区gmL'DHEA-d， 溶液各20区L，吹干，按“2.1.4”项下方法衍生化，进行 GC-MS分析，记录5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积比值(D)；另取相应浓度的标准溶液和内标溶液直接进行衍生化，记录相应浓度5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积比值(E)。以(D-B)/E×100%计算血浆中3个浓度的5-雄烯二醇的基质效应分别为(74.92±4.92)%、(91.51±3.67)%和(94.01±1.08)%，RSD 在1.15%~6.57%之间。 2.1.11 稳定性试验精密移取空白血浆 200区L，分 别加入0.2、10区gmL'的标准溶液各20区L，配制成低(200 ngmL ')、高(4000 ngmL ')2个浓度的标准含药血样，每个浓度平行3份，按“2.1.4”项下方法操作，计算5-雄烯二醇峰面积与内标峰面积的比值，代入标准曲线求得5-雄烯二醇的浓度。考察标准含药血样在室温放置 12 h，4℃冰箱中放置24 h，-20℃保存30d，反复冻融4次，以及衍生化后的溶液放置4、8、12、24h对稳定性的影响。结果表明在上述条件下，5-雄烯二醇在血浆中均能保持稳定。结果见表1。 表1 血浆中5-雄烯二醇分析方法的稳定性(n=3) Tab.1 Stability of 5-androstenediol in plasma 条件(conditions) 低浓度(low density) 高浓度 (high density) 测定值(found) / RSD/% 测定值(found)/ RSD/% (ng mL) (ng'mL) 0 时间 (time) determination immediately 204.62±9.09 4.4 4152.10±89.79 2.2 室温放置12 h (room temperature for 12 h) 188.03±3.34 1.8 4018.76±187.34 4.7 4℃保存 24h (4℃ for 24 h) 200.99±8.49 4.2 3 885.43±183.54 4.7 冻融 4次 (four freeze-thaw cycles -20℃保存30d 207.96±4.76 2.3 4185.43±81.92 2.0 (freezing for 30 days at-20 C) 199.03±9.67 4.9 4052.10±130.69 3.2 衍生物室温放置4 h(room temperature for 4 h 215.99±4.76 2.2 3952.10±145.12 3.7 after derivatization) 衍生物室温放置8 h (room temperature for 8 h 207.96±6.27 3.0 4118.76±126.81 3.1 after derivatization) 衍生物室温放置 12 h (room temperature for 12 h 188.03±3.34 1.8 3992.10±176.35 4.4 after derivatization) 衍生物室温放置 24 h (room temperature for 24 h after derivatization) 202.66±4.89 2.4 4085.43±175.40 4.3 2.2 药代动力学 2.2.1 血浆样品的采集 取8只SD大鼠，实验前适应性喂养3d，随机分为给药组(6只)空白组(2只)，称重，给药组按100 mg kg剂量皮下注射5-雄烯二醇混悬液，给药后于0.08、0.25、0.5、1、2、3、5、8、12、24、36、48、72h眼眶采血0.5mL，空白组给予相同体积的空白辅料，于早上8点至晚上8点每隔2h眼眶采血0.5 mL 于1.5 mL 涂有肝素钠的 EP 管中，在 12000r min' 下离心 10 min，取上清液，于-20℃下保存。 2.2.2 药时曲线及药代动力学参数按“2.2.1”和“2.1.4”项下方法操作，计算血浆药物浓度。结果表明：1d之中空白大鼠血浆中5-雄烯二醇的浓度基本上保持恒定，结果见图4，给药组不同时间点的血药 浓度经 DAS 2.1.1统计拟合后，显示大鼠皮下注射5-雄烯二醇混悬液在体内的代谢符合二房室模型，药时曲线见图5，药动学参数见表2。 3 讨论 3.1 5-雄烯二醇浓度测定方法的选择 有研究表明，采用 LC-MS 分析类固醇类激素时，含有酚羟基的类固醇类激素(如雌二醇、雌三醇、雌酮)在电喷雾离子化(ESI)模式下能够被离子化，具有很高的灵敏度111，但是5-雄烯二醇缺少这种结构特性，使其在HPLC-MS 中的灵敏度很低。