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介绍 酶是生物催化剂。如果细胞中没有酶,大多数生化反应将不能以需要的速率进行。从19世纪早期就开始对酶的生理学和生物学性质进行研究。人们对酶持续的兴趣来源于几个因素-酶在细 胞中的动力学和基本角色,非凡的催化能力和选择性。本实验评估了动力学性质中的2个性质,即酶活性和分子选择性的动力学描述。 本应用报告以酪氨酸酶描述酶活性的测定。使用LAMBDATM465紫外/可见分光光度计和UV LabTM软件快速采集数据并进行处理。 原理 酪氨酸酶是含有铜的氧化还原酶,可以催化单酚的邻位羟基化和邻苯二酚的有氧氧化。通过监控3,4-二羟(基)苯丙氨酸(多巴)氧化为红色多巴色素,进行酶活性测定。 图1.酪氨酸酶催化酪氨酸和多巴氧化 酪氨酸酶性质 酪氨酸酶通常被称为多元酚氧化酶,具有双催化活性:单酚的o-羟基化和0-双酚的有氧氧化。 monophenol+02— → catechol+H,O 蘑菇酪氨酸酶为四聚体,分子量为128000,含有4个Cu+。酶中有2种底物结合部位,分别用于酚类底物和双氧结合位;因此,能与铜形成复合物的物质为酪氨酸酶活性的可能抑制剂。 酶活性单位 溶液中酶的量常以活性单位来表示。常用的活性单位有三种:国际单位(IU),缩酮,比活性。国际酶生化委员会联合会推荐使用标准单位,国际单位或单位。在指定的PH、温度、离子强度和底物浓度下,1IU酶酶对应的量可以在1分钟催化1umol底物转变为产物。 其中, =摩尔吸收系数(M-1cm-1) V=比色皿中最终体积() A=吸光度 t=时间 (min, sec 等) 试剂和仪器 磷酸钠缓冲液, 0.1M, PH7.0 蘑菇中提取的酪氨酸酶(Sigma), 5单位/ul于磷酸钠缓冲溶液中L-3,4-二羟(基)苯丙氨酸(L-多巴), 2mg/ml于磷酸钠缓冲液中LAMBDA 465 紫外/可见分光光度计 UV Lab软件 比色皿(10mm光程) 过程 1. 准备0.1M磷酸钠缓冲液。 2.将酪氨酸酶和L-多巴溶解于0.1M磷酸钠缓冲液。 3.测定酪氨酸酶的量 3-1.按下表配制试剂 表1.酪氨酸酶测定一般过程,单位: ml Reagent 1 2 3 4 5 Phosphate buffer 1.995 1.990 1.980 1.960 1.940 L-Dopa 1 1 1 1 1 Tyrosinase 0.005 0.01 0.02 0.04 0.06 3-2.在475nm读取吸光度 3-3.被选酶的水平需覆盖的△A/min为0.025/min~0.25/min 4.计算酪氨酸酶浓度和酶活性因子 4-1.测定酪氨酸酶浓度 记录280nm下的吸光度(按结果部分计算酪氨酸酶浓度) 4-2.计算酶活性因子(见公式(I)) :=3600M-1cm-1(产物多巴色素的摩尔吸收系数) Vf=0.003 L (比色皿中最终体积) 将这些值代入公式(I),得到 单位=△A/At x0.83 因此,酪氨酸酶活性因子为0.83 5.仪器参数设置如下: 实验设置 数据类型: Absorbance 采样: 单池 模式: Faster ( Spectra No: 1, Scan No.:10, Integration No: 1, Gain No: 1) 实验类型: 酶活性 图2.测定酪氨酸酶活性的实验设置 6.测定最终样品溶液的A475。 结果 1.计算酪氨酸酶浓度 酪氨酸酶的吸收系数E2801%是24.9。即,1% (w/v) 酪氨酸酶在1cm比色皿中280nm下的吸收尾24.9。 Beer's定律:A=Elc 因此,从比值可以计算酪胺酸酶浓度 式中, C1=标准酪氨酸酶溶液浓度,即1% A2=未知浓度酪氨酸溶液在280nm的吸收,0.045因此, X=0.0018%(w/v) 将浓度转化为mg/ml并乘以稀释因子(最终体积/样品体积),酪氨酸酶浓度=0.18 mg/ml。 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 ( 地址:上海张江高科技园区张衡路1670号 ) 2.测定酪胺酸酶活性(见图3,表2,表3) 图3.每分钟A475的变化 表2.每30秒测定的吸收值 Time (Min) 475.000 nm 0 0.1091 0.5 0.219 1 0.3186 1.5 0.4106 2 0.4956 2.5 0.5724 3 0.6451 表3.人血清中的酚类底物水平 Name Start End Rate Activity Activity (Min) (Min) (Au/Min) Factor (umol/min) Tyrosinase 0 3 0.1780 0.8300 0.1477 3.比活性 酪氨酸酶的比活性为82单位/mg 结论 使用LAMBDA465紫外/可见分光光度计和UV Lab软件测定了酪氨酸酶活性。谱图测定快速,灵敏度良好,软件能有效定量和处理数据。 ( 1. Maniatis, F.L., Firitsch , E .F . ,Sambrook, J.,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring H arbor Press, New York, 1982. ) 2. Rodney Boyer, Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed.:Benjamin/Cummings,2000. ( 版权所有 ◎2014, PerkinElmer, Inc. 保留所有权利。PerkinElmer@ 是PerkinElmer, Inc. 的注册商标。其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 ) 要获取全球办事处的完整列表,请访问http:// www.perkinelmer.com.cn/AboutUs/ContactUs/ContactUsCHN_
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珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司为您提供《酪氨酸酶中酶活性检测方案(紫外分光光度)》,该方案主要用于其他中酶活性检测,参考标准《暂无》,《酪氨酸酶中酶活性检测方案(紫外分光光度)》用到的仪器有紫外可见分光光度计 LAMBDA 465 /。
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