大麦中赭曲霉毒素A检测方案(液相色谱柱)

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No.188 TSKgelTECHNICAL INFORMATION LC/MS 及 HPLC法分析大麦中的赭曲霉毒素 A Analysis of Ochratoxin A in barley by LC/MS and HPLC methods 赭曲霉毒素A是A.ochraceus 等真菌产生的一种霉菌毒素，在谷物、咖啡以及啤酒等中最常见，具有肝脏毒性以及肾脏毒性。目前，日本国内暂未设定检测限，不过国外设定了 5 ug/kg(麦类、CODEX) 以及2~10 pg/kg(麦类、EU)。中国在《GB 5009.96-2016食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定》中规定小麦和大麦的检出限为1pg/kg. 日本厚生劳动省通告的赭曲霉毒素A检测法，是使用免疫亲和色谱柱进行前处理后再采用LC/MS法以及 HPLC 法进行分析。本报告介绍了参照上述检测法对大麦样品中的赭曲霉毒素A进行分析的实例。 大麦样品的前处理方法如图2所示。添加乙腈/水混合溶剂，然后搅拌萃取。提取液过滤后，使用结合有赭曲霉毒素特异性抗体的免疫亲和柱进行纯化后的溶液作为待测样品。 (1)LC/MS法 分析条件如表1所示。分析柱使用了 TSKgelODS-100V 5pm， 通过乙酸铵水溶液/乙腈的梯度洗脱进行分离。采用 ESI 正负离子模式的任意一种均可以检出赭曲霉毒素A，本次实验采用 [M+H]+404进行检测。 图1赭曲霉毒素A的结构式 表1分析条件(LC/MS 法) 在大麦样品中添加浓度为10 pg/kg的赭曲霉毒素A， 赭曲霉毒素A在15分钟左右被洗脱，在未加标的大麦提按照图2进行前处理后，采用 LC/MS 法进行测定，色谱 取样品中没有检测到赭曲霉毒素A.图如图3所示。 图3大麦提取样品(加标与未加标)的色谱图(LC/MS法) 加标浓度：大麦中赭曲霉毒素A含量为 10ug/kg (2)HPLC法 分析条件如表2所示。分析柱采用了 TSKgelODS-100V 5pm， 流动相使用乙腈、水以及乙酸的混合溶剂进行分离。 通过荧光检测器，检测到了赭曲霉毒素A自带的天然荧光。并测定与图3中相同的各样品溶液，得到的色谱图如图4 所示。 图4大麦提取取品(加标与未加标)的色谱图 (HPLC法)加标浓度：赭曲霉毒素A含量为10 pg/kg 表2分析条件(HPLC法) Column：TSKgelODS-100V 5pm (4.6mml.D.×250 mm， 5 um)Eluent ： CH3CN/H2O/CH3COOH=480/510/10Flow rate： 1.0 mL/minColumn temp.：45℃Injection volume ：100 pLDetection ： FLD (Ex； 333nm， Em；460 nm) 两种检测方法的赭曲霉毒素A定量范围、重现性、定量限以及回收率，如表3所示。根据标准样品得到的校准曲线结果显示，两种分析方法在0.5~10 ug/L的浓度范围内，均呈良好的线性关系，相关系数为 r2=0.999。定量下限值(LOQ)为0.16和0.29ug/L，在用上述检测方法中的前处理方法时，大麦中含有的赭曲霉毒素A浓度分别相当于0.16 pg/kg和 0.29 ug/kg. 经确认，完全可以检测出 CODEX 规定的检测限的1/10浓度。另外，将添加了 10 pg/kg 赭曲霉毒素A标准物质的大麦作为样品，测得的回收率为102.4%和89.0%，结果良好。 表3各分析法的定量范围、重现性、定量限以及回收率 Methods Calibration curve RSD(%，n=6) LOQ Recovery(%) Range(ug/L) 2 (at 5pg/L) (ug/L) (ug/kg：barley) (at 10pg/kg： barley) LC/MS 0.5-10 0.999 1.57 0.16 0.16 102.4 HPLC 0.5-10 0.999 0.55 0.29 0.29 89.0 本报告介绍了LC/MS/MS和HPLC法对大麦样品中赭曲霉毒素A分析的实例。采用了免疫亲和色谱柱进行前处理。分析柱使用了TSKgel ODS-100V（5um），通过乙酸铵水溶液/乙腈的梯度洗脱进行分离。实验结果显示，两种检测方法在0.5-10 ug/L的浓度范围内，均呈良好线性关系，相关系数r2=0.999. 添加10 ug/kg赭曲霉毒素A的大麦样品的加标回收率为102.4%和89.0%，结果良好。