大鼠尿液中异丙嗪及其主要代谢物检测方案(毛细管柱)

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北京豫维科技有限公司联系人：水先生电话：]18911849923分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis)第29卷第3期2010年3月Vol. 29 No.3220~225 221第3期 大鼠尿液中异丙嗪及其主要代谢物的GC-MS分析 黄克建，朱定姬，李宏森'，林翠梧，李 璐，刘晓锋1，2 (1.广西壮族自治区公安厅物证鉴定中心，广西南宁530012； 2.广西大学化学化工学院，广西 南宁530004) 摘 要：采用气相色谱-质谱(GC-MS)分析了大鼠尿液中的异丙嗪及其代谢产物。尿液经β-葡萄糖醛酸酶酶解， Oasis@ HLB 3 mL 固相萃取柱提取后。以 Restek Rtx-5MS(30 mx0.25 mm×0.25 um)石英毛细管色谱柱为分析柱，经GC-MS分离检测。根据质谱图对代谢物的结构进行鉴定。结果表明：在大鼠尿液中检出了吩噻嗪、去甲基异丙嗪、异丙嗪亚砜、2-羟基去甲基甲丙嗪、二羟基异丙嗪、顺-N-(1-丙烯基)吩噻嗪、反-N-(1-丙烯基)吩噻嗪、顺-N-(1-丙烯基)吩噻嗪砂、反-N-(1-丙烯基)吩噻嗪砜、顺-N-(1-丙烯基)吩噻嗪亚砜及反-N-(1-丙烯基)吩噻嗪亚砜11种代谢物。对异丙嗪在大鼠体内的氧化、还原等主要代谢途径进行了讨论。 关键词：异丙嗪；尿液；代谢物；气相色谱-质谱 中图分类号：0657.71； R917 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2010)03-0220-06 doi： 10.3969/j. issn. 1004-4957.2010.03.002 Analysis of Promethazine and Its Metabolites in Rats Urine by GasChromatography -Mass Spectrometry HUANG Ke-jian'， ZHU Ding-ji ， LI Hong-sen’， LIN Cui-wu， LI Lu’， LIU Xiao-feng (1. Institute of Forensic Science， Public Security Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning5530012.China； 2. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China) Abstract： A gas chromatography and mass spectrometrie(GC-MS) method was developed for the a-nalysis of promethazine(PMZ) and its metabolites in wistar rat with the electron ionization(EI) andthe positive chemical ionization(PCI) mode. The sample was hydrolyzed with B-glucuronidase， andextracted by a Oasis@ HLB 3 mL solid phase extraction(SPE). The separation of target compoundswas performed on a Restek Rtx -5 MS(30 m×0.25 mm×0.25um) capillary column. The molecu-lar structures of the metabolites were identified based on their MS spectra. The result indicated thatPMZ and its eleven metabolites， including phenothiazine， desmethylpromethazine， promethazinesulphoxide， 2-hydroxy-desmethylpromethazine， dihydroxypromethazine， cis-N-(1-propenyl)phe-nothiazine， trans-N-(1-propenyl) phenothiazine， cis-N-(1-propenyl) phenothiazine-5-oxide， trans-N-(1-propenyl) phenothiazine-5-oxide， cis-N-(1-propenyl) phenothiazine-5，5-dioxide， trans-N-(1-propenyl) phenothiazine-5， 5-dioxide were found in rat urine. The main metabolic process of PMZ inrat bio-body was also discussed. Key words： promethazine； urine； metabolites； GC-MS 异丙嗪(Promethazine， PMZ)，又名非那根、抗胺荨、普鲁米近等，常用于治疗过敏、止吐、镇静、镇痛及哮喘等。