由于5-雄烯二醇结构中含有2个羟基，采用 GC-MS，通过硅烷化处理可以显著提高其挥发性、热稳定性以及改善峰形，未衍生化时，能够检测到5-雄烯二醇的质量浓度为5 ug'mL，衍生化后5-雄烯二醇的检 图4空白大鼠血浆的5-雄烯二醇的浓度-时间曲线(n=2) Fig. 4Average plasma concentration-time curve of 5-androstenediol ofblank rat plasma 图5 100 mg 'kg'5-雄烯二醇混悬液在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线(n=6) Fig.5Average plasma concentration-time curve of 5-androstenediolsuspension at the dosage of 100 mgkg 表25-雄烯二醇在大鼠体内的药代动力学参数(n=6) Tab.2 The main pharmacokinetic parameters of 5-androstenediolsuspension in rats 参数(parameter) x±s AUC(01)/(区ghL) 2 887.46±1033.70 AUC(0)/(区ghL) 3291.81±1114.46 MRT(0-t)/h 21.58±2.00 T/h 26.45±8.40 T/h 0.14±0.088 Cmax/(区gL') 336.58±132.13 CL/(Lh kg) 32.83±8.80 V/(L.kg) 1 264.02±525.33 测限为10 ng'mL'，能够满足血浆中5-雄烯二醇的浓度测定。 3.2 衍生化条件的优化 采用 GC-MS 的方法测定生物样品中的类固醇类激素所采用的衍生化试剂有吡啶-[BSTFA-TMCS(99∶1)](1：1)以及 BSTFA-TMCS(99：1)[12-13]，因此一本文考察了以50 uL BSTFA-TMCS (99：1)、50uL等量的吡啶和 BSTFA-TMCS (99：1)的混合溶液为衍生化试剂时，对衍生化效果的影响，结果表明无显著性差异，由于吡啶显弱碱性，对毛细管色谱柱产生不利的影响，故衍生化试剂选择 BSTFA-TMCS(99：1) BSTFA-TMCS(99： 1) 作为衍生化试剂，衍生化反应完成后，比较了直接进样和用氮气吹干后用乙腈复溶后进样的差异，结果发现后者的重现性较差，推测衍生化产物在氮气的吹干过程中有损失，因此最终确定以 BSTFA-TMCS (99 ：1)作为衍生化试剂，衍生化完成后直接进样。 考察衍生化反应时间为 45 min，反应温度为40、50、60、70、80℃时，对衍生化结果的影响，结果表明，随着反应温度的增加，内标的峰面积基本上保持不变，样品峰面积不断增大，当达到60℃时，再随着反应温度的增加，峰面积基本上保持不变，为保证衍生化反应完全，最终选择衍生化反应温度为70℃；考察反应温度为70℃，反应时间为15、30、45、60、90min时，对衍生化结果的影响，结果表明，随着反应时间的延长，内标的峰面积无显著性差异，样品的峰面积不断增大，当达到45 min 时，峰面积达到最大，因此最佳的反应温度确定为 45 min。 3.3 萃取溶剂的选择 本文考察了以甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙醚为萃取溶剂时，对测定结果的影响，结果以乙酸乙酯为萃取溶剂时的基质效应较大，以乙醚为萃取溶剂时，回收率较低，以甲基叔丁基醚为萃取溶剂时，基质效应较小，回收率较高，这与文献中以甲基叔丁基醚为萃取溶剂时提取效率最高L141相一致，因此最终选择以甲基叔丁基醚为萃取溶剂。 3.4 小结 本文建立了 GC/MS 衍生化的方法测定了大鼠血浆中 5-雄烯二醇的方法，采用液-液萃取并进行衍生化的前处理方法灵敏度高，重复性好，回收率高， 能够满足5-雄烯二醇的药动学研究要求。皮下注射的药动学参数为 AUC (0-) 为(2887.46±1033.70) ug·hL，Tu2为(26.45±8.40)h。 ( 参考文献 ) ( [1 ] ALLI S ON G. 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J Steroid Biochem Mo l B i ol， 2011， 12 7 (3-5)：396 ) ( (本文 于2 015年11月7 日 收到) ) 茅苍术麸炒前后对乙酸致胃溃疡大鼠胃动素和胃泌素的影响* 于艳1，袁媛2，贾天柱3，才谦 (1.辽宁中医药大学附属医院中医药实验中心，沈阳110847；2.辽宁省中医药研究院，沈阳110034； 3.辽宁中医药大学药学院，大连116600) 摘要目的：考察茅苍术麸炒后对乙酸致胃溃疡大鼠血清及胃组织中胃动素(MTL)和胃泌素(GAS)的影响，初步探讨茅苍术麸炒后抗胃溃疡作用变化的机理。方法：实验随机分成10组，即假手术组、模型组、奥美拉唑组、三九胃泰组、茅苍术生品低剂量组、茅苍术生品中剂量组、茅苍术生品高剂量组，茅苍术麸炒品低剂量组、茅苍术麸炒品中剂量组和茅苍术麸炒品高剂量组。参考 Okabe 方法进行适当改良，即外科手术法以乙酸诱导大鼠胃溃疡模型。采用常规组织病理学 HE 染色法观察胃组织病理改变情况，采用酶联免疫吸附 (ELISA) 法检测血清及胃组织中 MTL 和 GAS 的含量。结果：茅苍术麸炒品抗胃溃疡的作用优于生品。与假手术组比较，模型组大鼠血清及胃组织中 MTL 和 GAS 的含量明显降低；与模型组比较，茅苍术生品和麸炒品各组血清及胃组织中 MTL 和 GAS 的含量均有不同程度的升高，麸炒品的作用优于生品。结论：茅苍术麸炒后抗胃溃疡的作用增强，其作用机理部分是由于促进 MTL 和 GAS 的分泌。