环抱菌素中分离纯化检测方案(高速逆流色谱)

智能文字提取功能测试中

中国抗生素杂志2005年1月第30卷第1期·48· ·49·高速逆流色谱法分离纯化环孢菌素 方东升等 高速逆流色谱法分离纯化环孢菌素 方东升 谢阳 陈勇 陈晓明 郑卫 (福建省微生物研究所， 福州350007) 摘要： 应用高速逆流色谱法对环孢菌包的分离纯化进行研究，选择石油醚一丙酮一水(3：3：2，V/V)为两相体系，计算环孢菌素 A、B、C、D在两相体系中的分配系数，以上相为固定相，下相为流动相进行高速逆流色谱分离纯化，高效液相色谱法测测定组分纯度。实验结果表明一次高速逆流色谱即可将环将菌素粗品分离纯化，得到纯度98.5%以上的环孢菌孢A、B、C、D单组分，收率达85%以上。 关键词： 高速逆流色谱； 环孢菌素； 分离纯化 中图分类号：R979.5 文献标识码：A Separation of cyclosporins by high speed counter current chromatography Fang Dong-sheng，Xie Yang，，Chen Yong， Chen Xiao-mingancZheng Wei (Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou 350007) ABSTRACT High speed countercurrent chromatography (HSCCC)was used for the separation ofcyclosporin A， B， C， D by using petroleum ether/acetone/water (3：3：2，V/V)as two-phase solventsystem. The lower phase was selected as the mobile phase and upper phase as the stationary phase based on thecalculated partition coefficient (K) of cyclosporin A， B， C， and D. The purity of separated fractions was ana-lyzed by high performance liquid chromatorgraphy (HPLC). Experiment data shows that cyclosporin A， B，Cand D can be separated through one run of HSCCC with high purity(>98.5%) and recovery rates (>85%). KEY WORDS High Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC)； Cyclosporins；Separation andpurification 环孢菌素是由真菌产生的一组环状十一肽物质，由瑞士 Sandoz 公司于1976年首次报道，并从其产生菌多孔木霉(Tolypocladium inflatum)的发酵液中分离出二十多个同系物，此后又陆续从其它真菌中寻找到环孢菌素的产生菌L2~6]。环孢菌素具有广泛的生物活性，如环孢菌素A(CyA)已作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反应，环孢菌素H是含7个跨膜区域的G-蛋白耦合受体——甲酰化多肽受体的强抑制剂[7.8]，环孢菌素D的衍生物 PSC-833 可作为肿瘤多药耐药逆转剂191，环孢菌素C的衍生物具有抗 HIV 作用等[10]。因此，从环孢菌素产生菌的代谢产物中分离纯化环孢菌素各组分并研究它们及其衍生物的生物活性具有重要的意义。目前分离纯化环孢菌 素的方法主要有凝胶色谱，硅胶层析和高效液相色谱等。由于环环菌素同系物在结构上往往只是个别氨基酸甚至氨基酸构型的差异1.81，采用上述基于液-固色谱的分离方法往往很难将这些组分完全分离开来，因此探索环孢菌素新的分离技术具有很强的应用价值。 高速逆流色谱(High Speed Countercurrent Chro-matography，HSCCC)是国际上于20世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，高速逆流色谱利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相作为固定相，并将一相作为流动相用恒流泵连续输认，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相 ( 收稿日期：2004-04-09 ) ( 作者简介：方东升、男、生于1968年，工程师。主要从事微生物新药筛选的研究。 ) 间反复分配，按在流动相中分配系数的大小而依次得到分离11~131]. 高速逆流色谱作为一种新型的分离技术，与传统液-固色谱相比具有许多优点。首先，它不用固态支撑体，不存在样品组分的吸附、变性、失活、拖尾等现象，节省了材料和溶媒消耗；其次，它的分离效率高，并且分离时间短，一般几个小时即可完成一次分离；此外，有广泛的液-液分配体系可供选择，体系更换方便、快捷；它的进样量大，这对于样品的纯化制备显示出很大的优势。近年来，随着梯度洗先、pH区带优化、离子交换顶替、手性选择分离等技术的引入，高速逆流色谱技术将会得到更广泛的应用14.153. 