1951年被美国食品药品管理局(FDA)批准使用，有糖浆溶液及片状两种，以糖浆溶液较常见。其药性与可待因相似，1952年被 FDA 批准可与可待因联合使用(2)。2003年以来，我国的云南、广东、广西、湖南等地出现了俗称“1+1” “丁丙套装”、“套餐”、、“三合一”、.“丁丁”混合毒品注射滥用的情况，主要是将丁丙嗒啡溶于安定注射液、东莨菪碱注射液或水中，与盐酸异丙 ( 收稿日期：2009-12-04；修回日期：2010-01-20 ) ( 基金项目：公安部应用创新计划资助项目(2007YYCXGXST081)；广西壮族自治区公安厅科学研究与技术开发计划资助项目(桂公(科 技)[2005]4号) ) ( 第一作者：黄克建(I969-)，男，广西崇左人，高 级 工程师， Tel： 0771-2892352， E -mail： huangke ian911@163. com ) 黄克建等：大鼠尿液中异丙嗪及其主要代谢物的 GC-MS分析 嗪等药物混合注射[3-69。异丙嗪在生物体内易代谢，口服或静脉注射，仅有少于1%的异丙嗪原体通过 尿液排出17-8]。因此，研究异丙嗪在生物体内的代谢，对打击吸食毒品的违法犯罪活动具有重要意义。国内外关于异丙嗪在体内代谢的研究报道较少，大多是异丙嗪及其代谢物检测方法的研究，且报道的代谢物存在差异。文献[9-10]利用高效液相色谱法(HPLC)检测血液、尿液中 PMZ 及异丙嗪亚砜( Promethazine sulphoxide， PMZSO)、去甲基异丙嗪亚砜(Desmethylpromethazine sulphoxide， DMPMZ-SO)、去甲基异丙嗪(Desmethylpromethazine， DMPMZ)；文献[11]利用 HPLC 法检测生物检材中的PMZSO、DMPMZ 及去二甲基异丙嗪(Desdimethylpromethazine， DDMPMZ)；文献[12-13]利用紫外导数光谱法及超高效液相色谱-质谱检测尿液及动物源食品中 PMZ 及 PMZSO 代谢物；文献[14]用GC-MS 法检测人尿中2-羟基去甲基异丙嗪(2-Hydroxy-desmethylpromethazine，2-HDMPMZ)代谢物。 本文利用 GC -MS 法对大鼠尿液中异丙嗪及其代谢产物进行检测，推测了异丙嗪在大鼠体内的主要代谢产物及代谢途径。 实验部分 1. 1 仪器与试剂 QP 2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司)，配电子电离轰击源(EI)，正化学电离源(PCI)；3-18R 高速冷冻离心机(美国 Tomos公司)；固相萃取仪(美国 Supelco 公司)； Oasis" HLB 3 mL 固相萃取柱(美国 Waters 公司)； TTL-DC 型氮吹仪(北京同泰联科技发展有限公司)。 盐酸异丙嗪(公安部物证鉴定中心)；异丙嗪亚砜(纯度98%，加拿大 TRC 公司)；β-葡萄糖醛酸酶(美国 Sigma 公司， 22 mg， 1 134 600 u/g)， 临用时用 pH 4.8的醋酸钠缓冲溶液配制成5000 u/mL；甲醇、异丙醇(美国 Fisher 公司)；乙醚、氯仿等其他试剂均为国产分析纯。 1.22 GC-MS测定条件 GC条件：色谱柱： Restek Rtx -5 MS 石英毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25 p.m)；柱温：初始温度80℃ 保持1 min， 以5℃/min 程序升温至220℃，保持1 min， 再以3℃/min 程序升温至290℃，保持15 min； 进样口温度：280℃；载气(He)流速：1.42mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 pL。 MS条件：EI源和正化学电离源(PCI)；电子能量：70eV；倍增器电压：1.0kV；传输线温度：250℃；离子源温度：200℃；扫描方式：全扫描(SCAN)；扫描范围：55~350 u； CI反应气： CH4。 1. 3 样品采集 大鼠空白尿液：取5只Wistar 大鼠，各灌胃7 mL 蒸馏水，收集24h内的尿液，总体积为30 mL。大鼠阳性尿液：取5只Wistar 大鼠，各灌胃7 mL的 0.36 g/L 盐酸异丙嗪水溶液，收集灌胃后24 h 内的尿液，总体积为25 mL。 1.4 样品预处理 取20 mL 阳性大鼠尿液于锥形瓶中，用0.1 mol/L盐酸调至pH6.0， 加入 pH 4.8醋酸钠缓冲溶液5 mL、β-葡萄糖醛酸酶溶液0.5 mL， 摇匀，57℃酶解30 min， 用1 mol/L NaOH 调至 pH9.0， 离心10min(7 000 r/min)， 上清液过 Oasis HLB 3 mL 固相萃取小柱(预先用3mL甲醇、3mL超纯水、3 mLpH 9.2的 Tris-HCl缓冲液活化)，用3mL 5% 甲醇水溶液淋洗杂质，弃去淋洗液，离心5 min(7 000r/min)， 分别用3mL乙醚、3 mL氯仿-异丙醇(体积比9：1)洗脱待测物，合并洗脱液，70℃氮气吹干，残渣用100 u.L甲醇溶解， 供 GC-MS(EI、PCI)检测。同时平行作空白鼠尿。 2 结果与讨论 2. 1(GC-MS分析结果 按“1.2”分析条件对大鼠尿液样本提取物进行 GC-MS(EI、PCI)分析。