关键词：茅苍术麸炒品；中药炮制；麸炒法；胃动素(MTL)；胃泌素(GAS)；抗胃溃疡； ELISA； 中药活性分析 中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793(2016)06-0968-06 doi： 10.16155/j.0254-1793.2016.06.04 Effects of Rhizoma Atractylodis Lanceae on motilin andgastrin in rat model of gastric ulcer inducedby acetic acid before and after processing YU Yan ，YUAN Yuan ， JIA Tian-zhu’， CAI Qian’ (1.Experimental Center of Traditional Chinese Medicine， The Affiliated Hospital， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847， China； 2. Institute of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province， Shenyang 110034， China； 3. School of Pharmacy， Liaoning University ofTraditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China) Abstract Objective：To investigate the effect of Rhizoma Atractylodis Lanceae on levels of motilin (MTL) andgastrin (GAS) in the rat model of gastric ulcer induced by acetic acid after processing， andevaluate the mechanismsof action involved in the anti-ulcer properties of Rhizoma Atractylodis Lanceae. Methods： All rats were randomlydivided into the following 10 groups： sham-operated group， model group，omeprazole group， Sanjiu Weitai granule，low dose group of the crude Rhizoma Atractylodis Lanceae， middle dose group of the crude Rhizoma Atractylodis Lanceae，high dose group ofthe crude Rhizoma Atractylodis Lanceae， low dose group ofthe processed Rhizoma ( * 国 家自然科学基金 项 目 ( 81202919)；国家中医 药 管理局 中医 药行 业 科研专项项目 ( 2011 0 700712) ) ( 第 一 作 者 Tel： 18909816763； E -mail：95142012@qq.com ) www.ywfxzz.cn Chines Journal of Pharmaceutical Analysis 药物分析杂志网址：：标www. yuweichina.com 邮箱watercom GC-MS 衍生化法测定大鼠血浆中内源性5- 雄烯二醇及药动学研究目的：采用SIM 模式，建立一种快速、灵敏的GC-MS 衍生化方法测定大鼠血浆中5- 雄烯二醇。方法：以脱氢表雄甾酮-2，2，3，4，4，6-d6（DHEA-d6）为内标，血浆样品经过甲基叔丁基醚（MTBE）提取，离心，取上清液氮气吹干，通过BSTFA-TMCS（99∶1）衍生化后进行GC-MS 分析。RESTEK 色谱柱：Rxi -5ms（30 m×0.25 um×0.25 mm）；程序升温：初始温度为60 ℃，维持1 min，以40 ℃·min-1 速率升至220 ℃，再以5 ℃·min-1 的速率升至300 ℃，维持5 min；采用选择离子扫描模式（SIM），5- 雄烯二醇的定性离子为m/z 434、344，定量离子为m/z 344，DHEA-d6 的定性离子为m/z 366、276，定量离子为m/z 276。结果：血浆中5- 雄烯二醇质量浓度在80～5 000 ng·mL-1 范围内线性关系良好（r2=0.999 3）；低、中、高3 个浓度的准确度在70％～103％ 之间；日内、日间精密度均小于5％；提取回收率（n=4）在75.96％～104.01％；低、高2 个浓度的血浆样品在室温放置12 h，4 ℃冰箱中放置24 h，-20 ℃保存30 d、反复冻融4 次，以及衍生化后的样品室温放置4、8、12、24 h 均能保持稳定。大鼠皮下注射5- 雄烯二醇混悬液的药- 时曲线符合二室模型，其药代学参数为T1/2 为26.45±8.40）h，AUC（0-t）为（2 887.46±1 033.70）g·h-1·L-1。结论：本方法经方法学验证，可作为大鼠血浆中5- 雄烯二醇含量的测定方法，适合药动学研究。