本文报道高速逆流色谱在分离制备环孢菌素同系物方面的应用。 材料和方法 1.1实验材料 环孢菌素粗品粉末，福建省微生物研究所提供；高效硅胶板50mm×100mm，青岛海洋化工厂；石油醚(60~90℃)，上海联试化工试剂有限公司；丙酮，汕头达濠精细化学品公司；试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 1.2仪器设备 TBE-300 高速逆流色谱仪，深圳同田生化技术有限公司；LC-10ADVP高效液相色谱仪(自动进样器、紫外二极管阵列检测器)，日本岛津仪器公司；BSZ-100自动分部收集器，上海沪西分析仪器厂。 1.3实验方法 1.3.1溶剂系统的选择14] 溶剂系统的选择对于高速逆流色谱对样品的分离十分关键，要求溶剂可分层、被分离的溶质的分配系数(K)范围在0.2~2。结合实验积累的经验，选择石油醚醚丙酮一水(3：3：2)溶剂系统，配制一定量的两相溶剂，静置分层。 1.3.2确定固定相和流动相 各取2ml上相和下相于小试管中，加加1mg含环孢菌素A(CyA)、B(CyB)、C(CyC)、D(CyD)的粗品，剧烈振荡 lmin 后静置分层，用毛细管吸取近似等量的上下分层溶液于薄层高效硅胶板上，待溶剂挥发完后用水饱和的乙酸乙酯为展层剂，碘蒸汽显色，计算R： 值162。进样前的环孢菌素粗品，在TLC板上展开为四个斑点，分别为环孢菌素A、B、C、D组分，它们的R：值分别为0.56、0.34、0.23、0.69。 分别取上相和下相溶液进行 HPLC 检测，根据积分面积计算出环环菌素 A、B、C、D组分的分配系数K分别为1.4、0.6、0.2、5.6。选择上相为固定相，下相为流动相。根据K值判断，流动相中环环菌素C、B、A依 次流出，而环孢菌素D应留在固定相中，可以达到分离目的。 1.3.3 固定相保留率的测定 将固定相泵满螺旋柱，开启色谱仪，调节转速到600r/min(正转)，然后以2ml/min 的恒定速度将流动相泵入螺旋柱，收集主机出口流出的固定相。当主机出口流出流动相时，螺旋柱内固定相和流动相达到动力学平衡状态，此时测量被流动相推出的固定相体积V出，按下式计算固定相保留率p(固定相保留率p必须≥40%，否则该溶剂系统不适用)。 式中：V总一管路总体积(ml)； V出一流动相推出的固定相体积(ml)经计算，固定相保留率p=69%。 1.3.4 样品分离方法和组分收集 称取环孢菌素粗品 200mg，用流动相配成20ml的样品溶液，在固定相和流动相达到平衡状态后，由进样阀将样品溶液引入螺旋柱，转速600r/min(正转)，用流动相以2ml/min的流速洗脱，用分部收集器在进样60min 后开始收集，每3min 收集一管，每管6ml。 1.3.5 高效液相色谱分析方法 将收集到的环孢菌素各组分进行高效液相色谱分析，分析条件：NucleosilCi8色谱柱，填料粒径5um，流动相甲醇一水(80：20)，流速1ml/min，紫外检测波长205nm，柱温60℃，进样量20pl。 2红结果与分析 2.1高速逆流色谱分离结果 经高速逆流色谱分离，得到的样品收集管用毛细管点样在高效硅胶板上，用水饱和的乙酸乙酯为展层剂，碘蒸汽显色，计算R： 值，将 TLC 行为相同的收集管合并，收集到的样品可分为三部分。进样 450min后，停止高速逆流色谱主机运转，用固定相将主机螺旋·柱内的液体全部推出，收集为第四部分(表1)。 2. 2HPLC测定分析结果 2.2.1 进样前样品组分及含量分析 进样前环孢菌素粗品经 HPLC 分析，主要含有环环菌素C、B、A、D四个组分(图1)，各组分含量见表2。 表1 收集到的四部分样品情况 收集时间 收集体积 R：值 (min) 收集管数 (ml) 第一部分 93~120 9 54 0.25 第二部分 162~195 11 66 0.36 第三部分 276~435 53 318 0.58 第四部分 ..-. 330 0.70 环孢包素C、B、A、D组组保留时间分别为10.86、11.95、13.46和16.05min 图1 进样前环不菌素粗品 HPLC图 表2 环孢菌素粗品组分含量与重量 含量(%) 重量(mg) Cyclosporin C 9.1 18.2 Cyclosporin B 5.8 11.5 Cyclosporin A 76.4 152.8 Cyclosporin D 6.2 12.5 表3 HSCCC 分离后环菌菌素各组分纯度和收率 HPLC测定组分名称 重量 纯度 收率 (mg) (%) (%) 第一部分 Cyclosporin C 15.5 99.3 85.0 第二部分 Cyclosporin B 10.2 98.7 88.5 第三部分 Cyclosporin A 137.8 98.6 90.2 第四部分 Cyclosporin D 10.8 98.5 86.3 CyC 保留时间 10. 82min 图2 HSCCC 分离后环孢菌素C组分 HPLC 图 CyB 保留时间11.92min 图3 HSCCC分离后孢菌素B组分 HPLC 图 CyA 保留时间 13.49min 图4 HSCCC 分离后环孢菌素A组分 HPLC 图 CyD 保留时间16.04min 图5 HSCCC 分离后环孢菌素D组分 HPLC图 2.2. 2 分离后环孢菌素各组分纯度和收率 将收集得到的四部分样品经HPLC分析，分别为环孢菌素A、B、C、D，见表3和图2~5。 3 结论 通过本实验可得出以下结结： (1)在石油醚一丙酮一水(3：3：2，V/V)为两相系统条件下，用高速逆流色谱分离环孢菌素粗品，根据分配系数 Kc 关闭