图1为阳性大鼠尿液的 GC - MS(EI)总离子流图，与空白样本相比，阳性大鼠尿液样本中新增12个色谱峰，分别为 M1~M12，保留时间分别为27.92、28.7529.43、31.77、32.64、35.63、36.34、 图1 阳性大鼠尿液的 GC -MS(EI)总离子流图 Fig. 1 GC-MS(EI) total ion currentchromatogram of positive rat urine 36.53、37.92、38.07、39.12、39.84 min，质谱图见图2。在PCI分析模式下给出M1~M 12的相对分子质量分别为199、239、239、270、284、255、271、255、271、286、300、316。 取0.5 mL 0.36 g/L 盐酸异丙夜水溶液，按照“1.4”方法进行提取， GC -MS检测，从提取物中检出异丙嗪，未检出异丙嗪代谢物。 图2 异丙嗪及其代谢物的 GC-MS(EI)质谱图 Fig.22GGC -MS(EI) spectra of promethazine(PMZ) and its metabolites 2.2 大鼠尿液中异丙嗪及其代谢物的鉴定 通过 NIST 质谱库检索，确定M5为原形药物异丙嗪(相似度为97%)，其结构式和质谱碎裂方式见图3。异丙嗪的分子离子峰为 m/z 284，失去中性碎片N， N-二甲基-乙烯胺后形成碎片离子 m/z 213，再失去甲基形成碎片离子 m/z 198，接着失去中性碎片S后，形成m/z 166；碎片离子m/z 213 失去 H后，形成碎片离子 m/z 212；碎片离子 m/z212进一步失去S，形成碎片离子 m/z 180； m/z 72为N， N-二甲基-乙胺基碎片离子。 M4的保留时间为31.77 min， m/z 270 为分子离子峰，与异丙嗪原形药的分子离子峰 m/z 284 相差14u；与异丙嗪相比，少了 m/z 72碎片峰，增加了N-甲基乙胺 m/z58碎片离子，其余主要碎片离子与异丙嗪相同，推测M4为去甲基异丙嗪。其结构式和质谱碎裂方式见图4。 图3 异丙嗪的质谱碎裂方式 Fig. 3FFragmentation patterns of PMZ 图4 M4的结构式与质谱碎裂方式 Fig.4 Structure and fragmentation patterns of M 4 M 11 的保留时间为 39.12 min， m/z 300 为分子离子峰，与异丙嗪分子离子峰 m/z 284 相差16u，多1个氧原子，推测为异丙嗪的氧化代谢产物，与异丙嗪亚砜对照，其保留时间和EI质谱图与异丙嗪亚砜基本吻合，因此推测 M 11 为异丙嗪亚砜。其结构式和质谱碎裂方式见图5。 图5 M 11 的结构式与质谱碎裂方式 Fig. 5 Structure and fragmentation patterns of M 11 M 10的保留时间为38.07 min， 通过谱库检索确定为2-羟基去甲基异丙嗪，其结构式和质谱碎裂方式见图6。 M 12的保留时间为 39.84 min， m/z 316 为分子离子峰，与异丙嗪分子离子峰 m/z 284 相差 32 u，多2个氧原子，且El 质谱图中存在 m/z 72碎片离子，不存在[M-16]和[M-32]碎片离子，推测为异 丙嗪的二羟基代谢物。 逐6 M 10的结构式与质谱碎裂方式 Fig.6 Structure and fragmentation patterns of M 10 M1的保留时间为27.92 min， 通过谱库检索确定为吩噻嗪。 M2及M3的保留时间分别为28.75、29.43 min，分子离子峰均为 m/z239，比吩噻嗪分子离子峰m/z 199 多 40 u， EI质谱图中均存在与吩噻嗪相同的 m/z 127、154、166(167)、198(199)碎片离子，还存在m/z239、223、180碎片离子，推断M2和M3为一对N-(1-丙烯基)吩噻嗪顺反异构体。其结构式和质谱碎裂方式见图7。 图7 M2与M3的结构式及质谱碎裂方式 Fig. 7Structure and fragmentation patterns of M 2 and M 3 M6和M8的保留时间分别为35.63、36.53 min， 分子离子峰均为 m/z 255， 比M2、M3的分子离子峰 m/z 239 多16 u， 即多1个氧原子，且存在[M-16]碎片离子，其余碎片离子与M2、M3相同，推断M6及M8为一对N-(1-丙烯基)吩噻嗪亚砜顺反异构体。 M7及M9的保留时间分别为36.34、37.92 min，分子离子峰均为 m/z 271，比 M6和M8的分子离子峰 m/z 255 多16u，推断M7和M9为一对N-(1-丙烯基)吩噻嗪砜顺反异构体。 2.3讨 论 异丙嗪在大鼠体内易代谢，尿液中主要以代谢物形式存在，除检出己有文献报道的异丙嗪亚砜19-13、去甲基异丙嗪19-11.和2-羟基去甲基异丙嗪114)3个主要代谢产物外，还检出N-(1-丙烯基)吩噻嗪顺反异构体、N-(1-丙烯基)吩噻嗪亚砜顺反异构体、N-(1-丙烯基)吩噻嗪砜顺反异体和异丙嗪二羟基代谢物，未检出文献[11]报道的去甲基异丙嗪亚砜19-101和去二甲基异丙嗪代谢物。根据实验结果，推测异丙嗪在大鼠体内的主要代谢途径见图8。 黄克建等：大鼠尿液中中丙嗪及其主要代谢物的 GC-MS分析 图8 异丙嗪在大鼠体内的主要代谢途径示意图 Fig.8 Main metabolic passway of PMZ in rat ( 参考文献： ) ( [1] WEIL A J. 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